Recherche fondamentale

2 244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger visant à suivre la naissance des neurones. Les femelles gestantes reçoivent un composé par sonde gastrique, susceptible d'avoir un effet abortif au dernier tiers de gestation, et les souriceaux une injection pouvant léser ou infecter le point de piqûre. Les tissus sont prélevés après mise à mort aux stades voulus, les femelles reproductrices étant réutilisées puis tuées au plus tard à 45 semaines. Le porteur chiffre l'effectif à 2 244 sans autre justification que l'expérience passée du laboratoire et des tests statistiques.

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser le processus de génération des neurones dans différentes régions du système nerveux d’un mammifère, la souris. Pour cela, nous allons utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées adaptés à notre étude qui expriment des marqueurs fluorescents permettant de marquer les cellules qui donnent naissance aux neurones, et d’identifier ainsi des groupes de neurones issus d’une même cellule mère. Nous emploierons cette stratégie n’impliquant pas de chirurgie pour suivre le devenir des cellules composant le tube neural embryonnaire et déterminer comment ces cellules contribuent individuellement à la construction du tissu neural dans différentes régions du cerveau impliquées dans la mémoire et la cognition, ainsi que dans la rétine (siège de la perception visuelle), en contexte normal ou pathologique. Nous utiliserons en fonction de la question biologique posée des lignées de souris exprimant des marqueurs fluorescents permettant de visualiser les neurones, ou bien d’étudier leur activité. Les tissus marqués seront analysés post-mortem par des techniques de microscopie de fluorescence permettant de reconstruire très précisément en 3D les régions étudiées, ou de caractériser l’activité des neurones.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera d’apporter une meilleure compréhension de la construction du cerveau et de la rétine en contexte normal et pathologique. Le but est d’une part d’augmenter nos connaissances sur le développement normal du cerveau et de la rétine, encore incomplètement compris, et d’autre part de caractériser comment ce processus peut être affecté par différents problèmes survenant dans les cellules neurales en prolifération qui entrainent des désordres neurodéveloppementaux, épilepsies ou cancers. Ceci permettra de mieux comprendre l’origine de ces pathologies et comment les cibler thérapeutiquement. Pour cela, nous devons avoir une vue précise de la construction du tissu neural et de la contribution des cellules souches neurales à ce processus. Ce projet permettra une telle caractérisation dans différentes régions du système nerveux central d’une espèce mammifère (souris) proche de l’homme. Ce projet procurera des données de référence intégrant anatomie et développement du système nerveux central en contexte normal et pathologique. Ces données constitueront une base pour le développement de futures thérapies ciblant spécifiquement certaines des pathologies mentionnées ci-dessus.

Procédures

Pour déclencher l’expression des marqueurs fluorescents dans les cellules neurales, nous administrerons un composé chimique aux animaux en suivant deux méthodes distinctes en fonction du stade ciblé : Pour déclencher le marquage à un stade embryonnaire, le composé chimique sera administré par voie orale en une fois à l’aide d’une sonde gastrique à des femelles adultes gestantes vigiles (acte durant moins d’une minute). Pour déclencher le marquage à un stade postnatal précoce, le composé chimique sera administré par injection en une fois à des souriceaux vigiles (acte durant moins d’une minute).

Impact sur les animaux

La contention des animaux nécessaire à l’administration du composé chimique cause un stress temporaire. L’administration par voie orale à l‘aide d’une sonde gastrique aux animaux vigiles cause un inconfort temporaire et présente des risques de « fausse-route » et de microlésions. L’administration du composé chimique par voie orale, réalisée durant la gestation, est susceptible d’avoir un effet abortif ou de causer des problèmes à la naissance des animaux, en particulier lorsqu’il est administré durant le dernier tiers de gestation. La procédure d’injection utilisée sur les jeunes animaux est quant à elle potentiellement source de douleur localisée au point d’injection, et présente un risque d’infection au site d’injection. Il existe également un risque d’altération de croissance.

Devenir

Les animaux chez lesquels le marquage est déclenché à un stade embryonnaire seront euthanasiés aux stades demandés pour l’analyse et les tissus collectés pour des études histologiques ou le monitoring de l’activité neuronale sur tissu frais. Les femelles utilisées pour produire ces animaux et ayant reçu le composé chimique par voie orale seront réutilisées si possible et euthanasiées au plus tard à 45 semaines d’âge. Les animaux chez lesquels le marquage est déclenché à un stade postnatal par injection du composé chimique seront euthanasiés aux stades demandés pour l’analyse et les tissus collectés pour des études histologiques ou de d’activité neuronale sur tissu frais. Les femelles utilisées pour produire ces animaux injectés seront si possible réutilisées et euthanasiées au plus tard à 45 semaines d’âge.

Remplacement

En application du principe de remplacement, des études préliminaires sur nos systèmes de marquages sont préalablement réalisées in vitro dans des systèmes de culture cellulaire, permettant de valider les modifications génétiques que nous utiliserons dans nos modèles animaux (souris). Cependant, l’utilisation de la souris reste indispensable dans ce projet du fait des particularités et de la complexité de l’organisation du tissu nerveux des mammifères.

Réduction

Ce projet impliquera au maximum 2244 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Ce nombre est basé sur notre expérience passée au laboratoire sur des expériences similaires. Nous utilisons en parallèle un logiciel statistique adapté. De même, la significativité de nos résultats sera évaluée à l’aide d’outils statistiques adaptés à nos études.

Raffinement

En application du principe de raffinement, les souris seront examinées quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergées dans les conditions conformes à la règlementation. Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant les expérimentations. Les souris seront hébergées dans des cages ventilées en stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton, tunnel), avec nourriture et eau ad libitum. Le nombre d'animaux par cage est limité à 5. La température et l’hygrométrie des cages sont contrôlées conformément à la législation. Des points limites ont été définis et les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure chargée du bien-être animal. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d’euthanasier l’animal en dernier recours. Les animaux bénéficieront quand nécessaire d’une anesthésie générale. Enfin, une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée qui indique les actes effectués, permettant une surveillance adaptée aux procédures afin de s’assurer de leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est très similaire à l’Homme anatomiquement, physiologiquement et génétiquement (98 pour cent de conservation du génome). Sa petite taille et sa courte gestation favorisent ce modèle standard pour l’étude du système nerveux, qui permet d’établir des lignées ayant les caractéristiques nécessaires à nos études. Les études se feront à plusieurs stades de développement (embryonnaire, première semaine après la naissance, deuxième/troisième semaines après la naissance, entre 3 semaines et 3 mois après la naissance), nous permettant ainsi d’adresser nos questions biologiques d’intérêt durant les différentes étapes clefs du développement et de la maturation du système nerveux central (avant et durant la genèse des neurones, durant leur migration, pendant et après leur maturation fonctionnelle).

Pour repérer les individus les plus 'résilients' en vue de la sélection, 100 agnelles vont être soumises à des restrictions alimentaires de 30 à 50 % pendant plusieurs jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Quatre prises de sang, neuf échographies et une tonte dorsale s'y ajoutent, la faim et la perte d'état corporel étant décrites comme intrinsèques au protocole. Aucune n'est tuée dans ce projet, toutes poursuivant leur élevage et étant déjà prévues pour une autre étude quelques mois plus tard. Le porteur présente cette privation contrôlée comme un moyen d'améliorer à terme le bien-être des animaux non-humains d'élevage.

Objectifs

Le projet vise à caractériser chez des ovins en croissance la résilience à des challenges alimentaires contrôlés et relativement courts. L’objectif est d’explorer différentes modalités de restriction alimentaire, en variant leur intensité et leur durée, afin de déterminer dans quelle mesure ces perturbations permettent de révéler des différences de dynamique de réserves corporelles au cours de la croissance. Cette approche permettra d’établir la faisabilité d’un protocole de phénotypage précoce et non-invasif de la résilience. La validité de cette mesure de résilience chez le jeune reposera sur deux critères complémentaires : (1) la mise en évidence d’une variabilité intra‑ et inter‑individuelle dans les réponses aux challenges alimentaires évaluées à l’aide d’un indicateur non-invasif des réserves corporelles (épaisseur de gras dorsal mesuré par échograhie), et (2) la cohérence entre la dynamique des réserves corporelles évaluée via cet indicateur non-invasif et les indicateurs métaboliques du déficit énergétique qui nécessitent des prises de sang. L’objectif est de vérifier que les réponses physiologiques observées reflètent l’état énergétique réel de l'animal en croissance avant d’envisager un phénotypage à plus grande échelle uniquement sur l’indicateur non-invasif des réserves corporelles. Si la mesure de résilience est validée à ce stade précoce, une seconde phase du programme sera envisagée, afin d' appliquer un protocole similaire aux mêmes individus une fois adultes et en période reproductive. Cette étape (qui ne fait pas partie du projet présenté ici) permettra de confirmer la pertinence de la mesure chez la brebis adulte, de comparer les modalités de challenge les plus discriminantes entre les deux stades de vie, et d’étudier la relation entre résilience précoce et résilience adulte. In fine, le projet permettra d’explorer les liens entre résilience énergétique et d’autres caractères d’intérêt zootechnique ou adaptatif.En utilisant des challenges en milieux contrôlés et à partir d’un indicateur non-invasif des réserves corporelles, il sera possible d’identifier les individus les plus résilients et de les séléctionner visant à renforcer l’adaptation et la performance des troupeaux face à des conditions d’élevage contrastées.

Bénéfices attendus

Le projet apportera des avancées majeures dans la compréhension de la résilience énergétique chez les petits ruminants. La dynamique des réserves corporelles constitue un indicateur prometteur, mais elle est aujourd’hui principalement mesurée en milieu extensif, sans possibilité de caractériser précisément les challenges auxquels les animaux sont exposés. De plus, cet indicateur est le plus souvent évalué tardivement, chez la brebis reproductrice. Enfin les indicateurs les plus communs des réserves corporelles sont souvent soit peu précis (ex : note d’état corporel), soit nécessitant une méthode invasive (ex : métabolites sanguins), ce qui limite les possibilités de phénotypage de la résilience. Le protocole proposé permettra de tester la validité d’un phénotypage précoce de la résilience à l’aide d’un indicateur quantitatif et non invasif : l’épaisseur de gras dorsale mesurée par échographie. Si la résilience mesurée chez le jeune s’avère cohérente avec celle observée à l’âge adulte et dans des environnements variés, cela ouvrira la voie à des travaux de génétique visant à sélectionner des animaux plus robustes. Une telle amélioration de la résilience contribuerait également à renforcer le bien‑être animal, en réduisant la sensibilité aux variations alimentaires et aux situations de déficit énergétique

Procédures

Sur l’ensemble de la période expérimentale de 8 semaines, chaque animal aura 4 prélèvements de sang (temps de prélèvement : moins d’une minute). Chaque animal aura 9 échographies (8 minutes chacune) . Les 25 animaux suivant la procédure 2 auront une restriction de 50% de leur alimentation relativement à leur niveau non restreint pendant 4 jours et une restriction intermédiaire pendant 3 jours, les 25 animaux de la procédure 3 auront une restriction de 30% relativement à leur niveau non restreint pendant 4 jours et une restriction intermédiaire pendant 3 jours, les animaux de la procédure 4 auront une restriction de 50% de l’alimentation relativement à leur niveau non restreint pendant 8 jours et une restriction intermédiaire pendant 3 jours.

Impact sur les animaux

es potentielles nuisances dans ce projet sont principalement liées aux restrictions alimentaires temporaires et aux manipulations nécessaires au suivi des animaux. Les périodes de rationnement peuvent entraîner une sensation de faim transitoire, une légère perte d’état corporel, un ralentissement temporaire de la croissance et un stress métabolique modéré. Cependant les modifications de l’état corporel attendues lors des phases de restriction ne constituent pas une nuisance imprévue : elles sont intrinsèques au protocole, contrôlées et nécessaires pour mesurer la résilience énergétique. Ces variations sont limitées dans le temps, réversibles et correspondent à la réponse physiologique recherchée pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les manipulations associées aux mesures d’échographie dorsale et aux prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress ponctuel ou un inconfort bref lié à la contention. Une perturbation comportementale peut également survenir lors de l’adaptation initiale aux dispositifs automatisés ou lors des interventions humaines. La réalisation de la tonte dorsale et de l’échographie dorsale nécessite le passage des animaux dans un couloir de contention et l’immobilisation des animaux pendant 8 minutes maximum, pouvant provoquer un stress ponctuel ou un inconfort bref. Outre ce stress de contention, la tonte et l’échographie ne provoquent pas de douleur particulière. Ce stress, dû à la contention, diminue rapidement à mesure que les agnelles s’habituent à cette contention. Une poignée de concentrée distribuée en sortie de contention permet d’accélérer cette habituation et à réduire le stress des animaux. La prise de sang, nécessite le passage des animaux dans un couloir de contention pendant 1 minute maximum, pouvant provoquer un stress ponctuel ou un inconfort bref. La prise de sang génère une douleur brève et modérée en raison de la piqure de l’aiguille et peut potentiellement générer un hématome. Un baume (vétébiol) sera appliqué en cas d’apparition.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les agnelles poursuivront leur phase d’élevage.

Remplacement

Il n’est pas possible d’appliquer le principe de remplacement dans ce projet. À notre connaissance, aucun modèle in vitro, ex vivo ou in silico ne permet de reproduire l’ensemble des processus physiologiques impliqués dans la dynamique des réserves corporelles face à une challenge nutritionnel. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet, et aucune alternative ne permettrait d’obtenir des données équivalentes.

Réduction

Notre projet repose sur le phénotypage de 100 agnelles. À notre connaissance, il s’agit du premier essai visant à caractériser un caractère de résilience face à un challenge alimentaire contrôlé chez des petits ruminants en croissance. Sur la base de la littérature disponible et de nos données préliminaires, nous estimons qu’un minimum de 20 animaux par traitement est nécessaire pour détecter des différences de trajectoires des réserves corporelles avec une puissance statistique suffisante. Toutefois, compte tenu de l’incertitude sur la sensibilité de l’indicateur non-invasif utilisé pour les réserves corporelles (épaisseur de gras dorsal), et des aléas possibles en cours d’expérimentation, nous prévoyons une marge de sécurité de 25 %. Cette augmentation vise à garantir la robustesse des analyses tout en évitant d’avoir à mobiliser ultérieurement des animaux supplémentaires. Le nombre de prélèvements sanguins est limité au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques, en l’occurrence la description de la dynamique des indicateurs métaboliques du déficit énergétique induit par la restriction alimentaire. Par ailleurs, les 100 agnelles utilisées dans cette expérimentation sont déjà prévues d’être utilisées quelques mois plus tard dans un autre projet. Pour ce projet, ces agnelles devaient au préalable être adaptées au dispostif automatiques en vue d’un passage au cours de l’été 2026. Elles le seront donc grâce à la phase d’adaptation prévue dans ce projet. Par ailleurs, la phase expérimentale prévue ici ne devrait pas interférer avec le projet suivant car les challenges alimentaires sont relativement courts et suivies d’une phase d’alimentation à volonté qui permettra de récupérer rapidement les trajectoires normales de croissance. Par ailleurs, le projet suivant se focalise sur le suivi des animaux pendant une phase d’alimentation à base de fourrage, il n’inclue pas de traitement expérimental et contient procédures légères. Ainsi la mutualisation d’animaux déjà engagés dans une autre étude permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant leur entrée dans la halle, les agnelles seront pré-habituées directement dans leurs lots d’élevage. En effet, une porte mimant celle des distributeurs automatiques de concentré a été reproduite dans les lots d’élevage, avec mise à disposition de foin ou de concentré pour inciter les animaux à passer la tête afin de s’habituer à ce dispositif pour accéder au concentré. En amont de l’expérience, des claies sont placées de part et d’autre des abreuvoirs dans les lots d’élevage des animaux, de façon à habituer les animaux à accéder aux couloirs d’accès aux distributeurs (eau et concentré) de la halle. Les agnelles sont hébergées sur une litière paillée et en lots de manière à pouvoir exprimer leurs comportements sociaux. Elles sont habituées à être manipulées. Les prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire alternativement gauche et droite. La prise de sang peut potentiellement engendrer un hématome. Un baume (vétébiol) sera appliqué en cas d’apparition. Différents enrichisssements seront proposés en alternance au cours de l’expérimentation : bascule (planche fixée à un cylindre), cône de signalisation, et brosse. Une surveillance visuelle est effectuée au quotidien par les agents formés. En cas de signes de maladie (fièvre > 40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé) ou d’impact sur l’état général des animaux (prostration, cachexie, alopécie…), l’animal est immédiatement sorti de l’expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce ovine est l’espèce cible du projet. Les ovins sont directement concernés par les variations d’apport alimentaire rencontrées en élevage, notamment en systèmes extensifs où les animaux sont fréquemment exposés à des périodes de sous‑alimentation. Les mécanismes de mobilisation des réserves corporelles et de résilience énergétique étudiés sont donc particulièrement pertinents chez l’ovin. L’utilisation d’agnelles permet en outre d’envisager un protocole de phénotypage précoce transférable aux programmes de sélection ovine. Les animaux sont âgés de 100 jours environ. A cet âge les animaux sont sevrés et en pleine croissance. Ainsi lors des phases d’alimentation au concentré à volonté on observe généralement une augmentation rapide du poids et de l’état corporel. Nous prévoyons à l’entrée dans la halle en moyenne un poids d’environ 30 kg, une épaisseur de gras dorsal (EGD) de 2,8 mm. A partir des données historiques dans les mêmes conditions, on peut s’attendre après 6 semaines à un poids moyen de 38 kg et une EGD de 3,9 mm chez les animaux alimentés à volonté avec du concentrés. L’âge auquel les animaux seront utilisés permettra donc d’étudier l’effet d’une restriction alimentaire sur la résilience par rapport à une trajectoire de référence chez des animaux en croissance.

Sectionnés d'un fragment de nageoire caudale pour le génotypage puis soumis à un prélèvement de sperme, 900 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. La lignée mutante créée sert à vérifier si l'inactivation d'un site de fixation d'un microARN réduit la fertilité, comme observé chez le médaka. La plupart sont tués après deux générations pour l'analyse des organes, 75 individus hétérozygotes étant réutilisés pour entretenir la lignée dans un autre projet. Le porteur reconnaît qu'une lignée déjà présente au laboratoire, où ce microARN est désactivé, ne montre aucun effet délétère, ce qui interroge l'ampleur des atteintes attendues ici.

Objectifs

Les microARN sont de petits régulateurs qui contrôlent l’expression de certains gènes seulement. Comme ils sont très conservés au cours de l’évolution, on pense que leurs gènes cibles le sont aussi. Dans les testicules, un microARN est fortement et spécifiquement exprimé. Quand on l’inactive chez le male médaka et la femelle zebrafish, on observe le même type de défaut de reproduction : moins de spermatozoïdes et moins fécondant. Chez le médaka, un des gènes responsables de la baisse de la capacité de reproduction du male a déjà été identifié comme cible de ce microARN. Le projet consiste à supprimer, chez le zebrafish, uniquement le site de fixation de ce microARN sur ce gène, pour empêcher leur interaction. Si les males mutants ont aussi une baisse la qualité et de la quantité spermatique, cela montrera que la cible du microARN est conservée au cours de l’évolution. En parallèle, des analyses d’histologie et de biologie moléculaire permettront de décrire plus finement les conséquences de cette mutation sur la reproduction.

Bénéfices attendus

Les miARN, dont celui de l'étude, sont très bien conservés au cours de l’évolution, et il est généralement admis que leurs cibles le sont également. Pourtant, à ce jour, aucun modèle expérimental n’a permis de démontrer clairement une conservation évolutive des cibles de ces microARN, ni une conservation des phénotypes associés à la régulation d’un miARN sur un gène cible. Dans notre cas, le miARN travaillé, chez le médaka et le zebrafish, un impact similaire sur les phénotypes de reproduction, la mise en évidence d’une conservation évolutive des phénotypes et de leurs cibles chez le zebrafish pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies d’étude des défauts de fertilité humaine.

Procédures

Ce projet concerne la création d'une lignée mutante. Pour valider une lignée mutante un génotypage par fin clip (section d'un fragment de nageoire caudale) sera réalisé sur des animaux anesthésiés. Cette procédure est très rapide : moins de 2 minutes par animal, anesthésie et récupération incluses. Les animaux de première génération seront isolés jusqu’à 8 jours maximum, le temps de recevoir les résultats de séquençage du prestataire. Afin d'identifier les poissons, ceux-ci resteront dans des bacs individuels à paroi transparente, permettant un contact visuel avec leurs congénères. Les animaux mutants et sauvages de troisième génération subiront un prélèvement de sperme sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système reproducteur, car ce microARN est surtout exprimé dans les gonades. Le gène cible sera modifié pour empêcher la fixation du microARN et donc sa régulation. Nous anticipons principalement une diminution de la fertilité. Dans une lignée déjà présente au laboratoire où le microARN est désactivé, aucun phénotype délétère n’a été observé, nous ne nous attendons donc pas à des effets graves. Cependant, chez le médaka, un blocage des pontes peut survenir (arrêt de ponte par manque de stimulation mâle), caractérisé par l’absence d’œufs et un gonflement abdominal de la femelle, d’où un suivi spécifique des femelles zébrafish. Le génotypage est invasif (petit fragment de nageoire) mais réalisé sous anesthésie pour minimiser les nuisances, pouvant causer une réduction temporaire de l’activité locomotrice. La récolte de sperme est bien maîtrisée et n’entraîne pas d’inconfort notable. Les anesthésies pour prélèvements peuvent modifier temporairement le comportement alimentaire le jour même.

Devenir

Ce projet vise à étudier le fonctionnement des capacités de reproduction après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes. De cette même génération 75 poissons hétérozygotes (c’est-à-dire présentant une version du gène altéré et une « normale ») seront réutilisés afin de faire un maintien de la lignée (procédure faisant l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet).

Remplacement

L’objet du projet est d’étudier le rôle précis de l’interaction entre un micro ARN et un gène sur la fonction ovarienne et les phénotypes de reproduction. À ce jour, aucune méthode ne permet de reproduire fidèlement la complexité de la régulation génique et des interactions cellule–cellule recourir à l’animal entier. Le poisson‑zèbre a été choisi car il s’agit d’un modèle vertébré bien établi en biologie du développement et de la reproduction, présentant un système de reproduction fonctionnel, une proximité avec le modèle médaka déjà étudié pour le microARN et des outils génétiques disponibles et maîtrisés.

Réduction

In fine, il s’agit de réaliser des prélèvements post-mortem sur au moins 12 individus mutants (animaux homozygotes pour la mutation obtenus en 2ème génération) et au moins 12 individus de génotype sauvage (non mutés) soit 48 animaux de 2 génotypes différents. Par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus fondateurs porteurs de mutations intéressantes. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygote en 1ère génération lorsque les individus fondateurs sont croisés avec des animaux de génotype sauvage. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes (+/-) de la 1ère génération produira une 2ème génération homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif de cette 2ème génération ). Nous produirons donc le nombre d’individus strictement nécessaires assurant la réalisation de l’analyse des testis d’au moins 24 animaux.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau,densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums de 10 litres avec la densité de 30 animaux maximum/aquarium. Le génotypage ainsi que la récolte de sperme se feront sous anesthésie. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à la mutation) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier).

Choix des espèces

Le poisson-zèbre est particulièrement pertinent pour ce projet car il appartient à la même famille phylogénétique que le médaka, un téléostéen, permettant de tester directement la conservation évolutive de l'interaction entre gène/inhibiteur d’expression et des phénotypes reproducteurs associés. Il présente un système reproducteur bien caractérisé avec des phénotypes de fertilité facilement mesurables (nombre d'œufs pondus, taux de fécondation, dynamique folliculaire). Les outils d'édition génomique y sont parfaitement maîtrisés et efficaces, il présente un fort taux de fécondité (200-300 œufs par ponte) et un développement rapide (maturité sexuelle à 3 mois), permettant une production rapide de lignées mutantes. Le testicule est accessible à l'analyse histologique et l’analyse de l’expression des gènes. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, les testicules permettant une étude au stade de maturité de développement de l’organe.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Nourries huit semaines d'un régime gras et sucré à des horaires décalés, elles passent des tests métaboliques et cognitifs, avec un prélèvement de sang derrière l'œil sous anesthésie locale. Le projet veut montrer qu'un désalignement des rythmes jour-nuit dérègle le métabolisme et la mémoire. Cette "preuve de concept" reste annoncée au conditionnel, quand les prélèvements et le régime imposé sont, eux, bien réels.

Objectifs

Les mammifères présentent un rythme circadien de 24 heures, permettant de synchroniser les fonctions biologiques aux variations environnementales, notamment l’alternance jour/nuit. Cette synchronisation repose sur l’interaction entre l’horloge centrale et les horloges périphériques, et est principalement régulée par la lumière. La régulation du métabolisme est fortement dépendante de cette coordination pour maintenir l’homéostasie énergétique. Cependant, la pollution lumineuse et/ou des rythmes alimentaires irréguliers peuvent perturber cette synchronisation, induisant un désalignement entre horloges centrale et périphériques. La lumière artificielle nocturne inhibe la sécrétion de mélatonine, perturbant le rythme veille/sommeil et les horloges métaboliques (foie, muscles). Ces désynchronisations augmentent le risque de troubles métaboliques, surtout lorsqu’elles sont combinées à une prise alimentaire durant la phase de repos. L’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HHT), régulateur des hormones thyroïdiennes (HT), joue un rôle central dans le fonctionnement du cerveau, le métabolisme et les rythmes circadiens. Les HT influencent la neurogenèse, le métabolisme énergétique et interagissent avec les horloges biologiques. Leur production est essentielle pour maintenir la rythmicité des horloges métaboliques. Des dérèglements métaboliques peuvent entraîner une inflammation chronique favorisant la neuroinflammation. Celle-ci altère la plasticité neuronale, affecte les fonctions cognitives et augmente le risque de neurodégénérescence. La flexibilité métabolique apparaît comme un facteur clé de prévention des déséquilibres métaboliques. Elle dépend des horloges circadiennes, qui optimisent les processus métaboliques selon le cycle jour/nuit. La flexibilité métabolique pourrait être améliorée en synchronisant la prise alimentaire avec le rythme circadien naturel d’utilisation des nutriments. Ainsi, des approches comme le Time-Restricted Feeding (TRF), ou alimentation à horaires restreints, limitant la prise alimentaire à certaines plages horaires, ont montré des effets bénéfiques sur la régulation métabolique, bien que les mécanismes impliqués restent à élucider. Grâce au TRF, nous étudierons à l’aide d’une souche de souris sensible à l’obésité induite, les effets métaboliques, neuroinflammatoires et cognitifs d’une désynchronisation, ainsi que le potentiel de la resynchronisation alimentaire avec le cycle jour/nuit à restaurer l’équilibre métabolique et cognitif.

Bénéfices attendus

Notre projet pourrait apporter la preuve de concept des effets néfastes des perturbations circadiennes sur la régulation du métabolisme et de leurs conséquences sur la cognition. La désynchronisation devrait exacerber les perturbations métaboliques et promouvoir la prise de poids et une augmentation de la neuroinflammation, associée à une diminution de la neurogenèse, pouvant conduire à des altérations cognitives. Toutefois, ces effets devraient être réversibles grâce à la resynchronisation. Ces résultats devraient appuyer l’hypothèse selon laquelle les désalignements circadiens affectent à la fois le métabolisme et la santé cérébrale, augmentant les risques de vieillissement précoce et de neurodégénérescence.

Procédures

Les animaux ne seront soumis qu’à une seule procédure, qui sera constituée de 4 actes : - alimentation riche en gras et en sucre (45 % des calories apportées par la graisse et 17% des calories apportées par du sucrose) restreinte dans le temps (soit à volonté, soit durant le jour, soit durant la nuit) pendant 8 semaines - caractérisation métabolique : prise de poids hebdomadaire, test de tolérance au glucose avec mesure de la glycémie après gavage à partir d'une goutte de sang prise à la queue+prise de sang pour dosages hormonaux, mesure de composition corporelle par bioimpédance, mesure de la production de chaleur par caméra thermique - évaluation de capacités cognitives avec différents tests de comportements - prélèvement sanguin avant euthanasie

Impact sur les animaux

Les animaux ne devraient pas subir d’effets indésirables majeurs, le régime HFHS étant équivalent à une nourriture occidentale. On attend une prise de poids variable entre les individus, mais qui selon notre expérience ne devrait pas dépasser un gain de poids supérieur à 7% par rapport au poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de procéder aux prélèvements des différents tissus nécessaires à nos analyses.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer le recours aux animaux car les études physiologiques portant sur des influences métaboliques ne peuvent être réalisées que chez des animaux vivants, dans un système intégré. Par conséquent, l’impact du régime HFHS et de la synchronisation/désynchronisation de la prise alimentaire avec le cycle circadien de l’animal sur ses capacités cognitives ne sera observable qu’en réalisant des tests de mémoire sur animaux vivants. De même, nous ne pouvons pas mimer la flexibilité métabolique in vitro ou ex vivo, il est donc nécessaire d’utiliser l’animal entier.

Réduction

Dix animaux par groupe seront utilisés (6 pour les prélèvements de tissus et 4 pour les analyses immunohistochimiques), un nombre estimé à partir de nos expériences passées avec ce type d’analyses et qui est le minimum pour garantir une exploitation et une puissance statistique des résultats obtenus. Un nombre d'animaux plus faible serait dommageable dans l'exploitation de nos données et contribuerait à utiliser des animaux inutilement. Ainsi, nous évaluons le nombre d’animaux à 30 souris pour ce projet. Pour ne pas perdre en puissance statistique, l’analyse des résultats obtenus sera effectuée à l’aide d’un test non paramétrique avec permutation qui utilise une méthode de calcul exact avec une estimation par Monte Carlo

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (gel lidocaïne (gel ophtalmique à 2 %) pour anesthésie locale pendant la prise de sang en rétro-orbital). Les animaux disposent de nourriture selon le rythme décrit (mais leur permettant d’avoir l’apport calorique nécessaire sur 24h) et de l’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de nid en plastique. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de celles-ci grâce à une surveillance attentive (points limites, énoncés ci-après) et des soins adaptés. Même si nous n’attendons pas d’effets délétères marqués suite à notre procédure qui est légère, les indicateurs habituels comme la prostration, détectée par les animaliers ou par l’expérimentateur, l’absence d’alimentation (la diminution des quantités de nourriture disponible entre deux nourrissages est vérifiée par pesée), des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, grattement, léchage) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, agitation anormale ou hyperréactivité) seront particulièrement suivis. Dans le cas où un ou plusieurs des symptômes cités varient de manière significative, l’animal sera dans un premier temps sorti de la procédure, et/ou euthanasié dans les cas les plus extrêmes. Une bonne maîtrise de la procédure et un suivi assidu des groupes expérimentaux doit prémunir de la survenue d’incidents de ce type. Tout signe d'atteinte du système nerveux central (inclinaison de la tête, spasmes, convulsions, troubles de l'équilibre) entraînera systématiquement le retrait de l'animal de la procédure et son euthanasie.

Choix des espèces

Le modèle biologique choisi est la souris. Les connaissances accumulées par la communauté scientifique sur les souris, et particulièrement sur les C57Bl6/J dans les modèles d’obésité, ont permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques impliqués dans le maintien de la balance énergétique et de valider des tests comportementaux permettant de mesurer les capacités mnésiques des souris. Tous les protocoles utilisés dans ce projet de recherche ont été optimisés et validés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Nous utiliserons des animaux adultes (âgés de plus de 8 semaines au début de l’expérience), afin que les résultats ne soient pas faussés par la prise de poids induite par la croissance des animaux s’ils sont trop jeunes.