Oncologie

Toutes mises à mort pour des analyses moléculaires et histologiques, 746 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une greffe de cellules sous la peau, puis passe sous le pied à coulisse tous les deux jours pendant quatre semaines, endormie à chaque fois, soit une quinzaine d'anesthésies par animal. La tumeur peut entraîner une perte de poids et des ulcérations cutanées. Le porteur indique avoir déjà obtenu des résultats sur cultures cellulaires en trois dimensions, et conclut qu'il est "nécessaire" de passer à la souris parce que les cultures ne reproduisent pas les échanges entre la tumeur et le reste du corps.

Objectifs

Notre équipe modélise des altérations géniques identifiées dans des cancers et étudie les conséquences moléculaires et cellulaires de ces altérations et leur contribution à l’oncogenèse. Ainsi, dans le contexte des sarcomes, nous avons identifié des altérations génomiques conférant des propriétés oncogéniques in vitro telles que des capacités de prolifération, de clonogénicité et de formation de sphères en trois dimensions accrues. Nous devons valider maintenant nos modèles cellulaires sur un minimum d’animaux pour tenir compte du contexte physiologique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’étudier le rôle de remaniements génomiques dans l’initiation et/ou la progression tumorale de certains sarcomes L’utilisation du modèle in vivo est une étape primordiale dans la compréhension et la détermination de l’implication de ces changements génomiques dans le développement sarcomateux avec la participation du micro-environnement. Ce serait une avancée majeure sur l’étude du développement de ces cancers et, l’identification des voies dérégulées permettrait de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques afin de mieux prendre en charge ses patients. Les traitements actuels n’étant que peu efficaces sur ce type de pathologie.

Procédures

Les animaux vont subir une greffe sous-cutanée de cellules sous anesthésie, cette greffe nécessite une procédure implantatoire de moins de 5 min, le nombre d'animaux concernés est de 746. La croissance tumorale sera suivie par mesure externe au pied à coulisse (tous les 2 jours pendant 4 semaines) chez l’ensemble des animaux anesthésiés, intervention qui durera environ 5 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de stress dû à la contention/préhension des animaux. 2/ un risque mineur d’infection pour les injections sous cutanés. 3/ un risque de stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boîte à induction lors de l’injection et des mesures) et de réveil. 4/ la croissance tumorale peut également induire une perte de poids, des ulcérations et dans de rares cas des douleurs.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté afin de réaliser des analyses moléculaires et histologiques ultérieures nécessaires à la conclusion du projet. La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques.

Remplacement

Les premiers tests ont montré que les modifications du génome jouent un rôle clé dans les sarcomes. Cependant, les cultures de cellules en laboratoire ne sont pas un modèle parfait, car elles ne reproduisent pas les interactions entre la tumeur et le reste du corps. Cela limite leur utilité pour des applications cliniques. De plus, lorsqu’on cultive les cellules en 3dimensions leur capacité tumorale devient encore plus marquée, ce qui montre l’importance de la structuration tridimensionnelle des cellules. Pour confirmer ces premières observations, il est nécessaire de passer à un modèle plus complet : les souris. Les souris avec un système immunitaire incomplet, permettent d'implanter des cellules humaines et d’étudier la formation de tumeurs de manière plus réaliste. Les souris avec un système immunitaire fonctionnel, quant à elles, sont utilisées pour étudier la réponse immunitaire et la croissance des tumeurs dans un système immunitaire fonctionnel. Ces modèles animaux nous aideront à mieux comprendre le rôle des modifications génétiques impliquées dans le développement des sarcomes.

Réduction

La croissance des tumeurs sera suivie de manière régulière pendant toute l’expérience, en mesurant les tumeurs de façon non invasive avec un pied à coulisse tous les 2 jours. Pour analyser les résultats, nous utiliserons un test statistique qui est couramment utilisé dans ce type d'étude. En utilisant un logiciel de calcul statistique, nous avons aussi déterminé qu'il nous faudrait un certain nombre de souris pour que les résultats soient fiables. Nous utiliserons donc des groupes de 8 souris, et répéterons les expériences jusqu'à trois fois si nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Le nombre de souris utilisé dans l'étude sera donc le maximum prévu, et pourra être réduit en fonction des résultats obtenus. L’utilisation de certaines lignées cellulaires permettra aussi de diminuer le nombre de souris nécessaires en utilisant les mêmes groupes témoins.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l’enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de mesures compensatoires et de critères d’arrêt). La croissance tumorale sera suivie par mesure au pied à coulisse ce qui permettra de suivre la croissance des cellules tumorales et d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge rapide. Les animaux recevront des analgésiques et des anesthésiques en pré et/ou postopératoire afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris ayant un système immunitaire incomplet, pour pouvoir greffer des cellules humaines mais aussi des souris avec un système immunitaire intact qui nous aideront à étudier comment ce système interagit avec les tumeurs. Nous choisirons des souris de 8 semaines, car elles permettent une meilleure croissance des tumeurs. De plus, en choisissant de jeunes souris, on évite les problèmes liés à l'affaiblissement des animaux plus âgés.

Une injection de cellules tumorales humaines dans la mamelle, quatre gavages quotidiens, deux séances d'imagerie TEP sous anesthésie et une nuit de jeûne : 30 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de savoir si un traceur radioactif imitant les œstrogènes permet de repérer, sans biopsie, les mutations qui rendent les traitements hormonaux inefficaces. Ces souris sont immunodéprimées pour que la tumeur humaine prenne, ce que le porteur qualifie d'"indispensable" tout en reconnaissant que cet état, qui les expose aux infections, "est considéré comme dommageable". Toutes sont tuées après les examens pour que les tumeurs soient analysées.

Objectifs

Ce projet, réalisé dans 2 établissements utilisateurs, cherche à savoir si un traceur radioactif utilisé en imagerie médicale peut aider à repérer certaines mutations génétiques dans les cancers du sein. Ce produit imite une hormone féminine, appelée œstrogène, et se fixe normalement sur des récepteurs spécifiques dans les cellules cancéreuses. Or, certaines mutations peuvent empêcher ces récepteurs de fonctionner correctement, rendant les traitements hormonaux inefficaces. L'idée est donc de vérifier si ce traceur peut détecter ces mutations sans avoir besoin de faire un prélèvement et ainsi prédire si un traitement hormonal sera efficace ou non pour chaque patiente.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices majeurs, notamment : 1- Mieux prédire l'efficacité des traitements hormonaux : Certaines patientes atteintes d'un cancer du sein reçoivent un traitement hormonal, mais si leur tumeur présente certaines mutations, ce traitement peut être inefficace. Ce projet pourrait aider à adapter le traitement. 2- Éviter des prélèvements invasifs : actuellement, pour analyser les récepteurs aux hormones féminines et détecter d'éventuelles mutations, il faut prélever un échantillon de la tumeur, ce qui peut être douloureux et risqué.

Procédures

Site 1: Les souris recevront une injection de cellules tumorales humaines pour induire un cancer du sein, ce qui prendra environ 10 minutes par souris, sous anesthésie générale. Elles seront gavées 1x par jours pendant 4 jours avec une molécule permettant l'activation des récépteurs aux oestrogènes dans la tumeur, ce qui prends 1 minutes par souris. Elles seront suivies pendant 11 jours et auront 2 examens d’imagerie médicale à J9 et J11, toujours sous anesthésie générale. Site 2: Le premier examen, d’une durée de 25 minutes, servira à détecter la présence du récepteur aux hormones féminines, grâce à une hormone féminine radioactive. Site 2: Après une nuit de jeun, le second examen d’une durée de 25 minutes, permettra d’observer l'activité métabolique de la tumeur, grâce au glucose radioactif. Cette durée de 25-30 minutes comprend l'injection du produit radioactif (5 minutes), l'anesthésie (2 à 3 minutes), l'examen (11 minutes et 20 secondes) et le réveil de l'animal. Site 2: Avant l'examen de l'activité métabolique de la tumeur, un prélèvement sanguin pour mesurer la glycémie sera effectué sur chaque souris, ce qui prendra au maximum 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables prévus sont les suivants : • Douleur liée à l’injection mammaire des cellules tumorales. • Irritation des muqueuses de l'oesophage • Hypoglycémie potentielle due à un jeûne d’environ 12 heures avant l’examen. • Hypothermie potentielle causée par l’anesthésie générale. • Douleur liée au développement tumoral. • Le modèle de souris immunodéprimées est indispensable pour permettre l’implantation de tumeur humaines sans provoquer de rejet. Cette caractéristique est essentielle pour garantir la validité des résultats dans un contexte préclinique visant à reproduire au mieux lce qui est observé chez l’humain. L’état immunodéprimé des souris peut entraîner une vulnérabilité accrue aux infections. Bien que les animaux soient maintenus dans des environnements strictement contrôlés, cette condition est considérée comme dommageable. Cette nuisance est compensée par une surveillance quotidienne rigoureuse et des conditions d’hébergement adaptées, visant à minimiser les impacts sur le bien-être des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après les examens pour permettre l’analyse des tumeurs. Ces analyses sont essentielles pour valider les données obtenues lors des examens d’imagerie.

Remplacement

Les expériences sur les cellules en laboratoire ne permettent pas de reproduire précisément les interactions complexes entre les cellules tumorales, les vaisseaux sanguins et les tissus environnants. L’utilisation d’un modèle vivant est donc nécessaire pour répondre aux questions posées par le projet.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé en fonction d’analyses statistiques basées sur des résultats préalablement obtenus, et des données bibliographiques, afin de minimiser les effectifs nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. De plus, les techniques d'imagerie choisies permettent de suivre les animaux tout au long de l'étude sans avoir à les euthanasier à chaque étape, ce qui réduit considérablement le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront installées dans des cages adaptées, avec de la litière changée régulièrement, un enrichissement (comme des tunnels et du coton), ainsi que de la nourriture et de l’eau à volonté. Elles auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ensuite, une injection sera faite afin que les souris développent une tumeur. Leur état sera suivi de près : on surveillera la taille de la tumeur pour s’assurer qu’elle ne grossisse pas trop, et on vérifiera aussi régulièrement leur poids. À partir du 5ème jour, elles seront gavées avec la molécule qui induit l'expression des récepteurs aux œstrogènes. Ce produit peut induire une déshydratation des souris lorsqu'il est donné dans l'eau de boisson, le gavage permet donc d'éviter cet effet indésirable. Pour les examens d’imagerie, les souris seront anesthésiées afin qu’elles restent immobiles. Elles seront placées sur un lit chauffant pour ne pas avoir froid, et leur respiration et leur cœur seront surveillés en continu. Une fois l’examen terminé, elles resteront sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil. Certains examens demandent aux souris d’être à jeun pendant une nuit. Comme cela peut baisser leur taux de sucre, on vérifiera leur glycémie en prélevant une goutte de sang avant de commencer. Pendant toute la durée de cette étude, nous appliquerons les points limites que nous nous sommes fixés afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Des souris femelles immunodéprimées seront utilisées pour permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Le cancer étudié étant le cancer du sein, il est plus représentatif de la réalité clinique d’utiliser des femelles. De plus, des femelles âgées de 9 semaines ont une glande mammaire suffisamment développée pour garantir une injection correctement localisée.

Les souris de ce projet sont immunodéprimées, pour accepter la greffe de cellules pancréatiques humaines sans les rejeter. Elles sont 872, toutes tuées deux à six mois après la greffe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après destruction de leurs propres cellules bêta, elles subissent une chirurgie de greffe, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales quotidiennes, des prises de sang deux fois par semaine pendant vingt-quatre semaines et des tests de tolérance au glucose de deux heures et demie, avec pour effets attendus des hypoglycémies et une réaction du greffon contre l'hôte pouvant leur faire perdre plus de 20 % de leur poids. Le porteur annonce un modèle plus proche de la clinique humaine et une accélération du développement de thérapies, bénéfices renvoyés au long terme.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui présente deux formes : type 1 (T1D), caractérisée par une absence de sécrétion d’insuline causée par la perte de cellules béta pancréatiques; et type 2 (T2D), caractérisée par une résistance à l’insuline. En 2021, le T1D affectait 9 millions de personnes dans le monde et le T2D plus de 537 millions de personnes (OMS). Le traitement des deux formes de diabète est un enjeu de santé publique majeur, or il n’existe aujourd’hui aucune thérapie curative. Les seuls palliatifs chroniques sont, pour le T1D, l’injection quotidienne d’insuline et, pour le T2D, les approches thérapeutiques diminuant la résistance à l’insuline ou augmentant la sécrétion d’insuline tout en améliorant le profil métabolique. Néanmoins, les traitements actuels restent inefficaces pour soigner durablement les patients. De plus, la qualité de vie des patients reste très impactée (injections quotidiennes, complications, charge mentale) et associée à des risques importants, notamment des épisodes d’hypoglycémie dont certains peuvent être fatals (à une fréquence moyenne de 0.5 à 1 événement par an chez les patients T1D traités). Il est donc indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques comme la modulation de la réponse auto-immune dirigée contre les cellules béta, l’optimisation de la sécrétion d’insuline et l’amplification de la masse de cellules béta endogènes. Le projet présenté vise ainsi à répondre à ces besoins thérapeutiques par le développement d’un modèle animal humanisé translationnel, plus proche de la réalité clinique humaine. L’objectif du modèle est d’accélérer le développement de nouvelles thérapies et de limiter les échecs cliniques. Les objectifs du projet sont : 1) implémentation d’un modèle humanisé avec la greffe de cellules béta pancréatiques humaines productrices d’insuline dans la souris. 2) validation physiopathologique et pharmacologique du modèle : (a) dans le cadre du diabète auto-immun (T1D) : - Etude de la réaction auto-immune contre les cellules béta humaines du modèle, par des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques ou des cellules mononuclées sanguines périphériques (PBMC) humains, - protection par des cellules immunitaires régulatrices humaines, - et étude d’efficacité de composés pharmacologiques visant à renouveler les cellules bêta endogènes, (b) dans le cadre du T2D : - étude d’efficacité de composés pharmacologiques visant à optimiser la capacité sécrétrice d’insuline de cellules béta humaines.

Bénéfices attendus

Le projet proposera un modèle physiologique et translationnel de souris humanisées en termes de cellules béta, insuline et glycémie humaine. Ce nouveau modèle humanisé permettra de modéliser l’attaque auto immune des CD8+ et PBMC et le rôle protecteur de cellules immunitaires régulatrices. Il permettra également d’évaluer dans un contexte physiologique, l’activité de molécules potentiatrices de la sécrétion d’insuline, en développement dans le traitement du diabète de type 2, ou inductrices du renouvellement des cellules béta humaines, en développement dans le cadre du diabète de type 1. De plus, ce modèle murin de xénogreffe de cellules béta humaines pourrait, à plus long terme, permettre de développer des modèles hautement pertinents de diabète de type 2 à travers par exemple des régimes de type High Fat Diet et ainsi d’évaluer les nouvelles approches de lutte contre l’insulino-résistance et l’amélioration du profil métabolique. A plus long terme, les bénéfices attendus sont une accélération du développement de nouvelles thérapies innovantes pour le T1D et T2D et une amélioration des résultats cliniques (diminution des échecs thérapeutiques) par un meilleur criblage thérapeutique lors des phases préclinique.

Procédures

Les animaux seront soumis aux procédures suivantes: - injection intra-péritonéale jusqu'à 1 fois par jour pendant 5 jours, durée 5 min par injection, - prélèvement sanguin, 2 fois par semaine, pendant jusqu'à 24 semaines, durée 5 min par prélèvement, - chirurgie pour greffe de cellules béta pancréatiques humaines, jusqu'à 1 fois par animal, durée 15 min, procédure réalisée sous anesthésie générale, - échographie, jusqu'à 2 fois par animal, durée 30 min, procédure réalisée sous anesthésie générale, - test de tolérance au glucose, incluant 1 injection intra-péritonéale et jusqu’à 10 prélèvements sanguins pour mesure de la glycémie, procédure effectuée jusqu'à 2 fois par animal, durée 2,5 heures par procédure, - administration intra-péritonéale ou intra-veineuses de cellules immunitaires humaines ou de molécules pharmacologiques, jusqu'à 2 fois par animal, durée 5 min par injection.

Impact sur les animaux

Lors de ce projet, les souris pourront être soumises à : - une ablation des cellules béta endogènes, - une chirurgie pour implanter des cellules béta humaines, - une administration de cellules immunitaires humaines ou de molécules pharmacologiques. Plusieurs nuisances doivent être anticipées : A) liées à l’ablation des cellules béta endogènes pouvant générer des épisodes d’hypoglycémie. B) liées à la procédure de chirurgie : - Hypothermie liée à l’anesthésie, - Saignements, douleur et stress liés à la chirurgie. C) liées à la greffe de cellules béta : - pas de douleur attendue liée à la taille de la greffe, la taille attendue restant minime, - possible hypoglycémie due à une trop forte production d’insuline par les cellules greffées pouvant éventuellement générer un état de léthargie. D) liées au suivi de la greffe de cellules béta et à l’administration de cellules immunitaires - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des prélèvements de sang. - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections de cellules immunitaires. - Réaction immunitaire de la greffe contre l’hôte (GvHD). Les symptômes de la GvHD sont une perte de poids (>20%), une posture courbée, un pelage hérissé et une perte d’activité, - Hypoglycémie transitoire. E) liées au molécules pharmacologiques administrées - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections de molécules pharmacologiques. - Les molécules pharmacologiques qui seront utilisées sont des peptides et molécules connus et n’ont pas d’effet secondaire grave décrit chez la souris.

Devenir

Les animaux utilisés pour la mise en place du modèle diabétique seront euthanasiés 2 mois après la procédure, ce qui est le temps nécessaire pour confirmer le développement du diabète. Les animaux utilisés pour la greffe de cellules béta humaines puis pour l’évaluation de leur rejet et de leur protection seront euthanasiés au plus tard 6 mois après la greffe, ce qui est le temps nécessaire pour obtenir les résultats sur la survie, le rejet et la protection des cellules béta humaines.

Remplacement

Les expériences prévues dans ce projet ne peuvent pas être transposées efficacement dans un système in vitro tout en garantissant d’apporter des informations physiologiques pour les raisons suivantes : - Le projet vise à développer un modèle complexe multicellulaire humain d’une maladie métabolique incluant notamment des régulations faisant intervenir plusieurs tissus ; - L’objectif est d’évaluer l’impact de cellules immunitaires et de molécules effectrices sur la fonction de cellules béta humaines et sur leur capacité à maintenir une glycémie normale dans un environnement métabolique complet (foie, muscle, système digestif).

Réduction

Le principe de réduction du nombre d’animaux a été appliqué en premier lieu en se basant sur des résultats d’études similaires précédentes afin d’estimer statistiquement les nombres d’animaux nécessaires. Par ailleurs, pour les expériences de mise au point de protocoles, les nombres d’animaux nécessaires ont été estimés en se basant sur notre expérience de ce type d’approches. Le nombre de conditions expérimentales à comparer a également été calculé afin d’obtenir les résultats avec le nombre le plus faible possible d’animaux. Enfin, nous procéderons par étapes et conclusions intermédiaires afin, à nouveau, d’éliminer toute utilisation inutile d’animaux. Un second aspect de la réduction du nombre d’animaux est que les personnes qui effectueront les expérimentations seront précisément formées et habituées à chaque procédure afin de réduire au maximum le risque d’échecs mais aussi de nuisance pour les animaux et ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés. Enfin, nous procéderont dans toutes nos étapes à une surveillance des animaux pour les nuisances possibles, de façon à les minimiser et ainsi garantir une reproductibilité optimale de nos résultats et, en conséquence, une diminution du nombre de répétitions des expériences et ainsi du nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

La démarche de raffinement de ce projet implique : - personnel précisément formé aux procédures afin de limiter les nuisances ou la survenue de complications, - surveillance des nuisances possibles à toutes les étapes afin de minimiser les effets néfastes et la souffrance. Des échelles de scoring seront utilisées pour évaluer le bien-être et prendre des actions au plus tôt. Différentes actions seront menées : - Afin de réduire le stress, les animaux seront reçus et acclimatés pendant au moins 5 jours avant une procédure. - Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets pour enrichir leur environnement. - Pour la chirurgie, avant la procédure, les animaux recevront un analgésique. Puis une anesthésie par isoflurane. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera utilisé et l’animal couvert. Dans la phase de réveil, celui-ci sera placé dans une cage en isolation dans un environnement chauffé et monitoré pour sa température corporelle, hydratation, absence de douleur, et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, une analgésie sera administrée en préventif pendant 3 jours, le jour de la chirurgie inclus, 2 fois par jour espacé de 12h. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées (10 jours après la chirurgie). Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les conditions classique A2 et surveillé tous les jours. L’apparition des points limites sera surveillée avec observation des signes d’hypothermie, de douleur, stress, perte d’activité, déshydratation ou absence de prise de nourriture, perte de poids, infection ou ulcération de la plaie. Si un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il n’est pas possible de rétablir ou soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée. Nos procédures impactant la glycémie, des mesures, 2 fois par semaine, seront réalisées afin d’anticiper d’éventuels effets indésirables et les actions pour en minimiser les effets appliquées. Notamment dans le cas d’hypoglycémie (insulinome, mort des cellules béta), du sucrose sera fourni dans l’eau. Si un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal, et l’euthanasie appliquée s’il n’est pas possible de soulager l'animal.

Choix des espèces

Le choix du modèle mus musculus est lié à la praticité du modèle (taille, accessibilité) et à la disponibilité d’animaux immuno-déprimés qui favorisent l’implantation de cellules humaines ainsi qu’aux données déjà publiées sur ce type d’approches. Plus spécifiquement, le choix du modèle mus musculus est lié à l’existence de modèles publiés de greffe des cellules EndoC-bH® ainsi que d’injection de lymphocytes T ou de PBMC pour induire le rejet de greffe de cellules béta humaines. Les souris qui seront utilisées seront âgées d’entre 6 et 9 semaines au moment de l’ablation des cellules bêta endogènes. Ceci afin que les implantations de cellules EndoC-bH®, prévues 1 à 4 semaines après, soit faites sur des souris âgées de 7 à 13 semaines soit un âge permettant que l’animal ne soit pas trop petit afin de faciliter la chirurgie, tout en garantissant que les animaux seront adultes sans être trop âgés en fin de protocole soit jusqu’à 6 mois après l’implantation initiale de cellules béta.

6 312 souris mâles génétiquement modifiées pour développer des lésions précancéreuses de la prostate vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant cinq injections en une semaine et jusqu'à trois prélèvements sanguins. Certaines sont suivies jusqu'à deux ans et voient leurs lésions évoluer vers des tumeurs volumineuses, avec douleur abdominale, posture voûtée et perte de poids parmi les signes attendus. Le point limite retenu est une prostate de la taille d'une bille à la palpation, qui déclenche la mise à mort. Toutes sont tuées pour prélever la prostate et d'autres organes, le bénéfice avancé se limitant à démontrer l'intérêt des neutrophiles comme marqueur diagnostique ou comme cible thérapeutique.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure caractérisation de la progression des tumeurs est donc requise afin d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate développés au laboratoire sont basés sur l’expression de la recombinase chimérique Cre-ERT2 dont l'activité est induite par le tamoxifène dans l’épithélium prostatique, afin d'inactiver à l’âge adulte le gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines (Pten). Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme [4]. À noter que l'inactivation de Trp53 dans les cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN permet de lever la barrière de sénescence, accélère le développement d'adénocarcinomes et favorise l'apparition de tumeurs sarcomatoïdes métastatiques. De plus, la perte de l'expression du récepteur à la vitamine D (VDR) favorise le developpement de métastases et de tumeurs aggressives. De récentes études, dont les notres, suggèrent un rôle important des neutrophiles, des cellules myéloïdes du système immunitaire, dans la tumorigènese prostatique. Cependant, peu d'information sont disponible sur leur hétérogénité au cours de la tumorigénèse, ni sur l'efficacité de les cibler, voire de les utiliser comme biomarqueur. L'objectif de ce projet est de déterminer en utilisant des technologies innovantes si les neutrophiles contribuent à la progression des lésions précancéreuses de la prostate induites par injection de tamoxifène. Ce projet ce déroulera dans deux Etablissement Utilisateur.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate est un des cancers masculins les plus fréquents et meurtriers, notamment en raison de limite d’efficacité pour les traitements et les options diagnostiques. Ce projet vise à démontrer l’intérêt des neutrophiles comme nouvel outil diagnostique et comme cible thérapeutique pour ces cancers réfractaires.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections réalisées au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance) (EU1). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur des animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours (EU1). Une injection prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris (EU2). Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris. Un sous groupe subira sous anethesie générale, une injection suivi du sacrifice (EU1). (maximum 5 minutes sous anethesie gazeuse). Des cohortes independantes seront injectées avec le radiomarqueur et anesthésiées au maximum 3 fois (30 min max) (EU2). Des cohortes indépendantes seront traitées (10 secondes de contentions) 2 fois par jour pendant une semaine (EU2).

Impact sur les animaux

Suite à l'injection, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection, dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Lorsque les souris transgéniques développeront les lésions précancéreuses (PIN), à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. Dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris, dans ce cas une administration de solution saline sera réalisée. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement. Des secheresses ophtalmiques peuvent apparaitre au cours de l'anesthésie, dans ce cas un gel ophtalmique sera appliqué.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. De plus, les études longitudinales chez l'homme ne sont pas ethique puisqu'elle nécessite des biopsies à répétition. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points de cinétique ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. L’hétérogénéité des résultats des expériences antérieures demande des cohortes de 20 animaux par point de cinétique, ce qui justifie l’utilisation des test statistiques paramétriques. Afin d’obtenir des résultats significatifs, un nombre d’animaux utilisés par condition (d’un génotype donné à un âge donné) a été calculé en fonction de la différence attendue et de l'hétérogéneité observée. Dans ces conditions, on aura besoin de 20 animaux par groupe. La tomographie par émission de positrons (TEP) est un examen d'imagerie en médecine nucléaire qui est peu invasif, les quantités de produits injectées sont de l’ordre de 0,01 mg/Kg ce qui est extrêmement faible et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.

Raffinement

Pour l’ensemble des animaux, des points limites stricts et spécifiques au projet seront utilisés. Les points limites de l’expérience seront un volume de prostate après palpation de la taille d'une bille et le poids de la souris. Si la prostate devient volumineuse, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est trop importante ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Lors de l'anesthésie, une secheresse occulaire et une diminution de la temperature corporelle peut apparaitre. Aucun effet secondaire n'a été rapporté pour les molécules utilisées dans cette étude. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Enfin, nous procéderons à une habituation à la contention pour les injections intraperitoneales (IP). Lors des examens d'imagerie, un gel ophtalmique est appliqué pour éviter le dessèchement oculaire et une injection sous cutanée de NaCl à température corporelle est réalisée pour éviter la déshydratation. De même, la température rectale et la fréquence respiratoire sont monitorées en continu à l'aide d'une sonde rectale et d'un capteur de pression posé sur le thorax. Pendant les séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée afin de maintenir la température corporelle et anesthésiés à l'isoflurane (air ambiant). La durée d'analyse par imagerie est restreinte au maximum (3 semaines max par souris). Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des effets de la pathologie. Le transport se fera dans un vehicule adapté dans des cages de transcports adaptées et enichies afin d'assurer la sécurité des animaux (en terme de manipulations, d’équipements utilisés, moyens de transport, conditions de transport). De plus, ils seront manipulés en évitant tout effrayement.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans les gènes Pten, Trp53 et VDR le plus fréquemment impliqués dans les cancers de la prostate humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à la prostate qui est un organe qui termine son developpement post-puberté.

900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une injection de cellules tumorales dans le pancréas sous anesthésie, cinq prises de sang hebdomadaires, cinq à sept injections, deux gavages et une biopsie de l'extrémité de la queue. Un régime riche en graisses leur fait atteindre 45 à 50 grammes, ce que le porteur décrit comme un surpoids sans autre trouble métabolique, et une mise à jeun de six heures leur impose une faim qualifiée de gêne modérée. Toutes sont tuées pour l'analyse des tumeurs et des organes, le porteur soulignant que chaque souris fournira de nombreuses données. L'objectif reste descriptif, cartographier les sous-populations de macrophages associés aux tumeurs du pancréas chez des souris obèses ou non, l'identification de cibles thérapeutiques étant renvoyée à un "but ultime".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier l’impact de l’obésité sur l'hétérogénéité des macrophages associés aux tumeurs, leurs fonctions pro et anti-tumorales ansi que l’efficacité d’immunothérapies déjà existantes. Le but ultime est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants. Il a été établi depuis des décennies que l’abondance des macrophages dans les tumeurs était un marqueur de pronostic pour les patients atteints de cancer et ce quel que soit le cancer considéré. En clair, plus la tumeur contient de macrophages, plus le pronostic est mauvais. De plus, il est cliniquement établi que l'obésité est un facteur de risque de cancer. Mais ces observations cliniques restent en grande partie inexpliquées en raison de notre méconnaissance des fonctions des macrophages associés aux tumeurs. Récemment, les approches analytiques sur cellules uniques ont révélé une très grande plasticité des macrophages dans les tissus sains mais également dans les tumeurs avec la coexistence de diverses sous-populations macrophages. L’objectif principal de ce projet est la caractérisation des phénotypes et fonctions de ces cellules dans différents modèles murins de cancer, obèses ou non. La cartographie des macrophages associés aux tumeurs murins sera ensuite utilisée pour analyser les données humaines existantes afin d’identifier ces différentes sous-populations et mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’étudier l’impact de l'obésité sur l’identité et les fonctions des macrophages associés aux tumeurs. Le but ultime est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces pour le cacner du pancréas que ceux existants.

Procédures

Injection de cellules dans le pancréas sous anesthésie générale et analgésie (n=1, durée 10 minutes). Les animaux auront une prise de sang par semaine (n=5, durée 1 minute) sous anesthésie locale. Certains pourront avoir des prélèvements de sang pour mesure de la glycémie (n=5) après biopsie d'un fragment terminal de la queue, sous anesthésie locale. Les animaux auront entre 5 et 7 injections sous anesthésie locale (durée 10 secondes). Il seront mis à jeun 6 heures, et subiront 2 gavages vigiles (durée 10 secondes). Les animaux recevront des régimes riches en graisses, ce qui va occasionner un surpoids sans effet sur la tension pendant la durée de la procédure.

Impact sur les animaux

Les modèles génétiques ont déjà tous été étudiés et ne présentent pas de phénotype dommageable pour les animaux. Injection de tumeurs: les modèles de tumeurs que nous utiliserons dans ce projet peuvent occasionner de la douleur et une perte d'appétit. Régime riche en graisse : les souris vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines (pour arriver jusqu’à 45-50 grammes) et devenir un peu moins actives. Ces régimes n'induisent pas d'autres maladies métaboliques comme le diabète ou l'hypertension pendant la durée de régime. Nuisances dues aux tests d’homéostasie glucidique: - Injection sous anesthésie locale: impact léger dû à la contention - Mise à jeun de 6 heures: Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une gêne modérée due à la sensation de faim. - Gavage : stress léger et de courte durée dû à la contention et à la sonde de gavage. Nuisances dues aux prélèvements de sang : douleur locale et temporaire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyse des tumeurs et organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans les tumeurs dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). Pour étudier le développement tumoralréaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans sa globalité le comportement des macrophages du foie soumis à différentes régimes. Notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expériementaux est réduit à son minimum pour pouvoir tirer des conclusions solides des expériences proposées. Un calcul de puissance a permis de déterminer le nombre d'animaux par condition. De nombreux tissus et cellules, dont certaines rares comme les macrophages par exemple, seront collectés après euthanasie, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et transcriptomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.

Raffinement

Des examens cliniques seront effectués quotidiennement. . En ce qui concerne la manipulation des souris, celles-ci disposeront de suffisamment de temps pour s'acclimater à leur nouvel environnement. Nous appliquerons des méthodes visant à réduire le stress induit par la manipulation des souris, par exemple en évitant de les manipuler par la queue. Les procédures seront effectuées dans un environnement stérile et des mesures appropriées seront prises pour éviter les infections post-procédure. L'anesthésie et l'analgésie seront pratiquées pour chaque intervention pour réduire le stress et la douleur. Dès que les souris montrent de l'inconfort, la fréquence de surveillance sera augmentée et des mesures seront prises pour soulager le stress/la douleur. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme - Modèles de « fate-mapping » performants et originaux - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est adaptée pour étudier l’immunité et l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines.

Pour vérifier si une barrière lumineuse détourne les anguilles des turbines d'une usine hydroélectrique de la Garonne, 480 anguilles argentées de plus de 50 cm vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturées à l'épuisette par des pêcheurs professionnels, elles reçoivent sous anesthésie un émetteur radio glissé dans la cavité abdominale par une incision ventrale de 1,5 à 2 cm, restent hors de l'eau une trentaine de secondes à trois minutes le temps du marquage et de la biométrie, puis sont toutes relâchées vivantes dans le milieu naturel après réveil. La stabulation avant marquage reste sous les dix heures, le porteur indiquant qu'un séjour plus long favorise le stress et l'apparition de pathologies externes. L'espèce est classée en danger critique d'extinction, et le porteur indique que l'effectif de 160 individus par an sur trois ans repose sur le retour d'expérience d'autres études, "non nécessairement lié à un modèle statistique précis".

Objectifs

L’anguille européenne (Anguilla anguilla) est un poisson migrateur amphihalin (passage eau salé eau douce) classé en danger critique d’extinction. Pour sa sauvegarde, un plan de gestion national a été validé en 2010 à la suite de la mise en place d'un règlement européen du conseil du 18 septembre 2007 instituant des mesures de reconstitution du stock d'anguilles européennes. L’objectif du Plan de gestion est de répondre au règlement européen en mettant en œuvre des mesures de gestion augmentant l’échappement en anguilles argentées des bassins versants. Sur celui de la Garonne, de nombreuses actions sont menées pour la protection de cette espèce. En effet, ce fleuve et ses affluents constituent un axe privilégié pour la colonisation de l'anguille qui est une espèce catadrome, c’est-à-dire une espèce qui vit et grandit en eau douce et se reproduit en mer. Elle effectue donc sa migration de dévalaison au stade adulte. Dans un premier temps l’impact des ouvrages hydroélectriques sur la mortalité des anguilles lors de la dévalaison a été évalué, afin de proposer des mesures de gestion adaptées. En effet, ces ouvrages ont un impact majeur sur la mortalité des populations d’anguilles lié au passage d’individus dans les turbines. Le projet vise à étudier le comportement de cette espèce lors de sa migration au droit d’un barrage hydroélectrique équipée d’une barrière lumineuse et de tester son efficacité pour dévier les individus se dirigeant vers les turbines vers le déversoir du barrage. Pour ce faire, nous suivrons le comportement des anguilles dans leur phase argentée, c’est-à-dire lorsqu’elles sont prêtes à retourner dans l’océan pour effectuer leur migration de reproduction.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter des connaissances sur le comportement des anguilles au droit de cette usine hydroélectrique lors de sa phase de dévalaison et tester l’efficacité d’une barrière lumineuse pour augmenter le taux d’échappement des individus aux turbines qui équipent le site. Ce système peut potentiellement s’avérer efficace sur cet ouvrage et, le cas échéant, permettre d’éviter d’autres solutions techniques (grilles fines) qui, tout en étant possible, seraient beaucoup plus difficile à mettre en place.

Procédures

480 anguilles seront capturées par des pêcheurs professionnels. Elles seront pêchées par épuisette dans les bassins d’hébergement (la capture dure moins de 30 secondes) puis marquées avec un émetteur radio (maximum 3 minutes) adapté à la taille des individus, sous anesthésie et analgésie. Les anguilles seront ensuite placées dans des bassins de réveil (le réveil se fera en quelques minutes) puis relâchées dans le milieu naturel à l’issue d’une dernière pêche par épuisette (la pêche va durer moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

L’insertion des émetteurs radio et la réalisation des biométries induira une douleur modérée par l’acte chirurgical. Les poissons subiront également un stress engendré par la pêche dans les bassins de stabulation, l’anesthésie et un temps d'émersion d’environ 3 minutes pendant l’ensemble de ces opérations : marquage et biométrie. La somme des nuisances attendues lors de cette procédure est classée modérée.

Devenir

Tous les poissons marqués seront conservés vivants et relâchés dans le milieu naturel.

Remplacement

L’objectif étant de tester le comportement des anguilles dévalantes au droit de l’usine hydroélectrique et l’efficacité de la barrière lumineuse vis-à-vis de cette espèce, il n’est pas possible d’appliquer la règle du remplacement. Il est donc indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (anguilles jaunes de plus de 50 cm et argentées) afin d’obtenir des données pertinentes.

Réduction

L'objectif du projet est d’enrichir les connaissances scientifiques sur le comportement de la migration de dévalaison des anguilles argentées. L’objectif de marquer 160 anguilles par an (480 au total sur les 3 années) pour rendre compte des variabilités intraspécifique et les paramètres environnementaux impliqués dans la phase de migration (saisonnalité, débit, température, blocages…). Ce nombre a été défini en fonction du retour d’expérience sur d’autres expérimentations, et non nécessairement lié à un modèle statistique précis.

Raffinement

Les anguilles sont transportées sur le site d’expérimentation par des pêcheurs professionnels après capture. Les camions, équipés de cuves remplies d’eau de rivière et alimentées en oxygène sont adaptés au transport d’animaux vivants, et le personnel formé au transport. Le contrôle de l’état des poissons et du taux d’oxygène se faire tout au long du transport. Un couvercle sera disposé sur les bacs pour limiter le stress des anguilles. L’anguille, étant une espèce qui se déplace surtout la nuit, est facilement stressée par la lumière du jour. L’observation des anguilles pendant la phase de réveil ou de stabulation se fait en soulevant le couvercle des bacs. La stabulation des individus a lieu pendant un temps réduit (moins de 10h) afin de réduire le stress et le développement de pathologie externe, qui peuvent intervenir dans des conditions de stress trop importantes. Des lots de 10 anguilles maximum sont ensuite prélevées à l’aide d’épuisette nylon de maille 1,5 mm pour ne pas abimer les anguilles, pour être placées dans un bac noir avec couvercle contenant l'anesthésiant. L’eau est claire et une vérification des différentes phases de l’anesthésie des individus est effectuée. Le stade d’anesthésie recherché est l’immobilisation. Une fois anesthésiée, les marques seront introduites dans la cavité abdominale par une incision, de 1.5 à 2 cm, réalisée sur la face ventrale de l’anguille, au niveau de la partie postérieure de l'intestin. L'antenne est ressortie à l'aide d'un trocart de petite taille (aiguille à insuline), introduite dans l'animal à quelques mm de l'incision. La plaie sera suturée par 2-3 points simples. Une injection d'un analgésique sera effectuée pour réduire la douleur post opératoire au droit de l'incision. Ensuite les individus seront placés dans une cage de réveil placée dans l'eau, ils seront observés par observation visuelle directement depuis la surface. Les anguilles sont surveillées en vérifiant la ventilation et le retour rapide à un comportement normal et une reprise d’équilibre. La grille de suivi des signes cliniques est utilisée afin de noter toute observation sur les individus. Le marquage prend au maximum 3 mn par individu. Une vigilance des opérateurs sera apportée au raffinement dans toutes les étapes de la procédure : du marquage au réveil et lâcher aprés acclimatation.

Choix des espèces

L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et la cinétique de dévalaison des anguilles au droit d’un obstacle, il est indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (anguilles argentées). Nous utiliserons les anguilles argentées de plus de 50 cm afin d’analyser les cinétiques de migration de dévalaison et le comportement au droit d’un obstacle hydrauélectrique équipé d’une barrière lumineuse dont le but est d’éviter le passage dans les turbines des individus lors de la dévalaison.

Gavées chaque jour pendant 75 jours, soumises à quatorze prélèvements de fèces de vingt minutes chacun, puis à un test de tolérance au glucose de trois heures, 160 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le régime riche en graisses et en sucres qui leur est imposé doit provoquer l'obésité, avec une mobilité réduite et un risque de dermatites et d'ulcérations cutanées. Le porteur signale aussi un risque de lésion de l'œsophage lié au gavage quotidien, et annonce deux tests d'évaluation de l'anxiété de vingt minutes sans préciser lesquels. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever l'intestin, le foie et le cerveau, afin de mesurer l'effet de probiotiques et de prébiotiques sur le microbiote intestinal.

Objectifs

L'épidémie d'obésité qui sévit à travers le monde (15,7 % des Français sont considérés obèses) est liée à une augmentation de la prévalence des maladies métaboliques, telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. Au cours des dernières décennies, la recherche s’est tournée vers l’analyse du microbiote intestinal et de nombreuses publications ont démontré un rôle important de la dysbiose microbienne dans le développement des maladies métaboliques et inflammatoires. 38 000 milliards de bactéries vivent dans le microbiote et interagissent avec l'hôte, ce qui équivaut à plus de 100 fois le nombre de cellules de l'organisme humain. D'après l'ISAPP, l'International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics : " Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte". "Les prébiotiques sont des substrats qui sont utilisés sélectivement par les microorganismes de l'hôte, conférant un bénéfice pour la santé." Les prébiotiques et les probiotiques jouent des rôles complémentaires importants pour la santé intestinale. Il a été prouvé par plusieurs études que les probiotiques et les prébiotiques ont un rôle essentiel dans la gestion de l'obésité. Les probiotiques et les prébiotiques ont amélioré les niveaux de leptine et d'enzymes hépatiques liés à l'obésité. Les probiotiques et prébiotiques agissent en supprimant l'inflammation, en renforçant la barrière intestinale, en régulant l'activité des enzymes intestinales et la fonction neuroendocrine, affectant ainsi le stockage et la dépense énergétique. L'impact des modifications au niveau du microbiote peut agir directement sur l'axe intestin-cerveau. L'objectif de notre projet est de mettre en lumière l'importance de nouveaux probiotiques et des prébiotiques en tant que stratégie complémentaire pour traiter l'obésité, en agissant sur le microbiote intestinal, l'homéostasie intestinale ainsi que l'axe intestin-cerveau.

Bénéfices attendus

Pour évaluer l'efficacité des probiotiques ou des prébiotiques contre l'obésité en analysant les modulations du microbiote intestinal, il est impératif d'utiliser un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro ne peut remplacer la richesse du microbiote intestinal. A travers ce modèle, on peut tirer plusieurs bénéfices tels que : 1-Trouver des prébiotiques et probiotiques capables de réduire l'obésité chez la souris. 2-Observer une diminution des biomarqueurs liés à l'obésité. 3-Mettre en évidence des changements bénéfiques dans la composition du microbiote intestinal, avec une augmentation de l'abondance relative des bactéries bénéfiques. 4- Etudier l'impact des traitements sur l'axe intestin-cerveau. Nous espérons ainsi démontrer l'efficacité des prébiotiques et ainsi que des probiotiques pour la perte de poids et la normalisation de certains paramètres métaboliques tout en décryptant les mécanismes potentiels par lesquels les probiotiques et prébiotiques peuvent influencer la composition corporelle et le métabolisme.

Procédures

Gavages quotidien pendant 75 jours, qui dure moins de 30 seconde par souris. Prises de feces 14 fois pendant le protocole qui dure 20 min par prise. Test de tolérance au glucose, réalisé une seule fois et qui dure 3h avec une seule injection d'insuline. Test de tolérance à réalisé une seule fois pendant le protocole, avec une seule injection d'insuline. Deux tests d'évalution de l'anxiété chaque test dure 20 minutes par souris.

Impact sur les animaux

1 Le stress causé par le gavage quotidien, ainsi que le risque d'endommager l'œsophage. 2 Lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline , les injections peuvent entraîner de la douleur et de l'inconfort. Il est possible que ces procédures provoquent de l'irritation péritonéale. 3 L'obésité est le résultat d'une prise de poids excessive causée par un régime riche en graisses et en sucres. Cela va provoquer : • Une diminution de la mobilité due à un excès de poids. L'excès de sébum accroît le risque de lésions cutanées telles que les dermatites et les ulcérations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour réaliser les différentes analyses sur les organes tels que l'intestin, foie et cerveaux.

Remplacement

On a effectué une phase in vitro. L'impact des prébiotiques ainsi que de nouvelles souches potentiellement probiotiques a été testé in vitro. En analysant le spectre antimicrobien, la résistance aux enzymes, le pH et l'impact sur des cellules in vitro, on peut évaluer leurs effets anti-inflammatoires. En effectuant cette étape, on peut réduire le nombre de prébiotiques et de probiotiques utilisés pour la partie in vivo. Seuls les candidats ayant un impact sur la flore, une diminution de l'inflammation et une réduction de l'oxydation seront utilisés pour la partie in vivo. D’autre part, l'étude du microbiote intestinal nécessite obligatoirement l'utilisation d'un modèle animal puisqu'il est impossible de reproduire, in vivo , la structure écologique, constituée par des milliards de bactéries représentant 1000 espèces bactériennes majoritairement incultivables.

Réduction

Pour optimiser le nombre d'animaux nécessaires, on utilise les analyses statistiques standards. Il y aura que 8 animaux dans chaque groupe expérimental. Le nombre d’animaux a été optimisé via des méthodes statistiques standards. Dans le contexte de l'expérimentation animale, l'utilisation de tests statistiques appropriés peut contribuer à réduire le nombre d'animaux requis, tout en maintenant la validité scientifique de l'étude.

Raffinement

Amelioration de l'enrichissement par:. 1. Cylindres en plastiques : Ces cylindres offriront aux souris des possibilités supplémentaires d'exploration et de cachette, stimulant ainsi leur comportement naturel. 2. Bâtonnets à ronger : Ces bâtonnets permettront aux souris de satisfaire leur besoin naturel de ronger, contribuant à leur bien-être dentaire et comportemental. 3. Matériel de nidification supplémentaire : Nous fournirons des morceaux de coton supplémentaires pour permettre aux souris de construire des nids plus élaborés. Pour réduire le stress des animaux lors des manipulations, nous mettrons en place un protocole de pré-entraînement qui comprendra les étapes suivantes : 1. Habituation à la manipulation : Nous manipulerons doucement les souris pendant de courtes périodes (30 secondes à 1 minute) pendant la semaine précédant le début des procédures expérimentales. Cela permettra aux animaux de s'habituer au contact humain. 2. Simulation de procédures : Nous simulerons certaines procédures non invasives, comme le pesage ou le placement dans la cage de gavage, sans effectuer réellement ces procédures. Cela aidera les souris à se familiariser avec ces situations. 3. Exposition progressive aux équipements : Nous introduirons progressivement les équipements utilisés lors des procédures (comme les sondes de gavage) dans l'environnement des souris, sans les utiliser, pour réduire leur caractère anxiogène. Pour améliorer les conditions de vie des animaux en captivité et réduire les sources de stress, nous mettrons en place les mesures suivantes : 1. Surveillance documentée pendant les procédures expérimentales : • Mise en place de fiches de suivi individuelles pour chaque animal • Observation et enregistrement des signes spécifiques : • Poids • Présence de lésions cutanées • Comportement (isolement, posture inhabituelle, piloérection) • Consommation d'eau et de nourriture • Qualité du pelage • Mobilité 2. Protocole d'action en cas de détection de signes de détresse ou de malaise : • Consultation immédiate du vétérinaire responsable • Administration d'analgésiques si nécessaire • Ajustement des conditions d'hébergement (ex : isolation temporaire, enrichissement supplémentaire)

Choix des espèces

Les études sont réalisées sur des souris car il s’agit du modèle expérimental chez l’animal le plus utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude des effets induits par l'obésité en modèle riche en gras et sucres. La souris est un modèle remarquable pour étudier l'obésité, les animaux qui développent une inflammation et une résistance à l'insuline. En outre, nous avons mis au point tous les outils et techniques nécessaires pour mener à bien cette étude lors de nos travaux antérieurs sur ce modèle Le début des traitements à 6 semaines coincide avec le début de maturation de la flore intestinale.