Oncologie

Une greffe de tumeur sous la peau puis huit injections dans l'abdomen : 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour les analyses histologiques et la mesure de la progression tumorale. Le développement de la tumeur peut entraîner une perte de poids. Il s'agit de tester un anticorps dirigé contre une protéine appelée LVRF sur des tumeurs de médulloblastome, cancer cérébral de l'enfant, l'effectif de chaque groupe étant calé pour obtenir 80 % de chances d'un résultat statistiquement significatif. Les souris appartiennent à des lignées immunodéficientes, retenues parce qu'elles laissent se développer des cellules humaines greffées, et le porteur affirme qu'aucun système ne reproduit aujourd'hui la complexité du médulloblastome hors de l'animal vivant.

Objectifs

L’objectif est de tester in vivo l'efficacité d’un anticorps (anti-LVRF) sur la progression de tumeurs de médulloblastome. La validation in vivo de l'efficacité de ce composé sur le développement de la tumeur pourrait permettre la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les médulloblastomes.

Bénéfices attendus

Les médulloblastomes sont les tumeurs cérébrales malignes les plus fréquentes chez les enfants. Ils représentent 20% des tumeurs du système nerveux central chez l'enfant. Malgré les traitements standards (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie), la plupart des patients récidivent. Le taux de survie à 5 ans varie de 80% à 50%. Il est donc important de proposer aux patients de nouveaux traitements médicamenteux pour améliorer le résultat clinique. La validation in vivo de l'efficacité d'un traitement ciblant la protéine LVRF permettrait la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les médulloblastomes.

Procédures

Les 40 animaux recevront une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de médulloblastome (une seule intervention de 1 minute environ). Chaque animal recevra également un total de 8 administrations par voie intra-péritonéale (30 secondes/administration).

Impact sur les animaux

La manipulation, contention des animaux, les injections de cellules, d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. Le développement tumoral est susceptible d'entraîner une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie, pour les analyses histologiques ou de progression tumorale.

Remplacement

L'efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments sur la croissance tumorale des médulloblastomes nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique des médulloblastomes. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenu in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d'une grille de score. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal. Pour le bien- être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Les cages pourvues de couvercles filtrants seront disposées dans une armoire ventilée.

Choix des espèces

Le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. L'utilisation de lignées murines immunodéficientes permet la transplantation de cellules d'une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d'une espèce différente (souris). Les tumeurs de médulloblastome générées dans ce modèle animal sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 5 semaines et utilisées à l’âge de 6 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ces modèles physiopathologiques.

4 200 souris vont être utilisées par groupes de sept, chaque expérience étant répétée trois fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs poumons. Une partie reçoit des cellules tumorales pulmonaires par voie intraveineuse, une autre une injection intrapéritonéale hebdomadaire pendant dix semaines d'une molécule chimique qui déclenche un cancer du poumon, avec pour effet possible une gêne respiratoire. Le porteur décrit l'enjeu comme la compréhension du rôle d'un type de globule blanc, les cellules lymphoïdes innées 3, dans l'efficacité d'une chimiothérapie, le bénéfice pour les patients étant renvoyé au long terme. Le seuil de mise à mort est fixé à un score de 8, ou de 4 pendant trois jours d'affilée, la mise à mort se faisant par dislocation cervicale.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Plusieurs études se sont déjà attachées à identifier le rôle des différents globules blancs au cours d’un cancer et d’autres études ont montré que la chimiothérapie pouvait moduler les proportions des différentes populations de globules blancs. Il a été montré que l’efficacité du cisplatine dans le cancer du poumon chez la souris est dépendante d’un certain type de cellules immunitaires, les cellules lymphoïdes innées 3 (ILC3). Les ILC3 possèdent une protéine d’intérêt, qui est aussi retrouvé dans deux autres types de globules blancs. Les ILC3 pourraient être à l’origine de structures qui permettre une meilleure réponse immunitaire anti cancéreuse. Ainsi, nous voulons étudier dans un premier temps le rôle des cellules exprimant la protéine d’intérêt sur l’induction de la formation de ces structures après traitement par chimiothérapie grâce à des souris ne possédant pas du tout cette protéine dans un modèle de cancer du poumon. Par la suite, nous voulons étudier uniquement le rôle des ILC3 dans l’induction de ces structures. Pour cela, nous allons utiliser des souris possédant la protéine d’intérêt uniquement dans les ILC3 permettant leur étude précise.

Bénéfices attendus

Le cancer est un problème de santé public majeur. Il est donc nécessaire de trouver des traitements efficaces et bien supportés par le patient. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Les animaux reçoivent les cellules tumorales du cancer du poumon non à petites cellules murin en intra-veineuse (1 minute pour l’injection). Pour l’injection de la molécule chimique conduisant à un modèle de cancer du poumon semblable à ce qui peut se développer chez l’humain, les souris vont recevoir une injection en intra-péritonéale une fois par semaine, pendant 10 semaines. La durée de l’injection est d’environ 30 secondes. Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en intra-péritonéale (30 secondes). 1,3,5,7 et 10jours après le traitement par chimiothérapie, les souris sont mises à mort sous anesthésie générale (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour la mise à mort).

Impact sur les animaux

Le développement des deux modèles orthotopiques du cancer du poumon peut conduire à une difficulté respiratoire. Les animaux seront étroitement surveillés. Si la difficulté respiratoire devient trop importante, l’animal sera mis à mort. Les chimiothérapies utilisées peuvent entraîner une perte de poids chez les souris. Ainsi, le poids des souris sera vérifié 3 fois par semaine.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les poumons.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=7 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répéterons les expériences 3 fois de manière indépendante. Le test statistique utilisé sera celui le plus adapté en raison de la taille des groupes.

Raffinement

L’animal aura un temps d’acclimatation de minimum une semaine avant toute manipulation par l’applicateur du projet. Afin d’améliorer le bien-être des animaux, les souris ne seront pas isolées. De plus, de l’enrichissement sera présent dans les cages tel que des jouets, des frisotis pour leur nidification et des tubes pour qu’elles puissent se cacher. Les animaux seront observés quotidiennement et des points limites ont été établis en fonction des manipulations réalisées avec une grille de score associée. Si ce score atteint 8 ou s’il atteint 4 trois jours d’affilés, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les modèles expérimentaux pour lesquels on trouve plus facilement et en plus grand nombre des réactifs spécifiques à l’espèce. Les souris sont l’espèce de référence pour les études précliniques en cancérologie, permettant la reproduction et la validation des résultats facilement pas la communauté scientifique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

Diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratation, perte de poids, état du pelage, prostration : une grille de score décide à quel moment le rat quitte l'étude pour être tué au CO2. 288 rats sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements sanguins et tissulaires. Chacun reçoit jusqu'à huit injections intraveineuses d'anticancéreux sur 25 jours et jusqu'à vingt gavages quotidiens de la molécule testée, avec des tests hebdomadaires mesurant l'allodynie tactile et thermique, c'est-à-dire le seuil auquel un contact non douloureux devient douloureux. Le porteur reconnaît que des rats plus âgés seraient mieux corrélés à la clinique humaine, le cancer étant une maladie du sénior, mais indique qu'ils coûtent cher et sont rarement utilisés dans la littérature.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques. Cette neuropathie est la conséquence d'une altération des nerfs des patients et se caractérise par des fourmillements, des picotements et des douleurs distales et symétriques, altérant la qualité de vie des patients, et pouvant perdurer longtemps après la fin des traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique est très limitée (aucun traitement préventif recommandé et un seul médicament modérément recommandé pour les douleurs associées). Des travaux récents ont mis en évidence l’activation de processus inflammatoires sur des modèles animaux de neuropathies périphériques chimio-induites, avec notamment des modifications de la concentration de marqueurs sanguins pro- ou anti-inflammatoires chez des rats exposés à des anticancéreux neurotoxiques. Ces perturbations ouvrent la piste de la neuroinflammation dans le contexte de ce type de neuropathie. La neuroinflammation et le système immunitaire sont des pistes particulièrement explorées aujourd’hui dans le contexte de la douleur neuropathique contribuant à son maintien au cours du temps, et représentant de nouvelles cibles thérapeutiques. Une nouvelle molécule ciblant ces processus neuro-inflammatoires représenterait un candidat médicament intéressant. De plus cette molécule a déjà été testée dans le contexte de la douleur chez la souris et du cancer chez le rat, et représente ainsi un ligand particulièrement intéressant pour évaluer le rôle du système immunitaire dans le contexte de la douleur neuropathique. L’objectif du projet sera de mesurer l’effet préventif et analgésique de cette molécule chez l’animal vivant (modèles de neuropathies périphériques chimio-induites).

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles de traitement des neuropathies périphériques chimio-induites chez l'animal ciblant la neuroinflammation. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge de ces neuropathies chez les patients est très limitée, avec aucune stratégie préventive recommandée et un seul médicament modérément recommandé pour le traitement des douleurs neuropathiques associées. Ainsi ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement et de prévention des neuropathies périphériques chimio-induites.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections d’anticancéreux. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours pour deux modèles animaux et de 5 sur 9 jours pour un autre modèle animal, par voie intraveineuse, et durée des injections de 10 secondes (max). Tous les animaux recevront des gavages oraux quotidien de la molécule à l’étude pour une évaluation des effets préventifs (20 gavages sur 25 jours pour deux modèles animaux, et 8 gavages sur 9 jours pour un modèle animal), et pour une évaluation des effets analgésiques (3 gavages sur 3 jours pour tous les animaux). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront au maximum 60 minutes pour un animal.

Impact sur les animaux

La neuropathie induite par les anticancéreux sera associée à des douleurs modérées de type allodynie (stimulus non douloureux chez l'animal sain, ex : sensibilité tactile et thermique). Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux par rapport aux animaux contrôles. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille (voir annexe), et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide par inhalation de CO2.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des études afin d’effectuer des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones ou organoïdes. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de ces neuropathies, qui n'est-elle même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'une étude sur la douleur neuropathique, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer, évaluer et valider les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au minimum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Dans ce type d'étude exploratoire, il est difficile de réduire le nombre d'animaux au risque de ne pas pouvoir conclure (perte du bénéfice de l'étude et utilisation inutile des animaux). L'approche statistique reposera sur une méthodologie en bloc d'animaux (n=12). Cet effectif tiendra compte de la variance des paramètres étudiés et de la puissance des tests statistiques. Avec ces effectifs, sur les tests comportementaux, des tailles d’effet importantes supérieures à 1 sont attendues (différence des moyennes entre les groupes de l’ordre de 20 points pour un écart-type de 10), assurant une bonne qualité des résultats.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire (stimulation nociceptive moins intense). Les animaux seront stabulés dans des conditions standards de 3 animaux par cage (800 cm²), dans une salle climatisée (température 22+/-2°C et hygrométrie 50+/-10%) avec un cycle 12:12 et un libre accès à la boisson et à la nourriture. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille, et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide par inhalation de CO2.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies périphériques chimio-induites. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux. Les animaux seront agés de 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6-9 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

144 souris vont être utilisées, chacune subissant deux recueils de fèces, un gavage de glucose, une injection d'insuline, seize prises de sang, dix pesées, quatre jeûnes et 48 heures seule en cage calorimétrique. Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après dix semaines d'un régime qui les rend obèses. La question posée est de savoir si une carence en vitamine D chez le père modifie le métabolisme de sa descendance, l'application annoncée étant d'émettre des recommandations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer. Le porteur décrit une grille de points limites et un arbre décisionnel, puis ajoute qu'aucune analgésie n'est prévue pendant le protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de la carence en vitamine D chez la souris génitrice mâle, sur les trajectoires métaboliques de sa descendance. 9 animaux mâles et 9 femelles issues des géniteurs carencés ou non en vitamine D durant 5 ou 10 semaines seront soumis à un régime contrôle ou un régime obésogène durant 10 semaines. L'évolution pondérale des animaux sera mesurée. Des prélèvements de sang et de fèces seront réalisés ainsi que des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Enfin une mesure de la dépense énergétique sera réalisée par calorimétrie indirecte. Les animaux seront mis à mort afin de mesurer les niveaux d'expression de différents gènes en lien avec la vitamine D. De plus les mécanismes permettant d'expliquer le passage des effets de la carence paternelle à la descendance seront étudiés.

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans le cadre de ce projet permettront de connaitre l’impact d’une déficience paternelle en vitamine D sur la descendance. Cela servira de base pour émettre des recommandations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux prélèvements de fèces nécessitant de les héberger individuellement pendant un maximum d'une heure, suivi d'une prise de sang à la queue sur animal vigile. A 7 semaines les animaux passeront en cage calorimétriques durant 48 heures pour mesurer leur dépense énergétique. Ce procédé nécessite d'héberger individuellement les animaux pendant 48 heures dans une cage dotée de capteurs permettant de suivre la position de la souris dans la cage, mesurer la nourriture consommée ainsi que les échanges gazeux au sein de la cage. Une fois à 8 semaines de régime les animaux seront soumis à un unique test de tolérance à l'insuline, cette procédure nécessite un hébergement individuel d'environ 2 heures. Durant cette période les animaux recevront une injection d'insuline suivie de 7 prises de sang à l'extrémité de la queue à l'aide d'un glucomètre portatif (durée de la procédure de prise de sang: 1 minute). A 9 semaines à un unique test de tolérance au glucose, ces procédures nécessitent un hébergement individuel d'environ 2 heures, durant ces périodes les animaux recevront un gavage de glucose (durée de la procédure de gavage: 1 minute) suivi de 7 prises de sang à l'extrémité de la queue à l'aide d'un glucomètre portatif (durée de la procédure de prise de sang: 1 minute). Les animaux seront manipulés quelques minutes chaque semaine lors des mesures de masse. De plus ils seront soumis à une alimentation les rendant obèses durant toute la durée du protocole. En regroupant les interventions. Les animaux subiront chacun : deux recueils de fèces, un gavage de glucose, une injection d'insuline, quatre hébergements individuels (dont trois de moins de deux heures et un de 48h), 16 prises de sang (dont 14 sont des très faibles quantités réalisées pour mesure de glycémie à l'aide d'un glucomètre), 10 pesées (réalisées hebdomadairement) et un régime obésogène.

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus en hébergement individuel lors des recueils de fèces ce qui peut constituer une source de stress légère (nuisance de gravité légère, courte durée). Des prélèvements de sang seront réalisés à la veine caudale (une seule incision mais 7 ponctions, ce qui peut constituer une source de douleur légère et une source de stress modérée, nuisance de gravité modérée, courte durée). L'injection d'insuline intrapéritonéale peut constituer une source de stress et de douleur légère (nuisance de gravité légère, courte durée). Le gavage de glucose peut constituer une source de stress et éventuellement être une source de douleur légère (nuisance de gravité légère, courte durée). L'induction de l'anesthésie peut constituer une source de stress légère (nuisance de gravité légère, courte durée). Les animaux seront mis à jeûn à quatre reprises, pour à chaque fois une durée de moins de douze heures, ce qui peut constituer une source de stress légère (nuisance de gravité légère, durée modérée). Des animaux seront soumis à un régime obésogène répondant à tous leurs besoins nutritionnels susceptible d'entraîner des anomalies cliniques légères (nuisance de gravité légère, durée longue). Enfin, les animaux seront maintenus en hébergement individuel pendant 48 heures lors des mesures en cage calorimétrique, ce qui peut constituer une source de stress de longue durée (nuisance de gravité modérée, durée longue)

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d’intérêt qui seront ensuite analysés.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l’impact de la nutrition périnatale. La souris est un modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l’homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques chez la descendance, d'une carence en vitamine D chez le mâle géniteur. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu'il n’est pas possible de reproduire in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique de la descendance (descendance issue de 10 géniteurs différents). Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test de student, notamment en ce qui concerne la prise de masse des animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l’environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle pour une durée inférieure à 24h, avant d'etre replacé avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l’application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme. Le regime débutera à 6 semaines de vie et sera administré durant 10 semaines. Les différentes procédures seront réalisées durant cette période de 10 semaines de régime. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur pancréas, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour supprimer les cellules non-β de leurs îlots pancréatiques, elles reçoivent trois injections espacées de 48 heures, avant deux tests de tolérance au glucose de deux à six heures chacun : incision de la queue sous anesthésie, injection de glucose, sept à dix microprélèvements de sang, quatre prises de sang plus importantes, et pour certains lots un gavage lipidique. L'objectif est de mesurer ce que ces cellules apportent à la régulation de la glycémie, une question dont le porteur reconnaît qu'elle a été peu explorée. Il écrit travailler par ailleurs sur un simulateur de l'homéostasie glucidique que les données tirées de ces 400 souris viendront enrichir, "afin de réduire encore le recours à l'expérimentation animale".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre l’influence d'un type particulier de cellules des îlots pancréatiques sur l’homéostasie nutritionnelle à la fois dans les conditions physiologiques (régime normal) et dans les conditions physiopathologiques (régime gras classiquement utilisé pour mimer des conditions diabétogènes).

Bénéfices attendus

Le diabète est une maladie grave qui s’étend. Il est lié à une augmentation anormale et prolongée de la concentration de sucre dans le sang : c’est l’hyperglycémie. Les petits organes qui libèrent les hormones régulant la concentration de sucre dans le sang (la glycémie) s’appellent les îlots du pancréas. Ils sont constitués de plusieurs types des cellules. Les principales cellules des îlots sécrétant l’insuline, la seule l’hormone qui diminue la glycémie. Dans le diabète de type 1, ces cellules sont absentes. Dans le diabète de type 2, elles fonctionnent mal. En ce sens, ces cellules ont toujours été au centre des études sur la régulation glycémique en conditions normales et pathologiques. On connait donc très peu le rôle des autres cellules du pancréas dans ces mécanismes et surtout la manière dont elles influencent les cellules produisant l’insuline. Une autre limite de la plupart des études est d’avoir été centrées uniquement sur les effets du sucre (le glucose). En effet, l’alimentation contient d’autres nutriments : protéines, lipides…. Dans le présent projet, les chercheurs disposent de souris dont la particularité est de pouvoir inactiver les cellules ne produisant pas l’insuline. La manière dont ces souris régulent leur glycémie suite à une administration de glucose combiné ou non avec d’autres nutriments pourra donc être étudiée et surtout comparée avec celle des souris « normales » qui ont dans leurs îlots tous les types de cellules. Ceci apportera des informations cruciales sur le rôle de ces cellules dans ces processus. Pour mieux comprendre les interactions entre les différents types de cellules pancréatiques dans le diabète, certaines souris seront soumises à un régime gras qui mime certaines conditions favorisant le diabète de type 2. Les informations fournies par ce projet seront aussi cruciales par rapport au diabète de type 1. En effet, dans la perspective des futures thérapies cellulaires, nous saurons s’il suffit de greffer seulement les cellules produisant l’insuline ou un mélange équilibré des différentes cellules pancréatiques.

Procédures

Pour induire le phénotype recherché, les animaux recevrons 3 injections (10 secondes par injection) espacées de 48h. Pour les tests de tolérance au glucose, 2 expériences effectuées à 2 semaines d’écart (durée du test de 2 à 6h) : une incision (2 secondes) de la queue sera faite après anesthésie, s’en suivra une injection (10 secondes) de glucose avec ou sans autres nutriments, 7 à 10 prélèvements très légers de sang (10 à 30 secondes) pour détermination glycémie (espacés de 15min à 1h) seront effectués et 4 prélèvements (30 à 60 secondes) un peu plus importants de sang pour la détermination d’hormones (espacés de 30min à 1h). Pour les animaux de certains lots, 1 gavage (20 secondes) avec une solution lipidique sera effectué (après l’injection de glucose).

Impact sur les animaux

Des souris de ce type sont actuellement en élevage dans un autre laboratoire. En dehors d’une diminution de poids légère et transitoire (1-2 semaines maximum) après la suppression des cellules des îlots qui ne sécrètent pas l’insuline, aucun effet délétère n’a été recensé chez ces animaux. Dans de très rares cas, il peut arriver, malgré les soins post-expérimentaux que la queue cicatrise mal après les prélèvements de sang. Il peut aussi arriver extrêmement rarement, lors de l’injection de toucher un organe entrainant la mort de l’animal.

Devenir

A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées et leur pancréas sera prélevé pour diverses expérimentations ex-vivo.

Remplacement

Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes d’organes sur puce sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’homéostasie nutritionnelle des mammifères impliquant des interactions entre de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, rein…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère. Le modèle souris est le plus adapté car c’est le seul à ce jour permettant une ablation sélective des cellules non-β des îlots pancréatiques au travers du modèle que nous proposons d’étudier dans ce projet. Il n’existe actuellement aucun simulateur modélisant l’homéostasie nutritionnelle qui est au cœur de cette étude. Toutefois, nous travaillons justement sur un simulateur de l’homéostasie glucidique. Les données acquises dans ce projet sur ces animaux seront entre autres destinées à enrichir ce simulateur renforçant ainsi la puissance de cette approche de simulation afin de réduire encore le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Une réflexion approfondie a été effectuée pour réduire le nombre d’animaux tout en préservant une puissance statistique nécessaire sans laquelle il faudrait refaire l’étude. Une pré-étude a été réalisée antérieurement dans un autre laboratoire sur ces animaux montrant sans réserve la faisabilité du projet. Les tests in vivo décrits dans cette étude sont réalisés de manière courante depuis des années par notre équipe dans d’autres projets, mais sont aussi des tests courant largement utilisés dans les laboratoires qui travaillent sur le diabète au travers le monde, ils sont donc très standardisés. Il n’y a donc plus de mise au point technique et aucune perte d’animaux n’est à prévoir à ce niveau, ce qui contribue à limiter également le nombre d’animaux. Pour réduire encore le nombre de souris produites en élevage, le choix des animaux contrôles (témoins) produits permettra de diviser par 2 le nombre total d’animaux à produire. Nous réutiliserons les animaux d’un même lot pour 2 séries d’expériences ce qui permet de diminuer encore de 90 notre besoin total d’animaux, et enfin, après les tests in-vivo, les animaux produits seront utilisés pour récupérer leurs îlots pancréatiques pour des investigations sur ces tissus au sein de la même étude. Ceci permet encore une réduction de moitié des animaux utilisés. Ainsi, 400 animaux maximum (au lieu de 900 si les mesures précédentes n’étaient pas appliquées) seront utilisés. Chaque lot sera optimisé pour que le nombre d’animaux utilisé assure une significativité statistique. Les règles statistiques communément admises seront appliquées (à savoir : si la répartition des résultats suit une loi normale, des tests statistiques paramétriques seront employés. Si la distribution des données ne suivait pas une loi normale, les tests non paramétriques appropriés seront appliqués).

Raffinement

Les animaux seront regroupés entre 5 et 10 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi des dômes et carrés de ouate pour la nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Une habituation des animaux aux manipulations, contentions sera effectué la semaine précédant les tests. Les animaux seront pesés 2-3 fois par semaine et tous les jours durant la semaine suivant les expérimentations pour les lots concernés. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des animaux avant les incisions et une crème cicatrisante sera appliquée en fin d'expérience avec un suivi et nursing si besoin des animaux. Dans les 24h suivant les expérimentations, si une perte de poids >10% est constatée, une alimentation enrichie sera mis à disposition des animaux concernés. Cette alimentation enrichie sera maintenue jusqu’à ce que ces animaux aient recouvré leur poids d’avant injection, expérimentation. Si ce n’était pas le cas après 48h, ce qui n’est encore jamais arrivé lors des précédentes études avec le même type d’induction de phénotype, les mesures graduées et points limites habituels associées de l’animalerie seront appliqués.

Choix des espèces

Le modèle souris adulte est le plus adapté car c’est un mammifère dont le fonctionnement de l’organisme est transposable à celui de l’Homme adulte, notamment pour la régulation du glucose sanguin. C’est aussi le seul animal à ce jour permettant une ablation sélective des cellules non sécrétrices d’insuline dans les îlots pancréatiques dans le modèle transgénique que nous proposons d’étudier. Les études in vivo sur ces animaux seront faites au stade jeune adulte mâle, de 12 à 22 semaines. Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes de micro-organes in-vitro sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’équilibre nutritionnel des mammifères impliquant de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, reins…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère adulte vivant.

Un sérum toxique pour le rein, obtenu en immunisant des moutons contre des composants du glomérule de souris, est injecté sous anesthésie à toutes les souris du projet. 760 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, avec selon les protocoles un gavage ou une injection quotidienne pendant dix à quatorze jours et un recueil d'urine deux fois par semaine. Il s'agit de tester si l'inhibition d'une protéine de stress freine la formation des croissants cellulaires qui détruisent le filtre du rein. Le porteur décrit une prise de poids par ascite et par œdèmes après l'injection du sérum, puis conclut que les protocoles sont "relativement courts" et qu'il ne devrait pas observer de complications trop sévères.

Objectifs

Les maladies rénales affectent dix pour cent de la population mondiale avec une incidence croissante et elles représentent de nos jours un véritable enjeu de santé publique. Si ces maladies ne sont pas prises en charge, elles peuvent aboutir à une insuffisance rénale terminale (IRCT). L'IRCT est associée à une importante mortalité cardiovasculaire et à un coût élevé pour la société (environ 4 milliards d'euros par an en France). L'une des causes les plus sévère d'IRCT sont les glomérulonéphrites extracapillaires (GEC). Les GEC sont associées à une prolifération anormale de cellules rénales : les cellules épithéliales pariétales formant un "croissant" cellulaire dans le glomérule, unité de filtration du rein. Des données suggèrent l'implication des protéines de stress dans le développement de ces croissants. Il a été démontré que l'une de ces protéines de stress aurait un rôle délétère dans la GEC faisant de cette protéine une cible thérapeutique potentielle. Le principal modèle murin de GEC est caractérisé par l'injection d'un sérum toxique pour les reins (sérum obtenu après immunisation de mouton contre des composants du glomérule de la souris). Dans ce modèle, les animaux développent une atteinte rénale rapide dès le dixième jour, caractérisée par des lésions de croissants (reproduisant les caractéristiques histologiques et fonctionnelles des GEC humaines). Pour préciser le rôle in vivo de cette protéine de stress et l'intérêt thérapeutique éventuel de son inhibition, nous nous sommes fixés plusieurs objectifs : 1/ Etude de l'expression de la protéine de stress au cours du développement de la GEC expérimentale pour affiner le rôle in vivo de cette dernière 2/ Inhibition pharmacologique de la protéine à visée thérapeutique 3/Inhibition génétique de la protéine de stress dans plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées pour déterminer quelles cellules rénales sont impliquées dans la signalisation de cette protéine.

Bénéfices attendus

Les maladies glomérulaires représentent la première cause d'insuffisance rénale terminale. Le développement de thérapies ciblées agissant spécifiquement sur les cellules épithéliales glomérulaires (cellules locales) est donc essentiel afin de contrôler ces maladies glomérulaires. Ces travaux pourraient permettre de proposer la protéine de stress (étant déjà la cible de différents traitements) comme une cible thérapeutique prometteuse dans diverses maladies glomérulaires rénales. Comme nos premiers résultats l'indiquent, cette protéine pourrait être impliquée dans le développement de pathLaologies dévastatrices comme la glomérulonéphrite extracapillaire (GEC) aboutissant dans la majorité des cas à l'apparition d'une Insuffisance Rénale Chronique (IRC). De nos jours, l'insuffisance rénale chronique à des conséquences socio-économiques majeures. Son traitement représente l'un des couts les plus importants du budget de la santé pour une petite fraction de la population : il est urgent de disposer de davantage de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques. De plus, actuellement, le traitement de la GEC repose principalement sur une thérapie qui a des effets nefastes importants pour les patients concernés. Ce projet a l'ambition de proposer des stratégies thérapeutiques inhibant les mécanismes physiopathologiques clés impliqués dans le développement des croissants.

Procédures

(1) Tous les animaux recevront une injection de sérum sous anesthésie environ 3 minutes par souris sur un plateau thermostaté à 37degrés. (2) Pour les protocoles, certains animaux recevront un gavage par jour sur les périodes de traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minutes par souris. (3) Pour un autre protocole, certains animaux recevront une injection d'un traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minute par souris. (4) L'ensemble des souris auront un recueil des urines pendant le protocole deux fois par semaines environ 1 minute par souris. (5) Prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (1 minute environ/souris).

Impact sur les animaux

Le stress et la douleur peuvent être générés par : 1.les différentes injections des medicaments. Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent developper une inflammation et un stress lors de la contention pour la bonne administration. 2. Les manipulations quotidiennes en particulier pour les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent developper un stress lors de la contention pour le recueil d'urines quand elle est nécéssaire. 3. Les complications associées au modèle murin. Suite à l'injection du sérum toxique pour le rein, les animaux peuvent prendre du poids en raison de l'ascite et des oedemes développés lors de la mise en place des lésions rénales. 4. Complications liées à l'anesthésie au moment de l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Les protocoles mis en place dans le projet sont relativement cours, nous ne devrions pas observer de complications trop sévères pour les reins (perte de poids, baisse de la température corporelle).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs est la fonction rénale, qui doit être mesurée par le dosage de la concentration plasmatique de créatinine et d'urée.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (lésions tissulaires rénales) dans nos deux modèles d'insuffisance rénale aigue. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 760 souris. De plus, nous utiliserons des tests statitiques adaptés.

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront réduites au maximum grâce à l’application de mesures de raffinement appropriées. Avant le début de la procédure, les animaux seront acclimatés dans l’animalerie pendant au moins une semaine afin de les préparer à leur environnement. Leur bien-être sera assuré par un enrichissement optimal de leur environnement, comprenant une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes. Cette litière, initialement compacte, sera décompactée par les animaux eux-mêmes. Des morceaux de bois à ronger et un dôme refuge en cellulose seront fournis dans chaque cage, offrant aux animaux des éléments pour explorer et se cacher, contribuant ainsi à leur confort. La gestion de la douleur sera une priorité, avec l’utilisation de méthodes d’analgésie et d’anesthésie adaptées pour minimiser toute souffrance. Des points limites ont été définis pour assurer une surveillance stricte du bien-être des animaux tout au long de l’expérience. Afin de garantir leur état de santé optimal, une surveillance quotidienne de leur aspect physique et du poids des animaux sera effectuée par le personnel qualifié de l'animalerie ou les responsables du projet. Les animaux seront hébergés dans des conditions strictement conformes à la réglementation en vigueur. Chaque cage contiendra un maximum de cinq animaux, et l’animalerie respectera des conditions de température, d’humidité et de renouvellement de l’air rigoureuses conformément à la réglementation en vigueur.Enfin, pour la mesure de certains paramètres, des efforts seront faits pour réduire au maximum le stress lié à la contention, garantissant ainsi le bien-être des animaux tout au long de la procédure

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans cette étude est bien maîtrisé par le personnel du laboratoire, qui possède une grande expérience avec cette espèce. De plus, de nombreuses données relatives à ce modèle sont déjà disponibles dans la littérature scientifique, ce qui en fait un choix particulièrement pertinent, surtout en comparaison avec d'autres espèces. Cette étude bénéficie également de la possibilité de tester l'implication de voies de signalisation spécifiques à certaines cellules, grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre 8 et 10 semaines. À cet âge, ils possèdent un système glomérulaire mature, tout en ne présentant pas encore de lésions dues au vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.