Oncologie

Vérifier que les solvants fournis par des clients ne font pas souffrir les animaux avant de lancer les études payantes : 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin du protocole. Chacune reçoit jusqu'à deux administrations par jour pendant quatorze jours, dans le péritoine, sous la peau, dans une veine ou par gavage. Le porteur indique que ces injections répétées peuvent réduire la mobilité, courber le dos, faire plisser les yeux, et provoquer irritation locale, inflammation du péritoine, douleur musculaire ou diarrhées. L'amendement au projet ajoute 120 animaux pour tester aussi la molécule elle-même, et le porteur range l'ensemble sous les principes de raffinement et de réduction.

Objectifs

Dans le cadre de l'amélioration continue de nos méthodes de travail, notre objectif est de valider les produits utilisés pour diluer les molécules d'intérêt fournies par nos clients, lorsque ces véhicules n'ont pas encore été testés au préalable. Cette validation est cruciale lors de l'arrivée de nouveaux projets afin de garantir que le produit choisi n'entraîne pas de douleur aiguë ou chronique chez les animaux. L'objectif principal de cette étude est de confirmer les produits injectés aux animaux sont innofensifs. En assurant l'absence de douleur ou de détresse liée à l'administration du produit, nous serons en mesure de procéder aux études de traitement répétées en toute confiance, sans compromettre le bien-être animal et en garantissant l'exactitude des résultats expérimentaux, s'incluant dans le principe de raffinement. Cela nous permet également d'éviter de lancer des accouplements et de créer des cohortes avant d'être entièrement sûrs du protocole de l'étude, s'incluant dans le principe de réduction.Nous avons estimé, sur la base des projets réalisés à l'institut au cours des deux dernières années, que cette étude préliminaire pourrait être nécessaire au maximum six fois par an, en fonction des nouveaux projets nécessitant l'utilisation de produits non encore testés. Amendement 1 : Afin d’assurer une évaluation complète des conditions d’administration, cette étude inclura non seulement la validation des véhicules utilisés pour diluer les molécules d’intérêt, mais aussi l’injection de la molécule elle-même lorsque cela est pertinent (par exemple lorsque seul une concentration inferieur à déjà été testé in vivo, ou lorsque la molécule seule pourrait avoir un risque de toxicite) nécessitant une modification du projet initial avec ajout de 120 animaux. Cette approche permettra de vérifier l’innocuité de l’ensemble de la formulation administrée, garantissant ainsi que ni le véhicule ni la molécule d’intérêt n’entraînent de douleur aiguë ou chronique chez les animaux, tout en maintenant la rigueur scientifique et le bien-être animal.

Bénéfices attendus

- Évaluation de la sécurité du produit : Assurer que l'administration du produit ne provoque ni douleur aiguë ni douleur chronique chez les animaux. Cela est crucial pour garantir que nos essais ne compromettent pas le bien-être animal. - Fiabilité des études : En validant la non toxicité du produit, nous serons en mesure de mener des études de traitement répété en toute confiance, ce qui nous permettra de fournir des résultats fiables et précis sur les effets des molécules testées.

Procédures

Chaque animal sera soumis à 1 administration d'un produit contrôle au maximum 2 fois par jour pendant 14 jours par voie intrapéritonéale, sous cutanéee, intraveineuse ou par gavage. Ces gestes durent environ 1 minute et n'affectent pas le bien-être des animaux plus d'une heure.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des injections répétés pouvant conduire de manière aigue à une diminution de la mobilité de l'animal ou a des anomalies posturales (dos vouté, yeux plissés). En chronique les injections peuvent induire une irritation locale ( injection sous-cutanée), une inflammation du péritoine (injection intra-péritonéale), une douleur musculaire (injection intramusculaire) ou des diahrées (gavage oral).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole et les organes seront collectés si un effet négatif du traitement est visualisé.

Remplacement

Tester le produit à injecter avant la réalisation de l'étude expérimentale est une étape essentielle qui contribue à la sécurité, à l'efficacité et à la rigueur scientifique de la recherche. Cette phase permet de garantir que les résultats obtenus sont fiables et que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile, répondant ainsi aux exigences éthiques et scientifiques des études expérimentales. Ceci va permettre d'identifier des potentielles réactions indésirables de l'injection ou du composé en lui même mais egalement d'optimiser sa formulation ci necessaire

Réduction

Une étude pilote de 8 animaux sera réalisée pour les études necessitant une administration répétée d'un composé lorsque le client ne l'aura jamais testé par lui même aupréalable (exemple: véhicule repris de la littérature). Tester le véhicule en amont permet d'anticiper et de corriger d'éventuels problèmes avant qu'ils n'affectent l'étude principale, évitant ainsi des répétitioins d'une étude et donc l'utilisation de plus d'animaux. Cela nous permettra également d'éviter de lancer des accouplements et de créer des cohortes avant d'être entièrement sûrs du protocole de l'étude. Suite à nos retours sur les projets précédents et en concordance avec les études statistiques nous avons opté pour 8 animaux par groupe. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 8 animaux constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Amendement 1 : Cette étude inclura non seulement la validation des véhicules utilisés pour diluer les molécules d’intérêt, mais aussi l’injection de la molécule elle-même lorsque cela est pertinent.

Raffinement

La phase de test du produit contribue au raffinement des méthodes expérimentales en minimisant la douleur et la détresse, et en maximisant la qualité des données obtenues. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation ainsi que le poids chaque jour pendant les 14 jours de la procédure. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La souris est un mammifère permettant une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux pourront être utilisés à partir de l'âge de 1 mois jusqu'à 1 an, en fonction des exigences spécifiques de l'étude principale. Cette flexibilité d'âge nous permet d'adapter les animaux au modèle expérimental en phase avec les problématiques physiologiques pertinentes pour chaque étude.

1 200 souris, dont des souris génétiquement modifiées pour ne plus produire la protéine CD44, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et chacune passe jusqu'à 32 semaines sous régime gras ou reçoit jusqu'à 16 injections intrapéritonéales d'un agent qui provoque une fibrose du foie. Sous régime riche en graisses, glucides et cholestérol, les premières sont mises à jeun quatre heures puis gavées à la sonde rigide, avec un risque de passage du liquide dans les poumons et de détresse respiratoire, et reçoivent jusqu'à trois injections intrapéritonéales et plusieurs prises de sang à la queue. Le porteur annonce la validation d'une protéine qui "pourrait être une cible thérapeutique potentielle" dans les maladies du foie liées à l'obésité. Pour justifier le choix de la souris, il avance sa "natalité importante" et le fait qu'elle permet d'obtenir assez de "matériel" pour les analyses, puis conclut : "Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée".

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’à la fibrose/cirrhose puis au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, les traitements pharmacologiques restent très limités et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, et également à la surface des cellules stellaires hépatiques qui jouent un rôle clé dans la mise en place de la fibrose, en produisant de façon excessive du collagène. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de cette protéine est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n'exprimant pas cette protéine, et soumis à des régimes alimentaires ou des agents chimiques favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle d’une protéine à la surface des cellules qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans un contexte de maladie stéatosique du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

Dans la procédure 1 : Pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris seront mises à jeun pendant 4h puis recevront des solutions aqueuses par gavage à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge suivi de 2 prélèvements sanguins à la veine de la queue. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées et le sang sera alors prélevé au niveau de la veine de la queue. Enfin à la fin du régime, un dernier prélèvement sanguin sera effectué. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Un à deux prélèvements sanguins à la veine de la queue seront effectués (en milieu et en fin de traitement avec l’agent chimique).

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1 : pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris prendront du poids pouvant occasionner une gêne pour se déplacer. Lors des gavages des solutions aqueuses à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge, l’introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons peut se produire entrainant une détresse respiratoire. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées. À la suite de ces injections une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pouvant entraîner une inflammation au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront réalisées 3 fois au maximum pour atteindre la significativité statistique.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) pour chacune nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter leur sévérité. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances lors des pesées et/ou injections bi-hebdomadaires nous permettront de repérer précocement l’apparition de points limites qui imposent une action pour soulager l’animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles et femelles), la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles et femelles), le traitement chimique induisant de la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.

Le rat roussard, un rongeur diurne, vit en cage individuelle dès le sevrage, les mâles de cette espèce étant agressifs entre eux. 64 rats roussards et 64 souris, soit 128 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer l'effet de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme d'une espèce diurne et d'une espèce nocturne. Chacun subit une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie générale pour l'implantation d'un capteur de télémétrie, puis jusqu'à quatre semaines en cage individuelle, ce que le porteur décrit comme un "stress d'isolement social". Tous sont tués pour des analyses post-mortem, après un prélèvement de sang terminal que le porteur situe "après arrêt respiratoire de l'animal".

Objectifs

La lumière joue un rôle majeur sur la physiologie et la santé. Ce projet de recherche vise à étudier les effets de la lumière ambiante sur la prise alimentaire et le métabolisme au cours des 24 h. Les expériences seront menées en parallèle chez un modèle animal nocturne, la souris et chez un modèle animal diurne, le rat roussard. Dans ce projet de recherche, nous proposons de tester l’hypothèse selon laquelle l'exposition à la lumière optimise les comportements de prise alimentaire chez les espèces diurnes et nocturnes, par deux processus temporellement cohérents qui sont 1) les effets dépendants des horloges circadiennes et 2) les effets directs de la lumière sur le comportement. Nous proposons que les effets directs de la lumière favorisent la prise alimentaire de jour chez les espèces diurnes et inhibent la prise alimentaire de nuit chez les animaux nocturnes.

Bénéfices attendus

L’identification des effets directs de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme pourrait permettre de participer à la prévention et le traitement des troubles liés à la prise de nourriture et des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, par des approches de photothérapie ciblée et par des recommandations sur des horaires d’exposition à la lumière qui seraient à éviter.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 1h30 réalisée sous anesthésie générale et à un prélèvement sanguin terminal réalisé également sous anesthésie générale et après arrêt respiratoire de l'animal. Pour toutes les procédures les animaux devront être placés en cage inviduelle pour une durée maximal de 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement social d'une durée maximale de 4 semaines. La chirurgie d'implantation du capteur de télémétrie pourrait induire de l'inflammation, une perte de poids transitoire, une infection au site des sutures.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour analyse post-mortem.

Remplacement

La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme et la détection de la lumière impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, rétine, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles) et des relais nerveux et hormonaux, l’investigation des interactions entre horloges circadiennes et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro ou de modéliser in silico la réponse de ce circuit multi-organes.

Réduction

Pour les tests in vivo circadiens et métaboliques, le nombre d’animaux proposé (n=12 par condition) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales recueillies dans des études antérieures. Pour l'étude des réponses hormonales et neuronales à la lumière (post-mortem), le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire et par condition lumineuse) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures . Notre suivi systématiquement longitudinal des animaux réduit significativement le nombre d’individus utilisés.

Raffinement

Les souris issues d'un fournisseur agréé seront soumies à deux semaines d'acclimatation aux nouvelles conditions d'animalerie avant le début des procédures. Le rongeur diurne est quant à lui hébergé dès le sevrage en cage individuel car les mâles de cette espèce sont très territoriaux et donc agressifs entre eux. Les souris seront ensuite placées en cages individuelles pour la durée des procédures ce qui genèrera un stress d'isolement social que nous limiterons par ajout de frisure en plus de l'enrichissement classique des cages à savoir bâton à ronger et coton pour faire un nid. La frisure permettra de soutenir la thermorégulation de la souris individualisée notamment tout en apportant un enrihcissement supplémentaire pour la construction du nid. La procédure invasive de chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie adaptée et la température corporelle des animaux est maintenues grâce à un tapis thermostaté relié à une sonde rectale durant toute la procédure. Dès l'anestéhsie et ensuite jusqu'au réveil les animaux sont maintenus sous lampe chauffante. L'état de santé des animaux est évalué une fois par semaine avant la procédure de chirurgie puis au minimum quotidiennement à l'aide d'une grille de score adapatée après. Des points limites spécifiques ont été établis pour limiter la souffrance animal en arrêtant la procédure dès que nécessaire. En post-chirurgie pour aider la récupération de l'animal de la nourriture gélifiée sera ajoutée au fond de la cage pour faciliter la prise de nourriture et hydrique.

Choix des espèces

Pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, notre projet repose sur l’analyse comparative des réponses comportementales, physiologiques et neuronales entre un modèle animal nocturne et un modèle animal diurne. La souris est une espèce nocturne devenue un modèle classique en nutrition et en chronobiologie. C’est aussi un modèle incontournable en recherche animale par l’existence de nombreuses lignées transgéniques (y compris celles porteuses de mutations, celles avec gènes invalidés, ou avec gènes-rapporteurs). Une fois ce projet achevé, nous envisageons de rechercher les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris transgéniques exposées aux mêmes procédures expérimentales. Le modèle rongeurs diurnes sont des modèles expérimentaux appropriés pour la recherche biomédicale. Leur utilisation dans le projet présent est pertinente pour comprendre les différences de réponses entre espèces nocturnes et diurnes. C’est pourquoi les mêmes expériences seront faites en parallèle chez un rat diurne, et la souris nocturne. Jeunes adultes (2-4 mois) pour étudier un système circadien et un métabolisme matures et non-sénescents.

Aucun animal porteur du phénotype dommageable n'est gardé au-delà de vingt semaines, et tout individu atteignant un point limite est tué aussitôt. 2 880 souris vont être utilisées dans cet élevage de lignées à inflammation chronique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin. Le phénotype produit une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires, et les souris qui ne l'expriment pas rejoignent les groupes témoins. L'élevage alimente un projet sur le métabolisme des lipides dans le syndrome d'Aicardi-Goutières, et le porteur écrit que les animaux développeront une inflammation chronique vers vingt semaines tout en affirmant que les conditions d'élevage seront adaptées pour qu'ils ne développent pas de symptômes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’élever des animaux spécialement conçus pour nos expériences scientifiques. Grâce à ces expériences, nous cherchons à comprendre comment le métabolisme des lipides influence certaines maladies inflammatoires chroniques (ici par exemple le syndrome d'Aicardi-Goutières).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de découvrir des solutions thérapeutiques pour alléger les symptômes présents chez les patients souffrant d’inflammation chronique.

Procédures

Les animaux développeront aux alentours de 20 semaines d'âge une inflammation chronique liée à leur phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

Les nuisances liées à l'inflammation chronique dans ces modèles sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Les animaux ne seront pas maintenus plus de 20 semaines, les conditions d'élevage seront donc adaptées pour qu'ils ne dévellopent pas de symptômes.

Devenir

Les animaux issus de l'élevage seront soit utilisés pour renouveler les accouplements soit utilisés pour les expérimentations dans le cadre d'une utilisation continue sur site. Les animaux ne présentant pas le phénotype dommageable seront intégrés dans les groupes "contrôles". Tous les animaux seront utilisés. A la fin, ils seront tous euthanasiés.

Remplacement

L'objectif du projet scientifique associé à ces élévages nécessite l'utilisation de modèles animaux. Les méthodes substitutives notamment l'utilisation de modèle in vitro ne permet pas d'étudier la communication inter-organes.

Réduction

Afin de réduire le biais associé au sexe, des groupes équivalents d’animaux des deux sexes seront utilisés dans les protocoles expérimentaux proposés. Tous les animaux issus des accouplements seront conservés pour l'expérimentation.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues à la délétion génétique dommageable. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. De plus les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. De fait, afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux, les animaux seront placés en cage 3 individus (trio d'accouplements) avec pour enrichissement une maisonnette en carton et du coton pour la nidification. Les animaux avec un phénotype dommageable ne seront pas gardés en vie au delà de 20 semaines d'âge.

Choix des espèces

Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expérimentales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les animaux seront utilisées pour l'élevage, les animaux seront donc mis en accouplement entre 7 et 8 semaines et les animaux à phénotype dommageable seront maintenus en accouplements pour une durée maximale de 12 à 13 semaines ( âge maximum des animaux 20 semaines).

Vingt injections sous-cutanées quotidiennes entre les épaules, puis deux injections intrapéritonéales aux jours 21 et 23: 180 souris femelles de un à trois mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. L'induction du syndrome des ovaires polykystiques peut provoquer des épisodes douloureux au niveau ovarien, et les injections sous-cutanées des zones d'irritation. Le projet cherche des biomarqueurs qui prédiraient une réponse anormale à la stimulation hormonale, dont le risque d'hyperstimulation est accru chez les patientes atteintes de ce syndrome et suivies en procréation médicalement assistée. Le porteur ne nomme ni la substance qui induit le syndrome ni l'hormone injectée ensuite, et ne donne aucun chiffre à l'appui de l'effectif de 180 souris qu'il déclare avoir "restreint au maximum".

Objectifs

Le projet vise à comprendre le rôle des mécanismes qui permettent de controler la quantité de cholestérol à l'intérieur de la cellule, dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. Ce syndrome touche environ 10% des femmes en âge de procréer, il conduit à des troubles important de la fertilité et à des symptômes qui, chez certaines patientes, vont affecter leur qualité de vie. Par ailleurs, ces troubles de fertilité conduisent un large nombre de femmes à avoir recours aux techniques de procréation médicalement assistées dans le cadre d'un projet de parentalité. Ceci implique donc le recours à une stimulation hormonale de ces patientes qui présentent un risque clinique identifier d'hyperstimulation dont les conséquences peuvent être très délétaires. Il est important de noter que le risque d'hyperstimulation est très fortement augmenté chez les patientes souffrant du syndrome des ovaires polykystiques. Il a été montré que ces récepteurs jouent un rôle clé dans la réponse à la stimulation hormonale de l'ovaire. L'objectif principal du projet est donc de préciser leurs rôles dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. L'objectif secondaire sera d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la stimulation ovarienne associé à leur dysfonctionnement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mettre en évidence une liste de biomarqueurs prédictifs potentiels d'une réponse anormale à la stimulation hormonale au cours d'un protocole de procréation médicalement assistée. Ces candidats seront par la suite utilisé à des fin de recherche translationnelle pour éprouver leur valeur prédictive en qualité de biomarqueur en clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection sous cutanée quotidienne en position interscapulaire avec un volume de 0,1mL pendant 20 jour > nombre : 20 > durée : intervention de 20 à 60 secondes Injection intraperitonéale jour 21 et 23 avec un volume maximum de 0,15mL > nombre : 2 > durée : intervention de 20 à 60 secondes

Impact sur les animaux

L'induction du syndrome chez la souris, comme dans l'espèce humaine peut conduite à un impact sur la qualité du bien être suite à des épisodes douloureux au niveau ovarien. Les injections sous cutanée peuvent provoquer des zones d'irritations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de protocole pour prélèvements et analyses des tissus.

Remplacement

Les mécanismes qui conduisent à l'émergence du syndrome des ovaires polycystiques doivent être étudier à l'échelle de l'ensemble du tissu ovarien. Cette étude ne peut-être conduite que sur modèle animaux car il n'existe pas à ce jour de modèle alternatif pour modéliser la complexité du SOPK lors de la réponse à une stimulation hormonale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole pour l'ensemble du projet. Ce nombre a été défini en s'appuyant sur les études antérieures menées dans la littérature, ce qui permet d'évaluer la variance attendue dans chaque groupe et d'en définir l'effectif optimal.

Raffinement

Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques (anti-inflammatoires). Des points limites seront mis en place et suivi lors de la visite quotidienne, ainsi que lors des pesée réalisée tous les 2 jours. Un enrichissement renforcé est prévu pour les animaux en protocole (tube cartoné, pad fibres, buchettes de bois). Une manipulation low-stress sera effectué tout au long du protocole (prise en main en coupelle, contention minimale lors des injections, renforcement positif avant le debut du protocole pour habituer les animaux à l'expérimentateur). Les animaux seront hébergés dans des cages par 2 à 4 pour conserver leurs interactions sociales. Les injections seront réalisées par voie intraperitonéale pour les hormones de stimulation, par voie sous cutanée pour l'induction du syndrome ou pour le traitement antalgique. La pesée des animaux sera réalisée toutes les semaines.

Choix des espèces

Les mécanismes qui conduisent au développement du syndrome des ovaires polycystiques et les raisons de la réponse anormale à une stimulation hormonale sont très peu connue. L’accès à du tissu humain est possible, mais limité aux cellules du cumulus produit suite à l'ovulation. L'obtention de tissu ovarien issu de patientes atteintes de ce syndrome est impossible. En effet, ni exérèse, ni prélèvements sur l'ovaire ne sont indiqués dans cette situation clinique. Ainsi, l’exploration phénotypique et la caractérisation des dysfonctionnements sur l'ensemble de l'ovaire ne peut être conduite que sur des modèles animaux. Le modèle souris est celui le plus décrit dans la littérature. Nous utiliserons des femelles post-pubertaires, entre 1 et 3 mois, les animaux doit être en âge de se reproduire au sortir du protocole d'induction du syndrome des ovaires polykystiques.

Pour savoir si la réparation de l'ADN dans les neurones commande la mémoire et si elle peut être ciblée contre la maladie d'Alzheimer, 1 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever des organes et alimenter une biobanque. 1 152 d'entre elles subissent une chirurgie cérébrale de moins de 40 minutes, 360 une infection chronique dont la phase d'invasion provoque un syndrome fébrile de sept jours, et 216 des injections hebdomadaires pendant treize semaines. Toutes passent des tests cognitifs sur quinze jours, dont un labyrinthe de Barnes qui impose un hébergement individuel, et le porteur fixe la mise à mort à deux signes de souffrance parmi perte de poids supérieure à 20 %, déshydratation, léthargie et absence de toilettage. Les bénéfices annoncés restent de l'ordre de "mieux cerner la stratégie thérapeutique de demain", quand la fièvre, les chirurgies et l'isolement sont déjà programmés.

Objectifs

Des modifications épigénétiques notamment liées aux dommages causés à l'ADN jouent un rôle majeur dans les mécanismes liés à l'apprentissage et la mémoire. Dans ce cas, les dommages sont transitoires et efficacement réparés par des mécanismes encore mal compris dans les neurones. Des dérégulations de ces processus épigénétiques, qui aboutissent à leur signalisation chronique contribuent directement aux troubles mnésiques dans la maladie d'Alzheimer (AD), ainsi qu'au cours d'infections. Le projet a pour objectifs de déterminer l’importance de la détection ou de la réparation des dommages dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, ainsi que dans le processus de neurodégénérescence liée à l'AD. L'étude utilisera un modèle trangénique entrainant les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et l'infection subclinique ou l'expression combinée avec un modèle transgénique permettant de modifier le processus épigénétique dans des régions cérébrales d'intérêt.

Bénéfices attendus

Comprendre l'impact d'infections latentes communes (de seroprevalence 30-70% chez l'humain et qui augmente avec l'âge) sur la réponse au traitement contre la maladie d'Alzheimer est un enjeu clé pour mieux définir les stratégies thérapeutiques futures. Comprendre par quels mécanismes le senseur épigénétique contribue au processus mnésiques et à leurs altérations et évaluer par preuve de concept son potentiel thérapeutique contre la maladie d'Alzheimer permettront de mieux cerner ensuite la stratégie thérapeutique de demain concernant sa manipulation.

Procédures

Les interventions concerneront: i) des injections répétées hebdomadairement pendant 13 semaines, sur animaux vigiles (216 souris, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection de l'agent infectieux, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (360 souris, une injection de quelques secondes); iii) un type de chirurgies sous anesthésie générale de moins de 40 minutes par animal ( 1152 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), des processus cognitifs ( toutes les souris (1368), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal), test d'apprentissage et de mémoire spatiale (chaque souris testée une fois pendant 7 jours consécutifs, à raison de 3 essais d'exploration libre sur la table de 3 minutes maximum (selon la performance de l'animal) chacun par jour)), v)un prélèvement sanguin à la veine caudale pour test sérologique (360 animaux, quelques secondes).

Impact sur les animaux

Dans le cas d'infection, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes, où les souris doivent être hébergées individuellement, des mesures d'enrichissiment du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.

Devenir

A l'issue des 3 procédures, les 1368 souris seront euthanasiées par anesthésie profonde et irréversible, afin de réaliser le prélèvement d'échantillons d'organes, pour réaliser des analyses biochimiques, cellulaires ou moléculaires ou réaliser une biobanque.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant aux dommages de l’ADN. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. De plus, seule l'utilisation de l'animal permet d'étudier la coordination des différentes régions du cerveau entre elles. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires lors d'infection et de 12 dans le groupe non infecté. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 2 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe pour obtenir des résultats interprêtables.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 4 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont: perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, absence de toilettage. Les souris sont préalablement familiarisées avec le gel diet dans les jours précédant une chirurgie ou l'infection, ce qui optimise leur convalescence. Les chirurgies seront menées sous anesthésie générale accompagnée d'une analgésie opiacée en périopératoire et maintenue pendant 48h en post-opératoire. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids) . Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Enfin, les tests comportementaux sont choisis et menés en respectant les besoins écologiques des modèles: la recherche spatiale est motivée par récompense positive, les souris sont acclimatés à tous les tests et habituées aux dispositifs au moins une semaine avant chaque test. Les test ne requièrent que mobilité, exploration d'objets.

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel de l'agent infectieux que nous étudions, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques de la réponse aux dommages dans l'ADN des neurones dans le cadre d’une infection pertinente. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés ( modèles exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux pour ces modifications géniques n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieur à 6 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulations sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.