Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
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- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
De nouveaux régulateurs impliqués dans l’établissement de la tolérance immunitaire dans le thymus
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
La paralysie part de la queue et remonte le long de la moelle épinière, et le porteur limite la procédure à trente jours pour cette raison. 660 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 570 en sévère, toutes tuées pour analyse. Elles reçoivent des injections sous-cutanées et intraveineuses sous anesthésie gazeuse pour induire une sclérose en plaques, ou des cellules tumorales injectées sur chaque flanc suivies de quatre injections de traitement, avec une mesure quotidienne des tumeurs et une mise à mort au vingt-et-unième jour parce que le modèle devient létal au-delà de trente jours. L'objectif déclaré est d'identifier deux régulateurs de l'éducation des lymphocytes T, avec un bénéfice renvoyé au conditionnel face à une immunothérapie qui, selon le porteur, n'est efficace que chez 20 % des patients.
Objectifs
Les lymphocytes T sont un sous-type de globules blancs qui combattent les virus, les bactéries ou encore les cancers. Ces lymphocytes sont éduqués à ne pas reconnaître nos propres tissus comme des éléments étrangers dans un organe du système immunitaire appelé le thymus. Des dérégulations dans leur éducation peuvent conduire à des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques ou le diabète de type 1, mais également impacter l’efficacité de la réponse antitumorale. Dans le thymus, les cellules épithéliales médullaires thymiques, appelées mTEC, sont critiques à l’éducation des lymphocytes T. L’identification de régulateurs de l'éducation des lymphocytes T constitue un défi majeur pour améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la protection contre les maladies auto-immunes et les cancers. Dans ce contexte, notre équipe a identifié deux nouveaux régulateurs associés au développement de la sclérose en plaques. Nous avons alors émis l’hypothèse que ces facteurs pourraient contribuer à l’éducation des lymphocytes T. Notre projet visera à 1) caractériser le rôle de ces facteurs dans la protection contre des pathologies auto immunes à l’aide d’un modèle murin de sclérose en plaques ; 2) analyser l’impact de ces facteurs sur l'éducation des lymphocytes T et 3) déterminer l’impact de la déficience de ces facteurs sur la réponse antitumorale. En résumé, l’ensemble de ces travaux de recherche permettra de mettre en évidence la fonction de ces nouveaux facteurs clé dans la protection contre des maladies auto-immunes et l’éradication des tumeurs.
Bénéfices attendus
Les maladies auto-immunes touchent 5 à 10% de la population mondiale. Cependant, face à la complexité de ces maladies, il n’existe actuellement aucun traitement permettant de guérir les patients atteints. Par ailleurs, un défaut d’éducation des lymphocytes T peut également impacter l’efficacité de la réponse antitumorale. La stratégie actuelle utilisée pour booster la réponse des lymphocytes T contre la tumeur est basée sur l’utilisation d’anticorps : l’immunothérapie. Cependant, elle n’est efficace que chez seulement 20% des patients. Identifier les régulateurs de l'éducation des lymphocytes T pourrait constituer une nouvelle stratégie pour améliorer l’éradication des tumeurs et la protection contre les maladies auto-immunes. Ce projet pourrait démontrer que ces régulateurs sont critiques dans la lutte contre des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques et à plus long terme pourrait orienter les médecins vers des tests génétiques plus précis pour un meilleur diagnostic. De plus, ces régulateurs pourraient être impliqués dans l’efficacité de la réponse anti tumorale dans des contextes de tumeurs comme le mélanome ou le fibrosarcome. Notre approche de ciblage de ces régulateurs en combinaison avec une immunothérapie basée sur l’utilisation d’anticorps devrait améliorer l’efficacité des agents thérapeutiques pour améliorer la réponse anti tumorale.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse générale combinée a une injection sous cutanée d’analgésique (3 minutes par animal). Pour le protocole de sclérose en plaque, ces souris recevront en plus deux injections intraveineuse (3 minutes par animal) sous anesthésie gazeuse générale. Pour les deux types de tumeurs, les souris recevront sur chaque flanc des cellules tumorales par injection sous-cutanée sous anesthésie gazeuse générale (2 injections simultanées, pour une intervention d’environ 3 minutes par animal). Les souris recevront également 4 injections intra-péritonéales de traitement anti-tumoral (30 secondes par injection). Les tumeurs seront mesurées tous les jours post-injection sous anesthésie gazeuse générale (2 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanées et intraveineuses seront réalisées sous anesthésie générale légère par anesthésie gazeuse générale minimisant le stress, l'inconfort et la douleur liés à ces injections. Concernant le modèle de sclérose en plaque, la maladie peut générer des nuisances importantes caractérisées par la paralysie progressive de l’animal en commençant par la queue et remontant le long de la moelle épinière. Pour limiter la durée de souffrance des animaux, ces derniers seront suivis quotidiennement et la procédure n’excèdera pas les 30 jours. Concernant le modèle de sclérose en plaques ainsi que l’immunisation, l’injection sous-cutanée peut éventuellement générer une inflammation locale, qui sera surveillée attentivement de manière quotidienne. La probabilité d’apparition de ces nuisances et leur intensité sont susceptibles d’augmenter progressivement au cours de la procédure et devront être contrôlés. Concernant les modèles de cancer, la maladie peut générer des nuisances caractérisées par un inconfort, une douleur prolongée. Ce modèle pouvant être létal au-delà de 30 jours, les souris seront suivies, mises à mort et analysées à un temps de 21 jours dans le cadre de ce projet. Les nuisances possibles sont : un stress lié à la manipulation, une perte de poids, une gêne à la mobilité, une douleur.
Devenir
Les animaux d'intérêt générés seront mis à mort pour l'analyse à la fin des procédures.
Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale ne permet d’étudier la tolérance immunitaire et les cellules épithéliales thymiques. De plus, cette étude prend place dans un contexte pathologique, à savoir les pathologies auto-immunes et le cancer dans notre cas. Notre projet nécessite une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes tissulaires et cellulaires impliquées dans la réponse étudiée.
Réduction
Nous essaierons autant que possible de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Le choix du nombre animaux est réalisé en prenant en considération la variabilité interindividuelle, la variabilité de réponse au traitement antitumoral et la variabilité de prise et de pousse des cellules tumorales afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Ainsi, des cohortes de 4 à 5 animaux par groupe, selon les procédures, seront utilisées avec un total de trois expériences indépendantes. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront randomisés en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Du coton pour confectionner des nids est introduit dans chaque cage. Les animaleries bénéficient d'une température régulée à 21°C, d'une hygrométrie contrôlée, ainsi que d'une photopériode contrôlée. Concernant le stress de manipulation, les animaux seront manipulés par un seul expérimentateur par lignée sauf pour l’étape de randomisation dans les groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse générale avant chaque injection et mesure. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance quotidienne dès le début des procédures expérimentales afin d’identifier tout signe de gêne ou de douleur à l’aide d’une grille d’évaluation, à l’apparition de signes de douleurs des analgésiques seront administrés. En cas de faiblesse pouvant altérer la prise alimentaire ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Dans le cas du modèle de sclérose en plaques, les souris seront suivies quotidiennement et l’avancement de la pathologie sera mesuré à l’aide d’une grille constatant le niveau de paralysie de l’animal pouvant induire une augmentation de la surveillance à deux fois par jour.
Choix des espèces
L’espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés. La génétique de la souris est bien connue et étudiée depuis longtemps. De plus, la souris est le modèle de base pour étudier le système immunitaire et en particulier le thymus. Ce modèle animal couramment utilisé permet grâce à des techniques d’ingénierie génétique de cibler un gène précis dans un type cellulaire spécifique afin d’étudier sa fonction. Les souris seront utilisées entre 6 et 12 semaines, correspondant à un stade développemental de jeune adulte. A ce stade, le thymus des souris est pleinement développé et atteint sa taille et sa fonctionnalité maximale.
Prélèvements de tissus pour la caractérisation de souris génétiquement modifiés en recherche thématique, avec ou sans phénotype dommageable.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des souris hébergées est immunodéprimée, donc fragilisée face aux infections, ce que le porteur qualifie de phénotype dommageable tout en affirmant que leur bien-être n'en est pas affecté tant que l'hébergement reste adapté. 25 960 souris génétiquement modifiées vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'acte déclaré tient en un prélèvement de moins de deux millimètres de queue ou d'oreille, réalisé une fois sur des souris vigiles au moment du sevrage, avec un second prélèvement possible entre cinq et douze semaines si le génotypage échoue. Ces souris passent ensuite en utilisation continue dans d'autres projets, et l'effectif déclaré est calé sur les statistiques des années précédentes, avec une marge prévue pour les projets des cinq prochaines années.
Objectifs
Notre établissement utilisateur élève des animaux génétiquement altérés dédiés à la recherche scientifique dans divers domaines tel que la cancérologie, l'immunologie, neurologie, maladies métaboliques etc. Pour cela, nous utilisons une méthode de prélèvement de queue pour la caractérisation génétique. De plus, nous hébergeons des lignées immunodéprimées caractérisées de phénotype dommageable pour certains projets expérimentaux.
Bénéfices attendus
Les lignées immunodéprimées ont pour objectif de répondre à des questions scientifiques dans le domaine de l’immuno-oncologie ou de surveiller le maintien du statut sanitaire SPF dans le cas des sentinelles. Le génotypage permet la caractérisation génétique des lignées génétiquement altérées avec ou sans phénotype dommageable pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques des différentes structures travaillant dans notre animalerie (thématiques développées : cancérologie, digestif, cardiaque, osseux...).
Procédures
Prélèvement de queue (
Impact sur les animaux
La biopsie au niveau de la queue ou de l’oreille peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vue immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptées.
Devenir
Les animaux sont prévus pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques. La biopsie de queue ou d'oreille permet le génotypage et en fonction des croisement effectués permettra d'identifier les animaux utiles aux études.
Remplacement
Jusqu’à présent la méthode de biopsie de queue était la plus efficace pour identifier génétiquement les animaux. Cependant nous réfléchissons à mettre en place des méthodes alternatives moins invasives tel que le génotypage via prélèvement de poils, de salive ou de fécès. La difficulté d’une méthode non invasive est qu’elle soit applicable pour tous ce qui n'est pas le cas dans toutes les équipes de recherche. Les animaux immunodéprimés sont nécessaires pour des projets de recherche en immunooncologie. Concernant les sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, ce qui nous affranchirai de l’utilisation des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est basé sur les statistiques des années précédentes et en lien avec les différents besoins en fonction des projets scientifiques. Ce dernier reste suffisamment important pour pouvoir y inclure de futurs projets d’ici les 5 prochaines années. Nous sommes en cours d'expertise pour développer des méthodes de génotypage moins invasives. Concernant les animaux utilisés comme sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode alternative aux animaux de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, cela nous affranchirai de l’utilisation des animaux. Lorsqu’une lignée n’a plus d’intérêt scientifique à moyen ou long terme, nous encourageons l'arrêt de l'élevage de cette dernière associé à une méthode de conservation autre (cryopréservation...).
Raffinement
La biopsie de queue ou la biopsie à l’oreille sont réalisées lors du baguage sur des animaux vigiles. Ces méthodes sont éprouvées, précises, rapides (quelques secondes), standardisées et réalisées par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. En cas de signes de stress ou de douleur, du Douxocalm pourra être appliqué. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vue immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptés avec un statut sanitaire stricte et une fréquence de change rapprochée.
Choix des espèces
Nous avons majoritairement des élevages de souris. Ces animaux sont utilisés en fonction des besoins pour les différents projets scientifiques. Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule préhension). En cas de problème technique sur le prélèvement (défaut d'extraction de l'ADN par exemple), un deuxième prélèvement pourra être réalisé entre 5 et 12 semaines.
Développements méthodologiques en IRM chez le rat et la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 150
Prélevés en priorité parmi les animaux surnuméraires d'élevage, ceux dont le génotype ou le phénotype ne correspond à aucun besoin et qui sont de toute façon destinés à la mise à mort, 150 souris et 150 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Ils passent un examen d'IRM de une à trois heures sous narcose ou anesthésie, avec le cas échéant une injection de produit de contraste et des mesures de glycémie. Le porteur reconnaît qu'un réveil en cours d'examen ou un stress thermique ne peuvent pas être exclus, et indique que les souris et les rats sont tués à l'issue de la procédure. La finalité déclarée est l'amélioration de l'"offre de prestations" de la plateforme d'imagerie, et la rubrique consacrée à la réduction se limite à une phrase, sans justifier l'effectif de 300 animaux non-humains.
Objectifs
Notre plateforme de recherche est spécialisée dans l’imagerie préclinique (IRM) et la spectroscopie (SRM) par résonance magnétique. Les projets menés sur cette plateforme concernent des thématiques en biologie et en santé comme par exemple la cancérologie, la nutrition, les maladies neurodégénratives, la compréhension de pathologies ou encore la validation de nouveaux traitements. Pour améliorer son offre de prestations aux équipes de recherche et aux entreprises, la plateforme est amenée à développer en collaboartion avec les équipes support et utilsatrices, de nouvelles méthodes et de nouveaux protocoles d’IRM et de SRM. Ces développements méthodologiques sont toujours réalisés et validés dans un premier temps sur des objets-test spécifiques. Une fois cette étape de validation atteinte, il est néanmoins nécessaire de valider in-vivo cette fois-ci, ces nouvelles méthodes sur un nombre limité d'animaux. L’objectif de la présente demande n’est pas de se substituer au dépôt d’une demande d'autorisation de projet spécifique.
Bénéfices attendus
Proposer des outils d'imagerie opérationnels en utilsant en prioprité des animaux surnuméraires destinés à être mis à mort, en vue d'étdues plus spécifiques.
Procédures
Les animaux feront l'objet d'un examen d'IRM d'une durée comprise entre 1h et 3h. Les interventions prévues sur les animaux concernent la narcose (isofurane), l'anesthesie et le cas échéant, l'injection intraveineuse ou intrapéritonéal d'un produit de contraste, ou encore de solution saline (NaCl) ou de glucose, ainsi que des mesures de glycémie réalisées sous anesthésie ou narcose avec analgésie locale.
Impact sur les animaux
Malgré les efforts de raffinement (cf. 3.3.6.2) on ne peut exclure, (i) un stress thermqiue dû à l'anesthésie et/ou la narcose ou à certaines séquences d'imagerie (ii) le réveil de l'animal en cours d’examen ou (iii) un stress lors de l'installation de l'animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure. Dans le plupart des cas, des organes pourrant être prélevés à l'issu de la procédure.
Remplacement
Dans la plupart des projets menés par la plate-forme, less développements méthodologiques sont réalisés et validés dans un premier temps sur des objets-test spécifiques. Une fois cette étape de validation atteinte, il est néanmoins nécessaire de valider in vivo ces nouvelles méthodes et protocoles sur un nombre limité d'animaux afin d'optimiser ces nouvelles méthodes aux conditions expérimentales réelles (configuration matérielle nécessaire, posiiton de l'animal, suivi physiologique spécfique, synchronisation aux mouvements respiratiores ou cardiaques).
Réduction
Dans le mesure du possible, les animaux utilsés seront des animaux d’élevage destinés à la mise à mort (car génotype ou phénotype non cibles).
Raffinement
Pendant l'examen, une attention particulière est donnée au maintien de la températrue corporelle des animaux. De plus du gel ophtalmique est utilsé systèmatiquement. Les animaux bénéficient d'un enrichissement social et physique dans la zone d'hébergement. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une recherche systématique de points limites. Tous les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie générale avec une analgésie ad’hoc.
Choix des espèces
L'IRM de la platefrome est conçue principalemant pour l'imagerie pré-clinique. Le rat et la souris sont les espèces préférentielles des utilsateurs. Le stade de développement sera adapté en fonction du besoin méthodologique, ou en fonction des animaux disponibles si le stade de développement n'a pas d'influence sur le besoin méthodologique..
Caractérisation du comportement de tétée chez le nouveau-né de la souris modèle du syndrome de Prader-Willi et rôle de l’ocytocine dans ce comportement.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des souriceaux nouveau-nés séparés de leur mère jusqu'à quatre heures, stimulés au pinceau puis au laser infrarouge au niveau du tronc cérébral: 708 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tuées pour des analyses post-mortem. Les mères reçoivent des injections intrapéritonéales d'anesthésique et se voient retirer une partie de leur portée. Le projet cherche à comprendre pourquoi les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi tètent mal et comment l'ocytocine rétablit la tétée, un essai clinique de phase 3 étant déjà en cours chez des bébés. Trente femelles sont réutilisées pour quatre à cinq portées avant d'être tuées, et 312 autres souris sont utilisées pour la reproduction de huit lignées puis tuées vers l'âge de six mois.
Objectifs
Ce projet porte sur la compréhension de mécanismes physiopathologiques impliqués dans la tétée chez des souris modèles d’une maladie rare (le syndrome de Prader-Willi) et le rôle d’une hormone qui restaure une activité de tétée normale. En effet, il a été montré qu’il y a un dysfonctionnement de l’activité de tétée chez les souris modèles d’une maladie rare, tout comme cela a été observé chez les bébés Prader-Willi et que l’administration de l’hormone étudiée rétablie une tétée normale chez ces souriceaux. Ces études précliniques ont engendré des essais cliniques (PhaseI/II) chez des enfants atteints du syndrome de Prader-Willi, il résulte une amélioration (voire normalisation) de l’activité de succion. Toutefois le mécanisme d’action de cette hormone dans l’activité de tétée n’a jamais été investigué Les études associées à ce projet permettront d’identifier les altérations sensorielles ou motrices lors de la tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi, d’étudier comment l’hormone étudiée restaure une tétée normale chez ces souriceaux et quelles régions du cerveau sont activées, et donc d’argumenter l’intérêt d’utiliser cette hormone et définir les conditions optimales pour traiter les bébés Prader-Willi. Ce projet comprend 6 procédures. Au total, 708 souris, dont 678 issues de 164 croisements que nous effectuerons et 30 femelles provenant d'un fournisseur agréé, seront expérimentées.
Bénéfices attendus
Les bébés Prader-Willi présentent dans plus de 95% de cas un déficit de l’activité de tétée qui nécessite une intubation de quelques semaines. Cette intubation peut avoir des conséquences sur le développement et le comportement de ces enfants. Nos études précliniques ont montré que l’administration sous-cutanée d’une hormone (une seule administration à la naissance), permet de restaurer une activité normale de tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi et une amélioration dans le comportement cognitif et social de ces souris plus tardivement. A partir de ces études précliniques, une étude clinique de phase I/II a été mené chez des bébés Prader-Willi montrant une normalisation de la tétée chez ces bébés; une étude clinique en phase 3 est en cours. Il s’agit ici d’un projet qui est focalisé sur la tétée pour comprendre quelles sont les altérations mécaniques ou sensorielles qui empêchent les souriceaux modèles du Syndrome de Prader-Willi de téter normalement et comment une administration de l’hormone étudiée agit sur le plan fonctionnel (sensoriel ou moteur) et sur l’activité neuronale du cerveau pour rétablir une tétée normale chez ces souriceaux. Ce projet amènera : 1) une compréhension des mécanismes fonctionnels et cellulaires du déficit de la tétée dans un modèle du syndrome de Prader-Willi et par extension chez les bébés Prader-Willi ; 2) de mieux comprendre, en général, les mécanismes sous-jacents à l’activité de tétée qui est très peu étudiée ; 3) d’élucider comment l’administration de l’hormone étudiée corrige ce déficit; 4) plus généralement elle nous révèlera le rôle du de tout un système hormonal dans la tétée et cela nous permettra d’envisager d’élargir le traitement à des bébés qui présentent un déficit de tétée à la naissance (soit 10% des nouveau-nés). Les résultats attendus permettront donc de comprendre et de proposer un traitement approprié (en connaissance de cause) du déficit de tétée chez les bébés Prader-Willi mais aussi dans d’autres pathologies qui présentent un déficit de tétée. Cet aspect translationnel est vraiment très important.
Procédures
Sur les mères, les interventions sont : Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes. La séparation avec une partie de leurs nouveau-nés pour quelques heures (même si une partie des nouveau-nés restent avec elles). Sur les nouveau-nés, les interventions sont : Les injections sous cutanée sur les nouveau-nés. L’isolement de la portée de souriceaux de leur mère pendant 4 heures maximum. La manipulation des souriceaux pendant le test de saisie de tétine, La stimulation tactile des nouveau-nés à l’aide d’un pinceau. La stimulation externe (au niveau du tronc cérébral) de nouveau-nés à l’aide d’un laser Infra-rouge (peu énergétique) faite sur animaux non contraints Sur les souris génétiquement modifiées lors du maintien de lignée : caudectomie ; tatouage Il n'y a aucune procédure chirurgicale dans cette DAP. Un prélèvement de queue sera effectué sur animaux vigiles dans le cadre du génotypage si le génotypage ne fonctionne pas à partir d’une touffe de poils prélevée sur l’individu (des mises au point sont en cours) mais concernera au grand maximum 312 souris.
Impact sur les animaux
Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance par leur caractère douloureux. Malgré le temps très court de cette nuisance (
Devenir
Pour l’ensemble des animaux expérimentés en Procédures 1, 2, 4, 5 la mise à mort est justifiée par des analyses post-mortem sur des tissus prélevés. Procédure 3: 30 femelles réutilisées qui, après une première portée, seront utilisées deux fois dans notre étude et pourront aussi être utilisées comme génitrices 2 fois supplémentaires. Après 4 à 5 portées, les femelles seront euthanasiées. Procédure 6: 312 souris seront utilisées comme géniteurs (rices). Il s’agit du maintien de 8 lignées sur 4 ans et d’animaux qui seront géniteurs pour produire les animaux qui seront expérimentés. Ces animaux seront euthanasiés à l’âge adulte vers 6 mois.
Remplacement
Ce projet porte sur la physiologie et physiopathologie de la tétée qui est altérée dans la majorité des maladies neurodéveloppementales et en particulier dans le syndrome de Prader-Willi, qui est notre sujet d’étude. Il n’y a, à ce jour, aucune alternative à l’utilisation de mammifères pour conduire ce type d’étude. La stratégie de l’équipe a consisté en particulier à travailler sur le modèle de souris génétiquement modifié (qui mime ce déficit de tétée) et nous prenons en compte les analyses faites en parallèle sur les bébés Prader-Willi afin d’apporter le maximum de réponses pour comprendre les mécanismes mis en jeu en situation normale et pathologique et, ainsi, mieux traiter les patients.
Réduction
L'utilisation de souris qui sont identiques sur le plan génétique (ici une souche particulière de souris de laboratoire) permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisés. Les tests comportementaux présentent par nature une variabilité interindividuelle importante, encore plus avec les souriceaux à la naissance. Nous utiliserons des femelles qui ont déjà donné naissance à au moins une portée, pour favoriser le comportement maternel et ainsi optimiser le taux de survie des souriceaux. Notre importante expérience pour les tests de comportement depuis plus de 10 ans montre qu’il est généralement nécessaire d’utiliser des effectifs de 15-20 animaux par groupe, dans le test de saisie de tétine, pour valider la démarche statistique. En ce qui concerne les expériences pour étudier l’anatomie du cerveau ou l’activité électrique de neurones, nous utiliserons 6 animaux par condition. Le fait de ne pas distinguer les souriceaux mâles et femelles dans nos analyses (les travaux antérieurs ne montrent pas d’effet sexe sur le comportement de tétée) nous permet de diminuer de moitié le nombre de portées étudiées.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, dépourvu de pathogènes spécifiques. La température et l’hygrométrie sont contrôlées, avec un cycle de lumière de 12h. Les cages enrichies avec du matériel de nidification (dôme et coton) et la présence d'objets (cylindre carton). Les souris sont entre 2 et 4 par cage, mais pas isolées ou exceptionnellement mais moins de 48 heures. La douleur/souffrance des animaux adultes et souriceaux est évalué quotidiennement via l'observation de leur aspect (poil hirsute, position voutée, yeux fermés) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation, ou déplacement la pointe des pattes) en suivant la Grille de Score. Les souriceaux qui réaliseront le test de saisie pourront être isolés de leur mère pendant 20min à 1h. Pendant le temps de séparation de leur mère, les 4 souriceaux seront déposés dans un bac approprié, avec une partie de la litière et du nid de la cage maternelle (pour maintenir les odeurs maternelles) et en posant ce bac sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Sachant que seul 4 petits par portée seront testés, la mère reste dans la cage avec n-4 souriceaux (n étant le nombre de nouveau-nés), ce qui permet de diminuer le stress éventuel de la mère. Lors des injections sur les souriceaux au jour de la naissance et lors du tatouage des animaux de la procédure 6, un analgésique sera appliqué sur la peau pour diminuer la sensation de douleur.
Choix des espèces
L’étude que nous menons, dans le contexte pathologique, sur les déficits de tétée et l’effet de l’ocytocine dans des conditions physiologiques et pathologiques ne peut pas être menée sur des modèles in vitro ou via des modélisations. Cette étude évalue des paramètres de comportement de tétée ainsi que l’anatomie du cerveau. Il est donc nécessaire d’étudier des mammifères, en particulier des modèles de souris de la maladies rare qui nous intéresse mais aussi d’avoir la possibilité de travailler sur des modèles de souris génétiquement modifiés. A ce jour, la souris est donc le modèle le plus adapté à ce type d’étude. Les stades choisis sont le jour de la naissance car le déficit de tétée observé chez les bébés Prader-Willi démarre à la naissance (tout comme dans le modèle souris étudié) et des souris femelles adultes, mères des nouveau-nés étudiés, sont aussi expérimentées.
Rôle des voies de réponse aux défauts de l’homéostasie protéique dans la réponse aux traitements de chimiothérapie dans des modèles murins de cancers MSI (Instabilité des MicroSatellites)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue, une partie sans même être analysée puisqu'elle ne sert qu'à l'entretien de la lignée, 384 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques développent spontanément des lymphomes et des adénocarcinomes intestinaux dans leur première année de vie, avec grossissement de la rate, du thymus et du foie, occlusions intestinales et amaigrissement. Elles reçoivent jusqu'à quarante injections intrapéritonéales sur huit mois, vigiles, et alternent chaque mois deux semaines de régime gras et deux semaines de régime standard, cette alternance servant à faire apparaître plus souvent le type de tumeur étudié. Le porteur affirme qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et conclut qu'il est "nécessaire" de travailler in vivo.
Objectifs
Les cancers MSI (pour microsatellites instables), sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par la perte de l’activité du système de réparation de l’ADN appelée MMR (pour MisMatch Repair). Dans ce type de tumeurs, nous avons rapporté l’effet d’une mutation dans un gène codant pour une protéine dont le rôle est de protéger la cellule d’agressions et stress. La mutation de ce gène présente dans 25 pourcents des tumeurs des patients atteint de cancer MSI, affaiblis la cellule tumorale, tandis que son absence est associée à une résistance des tumeurs aux traitements de chimiothérapie. Avec ce projet nous voulons trouver une nouvelle piste thérapeutique pour les patients atteints de cancer MSI qui présente une mutation dans ce gène et qui donc est résistante à la chimiothérapie. Nous espérons expliquer comment les cellules tumorales utilisent cette protéine pour se défendre des dommages induits par les agents de chimiothérapie. Dans ce projet, nous testerons l'hypothèse selon laquelle la perte de fonction de la protéine influence la sensibilité des cellules tumorales aux chimiothérapies via la modulation de l'activité métabolique de la cellule. D’un point de vue fondamentale ce projet vise à améliorer nos connaissances des mécanismes de résistance à la chimiothérapie de certaines cellules tumorales. D’un point de vue clinique ce projet ouvre à terme des nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de patients atteints de cancers coliques de type MSI.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’élucider dans un point de vue fondamentale et clinique, le rôle du métabolisme dans la réponse à la chimiothérapie des patients atteints de cancers coliques de type MSI (pour Microsatellites instables). Les cancers MSI (pour microsatellites instables), sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par la perte de l’activité du système de réparation de l’ADN appelée MMR (pour MisMatch Repair). Des préliminaires montrent que dans environs 75 pourcents de ces types de tumeurs, le métabolisme et la protéostasie c’est-à-dire la biogenèse, le repliement, le trafic et la dégradation des protéines, seraient associé à une mauvaise réponse au traitement de chimiothérapie et ceci via une protéine spécifique que nous étudions ici. Les résultats que nous obtiendrons ouvriront à terme des nouvelles pistes thérapeutiques pour ce type de cancer
Procédures
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. Les animaux recevront un régime riche en gras à raison de 2 semaines par mois et retrouveront un régime classique les 2 semaines suivantes tout au long du projet. Les animaux recevront différents traitements par injections intrapéritonéales sur animal vigile à raison de 5 injections par mois pendant maximum 8 mois (soit 40 injections maximum). Dès l’apparition de signes évocateurs du développement d’une tumeur, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements pour répondre à la question scientifique.
Impact sur les animaux
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. Les effets indésirables sont donc principalement liés à ce développement tumoral. Les principaux symptômes du lymphome sont une augmentation de la taille des organes comme la rate, le thymus et le foie ainsi que dans certains cas des ganglions qui se manifeste généralement par une prise de volume au niveau abdominale/cou. Pour l’adénocarcinome intestinal, il s’agit d’une tumeur qui reste localisé et n’envahi pas les tissus/organes à distance (pas de métastase). Les souris dans ce contexte peuvent faire des occlusions intestinales qui se manifeste généralement par un amaigrissement. L’alternance entre régime standard et régime riche en gras pourra induire un léger stress en raison du changement d’alimentation (néophobie de la souris). L’administration des différents traitements par injection intrapéritonéale pourront induire un stress et une douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille. Les traitements devraient réduire les effets liés au développement tumorale (lymphome et adénocarcinome) avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités.
Devenir
À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires adaptée afin de prélever des tissus pour analyse. Une partie des animaux ne seront pas analysés puisqu’ils seront euthanasiés dans le cadre de l’entretien de la lignée.
Remplacement
La mise en œuvre de ce projet n’est aujourd’hui possible que grâce à l’obtention préalable de données in vitro. A ce stade de nos recherches, il est important tester notre hypothèse sur un modèle in vivo afin d’ouvrir à terme une nouvelle piste thérapeutique. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Dans le cas d’un projet qui vise à étudier l’effet d’une nouvelle molécule et l’implication du métabolisme dans la réponse à la chimiothérapie, il est nécessaire de travailler sur un modèle in vivo car mieux adaptés à l'observation des effets globaux sur un sujet vivant et en particulier pour ce qui concerne l’initiation et la progression tumoral ainsi que les effets autres qui pourraient se manifester sur l’organisme.
Réduction
Le projet impliquera un total de 384 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. En effet, en se basant sur les données de la littérature nous avons choisi de mettre en une étude séquentielle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Dans un premier temps, un premier lot d’animaux sera inclus pour définir la concentration optimale des traitements. Dans un second temps, nous évaluerons l’impact de ces traitements à leur concentration optimale sur nos modèles transgéniques. Cette stratégie permettant de réduire significativement le nombre d’animaux impliqués. De plus, l’utilisation de la stratégie du riche en gras de manière alterné permet d’accroitre la fréquence du développement de l’un des types de tumeur qui nous intéresse, ce qui permet de réduire la taille des groupes à 20 souris. Il apparait nécessaire de mettre en observation 20 souris par groupe pour espérer mettre en évidence un impact significatif du traitement dans le cadre de notre expérience en restant respectueux de la règle des 3R. Nous utiliserons différents tests statistiques pour l’interprétation fiable de nos résultats.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite). Les contraintes induites par le manipulateur dans ce protocole sont faibles (uniquement l’injection des traitements). Elles sont réalisées par du personnel formé et compétent et avec du matériel adapté en condition stérile. Durant les phases de traitement la surveillance sera augmentée afin de mettre en évidence toute intolérance liée au traitement. Un suivi pondéral des animaux sera réalisé afin de mettre en évidence une éventuelle perte/prise de poids. La principale douleur pouvant être subit par les animaux concerne surtout le développement naturel des tumeurs. Ainsi, grâce au suivi et à la très bonne connaissance des modèles murins utilisés, nous pouvons détecter les premiers signes d’un développement tumoral. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : Les souris sont des animaux modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation des modèles murins est la seule approche permettant d'intégrer le développement tumoral MSI et la complexité de la réponse aux traitements de chimiothérapie. Justification des stades : Les études se feront avec des animaux adultes. Les animaux impliqués dans la mise au point des traitements seront des animaux commerciaux utilisées à partir de 8 semaines de vie. Nous avons choisi cet âge pour tester la toxicité du traitement sur des animaux relativement jeunes afin d’envisager pour la dose un traitement préventif si besoin. Les modèles animaux qui développent des tumeurs spontanément rentreront dans le protocole de traitements à partir d’environs 8-10 semaines. Les souris auront alors atteint un poids et une taille favorable pour pouvoir bien supporter le traitement de chimiothérapie. De plus, grâce à notre expérience de ces modèles, nous savons que l’âge moyenne d’apparition des signes cliniques liés au développement de la pathologie est de 180 jours, ainsi la mise en œuvre d’un traitement à partir de 8-10 semaines nous permettra d’évaluer l’efficacité d’un traitement curatif ainsi que préventif.
Influence de la fréquence de prise alimentaire, pendant les périodes diurnes et nocturnes, sur les paramètres métaboliques de rats obèses.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Soumis à un régime hyperlipidique pendant vingt-huit semaines, hébergés seuls en cage et placés en cycle lumineux inversé, 336 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère et sont tous tués pour le prélèvement de leurs organes. Ils subissent des prélèvements sanguins à la onzième puis à la vingt-troisième semaine de régime, pendant un test de tolérance au glucose. L'objectif déclaré est de mesurer si une alimentation restreinte à quelques heures par jour corrige les dérèglements métaboliques, avec des retombées annoncées pour le travail de nuit et le décalage horaire. Le porteur reconnaît que l'isolement et le régime gras peuvent altérer la masse et la force musculaires des rats, et indique qu'un effectif de 30 est "correct" pour l'analyse statistique dans ce domaine, alors que le projet en compte 336.
Objectifs
L’étude de la destructuration pathologique de l’organisation circadienne de l’organisme, se traduit à long terme par des troubles cliniques sévères (perturbations du sommeil, altérations métaboliques). Notre objectif principal va être d’étudier les voies par lesquelles les horloges principales et secondaires contrôlent la rythmicité des processus physiologique.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche sur l’obésité et le diabète. La prévalence de l’obésité est en constante augmentation au niveau mondial (OMS), de même que les maladies qui lui sont associées (maladies cardiovasculaires, diabète...). Le concept de chronobésité, rattachée aux pathologies diabétiques et obésités, découle de l’hypothèse selon laquelle une désynchronisation chronique du cycle veille-sommeil et des rythmes circadiens (cycle d’environ 24 heures) favoriserait la surcharge lipidique. Les rythmes circadiens sont contrôlés par des oscillations moléculaires que l'on nomme "horloges". L'horloge circadienne principale se situe dans le cerveau, au niveau de l'hypothalamus, elle est synchronisée essentiellement par la lumière, mais également par d'autres facteurs (comportementaux, pharmacologiques ou nutritionnels). En plus de cette horloge principale, des horloges secondaires situées dans les organes périphériques (foie, tissus adipeux, coeur) interviennent également dans le contrôle des rythmes circadiens. Le rythme des prises alimentaires serait régulé par une horloge alimentaire, une meilleure connaissance de la synchronisation alimentaire ouvrira la voie à de nouvelles approches thérapeutiques permettant de corriger les anomalies circadiennes délétères liées aux pathologies métaboliques telles que l’obésité et le diabète. Elle permettrait également de prévenir les troubles métaboliques induits par les désynchronisations dues aux modes de vie actuels (travail de nuit, travail posté, décalage horaire). Les stratégies employées devraient mettre à profit l’effet synchroniseur d'une planification et d'une composition des repas optimisées. Pour mener à bien cette étude, les rats seront soumis à un cycle inversé de 12h/12h : 7h00-19h00 (période nocturne ou d’activité) et 19h00-7h00 (période diurne ou de repos) qui nous permettra d’étudier le rôle de l’horloge alimentaire sur l’impact des désordres métaboliques.
Procédures
De jeunes rats agés de 4 semaines seront soumis à un régime hyperlipidique pour induire une obésité et une insulino-résistance pendant 28 semaines. Les animaux subiront des prélèvements sanguins à la 11ème et 23 ème semaine de régime pendant le test de tolérance au glucose.
Impact sur les animaux
Un stress lié à l'isolement des animaux et un effet délétère à long terme qui peut survenirsur la masse et la force musculaire des rats soumis au régime hyperlipidique.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d'organes.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, nous devons avoir recours à un modèle animal pour mimer et pour mesurer les effets bénéfiques que l’on peut attendre d’un changement de pratique alimentaire telle que l’alimentation limitée dans le temps (TRF :Time Restricted Feeding). L’utilisation d‘un modèle animal est incontournable. En effet, ce type de projet ne peut en aucun cas être remplacé par des expériences in vitro. Nous avons besoin d’étudier des paramètres comportementaux et de physiologie intégrée qui implique les interactions entre les nombreux organes et que l’on ne peut pas modéliser in vitro.
Réduction
Cette étude ne peut être remplacée par d’autres moyens que les modèles animaux, car nous regardons les dialogues inter-organes avec comme résultante le taux de glucose sanguin, nous utiliserons le minimum de rats nécessaire en respectant le bien-être animal (raffinement des procédures, amélioration de leur environnement). Le nombre d’animaux est minimisé et nous effectuerons les différentes expérimentations sur des mêmes groupes de rats tant que celles-ci se révèlent non invasives et peu douloureuses : IPGTT, ITT, PPT et GTT. Les animaux seront leur propre contrôle, cela nous permet ainsi de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le domaine de l'étude d’une désynchronisation des repas, un n de 30 est correct pour l'analyse statistique : Utilisation du Test de Student et du Test ANOVA. Il n’existe pas de modèles in vitro permettant ce type d’analyse. En vue d’appliquer les réglementations Européennes en termes de réduction.
Raffinement
Le soin apporté aux animaux par le personnel animalier et les responsables du projet a pour but d’améliorer le bien-être des rats. De réduire, supprimer ou soulager les douleurs. Les causes de souffrance et de stress pourraient provenir du régime alimentaire hyperlipidique ou de l’isolement. Le milieu de vie en cage d’hébergement est enrichi en bâtons de bois. Le suivi des animaux se fait individuellement (manipulation 5jours/7, suivi du poids corporel) tout au long de l’étude jusqu’à la mise à mort. Le mal être inattendue d’un animal est pris en charge selon les points limites établis et à une utilisation des procédures réglementaires et à la mise à mort. Ce suivi permet de valider les résultats scientifiques
Choix des espèces
Le rat Sprague Dawley développe une obésité sous régime hyper lipidique (5524cal/g) ce régime modélise plus fidèlement les apports caloriques actuels chez l’homme, sans pour autant induire de diabète de type 2. Il est également important de noter que des « sous-groupes » d’animaux apparaîtront au sein de ces animaux, en effet certains prendront du poids suite à la consommation du régime, alors que d’autres se maintiendront à un poids normal, présentant une résistance à l’induction de l’obésité par le régime. Pour ce projet, les changements métaboliques attendus (prise alimentaire, prise de poids, glycémie, insulinémie), les organes impliqués (intestin, cerveau, muscles, foie, tissus adipeux) et le fluide biologique (LCR) sont tels que nous sommes contraints d'avoir recours à un modèle préclinique proche des pathologies métaboliques humaines telles que l’obésité. Les rats Sprague Dawley arriveront à l’animalerie à l’âge de 3 semaines (jeunes sevrés), ils auront une semaine d’habituation à l’animalerie. Ils seront utilisés à l’âge de 4 semaines.Ils seront mis en cage individuellement pour obtenir une obésité juvénile avec prise de poids corporel et de masse grasse, ils seront soumis à deux régimes hyperlipidiques . Un autre groupe de rats du même âge auront une nourriture standard ad libitum. L’objectif est également de vérifier l’efficacité du TRF (Time Restricted Feeding), une approche diététique où l’apport calorique est réduit à quelques heures sans altérer l'apport quotidien en qualité ou en quantité de nutriments afin de lutter contre l’obésité et les troubles métaboliques. Pendant toute la durée de l’étude. Ils seront en cycle inversé et ils seront utilisés pour l’expérimentation à l’âge de 11 semaines.
Etude du rôle des récepteurs nucléaires orphelins au cours du développement préimplantatoire murin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Toutes tuées pour que leurs embryons soient prélevés, 1 747 souris femelles vont être utilisées dans une procédure déclarée d'un niveau de souffrance léger. La superovulation leur est provoquée par deux injections intrapéritonéales d'hormones à quarante-huit heures d'intervalle, de façon à porter à vingt ou trente le nombre d'embryons prélevés sur chaque femelle. Le porteur écrit que ces injections sont "dénuées de tout effet nocif" tout en reconnaissant une douleur, un inconfort et un stress de courte durée. Il indique que ses travaux antérieurs sur cellules souches embryonnaires ne récapitulent pas la ségrégation des lignages dans l'embryon et qu'il doit désormais tester ses conclusions directement sur des animaux.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de clarifier les rôles joués par une classe de facteurs capables de contrôler l’expression de gènes, dans le développement de l’embryon de souris. Après la fécondation, les embryons de mammifères doivent générer rapidement tous les types de cellules nécessaires pour s'implanter dans l'utérus et se développer. Ce processus dépend de la mise en route de l’expression de gènes (en anglais: zygotic genome activation, abrévié ZGA), et sur la réinitialisation de l'état de l'ADN hérité des parents. Cette opération est nécessaire pour effacer l’origine parentale de l’ADN au début de la vie et comprend la nécessité de réparer et d'étendre les extrémités des molécules d'ADN, dans des régions connues sous le nom de télomères. Les récepteurs nucléaires ont été impliqués dans ce processus, mais il reste à prouver qu’ils ont un rôle essentiel. Une fois la ZGA achevée et après les deux premières divisions cellulaires, des cellules différenciées émergent et vont donner naissance au trophectoderme, qui formera une partie du placenta, l'endoderme primitif, qui contribue au sac vitellin, et l'épiblaste, qui génère tous les tissus constituant le corps adulte. Ce potentiel immense de l’épiblaste est qualifié de pluripotence. Nos travaux antérieurs in vitro sur des cellules embryonnaires souches, lignées cellulaires issues de l’embryon qui conservent le même potentiel immense de différenciation, ont montré que deux récepteurs nucléaires, sont ensemble indispensables au maintien de la pluripotence. Il est donc important de comprendre si l'acquisition de la pluripotence repose aussi dans le contexte du développement embryonnaire naturel sur l'activité de cette classe de gènes. Bien que les résultats publiés sur l’inactivation des gènes de récepteurs nucléaires ne montrent pas d’effet sur les premiers jours du développement, nous pensons que l'importance de ces gènes a été masquée par la capacité de l’embryon à compenser l’absence de l’un des gènes par un autre gène de la famille. En utilisant de souris génétiquement modifiées nous allons définir le rôle synergique de plusieurs récepteurs nucléaires dans la réinitialisation et l’activation du génome, la spécification de différents types cellulaires embryonnaires, et en particulier dans l’acquisition de la pluripotence. L'objectif principal de ce projet est donc de générer de nouvelles connaissances scientifiques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre le rôle d'une classe importante de gènes, les récepteurs nucléaires orphelins, dans la coordination des premiers jours du développement embryonnaire, qui aboutit à la formation entre autres d’une population de cellules capable de donner naissance à tous les types de cellules constituant le corps adulte. L’embryon permet d’obtenir des cellules qui peuvent être cultivées et maintenues en laboratoire in-vitro: les cellules souches embryonnaires, ou « ESCs ». Comme les cellules de l’embryon préimplantatoire, les ESCs sont aussi pluripotentes et capables de générer de nombreux types cellulaires. Cette propriété remarquable suscite beaucoup d’espoir dans le domaine médical dans le cadre de thérapies de remplacement cellulaire. Une des retombées de nos travaux sur les embryons est d’identifier les conditions permettant de dériver des modèles cellulaires de type ESCs, mais plus immatures et donc possédant des potentialités accrues de différenciation. Ainsi, en plus de générer des connaissances de base pour mieux comprendre le développement embryonnaire de la souris, mais également d’autres mammifères, nos résultats pourraient faire progresser de manière significative notre capacité à utiliser les ESCs dans la clinique.
Procédures
Nous utiliserons la superovulation, une technique basée sur 2 injections consécutives d'hormones par voie intrapéritonéale, nécessitant l'immobilisation de l'animal pendant moins d’une minute, à 48 heures d'intervalle.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux seront dues à deux injections d’hormones dans l’abdomen. Ces injections sont dénuées de tout effet nocif dans les conditions d’utilisation prévues. Néanmoins, elles peuvent entrainer une douleur, inconfort et stress de sévérité légère de courte durée sans impact sur la santé ou le bien-être animal.
Devenir
Toutes les femelles seront mis à mort pour prélever des embryons.
Remplacement
Nos travaux antérieurs ont largement utilisé les cellules en culture (ESCs) et ont permis d’identifier une classe de gènes, les récepteurs nucléaires orphelins, qui pourraient être impliqués dans les processus de différenciation cellulaire. Bien que l'étude in vitro des lignées de cellules pluripotentes présente un intérêt indéniable, ce modèle de différenciation ne récapitule pas complètement les mécanismes qui contrôlent la ségrégation des différents lignages embryonnaires, et les résultats obtenus en culture doivent être vérifiés et développés dans le contexte du développement naturel. C'est précisément pour ces raisons que nous devrons maintenant tester directement sur des animaux les conclusions de nos études précédentes.
Réduction
Notre travail est basé sur la comparaison entre des embryons témoins et des embryons porteurs de mutations dans différents gènes. Pour réduire le nombre de souris femelles utilisées, nous avons : • optimisé les croisements, de sorte que chaque femelle produit à la fois les embryons témoins et des embryons porteurs des mutations étudiées, dans les proportions désirées. • Nous prévoyons aussi d'utiliser la superovulation, une technique permettant d'obtenir, à partir de chaque femelle 20-30 embryons. Nous chercherons également à utiliser le moins d'embryons possible pour chacune des approches expérimentales : • Nous devrons évaluer l'expression des gènes dans les embryons et la capacité de l'ADN à être lié et modifié par des facteurs régulant le développement. Pour ces techniques basées sur le séquençage ADN, les exemples existants dans la littérature font souvent état de l'utilisation de centaines d'embryons par échantillon. Nos données préliminaires suggèrent que des données informatives sont obtenus à partir d'embryons uniques, bien que le bruit de fond et les effets de lot soient dans ce cas substantiels. Des améliorations techniques ont été implémentée, pour maximiser la reproductibilité, permettant l'utilisation de seulement 5 embryons par condition, répétée en 5 expériences indépendantes. • Nous devrons également visualiser par microscopie la présence et la localisation des facteurs contrôlant la spécification et la prolifération de chaque type cellulaire de l’embryon précoce, ainsi que suivre les extrémités des molécules d'ADN présentes dans chaque cellule, les télomères, et les protéines actives à ces régions. Nous utiliserons aussi la microscopie pour mesurer les niveaux d'expression génique globaux, et ceux de gènes spécifiques. Pour analyser chacun de ces facteurs/gènes par microscopie, entre 5 et 10 embryons sont nécessaires, et les analyses doivent être répétées au moins 3 fois. Néanmoins, 3 marqueurs peuvent souvent être analysés sur chaque embryon en même temps. Nous veillerons donc à coupler la détection de plusieurs marqueurs par embryon, et nous analyserons le moins de marqueurs possible, tout en obtenant des résultats informatifs. Enfin, des modèles de culture cellulaire pourront nous aider à établir des priorités ou d'éliminer certaines sections expérimentales tout au long de l'exécution du projet.
Raffinement
Les souris concernées par cette demande sont les femelles donneuses d’embryons, sur lesquelles deux injections intrapéritonéales seront réalisées. Bien que ces injections ne soient pas dommageables, tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, nous veillerons à ce que les animaux n'assistent pas aux injections d'autres individus, pour ne pas provoquer de stress avant la procédure. Nous immobiliserons les animaux avec précaution, et après qu'il se soient adaptés à la manipulation par l’expérimentateur.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui partage 99% d’homologie avec le génome humain, d’où son intérêt majeur en recherche fondamentale sur le développement. En plus, des souris génétiquement modifiées existent déjà pour les gènes étudiés. Les souris femelles donneuses d’embryons sont des souris âgées de 3 à 12 semaines : la stimulation hormonale est efficace pour induire l’ovulation sur cette tranche d’âge.
Elevage de souris génétiquement altérées immunodéficientes dans un contexte de recherche en cancérologie.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris de cette lignée naissent dépourvues de système immunitaire fonctionnel, ce qui les rend vulnérables aux agents pathogènes courants comme aux germes commensaux, et impose une vie entière derrière des barrières stériles, avec eau acidifiée et cages autoclavées. 10 100 souris vont être élevées ainsi, dans une procédure déclarée d'un niveau de souffrance léger, l'unique geste décrit étant le changement hebdomadaire de cage à la pince. Le porteur signale chez les animaux plus âgés des queues enroulées, des têtes inclinées et des boiteries du train arrière, à une fréquence qu'il estime supérieure à 0,5 %. Cette production continue alimente des projets de cancérologie où ces souris facilitent la prise de greffes tumorales, leur devenir se réglant alors dans ces autres autorisations.
Objectifs
Les cancers sont une cause majeure de décès, derrière les maladies cardio-vasculaires.Ils représentent environ 13% de la mortalité mondiale. La croissance tumorale et la dissémination métastatique sont des processus très complexes et dynamiques dont les mécanismes ne sont pas encore compris dans leur entièreté. La recherche préclinique sur modèles animaux est aujourd’hui une étape indispensable pour améliorer notre compréhension de ces maladies et pour évaluer l’innocuité et l’efficacité des nouvelles thérapies. L’implantation orthotopique de cellules ou de tissus tumoraux permet de reproduire le plus fidèlement possible les mécanismes intervenant en pathologie humaine afin de pouvoir prédire l’efficacité clinique des nouvelles molécules anticancéreuses. A cette fin, notre plateforme d'élevage et d'expérimentation animale assure la production de souches de souris immunodéprimées (dont la souche NSG : NOD-SCID Gamma) qui facilitent la prise tumorale. Aussi, ce projet vise à décrire les procéssus de production et de soins apportés à l'élevage de cette souche de souris immunodéprimée impliquées dans les projets de recherche nécéssitant l'utilisation d'animaux de laboratoire et autorisées par le Ministère de l'Enseignement Supérieur.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes impliqués dans l'initiation au développement du cancer jusqu’à sa dissémination sous forme plus agressive (métastatique) permet d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et visent à développer des approches innovantes ciblant les altérations de la cellule cancéreuse ou de son environnement dans le but de progresser vers de nouveaux traitements.
Procédures
Change hebdomadaire de cage au moyen de pince stérile
Impact sur les animaux
Les souris NSG sont gravement immunodéficientes et sensibles à l'infection par un large éventail d'agents pathogènes normaux, d'agents pathogènes opportunistes et d'organismes commensaux.
Devenir
L'élevage des souris NSG permettra d'inclure les souris produites en continue dans des projets de recherche permettant de mieux comprendre le développement des cancers et de trouver de nouvelles pistes de thérapie.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité la réponse immunitaire et l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale, ainsi que les relations entre les différentes cellules dans un contexte physiologique ou pathologique. Cela est impossible à reproduire in vitro (dans des cultures de cellules) en raison de la complexité des interactions entre les différents types de cellules jouant un rôle dans le développement et la progression de la maladie
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir produire les souris NSG inclus dans les demandes d'autorisation de projet. Les besoins de production seront analysés tous les trimestres afin d'ajuster le nombre d'animaux au calendrier des procédures en cours d'exécution.
Raffinement
Les souris NSG sont gravement immunodéficientes et sensibles à l'infection par un large éventail d'agents pathogènes normaux, d'agents pathogènes opportunistes et d'organismes commensaux. Le maintien de souris NSG sans agents pathogènes est possible et réalisable par la mise en œuvre de pratiques de barrière strictes et d'une technique aseptique, pour garantir l'état de santé des souches NSG • Tous les aliments, eau, litière et cages entrant dans la pièce doivent être autoclavés ou stérilisés d'une manière ou d'une autre. • Microisolateur ou pressurisé en cage ventilé individuellement (PIV) est recommandé • L’acidification de l’eau à pH 2,5 – 3,0 contribue à prévenir l’infection par les espèces de Pseudomonas • L'équipement de protection individuelle (pâtelages stériles, rotules, gants, masques et couvre-cheveux) doit être porté à tout moment pour couvrir votre peau et minimiser les risques de propagation des bactéries aux souris. • Mordre les souris avec des pinces désinfectées, et/ou avec des mains gantées qui ont été stérilisées avec de l'éthanol • Changer de cage sous une hotte à circulation laminée. Désinfectez les mains après avoir ouvert le dessus de la cage ventilée, atteindre la cage ou retirer vos mains gantées de la cagoule. Désinfecter la hotte entre les changements • Dans un environnement de barrière strict, changements bihebdomadaires sont suffisants pour maintenir des souris saines. Cependant, les installations de recherche pourraient envisager de changer de cage chaque semaine pour empêcher l'introduction de doses minimales d'organismes opportunistes ou de plantes dans l'environnement de la cage • La queue enroulée, l'inclinaison de la tête et la boiterie des membres arrière sont observées à basse fréquence. Ces affections sont très peu fréquentes (incidence de 0,01 %) chez des souris jeunes, expérimentalement ou nées. L'incidence est estimée à plus de 0,5 % chez les souris plus âgées utilisées pour l'humanisation et d'autres études.
Choix des espèces
Les animaux utilisés pour la recherche permettent d’étudier les maladies et leurs traitements sur des systèmes vivants comparables par de nombreux aspects au corps humain. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe (interactions entre les gènes et les facteurs environnementaux, mécanismes de croissance et de dissémination) et pour améliorer les stratégies préventives, diagnostiques et thérapeutique (amélioration des moyens de détection, développement de nouveaux traitements, adaptation du traitement au phénotype précis des tumeurs). Les souris reproductrices seront selectionnées à l'age de 8-10 semaines, elles seront mises en accouplement à l'âge adulte (8 semaines), stade qui correspond à leur maturité sexuelle pour une période de 6 mois. Le sevrage et le sexage seront réalisés entre 3 et 4 semaines. Les souris impliquées dans les projets entreront dans les procédures expérimentales à l'age de 5 à 12 semaines.
Etude de la dépendance du genre à la restriction potassique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
156 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune passant soixante-douze heures puis quatre-vingt-seize heures seule en cage à métabolisme, sur un sol grillagé que le porteur décrit lui-même comme peu confortable. Sept fois, elles sont enfermées deux minutes dans un tube étroit pour une mesure de composition corporelle, la vessie vidée au préalable par massage abdominal. Un régime carencé en potassium leur est imposé et deux prélèvements sanguins sont pratiqués sous anesthésie, avant une chirurgie de quinze minutes sans réveil pour prélever les reins. Le porteur annonce comme bénéfice humain une prise en charge peut-être différente des hypokaliémies féminines, et comme bénéfice pour les animaux non-humains le fait de pouvoir désormais associer les femelles de ses élevages aux expériences.
Objectifs
Au-cours de l’évolution, nous avons considérablement changé nos habitudes alimentaires passant d’un régime riche en potassium et pauvre en sel à un régime (dit régime occidental) diamétralement opposé. Nous sommes actuellement très loin des recommandations de l’organisme mondial de la santé concernant les apports nutritionnels en sodium et potassium. Heureusement nos reins sont là pour nous aider à faire face à ces changements. Cependant, à long terme cette alimentation peut contribuer au développement de maladie comme l’hypertension et être corrélée à un risque accru de mortalité. Il est bien connu que le manque de potassium dans l’alimentation va induire une adaptation :1) le muscle peut relarguer du potassium contribuant rapidement à la modulation du potassium plasmatique et 2) le rein va diminuer sa sécrétion de potassium dans les urines et augmenter sa réabsorption vers le sang. Deux protéines essentielles à l’adaptation à un régime dépourvu de potassium ont été mise ne évidence : un transporteur rénal spécifique et un facteur de croissance,. L’ensemble de ces études ont été réalisé chez le mâle. Cependant une étude récente montre une différence d’adaptation à un régime carencé en potassium entre des souris mâles et femelles. Notre projet vise à comparer l’adaptation rénale de souris mâles et femelles à la restriction en potassium, et en comprendre les différences. L’ensemble des études seront réalisées chez des souris mâles et femelles sauvages ou n’exprimant pas le transporteur rénal spécifique ou le facteur de croissance .
Bénéfices attendus
La prévalence de l'hypertension artérielles est très élevées dans nos populations avec une différence notoire entre les hommes et les femmes (36 pourcents contre 25.2 pourcents - Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire, 2018). Notre étude est un projet original de recherche fondamentale dans le domaine de la physiologie et physiopathologie rénale. Du point de vue des animaux, les résultats permettront de mettre en œuvre un des aspects des 3R, à savoir la réduction puisque nous pourrons associer les femelles de nos élevages à nos expériences. Du point de vue bénéfice humain, les résultats nous permettront de peut-être envisager une prise en charge différente des hypokaliémies féminines. Nos recherches désigneront des protéines importantes, potentielles cibles thérapeutiques, qui pourraient être différentes chez les hommes et les femmes.
Procédures
Au cours de ce projet, nous réaliserons 5 prélèvements urinaires en cages à métabolisme sur animal vigile au cours de 2 sessions en cage spécifique. La première session en cage métabolique implique un hébergement individuel de 72h à raison de 48h d’habituation et 24h pour le recueil. La seconde session dure 96h correspondants à 4 fois 24h pour 4 recueils. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation en continue dans ces cages. Nous effectuerons 7 mesures de la composition corporelle en fluides (masse grasse, masse maigre et eau libre) en utilisant un appareil de résonance magnétique nucléaire dédié à ces mesures . Cette technique est non invasive et n’induit aucune douleur chez l’animal. L’animal est placé délicatement dans un petit tube qui restreint ces mouvements, le tube est placé dans l’équipement de mesures durant 2 minutes, puis l’animal est sorti du tube et replacé dans sa cage. Nous réaliserons également 2 prélèvements sanguins de faible volume réalisés sur des animaux anesthésiés et analgésiés : les 2 prélèvements seront espacés d’environ 11 jours, le geste dure 1min/animal. Enfin, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie et analgésie au cours d’une chirurgie sans réveil (15 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des interventions sont connus car déjà testés chez l’animal. Le régime carencé en potassium est normalement bien toléré. La mise en cage à métabolisme peut entrainer un stress chez l’animal, par le fait qu’elle restreint légèrement la liberté de mouvement des souris et qu’elle impose un hébergement individuel des animaux . Leur structure rend l’ hébergement peu confortable sur une grille. La mesure de Kalièmie nécessite un prélèvement sanguin qui sera fait sous anesthésie et qui peut entrainer une hémorragie. Les risques liés à l’anesthésie sont à prendre en compte, comme par exemple, la survenue d’une l’hypothermie. Certaines souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle par mesure de résonance nucléaire magnétique. Cette procédure peut entraîner un léger stress au moment de la manipulation des souris pour vider leur vessie par massage abdominale et le temps de la mesure (2 minutes ).
Devenir
A la fin de chaque procédure , tous les animaux de la procédure seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie. L'euthanasie des animaux est requise en raison des prélèvements d'organes nécessaire pour répondre à la question scientifique.
Remplacement
Notre projet vise à comparer l’adaptation rénale de souris mâles et femelles à la restriction en potassium. Cette adaptation met en jeu différents organes qui vont interagir les uns avec les autres via différents stimuli (messages hormonaux, humoraux…). L’analyse d’une telle complexité nécessite de travailler sur des organismes vivants entiers (ici des souris).
Réduction
Pour les procédures mise en œuvre, le nombre de souris par groupe sera de 12 animaux pour une procédure et 14 animaux pour l'autre. Il y aura 6 groupes par procédure soit un total de 156 animaux. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Ce chiffre correspond au nombre de souris nécessaires afin de mettre en œuvre les analyses statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Dans la mesure du possible, un même animal sera utilisé pour la mesure de plusieurs paramètres comme décrit dans les différentes procédures.
Raffinement
Les procédures de raffinement mises en place sont les suivantes : 1) 5 souris maximum par cages en portoir ventilé, dans des conditions d’hébergement conforme à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée 2) Libre accès à l’eau et la nourriture sous forme de croquettes (en hébergement individuel, la nourriture sera en poudre et déposée dans la mangeoire adéquate), 3) Enrichissement par nids végétaux et/ou tunnels en carton ou plastique dans les cages et/ou buchettes en peuplier de taille moyenne, sans traitement chimique et autoclavable (les animaux peuvent les ronger, les déplacer…). Lors du passage en hébergement individuel, étape indispensable pour avoir accès aux métabolites urinaires et à la fonction rénale, les cages sont placées côte à côte afin que les animaux gardent un contact visuel, auditif et olfactif. Nous placerons une petite coupelle en verre de 6 cm de diamètre et de 1cm de hauteur de bord dans la cage qui servira de nid à la souris. Nous avons, au préalable, vérifier que la majorité des souris s’installent dans cette coupelle pour dormir et que cela ne change pas les recueils d’urine ou de fèces. Pour la mesure dans l’appareil à résonnance magnétique nucléaire, les animaux seront habitués à être manipulés et à être placés dans le tube de mesure. Les mesures de kaliémie seront réalisées sous anesthésie totale . L’expérimentateur qui fera ces prélèvements a plus de 10 ans d’expérience. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux subiront une anesthésie sans réveil, avec analgésie. L’ensemble des expériences sera mené par des personnels hautement qualifiés et formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Choix des espèces
L’intérêt d’utiliser des souris est que nous possédons des résultats préliminaires chez cette espèce. De plus les modèles transgéniques que nous voulons étudier existent chez la souris et nous les élevons à l’animalerie. Nous utiliserons des souris adultes mâles et femelles « normales » (dites sauvages) et transgéniques âgées de 8 à 16 semaines. L’âge adulte est nécessaire pour que la néphrogénèse (développement du rein) soit totalement terminée.
Etude du rôle de l’inflammation dans l’obésité chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Comparer un régime riche en graisses donné en continu ou par alternance de deux semaines : 2 080 souris vont être utilisées pendant vingt semaines de régime gras, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Les nouveau-nés subissent une biopsie de la queue pour génotypage, puis les animaux reçoivent jusqu'à quatre injections intrapéritonéales, un gavage et jusqu'à dix prélèvements sanguins à la veine de la queue, le dernier se faisant en rétro-orbitaire sous anesthésie. Pendant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, chaque souris est isolée dans sa propre cage. Le porteur annonce des points limites lors de ces tests, avec apport de glucose ou d'insuline si les seuils sont atteints, et un enrichissement par bâtonnets de bois pour éviter que les dents ne poussent anormalement faute d'aliment dur.
Objectifs
L’obésité est en augmentation croissante dans les pays industrialisés et les pays en voie de développement et contribue à l’augmentation des pathologies cardiovasculaires qui se situent au premier rang des causes de mortalité dans le monde. De ce fait, l’étude des mécanismes impliqués dans le développement de cette pathologie constitue un enjeu majeur de santé publique. Notre projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans l’obésité, et plus particulièrement d’étudier les effets induits par un régime induisant l’obésité donné de manière discontinue en comparaison avec ce même régime donné de manière continue. Nous étudierons en particulier les effets de ces 2 régimes sur la modulation de la réponse inflammatoire. Seule l’expérimentation in vivo, qui mime de façon fidèle la complexité de la réponse inflammatoire dans un contexte d’obésité nous permettra de mettre en lumière des acteurs clés impliqués dans la pathogenèse de cette maladie. Pour cela, nous évaluerons différents paramètres métaboliques et immunologiques chez des souris soumises à un régime riche en acides gras. Pour induire l’obésité, nous allons utiliser un modèle d’obésité chez des souris contrôle et des modèles génétiquement modifiés (mâles et femelles, nombre total de souris : 2080 sur une durée de 5 ans). Ce modèle murin est une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de cette maladie. En effet, actuellement il n'y a pas de systèmes in vitro qui reproduisent, imitent ou permettent la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’obésité chronique. Ce projet comporte 2 procédures : (A) une qui consiste en la mise des animaux sous régime riche en matières grasses soit de manière continue ou discontinue (en alternant le régime gras et standard toutes les 2 semaines) pendant une durée maximale de 20 semaines de régime gras pour les 2 groupes de souris. Cette durée de régime gras de 20 semaines permet le développement de l’obésité. Pour évaluer les paramètres métaboliques des tests de tolérance à l’insuline et au glucose seront effectués. Ces tests consistent en l’administration d’insuline par voie intrapéritonéale ou de glucose par voie orale, des prélèvements de sang seront ensuite réalisés sur souris vigile à différents temps pour doser le taux de glycémie. Il y a également un prélèvement sanguin à effectuer avant la mise à mort des animaux. (B) une seconde pour l'élevage des animaux.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet nous permettront de comprendre, in vivo, le rôle de l'inflammation mise en jeu dans les différents types cellulaires et tissulaires et son implication dans l'obésité. Cela permettra de définir de nouvelles approches thérapeutiques ciblant la réponse immuno-inflammatoire pour le traitement des patients présentant des maladies métaboliques telle que l'obésité.
Procédures
Des animaux seront utilisés pour la génération de colonies d'animaux. Les nouveaux-nés auront une biopsie caudale. Les animaux auront jusqu'à 4 injections intrapéritonéales sur toute la durée de la procédure (durée inférieure à 30 secondes par injection) . Les animaux vigiles auront un gavage (durée inférieure à 30 secondes) au cours de la procédure. Des prélèvements sanguins auront lieu sur animaux anesthésiés (une seule fois avec une durée inférieure à 30 secondes) ou vigiles à la veine de la queue (jusqu'à 10 prélèvements de moins de 30 secondes).
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : 1- inconfort lié à la préhension et contention des animaux, lié au gavage, 2 - potentielle douleur au point d'injection en intrapéritonéale et au prélèvement sanguin terminal en rétro-orbitaire, 3 - stress lié à l'anesthésie, à l'individualisation des animaux durant les tests métaboliques et aux prélèvements de sang à la queue.
Devenir
A l'issue des différents gestes techniques, tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure dans le but de prélever les différents organes ou tissus d'intérêt. Ceci nous permettra d'étudier les populations cellulaires d'intérêt à l'aide de différentes expériences, afin de répondre aux différentes questions posées dans le cadre de ce projet.
Remplacement
Actuellement il n'existe pas de système in vitro qui reproduise, imite ou permette la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’obésité. Les modèles in vivo sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l’obésité. L’expérimentation in vivo est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie.
Réduction
Selon le principe de réduction décrit au 2° de l'article R. 214-105 du code rural et de la pêche maritime, et à partir des données de la littérature et de notre expérience sur le sujet (résultats analysés avec des tests statistiques adaptés), nous avons déterminé un nombre minimun de souris par groupes expérimentaux pour avoir assez de matériel et garantir une analyse statistique fiable. Nous visons toujours à maximiser l'information qui peut être récupérée à partir d'un seul animal. Les accouplements (en trio) seront optimisés (choix des génotypes) pour permettre l'obtention des groupes d'animaux nécessaire à la réalisation des expériences dans les conditions définies ci-dessus.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Le suivi quotidien de tous les animaux par le personnel qualifié (zootechniciens et expérimentateurs) et la mise en place de points limites adaptés permettront d'identifier et de limiter toute souffrance et douleur. Il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas : maisonnettes si des comportements de domination sont observés ; bâtonnets de bois pour les cages sous régime riche en gras (aliment mou) pour éviter la pousse ou abrasion dentaire anormale. Lors des procédures expérimentales, les nuisances seront réduites au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Pour la procédure des tests métaboliques de tolérance à l'insuline et au glucose, les souris seront individualisées pour limiter les interactions avec les congénères, la glycémie sera suivie en cinétique et l'apport de glucose ou l'insuline sera réalisé si nécessaire en fonction des points limites définis. Ensuite, les animaux retourneront avec leurs congénères, dans la cage d’hébergement d'origine pour limiter le stress lié au changement de cage. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs ou par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Un suivi hebdomadaire du poids des animaux sera réalisé par les expérimentateurs.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude de l'obésité avec notamment le développement du syndrome métabolique dans un laps de temps raisonnable. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées génétiquement modifiées que nous souhaitons étudier. En effet, la souris est l'espèce dont la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. L’utilisation des souris permet ainsi d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés, qui nous permettront d’appréhender le rôle spécifique d’un type cellulaire, d’un facteur ou encore d’une voie de signalisation dans l’obésité. Grace à ces modèles murins, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Les souris seront utilisées au stade adulte, à partir de 8 semaines. Le développement de l’obésité est corrélé à l’âge, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes. Au stade nouveaux-nés, les animaux seront marqués par bagage et une biopsie caudale sera réalisée afin de génotyper et ainsi sélectionner les animaux génétiquement modifiés pouvant rentrer dans la procédure.
Maintien de ressources génétiques pour l’étude de caractères de fitness et de variants morphologiques chez la poule
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Maintenir sur pied des lignées de poules pour de futures expériences et pour l'expertise utile aux sélectionneurs commerciaux : 3 640 poules vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, réutilisées ensuite comme reproductrices ou dans d'autres protocoles. Chaque animal subit une ou deux prises de sang de moins d'une minute, parfois au sinus occipital, geste dont le porteur reconnaît qu'il peut provoquer des lésions cérébrales. Le passage en cage collective ouvre des épisodes de picage pouvant aller jusqu'à des plaies cutanées profondes et des atteintes de l'appareil locomoteur, et les élevages de longue durée entraînent des dégradations d'état général dont la cause reste parfois indéterminée avant autopsie. Le porteur situe l'intérêt de ces lignées dans la coloration du plumage, caractère servant à distinguer les poulets commerciaux sur les marchés à l'export, et dans un déterminisme d'ovulations multiples encore inconnu.
Objectifs
Pour la lignée d'origine égyptienne , le présent projet vise à maintenir son originalité en limitant l'évolution de la consanguinité, inévitable dans une population fermée, et à caractériser son génome de manière approfondie. Pour les génotypes modèles, le projet consiste à produire des animaux de phénotypes contrastés au sein de familles informatives afin d'identifier la base moléculaire de ces phénotypes. Pour tous les caractères morphologiques, le déterminisme monogénique est déjà établi, mais la nature du gène responsable reste à identifier par séquençage du génome et analyses histologiques. Pour la lignée à ovulations multiples, un projet de séquençage est en cours pour identifier les régions du génome contrôlant ce caractère par différence avec les données de séquençage d’autres lignées de race identiques qui ne présentent pas ce phénotype.
Bénéfices attendus
La lignée d'origine égyptienne a déjà été étudiée pour l'étude des mécanismes de résistance à la coccidiose, à la maladie de Marek et a montré un effet d'hétérosis important en croisement avec une lignée commerciale de poules pondeuses à oeufs bruns. C'est un génotype de référence à garder disponible sur pied pour de futures expériences sur l'adaptation à des conditions d'élevage diversifiées ou sub-optimales. Les modèles génétiques donnent lieu à des publications de haut niveau présentant le mode d'action de gènes importants pour le développement ou pour la pigmentation. La coloration est un caractère utilisé pour distinguer différents types de poulets commerciaux et se révèle importante pour les sélectionneurs visant des marchés à l’export. Le maintien de ces modèles permet de conserver une expertise utile pour des collaborations avec les sélectionneurs commerciaux. Le déterminisme des ovulations multiples est encore inconnu, en particulier dans les lignées légères comme la race Leghorn blanche. Le maintien de cette lignée nous permet d’appliquer une approche de génétique inverse pour identifier ce déterminisme et de pouvoir ensuite réaliser des prélèvements pour valider des gènes candidats suggérés par l’approche génétique.
Procédures
Une à 2 prises de sang d'une durée de moins d'une minute
Impact sur les animaux
Le passage en cage collective ou en parquets au sol de groupes de coqs modifie la structure sociale du groupe, entraînant des comportements de dominance-dominé qui peuvent être observés jusqu'à ce que la structure sociale se rétablisse. Le passage à la cage collective comporte intrinsèquement des risques de picage entre les animaux, pouvant entraîner des plaies cutanées plus ou moins profondes et étendues, ainsi que des atteintes à l'appareil locomoteur. Au cours des élevages de longue durée comme celui-ci, une dégradation de l'état général d'un individu peut également être observée, les causes étant parfois indéfinies avant une autopsie. La réalisation d'une prise de sang est susceptible de conduire à la formation d'un hématome. Si elle est effectuée au niveau du sinus occipital, des lésions cérébrales peuvent survenir. La contention au moment de la prise de sang peut également générer un stress chez l'animal, qui est momentanément privé de ses mouvements (maximum 1 minute).
Devenir
Nous utilisons les individus pour permettre la production d'une descendance. Les animaux n'ayant pas subi d'intervention majeure, nous envisageons de pouvoir les réutiliser dans des protocoles de recherche nécessitant des individus en bonne santé et de génotype connu.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de maintenir une population d'animaux vivants présentant des phénotypes d’intérêt. Cette démarche ne serait pas réalisable sans leur utilisation. Toutefois, il est possible de réaliser de la congélation de semence pour les animaux porteurs de mutations identifiées. Le taux d’éclosion en semence décongelée reste très variable et toujours inférieur à 50%, donc on ne peut utiliser cette solution de remplacement que pour conserver des coqs porteurs d’une mutation déjà identifiée, facile à suivre dans leur descendance. En revanche, pour la lignée Fayoumi, des essais antérieurs de congélation de semence ont montré une faible fertilité après décongélation, donc cette solution est un appoint pour sécuriser la lignée ou reconstituer des familles perdues, mais en aucun cas une solution de remplacement total.
Réduction
Nous avons déjà réduit au maximum les effectifs de reproducteurs pour les génotypes modèles et pour la lignée d'origine égyptienne. Toutefois, au fur et à mesure de l'identification des mutations causales et de leur publication, nous prévoyons de diminuer le nombre d'animaux porteurs, et d’augmenter le recours à la congélation de semence si la qualité de la semence des coqs le permet, afin d’espérer une fertilité suffisante après décongélation.
Raffinement
Hébergement : Les animaux seront maintenus en groupes sociaux tout au long de l’élevage. Les animaux en comportement collectif auront à leur disposition divers enrichissements, tels que des perchoirs, des blocs à picorer, des chaînettes métalliques, des bandelettes de tissus pour stimuler le jeu, et des isolateurs seront inclus dans certaines cages pour offrir aux animaux des zones de refuge. Pour prévenir le picage, des répulsifs anti-picage pourront être appliqués sur les animaux concernés. Une surveillance soutenue sera assurée plusieurs fois par jour pour détecter précocement toute détérioration du bien-être. Un arbre de décision destiné à faciliter la gestion quotidienne des animaux (en cas d'atteinte ou non du point limite) a été développé et sera fourni aux zootechniciens en charge du suivi des animaux. Procédure : Dans le cas de la prise de sang au sinus occipital, afin de réduire les risques de lésion cérébrale associés à cette procédure, le préleveur utilisera une garde qu'il positionnera sur son aiguille pour éviter toute enfoncée excessive. La facilité de visualisation de ce site d'injection évitera l'arrachage douloureux de plumes pour les animaux. Un point de compression de 30 à 60 secondes sera effectué pour limiter la formation d'hématome. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour assurer une contention appropriée pendant la prise de sang, permettant ainsi de limiter les mouvements erratiques des animaux susceptibles d'entraver le prélèvement. Tout le personnel affecté à cette tâche sera formé à la contention et à la prise de sang sur la volaille. Les personnes en charge du prélèvement de sang au sinus occipital recevront une formation spécifique à cette procédure et auront l'habitude de la réaliser régulièrement pour assurer la fluidité des gestes. Dans le cas de la prise de sang effectuée à la veine alaire ou jugulaire, de l'alcool à 70°C sera appliqué pour désinfecter la zone de prélèvement et profiter des capacités de vasodilatation de ce produit, rendant ainsi la ponction plus aisée. De plus, un point de compression sera réalisé et deux expérimentateurs seront mobilisés.
Choix des espèces
Les applications attendues de nos travaux concernent la sélection et la gestion de la diversité génétique des volailles. La poule est l’espèce de volaille la plus utilisée en recherche et en production. C’est aussi celle dont le génome est le mieux connu parmi tous les oiseaux domestiques. Enfin certains phénotypes ne s’expriment que dans cette espèce. Pour toutes ces raisons nous avons choisi l’espèce Gallus gallus. Les animaux sont utilisés au stade jeune, pour l’observation des variants morphologiques, et au stade adulte pour les performances de ponte et de production de semence.
Mise en place et caractérisation phénotypique d’un modèle murin d’encéphalopathie du prématuré.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Des souriceaux reçoivent dès leurs premiers jours de vie une injection intrapéritonéale d'extrait bactérien destinée à reproduire l'encéphalopathie du prématuré, puis subissent deux chirurgies de quarante-cinq minutes pour la pose de prothèses de contention de la tête. 2 160 souris sont concernées, 1 120 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 1 040 d'un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur annonce des déficits fonctionnels et cognitifs parmi les effets attendus, et décrit par ailleurs les nuisances de l'imagerie et des tests comportementaux comme un simple stress lié à la manipulation, à l'isolement et à la nouveauté, sans préciser lesquels de ces tests seront pratiqués. Il affirme que ces modèles inflammatoires reproduisent "parfaitement" les caractéristiques de la pathologie humaine.
Objectifs
Une naissance est considérée comme prématurée lorsqu’elle intervient avant 37 semaines et se positionne comme un véritable problème de santé mondiale avec une incidence de 15 millions de cas par an. La prématurité est notamment associée à un large spectre d’altérations globales du développement se manifestant sous la forme de troubles moteurs, sensitif (e.g. vision), d’une altération des fonctions cognitives ou encore de troubles de l’attention et de l’hyperactivité. Ces déficits neurologiques qui peuvent demeurer observables jusqu’à l’âge adulte sont caractérisés au niveau morphologique par un ensemble d’anomalies cérébrales qui sont regroupées sous le nom d’encéphalopathie du prématuré.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre différentes pathologies neurodéveloppementales humaines. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude phénotypique de l’encéphalpathie du prématuré doit s’effectuer sur des modèles in vivo. De plus, les méthodes ex vivo de ce projet seront réalisées en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux et pour mieux caractériser les processus moléculaires et cellulaires sous-jacents.
Procédures
L’ensemble des souriceaux recevront une injection intra péritonéale d'un extrait de proteine bactérienne afin de reproduire l’encéphalopathie du prématuré (N =2160). Aux jours post-nataux (P) 3, 5, 7, 10, 15, 30 et 60 une imagerie par résonance magnétique (50 minutes maximum, n = 420) et une imagerie fonctionnelle échographique (1 heure maximum, n = 420) seront réalisées avec une injection intraveineuse de l'agent de contraste au préalable. La méthode la plus efficiente pour cette administration sera évaluée dans une procédure de mise au point (40 souriceaux seront concernés par cette procédure de mise au point). Deux procédures chirurgicales d’une durée de 45 minutes seront réalisées afin de poser des prothèses de contention qui permettront d’éviter les artéfacts de mouvements de la tête lors des acquisitions en imagerie fonctionnelle échographique (n = 420) et en microscopie (n = 280). Les tests comportementaux seront réalisées de manière longitudinale à P3, P5, P7, P10, P15, P30 et P60 (n = 240).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : Pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Lors des tests comportementaux, les animaux peuvent être soumis à un stress dû à la manipulation, l’isolement ainsi qu’à la nouveauté. Durant les examens d’imagerie, les animaux peuvent subirent un stress dû à la manipulation. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié notamment grâce à la prise journalière du poids des animaux, leur observation dans la cage en s’assurant de leur bien-être (prise alimentaire et boisson).
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations sur des coupes de tissu.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (encéphalopathie du prématuré, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature. De plus, les analyses comportementales et les analyses morphologiques ne seront pas réalisées chez les mêmes animaux pour éviter la récupération fonctionnelle et donc le biaisement des résultats. Aussi, le projet comporte deux procédures de mise au point qui permet de s’assurer que les suivantes seront réalisées de la meilleure façon. Ce point limitera l’utilisation d’animaux pour des expériences qui ne marcheraient pas. Enfin, l’effet sexe sera observé, ce qui permettra de limiter l’utilisation d’animaux pour des résultats qui seraient biaisés par ce paramètre.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant, pendant et après chaque procédure le nécessitant. Au cours de l’intervention chirurgicale (pose du support de tête pour limiter les mouvements de la tête lors des examens d'imagerie), les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Les yeux des souris seront couverts avec du gel oculaire afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil chauffée. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. De plus, la souche utilisé dans ce projet est également utilisée comme fond génétique de plusieurs lignées génétiquement modifiées utilisées au laboratoire et qui pourront, plus tard, être éventuellement utilisées dans le cadre de ce projet. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, les modèles d’encéphalopathie du prématurés induits par des stimuli inflammatoires sont très souvent utilisés car ils reproduisent parfaitement les caractéristiques de la pathologie humaine, ce qui en fait un modèle d’étude robuste. De même, il est admis que l’inflammation systémique induit des changements au sein du compartiment vasculaire comme dans ses interactions avec les cellules qui l’entourent. Cet ensemble de connaissances et les acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les procédures sont basées sur un stimulus inflammatoire à partir du premier jour post natal. Il est donc nécessaire de se procurer des femelles gestantes en amont afin de limiter le stress du voyage aux nouveau-nés. Le stade de développement de ces femelles est de 2 à 5 mois car nous devons attendre leur maturité sexuelle. La procédure de mise au point engendrera une évaluation comportementale au 7ème jour post natal chez les souriceaux. A ce même stade, une mise au point du protocole d’injection de l’agent de contraste pour les examens d'imagerie sera réalisée. En effet, cet agent de contraste nécessite d’être injecté en intraveineuse mais la voie habituellement utilisée (dans la veine caudale de la queue) n’est pas réalisable à ce stade de développement précoce. Une analyse microscopique sur coupes de tissus prélevés au 15e jour post natal permettra de voir si le modèle récapitule bien l’atteinte la plus décrite dans l’encéphalopathie du prématuré. De plus, au cours du développement physiologique et pathologique chez la souris, les changements fonctionnels, morphologiques comme les processus cellulaires et moléculaires en jeu s’opère très rapidement. De ce fait, une analyse à de nombreux stades de développement (jours poast nataux 3 / 5 / 7 / 10 / 15 / 30 / 60) est nécessaire afin d’identifier des différences dans le développement des différents groupes.