Oncologie
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Impact du neurodéveloppement dans la maladie de Huntington chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
6 150 souris vont être utilisées, et dans une partie des portées, chaque embryon reçoit une injection dans le cerveau, in utero, au cours d'une chirurgie de 30 à 45 minutes de sa mère sous anesthésie générale. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes les souris sont tuées à l'issue de chaque procédure, certaines sans réveil, par dislocation cervicale, après un prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie. Une partie passe à trois puis à six mois deux séries de cinq tests comportementaux que le porteur ne nomme pas, hormis un test de motivation précédé de 24 heures de jeûne. Il annonce que les souris seront tuées "à 6-8 mois, avant apparition du phénotype dommageable", et prévoit des analyses à 3, 6, 8 et 12 mois, âge à partir duquel la mutation de la maladie de Huntington peut causer difficultés locomotrices, prostration et perte de poids.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie génétique incurable causée par une mutation dominante, si un parent porte une version de la mutation il sera atteint et la transmission à sa descendance sera de 50 pour cent. Cette mutation entraîne le dysfonctionnement et la dégénérescence de sous-populations neuronales. Plus spécifiquement, plusieurs étapes du développement cortical sont modifiées. Cependant, les mécanismes physiopathologiques développementaux observés dans la maladie de Huntington, restent méconnus. En particulier, comment des modifications précoces auront des conséquences sur la dégénérescence du cerveau. Dans ce projet, nous évaluerons les conséquences de cette maladie sur la génération des différents types cellulaires du cortex en développement et du cortex adulte, ainsi que les stratégies de compensations qui pourraient se mettre en place pour pallier aux effets délétères de la mutation. Cette étude permettra la découverte de marqueurs permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades très précoces et d’identifier des cibles thérapeutiques pour retarder ou atténuer cette maladie neurodégénérative.
Bénéfices attendus
L’étude des mécanismes sous tendant le développement de la maladie de Huntington permettront à long terme de mettre en évidence des biomarqueurs qui représentent les différents stades d’évolution de la maladie. Après identification de ces différents stades, l’objectif sera de développer des cibles thérapeutiques adaptées afin de retarder ou limiter les symptômes associés à cette pathologie.
Procédures
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 12 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué, rapidement et une seule fois sur chaque animal (moins d'une minute par animal). Nous réaliserons des injections de produits pharmacologiques ou de vecteurs viraux, dans des zones spécifiques du cortex des embryons en intra utérin. Ces injections nécessitent une chirurgie sous anesthésie générale des femelles gestantes (30-45 minutes, 1 fois). Chaque embryon reçoit une injection intracérébrale. Les animaux impliqués dans les analyses comportementales réaliseront 2 séries (l’une à 3 mois, la deuxième à 6 mois) de 5 tests comportementaux vigiles sur une période d’un mois. Lors du test de privation de nourriture les animaux seront mis à jeun sur une période de 24 heures. Le prélèvement du liquide céphalorachidien implique une chirurgie sous anesthésie générale, une seule fois pour chaque animal pendant 5 minutes maximum. Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale à l'issues de cet acte. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire appropriée, efficace et reproductible.
Impact sur les animaux
Le prélèvement pour génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal, il sera réalisé rapidement et une seule fois sur chaque animal. L’acte d’injection pratiqué sous anesthésie peut générer de la douleur lors de la chirurgie et en post opératoire pendant quelques jours. Il y a un risque lors de l’anesthésie (dépression cardiorespiratoire, hypothermie), ainsi qu’un risque infectieux et hémorragique. *Le prélèvement de liquide céphalorachidien est réalisé sous anesthésie générale et sera suivi d'une euthanasie.* Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. La privation de nourriture de 24h nécessaire à la mise en place lors du test comportemental explorant la motivation peut également induire un état de stress et de fatigue chez les animaux. La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 12 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Devenir
**A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem, prélever des embryons, ou parce qu'il ne sera pas possible de les réutiliser ou replacer du fait de leur modification génétique.**
Remplacement
L’étude du cerveau en développement nécessite le recours à un modèle animal car il permet de préserver l’environnement du développement utérin (impliquant différents types cellulaires qui interagissent entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire). L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec un modèle de mammifère qui permet de suivre l’évolution du cerveau tout au long du développement et de la vie de l’animal. Le développement cérébral et la génétique de la souris présentent des similarités avec ceux de l’Homme. Ces éléments font de la souris un modèle indispensable pour notre étude. Nous utiliserons des cultures cellulaires afin de valider les outils moléculaires qui seront ensuite injectés chez l’animal.
Réduction
**Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisées. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés. Pour la totalité du projet nous estimons que nous utiliserons au maximum 6150 animaux.**
Raffinement
**Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce (température, hygrométrie, luminosité, enrichissement, hébergement en groupe, etc.). Ils bénéficient d’eau et de nourriture adaptée à leur stade physiologique à volonté et sont observés quotidiennement. Les animaux seront euthanasiés à 6-8 mois, avant apparition du phénotype dommageable, et surveillés à l’approche des 6 mois pour détecter des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 2 signes caractéristiques liés à la mutation. Nous réaliserons des accouplements avec des souris WT afin d’éviter toute dérive génétique. La biopsie de queue pour le génotypage sera réalisée sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide) et limitée au strict minimum (environ 1mm). Le geste est rapide, parfaitement maitrisé, et réalisé dans un endroit dédié au calme. Une surveillance adaptée du souriceau est mise en place après le geste. Cette technique de prélèvement permet d’obtenir une quantité suffisante d’ADN pour le génotypage sans risque d’induire des effets indésirables majeurs pour l’animal. En effet sur un animal si jeune il ne serait pas possible d’obtenir la quantité de poils suffisante, un prélèvement de sang pourrait induire un choc hypovolémique et la biopsie d’oreille n’est pas possible avant 2 semaines du fait de la petite taille des oreilles. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Afin d’améliorer le bien-être de la mère dans les cages post chirurgie ajout d’une maison, d’un nid en coton et d’une nourriture enrichie (hydrogel, nourriture facile d’accès). Les chirurgies sont réalisées le matin afin d’observer les animaux le soir et administrer les médicaments nécessaires. Une liste d’observation post opératoire sera remplie. Après les chirurgies, les animaux seront observés (infections, mauvaise cicatrisation, prostration ou d’agitation et perte de poids anormaux) 2 fois par jour par l’équipe, et chaque jour par l’animalerie. Une grille de scoring de la douleur sera utilisée. Les nouveaux nés post chirurgie seront suivis durant les premiers stades de vie pour s’assurer que la modification induite par la chirurgie n’entraine pas de modification développementale dommageable. Une grille de score clinique sera utilisée dès la naissance. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris à 8 mois afin qu’elle se fasse sans douleur.**
Choix des espèces
Il n’existe pas d’autre méthode expérimentale n’impliquant pas d’animaux vivants et permettant d'étudier le développement et la complexité du cortex. Ces analyses nécessitent l'utilisation de souris : le comportement des neurones corticaux diffère selon leur environnement, ils adoptent un comportement migratoire in vivo et de croissance neuritique en culture; l'organisation laminaire du cortex, et les connexions neuronales qui y sont formées ne peuvent être reproduits en culture; la complexité des interactions entre les différents types cellulaires du cortex. Ainsi les modèles in vitro sont insuffisants pour étudier la complexité et la mise en place des réseaux neuronaux corticaux. La souris est un modèle de choix pour la transgénèse et les organismes génétiquement modifiés et nous avons à disposition plusieurs modèles murins de la maladie de Huntington. Nos modèles de souris ont été décrits comme reproduisant de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Le but de ce projet étant de suivre l’impact des modifications ayant lieu au stade embryonnaire sur les stades tardifs, nous allons nous focaliser sur les âges suivants : chez l’embryon (jour de gestation 14 et 16) pour observer l’effet direct de la modification pendant l’établissement des couches du cortex cérébral, à un stade juvénile pour étudier la continuité du développement post-natal, et à 3, 6, 8 et 12 mois pour évaluer les conséquences au stades adultes de la modification embryonnaire, en comparant le phénotype des souris traitées à celui des souris modèles de la maladie. Nous utiliserons des animaux reproducteurs adultes afin de générer les animaux nécessaires pour nos procédures. Les animaux générés seront prélevés pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours.
Différenciation de cellules structurantes du ganglion lymphatique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Cinquante souriceaux âgés de deux à quatre jours vont être gavés ou piqués sous la peau pour que le personnel maîtrise le geste sur des nouveau-nés. 118 souris en tout vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour examiner leurs ganglions lymphatiques au microscope. Chaque animal reçoit trois gavages ou trois injections sous-cutanées sur trois jours consécutifs, avec une contention par la nuque, le gavage pouvant irriter à force de répétition. Le projet valide une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée, et le porteur justifie ses 68 autres animaux par le fait que le génotype reste inconnu à l'âge de l'administration, un quart environ formant les groupes utiles, pour une lecture qualitative de lames sans analyse statistique.
Objectifs
Les ganglions lymphatiques permettent l’initiation de la réponse immunitaire. Leur structure est formée par des cellules stromales qui forment un espace tridimensionnel dans lequel les cellules hématopoïétiques transitent et se regroupent en zones distinctes. Les cellules stromales mésenchymateuses du ganglion lymphatique organisent ainsi l’organe pour son bon fonctionnement. Des modèles de souris sont requises pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires pour la formation de ces cellules organisatrices. Dans ce projet, nous évaluerons une nouvelle souris génétiquement modifiée pour sa capacité de marquer les cellules mésenchymateuses et suivre leur différenciation.
Bénéfices attendus
Ces expériences permettront de valider le nouveau modèle de souris génétiquement modifiée et de faire avancer la recherche sur la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires. Les cellules mésenchymateuses jouent notamment un rôle clé dans la réponse immunitaire humorale impliquant des anticorps contre des maladies infectieuses, ou dans la formation des structures lymphoïdes retrouvées dans des cancers, ou des organes affectés dans des maladies autoimmunes. Ces résultats apporteront ainsi à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné que des thérapies anti-cancer et anti-maladies autoimmunes visent le système immunitaire, ces résultats auront des retombées sur la thérapie anti-cancer et contre des maladies autoimmunes.
Procédures
Trois gavages ou 3 injections par voie sous-cutanée sont réalisés sur animal vigile sur une période de 3 jours consécutifs (duée de chaque injection ou gavage: 2-3 minutes). Le génotypage sera réalisé sur un surplus de tissu provenant de l'identification des animaux ou sur biopsie de queue réalisée post-mortem.
Impact sur les animaux
Le gavage peut être source d'irritation, du fait de la répétition du geste. Les injections répétées par voie sous-cutanée peuvent induire un certain inconfort. Ces voies d'administration nécessitent une contention au niveau de la nuque, source d’inconfort pour l’animal pendant quelques secondes.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux à l'issue de la procédure et analyse post-mortem des ganglions lymphatiques par microscopie
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la differenciation des cellules mésenchymateuses dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière fiable par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Nous avons identifié des données dans la littérature scientifique, tels que la quantité de tamoxifène à administrer ou le moment choisi dans le développement de l’animal, permettant une meilleure réussite de l’expérience et ainsi de réduire le nombre de souris. Les moyens de l’administration (gavage oral ou injection par voie sous-cutanée) ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Une étude-pilote sera réalisée sur un maximum de 50 souriceaux âgés de 2-4 jours afin de maitriser les gestes techniques chez le nouveau-né, et ainsi minimiser la souffrance qui pourrait être induite lors de la manipulation. La validation de notre modèle sera ensuite réalisée avec un total de 68 animaux, en comparant l’efficacité d’excision suite à l’administration du tamoxifène par voie orale ou par injection sous-cutanée, versus des animaux contrôles qui recevront le véhicule. Ce total de 68 animaux est nécessaire dans la mesure où les produits seront administrés à 2-4 jours d’âge, où le génotype des animaux n’est pas connu. Théoriquement ¼ des animaux constitueront ainsi les cohortes expérimentales, soit environ 22-23 souris (15 animaux expérimentaux + 7-8 contrôles), effectif suffisant pour valider notre hypothèse. Cette validation est notamment basée sur une méthode d’analyse histologique qualitative, et n'implique donc pas d'analyse statistique, mais repose uniquement sur l'observation microscopique des lames.
Raffinement
Les injections sous-cutanées et les gavages sont effectués par un personnel formé et expérimenté. Les souriceaux sont rapidement retournés à la mère après injection ou gavage. Les souriceaux sont observés et surveillés dans les minutes qui suivent le gavage afin de s’assurer qu’il n’y a pas eu de fausse route. Un temps de récupération après les administrations est accordé (24h) aux animaux. Le bien-être de l’animal est évalué par un personnel expérimenté, prenant en compte l’attention accordée aux souriceaux par la mère, le lieu d’injection (sous-cutané au niveau de la nuque) et la croissance des animaux, le poids, l’apparence, le comportement, l'hydratation, la respiration et l’aspect des fèces. Lorsque qu’une anomalie est observée, l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. A l’aggravation, la Structure du Bien-Être Animal est contactée et des mesures conseillées appliquées. Des points limites spécifiques ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les souris seront hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis par cage. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. L’hébergement bénéficie d’un enrichissement des cages (matériel de nidification) et un tunnel sera utilisé lors de chaque manipulation et change.
Choix des espèces
La fonction du ganglion lymphatique et sa structuration sont identiques entre l’homme et la souris. Il existe chez la souris des moyens de suivre la différenciation des cellules par marquage génétique (lineage tracing) et d’invalider des gènes dans un type de cellules afin de pouvoir étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la différenciation des cellules des ganglions lymphatiques à partir des cellules progénitrices. Des nouveaux-nés de 2 à 4 jours seront utilisés, en lien avec le développement du ganglion lymphatique qui commence au stade embryonnaire et se termine environ 5 à 7 jours après la naissance. Des souris adultes (8 semaines) où la différenciation des des cellules des ganglions lymphatiques est complétée, recevront également le tamoxifène et seront utilisées comme contrôles.
Induction d’un syndrome métabolique (obésité, diabète, stéatose hépatique non alcoolique) par un régime riche en graisse et/ou en sucre chez des rongeurs (souris, rats, hamsters)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 500
Hamsters dorés : 2050
20 550 rongeurs vont être utilisés, 18 000 souris, 500 rats et 2 050 hamsters dorés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, léger pour 50 hamsters. Ils reçoivent pendant 34 semaines au maximum une nourriture riche en graisse et une eau sucrée, jusqu'à développer obésité, diabète, dyslipidémie et stéatose hépatique, pouvant aller jusqu'à la fibrose, la cirrhose ou un cancer du foie. Une goutte de sang leur est prélevée à la queue ou à la veine saphène sans anesthésie, jusqu'à deux fois par jour. La majorité de ces animaux sont ensuite expédiés à un laboratoire de recherche pour être utilisés dans son propre projet, les hamsters sur lesquels le personnel s'est entraîné aux prélèvements étant tués, et le porteur écrit que l'effectif a été fixé à la demande de ses partenaires, sans qu'"aucune approche statistique" ait été réalisée.
Objectifs
A l’échelle mondiale, les maladies liés au surpoids représentent une part non négligeable des décès estimé à plus de 1,2 million par an. En 2016, 650 millions d’adultes étaient obèses, soit 3 fois plus qu’en 1975. En 2021, le diabète affecte plus de 537 millions de personnes. La dyslipidémie et la NASH (stéatose hépatique non-alcoolique) sont provoqués par le diabète et l’obésité. La dyslipidémie touche quelques milliers de patients chaque année en France et la société nationale française de gastro-entérologie considère qu’un quart de la population française est touché par la NASH. Par l'alimentation de rongeurs avec un régime riche en lipides et/ou glucides, il est possible d'induire ces phénotypes spécifiques : obésité, dyslipidémie, diabète et NASH. Ces rongeurs avec syndromes métaboliques seront utilisés pour évaluer les effets de médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet aura des bénéfices pour l’homme. Ce projet pourra amener à long terme des solutions thérapeutiques pour traiter les syndromes métaboliques du surpoids et du diabète. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Les animaux auront à disposition un aliment standard et/ou un aliment riche en gras et une eau standard et/ou une eau additionnée de sucre, mis en ad libitum pendant 34 semaines maximum. Une mesure glycémique pourra être faite sur les animaux en aigue (2 mesures par jour et par animal avec 3 jours de récupération entre 2 séries de mesures) ou en chronique (une mesure par animal par semaine). Une goutte de sang (environ 50 µl) est recueillie après piqure, à l’aide d’une aiguille de taille adaptée sans anesthésie, de la queue au niveau de la veine caudale pour la souris et le rat, et à la veine saphène pour le hamster.
Impact sur les animaux
Au fil de la prise alimentaire riche en gras et de l’abreuvement riche en sucre, les animaux pourront exprimés des signes cliniques plus ou moins modérés. Les animaux vont développer une obésité et des syndromes métaboliques tels diabète, dyslipidémie, insulino-résistance, NASH pouvant aller jusqu’à une fibrose, une cirrhose ou un cancer du foie à long terme (après la phase préparatoire).
Devenir
La majorité des animaux sont expédiés à un laboratoire de recherche pour une utilisation dans son projet de recherche. Les hamsters d’entrainement pour le prélèvement sanguin seront mis à mort et pourront servir à de la formation post-mortem du personnel.
Remplacement
L’induction de modification métabolique chez l’animal fait intervenir plusieurs types cellulaires produisant des facteurs tendant à moduler ou amplifier la réponse. Toute cette cascade d’événement faisant intervenir des facteurs autocrines, paracrines ou exocrines aussi variés que complexes ne permet pas une étude significative et déterminante in vitro. Par ailleurs, l'objet de cette étude est d'évaluer l'impact sur une fonction vitale de l'organisme, ce qui ne peut être fait que sur un organisme vivant.
Réduction
Nous réalisons ce protocole alimentaire à la demande de nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre leur objectif scientifique. Aucune approche statistique n'a été réalisée.
Raffinement
Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long de cette phase préparatoire. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Enfin, les contentions et prélèvements seront réalisés par un personnel formé et expérimenté.
Choix des espèces
Les souris, rats et hamsters sont des espèces animales les plus pertinentes par la proximité physiologique avec l'Homme et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur les maladies métaboliques liés au surpoids car elles développent naturellement ce type de pathologie ayant une affinité à la nourriture grasse et sucrée similaire à l’Homme. Pour les hamsters syriens dorés, ils ont un métabolisme des lipoprotéines imitant la dyslipidémie humaine car il exprime la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP). Les animaux pourront commencer le régime alimentaire à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum) et seront expédiés aux laboratoires de recherche à l’âge demandé.
Origine et suivi des cellules du système cardiovasculaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Les souris de ce projet portent une recombinase qu'une injection déclenche, pour marquer certaines cellules du cœur et suivre leur descendance. 224 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une ou deux injections dans l'abdomen, sur deux jours consécutifs quand la seconde est jugée utile, les femelles gestantes étant injectées entre le sixième et le treizième jour de gestation. Toutes sont ensuite tuées pour prélever des organes, alors que le porteur écrit n'avoir jamais observé d'effet délétère chez les animaux injectés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier les gènes et cellules qui participent au développement du système cardiovasculaire chez l'embryon et au maintien de l'homeostasie du cœur chez l'animal adulte afin de mieux appréhender l'étiologie des cardiopathies congénitales et acquises qui se développent après la naissance. Le développement du cœur et l’homéostasie cardiaque dépendent de l'expression d'un nombre important de gènes et la contribution de différents types cellulaires. Dans cet objectif, nous utiliserons des souris transgéniques chez lesquelles on peut induire l'activité d'une recombinase qui permet la détection des cellules recombinées et de leurs dérivées. Différentes lignées sont ciblées: les progéniteurs cardiaques, les cellules dérivées de l’épicarde, les cellules des crêtes neurales et enfin les cardiomyocytes. Les études sur le développement cardiaque nécessiteront l’induction au cours de la gestation tandis que les études après la naissance seront réalisées par des inductions chez les mâles et femelles. Ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur le développement et le maintien du système cardiovasculaire ainsi que sur l'étiologie des pathologies congénitales et acquises.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur le développement cardiaque depuis les stades précoces du développement cardiaque. Il étudiera l’importance de ces évènements précoces sur le maintien du système cardiovasculaire. Les résultats attendus doivent également permettre de mieux aborder l’étiologie des pathologies cardiaques congénitales et acquises.
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou deux injections intrapéritonéales. Si deux injections sont réalisées, elles seront réalisées sur 2 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Nous n'avons jamais observé d'effet délétère sur les animaux injectés lors de nos expériences précédentes. Une possible infection peut apparaître au site d'injection, mais cela n’a jamais été observé lors de nos expériences précédentes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organe.
Remplacement
L'utilisation de modèle in vitro ne permet pas de reproduire le développement cardiaque ni celle du coeur dans leur compléxité physiologique chez l'animal. Les stratégies de remplacement n'existent pas et l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés telle que présentée ici est la seule approche qui nous permette actuellement de répondre à nos objectifs de suivi des cellules qui contribuent au développement et à l'homéostasie du coeur.
Réduction
Nous nous efforçons à limiter le nombre d’animaux par groupe en tenant compte des controles et à utiliser au maximum les données de chaque animal. L’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Nos études précédentes nous montrent qu’il faut en moyenne 10 souris par groupe pour avoir des données exploitables. Nous arrêterons de générer des animaux aussitôt que nos résultats seront exploitables statistiquement..
Raffinement
La réglementation est appliquée selon la législation en vigueur pour tous les animaux en procédure pour ce qui concerne l’hébergement, la surveillance et la mise à mort. Les injections sont toujours des actes planifiés à l'avance et rapides ce qui permet de limiter le stress de l'animal. L'apparition d'infection au site d'injection si elle a lieu sera traitée par un antiseptique. Si l’animal présente un signe de souffrance il recevra une injection d'anti-inflammatoire. Une grille de score avec les différents points limites est disponible et adaptée aux besoins du projet.
Choix des espèces
Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du coeur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Les souris génétiquement modifiées représentent donc un modèle pertinent pour nos recherches fondamentales afin d'appréhender au mieux les maladies humaines. Les femelles gestantes seront injectées au plus tôt au stade embryonnaire de 6.0 jours après l'accouplement, stade qui correspond à l'identification des premiers progéniteurs cardiaques, et au plus tard avant le 13ème jour embryonnaire, la gestation chez la souris étant de 21 jours. Lorsque l'étude s'adressera à des animaux après la naissance, les injections seront réalisées entre le stade P0 et P3 ou au stade adulte lorsque requis, entre 8 et 12 semaines. Les animaux seront injectés deux fois sur deux jours consécutifs lorsque nécessaire afin de s'assurer de la recombinaison de l'ensemble des cellules ciblées. La nécessité de deux injections pour une recombinaison fiable résulte de l'expérience acquises au cours des années et est en faveur de la règle des 3R car cela permet d'obtenir des résultats plus stables rapidement et de réduire le nombre d'animaux injectés.
Etude d’une molécule clef dans la lamination du cortex cérébral chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Sur les 656 souris de ce projet, 336 sont des embryons prélevés par césarienne au terme de la gestation pour leur retirer le cerveau, 245 sont tuées parce qu'elles n'ont pas le génotype recherché et 18 mâles géniteurs le sont parce que leur génotype interdit de les utiliser ailleurs. Les 57 femelles gestantes, contenues puis injectées dans la veine de la queue, sont tuées au stade embryonnaire de 18,5 jours. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 263 animaux et modéré pour 393. Le tamoxifène injecté peut dérégler l'équilibre hormonal de la gestation et faire mourir les embryons in utero, et le porteur justifie l'ensemble en indiquant qu'aucun organoïde de cerveau, murin ou humain, n'a à ce jour reproduit la formation des six couches de neurones du cortex.
Objectifs
Des anomalies génétiques chez l’homme affectant les processus de prolifération, de migration et de différentiation cellulaire peuvent aboutir à des malformations du cerveau. L’effet des mutations dans des gènes orthologues sur le développement embryonnaire est modélisé chez la souris. Ce projet vise en particulier à étudier le rôle clef d’une molécule dans la formation des couches de neurones dans le cortex cérébral et à déterminer si la quantité de cette protéine est un facteur déterminant dans la sévérité du phénotype. Pour contrôler la quantité, une stratégie d’invalidation génétique conditionnelle est utilisée reposant sur l’injection de tamoxifène chez la femelle gestante pour induire la perte de fonction de la molécule ciblée au cours du développement embryonnaire. 336 embryons seront collectés par césarienne et mis à mort pour prélever leur cerveau et une biopsie cutanée. Des études histologiques et biochimiques seront réalisées sur ces cerveaux pour quantifier la sévérité de la malformation corticale et le génotypage sera effectué sur la biopsie cutanée.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans des anomalies du cortex cérébral observées chez l’homme. L’utilisation d’un modèle génétique contrôlé chez la souris permet de reproduire ces malformations corticales et les connaissances acquises sur les mécanismes permettent de tester chez l’animal des approches thérapeutiques qui pourraient être appliquées à l’Homme.
Procédures
Les femelles gestantes (57) subiront une contention permettant l'injection intraveineuse (10 secondes) dans la veine caudale d'un produit.
Impact sur les animaux
L’injection par voie intra-veineuse de la souris adulte peut entrainer une douleur légère de courte durée. Le tamoxifène, antagoniste des œstrogènes peut altérer l’équilibre hormonal pendant la gestation et entrainer une mortalité prénatale avec une résorption des embryons.
Devenir
Toutes les 656 souris du projet seront mises à mort. - 245 souris issues du croisement des lignées simples car elles n’auront pas les génotypes d’intérêt. - 57 femelles gestantes pour collecter les embryons au stade embryonnaire 18.5 après leur fécondation. - 336 embryons collectés pour prélever leur cerveau et une biopsie cutanée. - 18 mâles géniteurs utilisés pour les croisements contrôlés car ils ne pourront pas être réutilisé pour d’autres projets en raison de leur génotype unique.
Remplacement
Les questions scientifiques adressées dans ce projet ne peuvent être étudiées qu’in vivo, sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle in vitro même les plus sophistiqués comme les organoïdes de cerveau ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. Jusqu’à présent la lamination complète du cortex c’est-à-dire la formation des 6 couches de neurones n’a jamais été observé dans les organoïdes de cerveau qu’ils soient d’origine murine ou humaine.
Réduction
La stratégie de croisement contrôlée permettra de générer tous les génotypes nécessaires à l’étude et tous les embryons générés seront analysés sans sélection. Il a été montré dans ce type d’études de modèles animaux qu’un échantillon de 7 animaux par condition est suffisant pour mettre en évidence une différence de 20%.
Raffinement
Les animaux progéniteurs sont maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant leur croisement. Après croisement contrôlés, les femelles gestantes sont regroupées par paire. Les males reproducteurs sont placés avec des femelles âgées qui ne sont plus fertiles pour éviter leur isolement en attendant les croisements contrôlés suivants. Au stade embryonnaire 9,5 jours après le coït (E9,5), la queue de la femelle gestante à injecter en intraveineux (IV) est imprégnée de crème analgésique pendant 15 minutes. La souris est ensuite maintenue dans une boite de contention et sa queue chauffée sous une lampe afin de provoquer une dilatation de la veine caudale et faciliter l’injection du produit par voie IV. Les femelles injectées sont regroupées et surveillées quotidiennement en application des points limites stricts et spécifiques du projet jusqu’au stade de leur mise à mort à E18.5. Les embryons collectés à E18.5 sont endormis par le froid avant leur mise à mort.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité́ des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projet tels que les modèles génétiquement modifiés. L'expérimentation est menée sur des embryons en fin de gestation, stade qui nous permet de voir l'effet des modifications génétiques sur cette étape critique du développement dans le cerveau.
Étude des propriétés biologiques, de la sécurité sanitaire et de la qualité nutritionnelle d’une alimentation à base de farine d’insectes chez le rat
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Isolés en cage individuelle pendant quatorze semaines, soumis à treize prélèvements de sang à la queue étalés sur deux heures, à 72 heures en cage de mesure de la dépense d'énergie puis à 48 heures en cage de recueil des urines et des fèces, 144 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à la fin pour doser leurs organes. Le projet évalue l'intérêt nutritionnel et les risques toxicologiques de quatre farines d'insectes, présentées comme une alternative durable aux protéines animales. Le porteur annonce vouloir étudier la motricité, la mémoire, le stress et l'anxiété de ces rats, sans nommer un seul des tests comportementaux prévus.
Objectifs
La production alimentaire actuelle est indissociable de son empreinte écologique. En effet, notre façon de nous alimenter devra changer en raison de l'épuisement de certaines ressources, de la dégradation de l'environnement et de la biodiversité liée à certaines pratiques agricoles et habitudes de consommation. Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de viandes et de poissons (dont la disponibilité diminue). Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets agricoles et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Face à cette problématique, la consommation de farine d’insectes se présente comme une solution durable et écologiquement viable pour nourrir l’ensemble de la population. Néanmoins, il est essentiel d’évaluer les impacts sur la santé d’un remplacement des protéines de notre alimentation actuelle par des protéines d’insectes. Ainsi notre objectif est d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de farine d’insectes. De plus, nous nous intéressons aux différentes conditions d’élevage des insectes car l’alimentation donnée aux insectes pour leur croissance peut impacter leur qualité nutritionnelle et leur potentielle contamination. Notre évaluation des impacts sanitaires reposera sur deux objectifs : 1) l’évaluation des bénéfices nutritionnels et 2) l’évaluation des risques toxicologiques, le tout en fonction des conditions d’élevage.
Bénéfices attendus
Nous pensons que le statut nutritionnel de ces farines d’insectes sera comparable, voire supérieure, à celui des produits animaux traditionnellement consommés et représentant l’apport protéinique dans notre alimentation. Notre étude pourra potentiellement mettre en évidence un bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées pour remplacer les protéines d'origine animale dans notre alimentation. De plus, pour promouvoir une alimentation humaine à base de farine d’insectes il est nécessaire d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de ces farines d’insectes et donc d’étudier leur contamination en résidus de pesticides et contaminants de l’environnement. Une évaluation approfondie du rapport bénéfice/risque est donc indispensable pour déterminer s’il est possible de promouvoir une augmentation de la consommation de farine d’insectes et si ces farines peuvent être consommées en quantités suffisantes pour remplacer les protéines animales. L’étude inclut également l’analyse de différentes méthodes de production d’insectes afin de mieux maîtriser les modes d’élevage dans le but d’optimiser les avantages nutritionnels tout en minimisant les risques pour la santé. En conséquence, cette recherche pourra offrir des recommandations précises aux producteurs en matière d’élevage, ainsi qu’à la population concernant leur consommation. Si la qualité nutritionnelle et la sécurité sanitaire des farines d’insectes sont confirmées, leur utilisation pour remplacer les protéines animales pourrait avoir un impact environnemental positif. En effet, remplacer la consommation de poisson par celle d’insectes présenterait un avantage notable, notamment en réduisant la pression sur la biodiversité marine, menacée par la pêche intensive répondant à la demande croissante en protéines animales.
Procédures
Les animaux seront en isolement physique pendant 14 semaines. Ils pourront cependant se sentir, s’entendre et se voir. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme et sur leur activité locomotrice spontanée. Au cours de cette intervention les rats sont placés dans des cages de dimension similaire à celle utilisée pour l'hébergement standard. Seul le couvercle est différent : dans ce cas, il est équipé des capteurs nécessaires au recueil des données. Les cages sont disposées dans une enceinte dotée de capteurs infrarouge permettant de suivre le déplacement de l'animal. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48h pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.
Impact sur les animaux
Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible à l'aide de jouets. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. Pour le test du glucose, un gavage oral sera réalisé sur quelques secondes. Pour le test de l’insuline, une injection sera réalisée en quelques secondes. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de la dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48 heures pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.
Devenir
Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir réaliser l’ensemble des prélèvements nécessaires, notamment des dosages au niveau des organes.
Remplacement
Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée au sein de notre projet. Ils démontrent une faible toxicité en test sur cellules pour une exposition à une fraction d’insecte. Dans ce même projet nous avons également analysé la composition nutritionnelle et la contamination de plusieurs farines d’insectes. Ceci a révélé une teneur en métaux lourds à étudier plus en détail. Notre étude vient donc dans la suite de ces résultats, évaluer l’impact sur un organisme entier. De même, aucun modèle de simulation ne pourra reproduire la complexité de l’organisme et il n’existe pas, dans ce cas-là, d’alternative expérimentale. L'étude du métaolisme ainsi que les effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. Une étude épidémiologique ne peut pas être réalisée dans ce cas car la farine d’insectes est très peu consommée (et de manière irrégulière) en France. Cette consommation par quelques individus est anecdotique et correspond à des quantités très faibles de farine d’insectes. Une étude épidémiologique ne pourrait pas être réalisée avec les données de consommations de pays consommant régulièrement des insectes car la production d’insectes est différente de celle aujourd’hui réalisée en Europe. De plus, cette étude s’intéresse à la métabolisation et l’élimination par un organisme entier de substances toxicologiques tels des contaminants ou résidus. Le modèle de rat correspond à l'espèce la plus pertinente et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse de façon durable sans qu'il soit possible de la soulager. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour ce genre d’étude De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (95 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres.
Réduction
Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. Selon nos évaluations statistiques et ce qui a été retrouvé dans la littérature scientifique, nous estimons un nombre de sujets nécessaires de douze rats par groupe afin de pouvoir visualiser une différence statistique entre les groupes. De plus, nous souhaitons tester quatre farines insectes différentes qui présentent des propriétés nutritionnelles et des contaminations en polluants différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à commercialiser. Le nombre de rats dans chacun des groupes expérimentaux a été décidé afin d'assurer des résultats scientifiques fiables et robustes tout en utilisant un nombre total d'animaux minimal. Notre protocole utilisera des rats femelles et des rats mâles. Ce choix est fait en regard de différences connues entre le métabolisme chez la femelle et chez le mâle.
Raffinement
Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera incorporé de la farine d’insectes qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible. De même, les cages des animaux seront placées dans une même salle de stabulation et les animaux pourront se voir et se sentir tout du long du protocole. Des méthodes d’enrichissement social seront mises en place pour tous les animaux : une remise en groupe sociaux une fois par semaine pendant 15 minutes et deux séances de tickling par semaine de 5 minutes. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.
Choix des espèces
Le modèle rat a été choisi en tenant compte de la littérature récente et des études de biodisponibilité et de toxicologie. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des modèles de rat. Nous comptons nous appuyer sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. Le choix du rat se justifie également par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire sur ce modèle. Le rat est un modèle qui a la capacité de prendre des décisions et de s'adapter à son environnement avec des zones cérébrales fonctionnelles analogues à celles de l'homme notamment pour la motricité, la mémoire et le stress ou l’anxiété. Nous souhaitons étudier ces comportements dans notre étude pour évaluer l'impact des apports nutritionnels. C'est également une espèce plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Les rats seront âgés de 10 semaines pesant environ 250g au démarrage de l'étude. Les rats seront âgés de 24 semaines à la fin de l'étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc avoir des rats « équivalents » à cette tranche d’âge. De plus, plusieurs études de biodisponibilité de protéines ou d’impact toxicologique via une exposition alimentaire ont été menées sur des rats de cet âge. Réaliser l’expérimentation dans des conditions similaires à ces études nous permettrait de comparer nos résultats avec ceux de la littérature.
Etude moléculaire des troubles du neurodéveloppement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les souriceaux de plus de sept jours sont tatoués aux coussinets et prélevés à la queue avant dix jours de vie, et une partie, déjà isolée deux fois cinq minutes à six jours pour enregistrer ses vocalisations, passe à l'âge adulte, sur environ deux mois, six tests : open field, labyrinthe en croix surélevé, test à trois compartiments, reconnaissance d'objet, réflexe de sursaut et conditionnement de peur par chocs électriques aux pattes. Des femelles gestantes subissent trois contentions de 45 minutes par jour pendant six jours, d'autres une ouverture de l'abdomen sous anesthésie pour marquer des cellules du cerveau des embryons par électroporation. 3 424 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le rôle d'une protéine dans le développement du cerveau et les troubles du neurodéveloppement. Le porteur situe les sons du test de sursaut à 120 décibels, puis à 110. Toutes les souris seront tuées, dont 1 680 une fois leur rôle de reproduction achevé.
Objectifs
Notre étudions une molécule sécrétée dans le milieu extracellulaire qui contrôle des étapes cruciales du développement du cerveau. En effet, des altérations de niveaux de cette protéine d’intérêt sont observés dans de nombreuses pathologies psychiatriques dont l’autisme, la schizophrénie et la dépression mais aussi la lissencéphalie et l'épilepsie. Or plusieurs populations cellulaires sécrètent cette protéine lors d'étapes successives du développement du cerveau. L'objectif du projet est d’identifier les rôles respectifs de ces populations sources de notre potéine d'intérêt dans le développement du cerveau et l’étiologie des troubles du neuro-développement en combinant des approches moléculaires, histologiques, électrophysiologiques et comportementales.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ces travaux nous permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’étiologie des troubles du neurodéveloppement, pour envisager de nouvelles approches diagnostiques ou thérapeutiques.
Procédures
Tous les souriceaux de plus de 7 jours subiront un stress léger lié à la contention et au tatouage (1 min) ainsi qu’une douleur légère liée au prélèvement à la queue (10 sec) entre P7 et P10. Cette intervention n’aura lieu qu’une fois, sauf cas exceptionnel de prélèvement dégradé. -Les animaux qui réaliseront les tests comportementaux subiront les stress accumulés liés à leur isolement pendant 2x 5 min pour enregistrer des vocalisations à P6, puis aux tests comportementaux successifs à l’âge adulte sur environ 2 mois, avec au moins 3 jours de repos entre chaque test : OF (20 min), EPM (7 min), 3-chambers (30 min), NOR (30 min), tests d’inhibition du réflexe de sursaut (32 min) et de conditionnement par la peur (8min/jour pendant 4 jours). Plus spécifiquement, ces deux derniers tests imposent aux animaux de subir ponctuellement des sons à très hauts décibels (120 db) ou des chocs électriques sur les pattes (0,6mA), qui même si modérés et très ponctuels, induisent une réaction de stress visible (posture de freezing). - Pour l’étude des conséquences du stress prénatal, les femelles gestantes subiront un stress répété par contention (3 x 45 min / jour pendant 6 jours). - Les femelles gestantes subissante une électroporation in utero subiront une analgésie (voie sous-cutanée, 10 sec) et une anesthésie générale profonde (voie respiratoire), suivies d’un acte chirurgical de 45 min comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures, puis des injections sous cutanées d’analgésique d'une durée de 30secx2 fois x 3 jours. - Les animaux subissant les actes de perfusion intracardiaque subiront un stress lié aux injections intrapéritonéales d’analgésique et d’antalgique (2 x10 sec). Lot1: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec); Lot 2: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) en juvénile puis perfusion intracardiaque à P25 (2 injections de 10 sec); Lot 3 : Tatouage (1min), isolation pour vocalisations (2x5min) et prélèvement (10sec) en juvénile, puis OF (20 min), EPM (7 min), 3-chambers (30 min), NOR (30 min), tests d’inhibition du réflexe de sursaut (32 min) et de conditionnement par la peur (8min/jour x 4 jours); Lot 4a: perfusion intracardiaque à P4 ou P7 (2injX10 sec); Lot 4b: Eléctroporation in utero (1injX10sec, chirurgie sous anesthésie générale profonde 35min, suture 10min, 2 injX10secX3 jours), tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) puis perfusion intracardiaque (2injX10sec); Lot 5: stress prénatal (3X45min X6jrs)
Impact sur les animaux
Les souriceaux subiront après la naissance une contention pour permettre un tatouage des coussinets des phalanges et un prélèvement à la queue qui peuvent entrainer un stress et une douleur légers. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer une souffrance si elle est mal prise en charge par le traitement analgésique. A noter que l'étape d’anesthésie en elle-même peut également provoquer un stress chez l’animal. Pour réaliser l’enregistrement des vocalisations, certains souriceaux devront être isolés pendant 2 fois 5min , ce qui est une source de stress. De même, les tests comportementaux successifs adultes sont une source de stress, notemment les tests d’inhibition du réflexe de sursaut ou de conditionnement par la peurqui imposent aux animaux de subir des sons à très hauts décibels (110db) et des chocs électriques sur les pattes, qui même si modérés, induisent une réaction de stress notable (posture de freezing). Pour l'étude des conséquences du stress prénatal sur l'épigénétique, certaines femelles gestantes subiront un stress répété par contention. Afin de marquer les astrocytes, certaines autres gestantes subiront une analgésie (voie sous-cutanée) et une anesthésie générale profonde (par voie respiratoire) de 45 minutes, suivies d’un acte chirurgical comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures, puis des injections sous cutanées d’analgésique d'une durée de deux minutes 2 fois par jours pendant 3 jours. Aucun phénotype dommageable n’a été observé ou décrit dans la littérature pour les génotypes décrits.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans le cadre de l'étude seront mis à mort, soit à des fins d'études histologiques (lot 2, 384 animaux; lot 4, 368 animaux), épigénétiques (loy 5, 224 animaux), électrophysiologiques (Lot 1b, 384 animaux) ou comportementales (lot 3, 384 animaux), soit après avoir achevé leur rôle de reproduction (lot 1a, 1680 animaux).
Remplacement
A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire in vitro la complexité du cortex en développement et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part, ce qui rend l’utilisation d’un modèle murin indispensable à la réalisation de ce projet. Notamment, les effets du stress périnatal impliquent des interactions précises, transitoires et adaptatives entre les hormones, les neurotransmetteurs et les neuro-modulateurs, mais aussi avec les systèmes inflammatoires, digestifs et sanguins qui sont encore mal connues et ne peuvent être reproduites in vitro.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous optimisons les croisements des lignées transgéniquespour obtenir un pourcentage maximal d’animaux d’intérêt et nous optimisons au maximum les échantillons obtenus en réalisant plusieurs séries de coupes par cerveau pour réaliser plusieurs marquages différents sur un même cerveau. Pour les études histologiques, un test de puissance G réalisé à partir de résultats antérieurs sur un autre modèle de souris nous préconise une taille de groupe de 6 individus par genre. Pour les études comportementales, nos résultats antérieurs préconisent une taille de groupe de 12 individus. Les analyses statistiques seront réalisés par un test adapté.
Raffinement
Des points limites strictes et spécifiques à chaque procédure sont appliqués. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton de nidification et bâtonnet de bois) et sont regroupés en groupes sociaux de 2 à 6 individus par cage. La mise à mort par perfusion de paraformaldéhyde est réalisée sous anesthésie générale profonde et après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine. La chirurgie d’électroporation in utero est réalisée sous anesthésie profonde préalable par l’isoflurane (4% pour l’induction et 2% pour le maintien de l’anesthésie) et sur une plaque chauffante (37°C), et ce après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine, la désinfection du site d’incision et l’ajout d’une gel ophtalmique pour la protection des yeux. Après l’opération, l’animal reçoit à 24 et 48h l’analgésique Meloxicame en sous-cutané.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées, grâce à la présence précoce des cellules sécrétant notre protéine d'intérêt à la surface du cortex. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés sont disponibles chez la souris. Le génotypage et les prélèvements seront réalisés sur les souriceaux entre 4 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges sans douleur. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Pour étudier les rôles des sous-populations cellulaires sources de Reln dans la formation des couches corticales nous allons étudier les stades embryonnaires E12.5, E14.5 et E16.5, puis les stades postnataux P0 et P25. En effet, les neurones corticaux sont générés entre E12.5 et E16.5, atteignent majoritairement leur position à P0 mais continuent à migrer et à se différencier dans les couches corticales jusqu’à P25. Les effets des quantités de Reln sur la prolifération et la maturation des astrocytes seront analysés aux stades post-nataux P4 et P7 (avant et après la phase de prolifération) et P25 (pour pouvoir visualiser une arborescence mature). Les effets du stress prénatal sur l’expression de Reln seront évalués à P0, quand les deux sources principales de Reln corticale sont simultanément présentes. Enfin les rôles spécifiques des sous-populations sur le comportement seront analysés à P6 pour les vocalisations néonatales (âge du pic de vocalisation induite par l’isolation) et à l’âge adulte (P60-P120) pour les autres tests comportementaux qui nécessitent une maturation achevée des circuits.
Evaluation de l’effet thérapeutique de la molécule soluble CSF1R-Fc dans des modèles murins de xénogreffe de cellules tumorales de mélanome.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune portant sous la peau une greffe de cellules de mélanome mesurée au pied à coulisse deux à trois fois par semaine. Une fois la tumeur passée 50 mm3, les injections de traitement se succèdent tous les deux jours, avec une séance de bioluminescence hebdomadaire sous anesthésie. La molécule testée bloque un récepteur immunitaire, dans l'espoir déclaré d'un transfert vers la clinique pour les patients en échec thérapeutique. Le projet déclare un niveau de souffrance léger, tout en indiquant qu'une tumeur à un stade avancé peut gêner les déplacements des animaux.
Objectifs
Des études ont montré que les patients atteints de mélanome malin avancé présentaient des concentrations sériques élévées de la protéine CSF1, et une corrélation de cette expression avec la progression de la maladie. L'analyse de biopsies de mélanomes primaires et métastatiques ont révélé une corrélation de l’expression de cette protéine CSF1 et de son récepteur avec l'abondance de lymphocytes T spécifiques de la tumeur. Des études in vitro ont également montré que les lymphocytes T spécifiques de la tumeur, induisaient après activation, la sécrétion de CSF1 par divers types de cellules du microenvironnement tumoral. Enfin, des études précliniques ont montré que le blocage du récepteur du CSF1 combiné au blocage d'un point de controle immunitaire retardaient la croissance tumorale dans certains modèles de cancer de souris, dont le mélanome. L’ensemble de ces données suggère que l'induction de la protéine CSF1 dans le mélanome représente un mécanisme de résistance adaptatif conservé déclenché par des lymphocytes T activés, qui est corrélé à la progression de la maladie. L’objectif de cette étude est donc d’évaluer l’efficacité thérapeutique d'une molécule soluble bloquant le CSF1 Récepteur dans deux modèles de mélanomes, réfractaires à d'autres thérapies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont dans un premier temps la mise en place d’un modèle de mélanome le plus représentatif de la pathologie et de la problématique thérapeutique qui permettra l’évaluation thérapeutique de notre molécule bloquant le CSF1R mais qui pourra également par la suite servir à tester d’autres stratégies en développement dans notre équipe ou par des collaborateurs. L’étude de l’efficacité de notre molécule soluble bloquant le CSF1 Récepteur nous permettra dans un premier temps de l’optimiser en fonction des résultats obtenus puis dans un second temps d’envisager un transfert vers la clinique afin de proposer un nouveau traitement au patients atteints de mélanome, particulièrement ceux en échec thérapeutique.
Procédures
Injection des cellules tumorales en sous-cutané (15 minutes par souris, animaux anesthésiés). Suivi de la croissance tumorale 2-3 fois par semaine par mesure avec un pied à coulisses et prise de poids (animaux anesthésiés). Injection des traitements tous les 2 jours lorsque la tumeur est >50mm3 (animaux vigiles). Suivi de la croissance tumorale par mesure bioluminescence 1 fois par semaine (animaux anesthésiés).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés à l’implantation de la tumeur. L’implantation de la tumeur, bien que réalisée sous anesthésie et analgésie, peut conduire à une douleur légère et de courte durée aux animaux. Une fois la tumeur développée à un stade avancé il est possible qu’elle provoque une gêne aux déplacements des animaux mais sans conséquence sur leur alimentation …. Les points limites de l’expérience seront bien sûr adaptés dans le cas, peu probable, où le développement de la tumeur induirait un changement important du comportement lié à la douleur ou autre. De plus, la réalisation du traitement nécessitera de multiples injections qui peuvent également induire une douleur légère et éphémère ainsi qu’un stress.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à l'atteinte de points limites. Des prélèvements sanguins et post-mortem (tumeur, rate) seront effectués sur l'ensemble des animaux afin de réaliser une analyse comparative entre les groupes, et ainsi évaluer les effets de notre molécule sur les réponses anti-tumorales intervenant dans ce modèle.
Remplacement
La nature de cette étude ne permet pas de s’affranchir de l’utilisation d’animaux ; le même niveau d’information ne pouvant être apporté par des études in vitro ou in silico, étant donné la complexité de la réponse immune. Toutefois, l’utilisation d’animaux démarrera seulement une fois que notre molécule sera parfaitement caractérisée et son efficacité validée in vitro dans plusieurs modèles en 2D de mélanome.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, chaque étape sera réalisée successivement et les modèles/protocoles les plus pertinents seront finement sélectionnés à chaque étape. Chaque protocole sera réalisé dans un premier temps sur un petit nombre d’animaux avec le nombre minimum de groupe. Si la stratégie fonctionne, elle sera alors reproduite pour confirmer les résultats et le cas échéant des groupes contrôles seront ajoutés et le nombre d'animaux augmenté à 10 animaux final par groupe. Ce nombre est suffisant pour réaliser des tests statistiques pour évaluer la survie des animaux. D’autres tests statistiques seront également réalisés sur les données de mesure au pied à coulisse, de bioluminescence ainsi que les analyses sur organes en fin de protocole, afin d’exploiter au maximum les résultats obtenus.
Raffinement
Afin de prévenir au maximum le stress des animaux, les souris sont maintenues en groupe sociaux, dans un environnement enrichi (frisottis + tunnels) et observées quotidiennement afin d’identifier tout changement de comportement lié au stress ou à la douleur et sacrifiées en cas de souffrance. L’implantation des cellules tumorales et le suivi des animaux par bioluminescence seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie locale. Les points limites seront définis sur de nombreux critères incluant le poids et le comportement des animaux en plus de la taille/aspect de la tumeur et résumé dans un tableau pour obtenir la définition des poids limites la plus précise possible et éviter toute souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Les souris sont de bons modèles d'étude, notamment pour évaluer le bénéfice de nouvelles stratégies antitumorales, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement,...). Ce projet sera réalisé sur des souris immunocompétentes afin de pouvoir analyser le système immunitaire infiltrant la tumeur. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux, facilitant les gestes liés aux greffes de cellules tumorales, à la réalisation du traitement et renforçant également la pertinence des effets thérapeutiques (transfert clinique chez des patients adultes).
Evaluation d’agonistes inverses du GPER dans la neuropathie chimioinduite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Rendues douloureuses par administration répétée d'un anticancéreux, les souris de ce projet portent une neuropathie chimio-induite depuis la mise en place du modèle jusqu'à leur mort, soit deux semaines. Elles sont 552, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La douleur est mesurée par application d'un filament sur la patte, 64 animaux subissant en plus l'immersion de la patte dans un bain thermostaté et 16 une chirurgie de trente minutes sous anesthésie. Le porteur qualifie cette douleur de modérée, quand le projet déclare l'ensemble des 552 souris en souffrance sévère. Toutes seront tuées, la souffrance de l'animal ne pouvant pas être supprimée selon le porteur.
Objectifs
Le cancer du sein triple négatif, qui représente environ 17% des cancers du sein, a un pronostic très défavorable. Plus de 50% des patientes recevant une chimiothérapie développent des douleurs dites douleurs neuropathies induites par la chimiothérapie. De telles douleurs imposent des réductions de dose et des interruptions de traitement qui affectent inévitablement la survie. Il a été montré qu'un composé modulant le récepteur GPER (pour "G protein-coupled estrogen receptor") était doté d'une action anticancéreuse sur des cancers triple négatif chez la souris. Plus récemment, il a été montré chez l’animal que ce composé exerçait une action antalgique et anti-inflammatoire. Cela suggère qu'il serait possible de contrôler en même temps et chez un même sujet la croissance tumorale et la douleur en ciblant ce récepteur GPER. Ce projet s’intègre dans une collaboration avec une équipe de chimiste qui réalise la synthèse et la sélection de molécules modulatrices du GPER. Les meilleurs composés sont testés in vitro sur la croissance tumorale. Ainsi, nous souhaitons, chez des souris, évaluer l’action des meilleurs molécules précédemment identifiées sur la douleur neuropathique induite par la chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant non seulement de lutter contre la progression du cancer mais aussi les douleurs neuropathiques induite par la chimiothérapie. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, diffusion sanguine et système immunitaire. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.
Procédures
L’ensemble des animaux (552 souris) subiront des injections pour administrer l’anticancéreux et des composés à tester. Une injection dure quelques secondes sur animal vigil. L’évaluation de la douleur sera réalisée par l’application d’un filament au niveau de la patte de l’animal. La douleur chez certains animaux (64 animaux) sera évaluée par le test d’immersion de la patte. Ce test consiste à immerger la patte de l’animal dans un bain thermostaté. Ces deux tests sont susceptibles d’entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. 16 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale qui durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
L’ensemble des animaux du projet présenterons une douleur neuropathique induite par la chimiothérapie à l’exception des animaux contrôles. L’induction de cette douleur neuropathie chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. Elle sera induite par administrations répétées d’anticancéreux. Elle peut être associée à une diminution du gain de poids des animaux. La douleur est modérée et sera ressentie de la mise en place du modèle jusqu’à sa mise à mort, c’est-à-dire 2 semaines. Les animaux de l’ensemble du projet subiront des injections pour administrer les composés testés. La piqure d'aiguille pour l’injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’application d’un filament au niveau de la patte de l’animal ou l’immersion de la patte de l’animal dans un bain thermostaté est susceptible d’entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. Après la chirurgie de certains animaux, ils seront isolés pendant environ 30 minutes pour la vérification du bon déroulement de l’étape de réveil.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal ne peut être supprimée.
Remplacement
Les composés synthétisés seront, avant tout passage sur modèle animal, testé in silico pour leur capacité à interagir avec le récepteur GPER, ainsi que in vitro sur culture cellulaire pour évaluer et comparer leur effet avec le peptide de référence. Seuls les composés possédant une meilleure activité pharmacologique que le peptide de référence seront étudiés chez l’animal. S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. Ce type d'étude sur modèle animal est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus, le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. Si les résultats de la 1ère procédure sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées.
Raffinement
Pour les animaux subissant une chirurgie, une anesthésie adaptée sera mise en place ainsi qu’une analgésie post-opératoire. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. Afin de limiter la souffrance liée au prélèvement de queue et de phalangectomie des animaux issus de croisement génétiques, l’identification de l’animal se fera par tatouage à l’âge d’une semaine et l’évaluation du génotype se fera sur prélèvements de follicules pileux. Une grille de score adaptée au modèle utilisé a été réalisée et fournie en pièce jointe. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.
Développement et évaluation de l’effet thérapeutique de cellules immunitaires modifiées pour l’immunothérapie dans des modèles de tumeurs solides chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
7 969 souris vont être utilisées, 7 744 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune recevant une greffe de cellules tumorales dans le cerveau ou dans le vitré des deux yeux. Après une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie, certaines portent un dispositif intracérébral relié à une pompe implantée dans le dos, et toutes passent deux à trois séances d'imagerie par semaine, avec trois ponctions de liquide céphalorachidien de trente minutes et une prise de sang toutes les deux semaines. La perte de vision provoquée par les tumeurs oculaires est présentée comme sans conséquence, la vue n'étant pas l'organe sensoriel prédominant chez les rongeurs, et les deux yeux sont greffés pour diviser par deux le nombre d'animaux. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de lymphome cérébral primitif ou de glioblastome restent renvoyés à des travaux précliniques que le porteur reconnaît nécessaires, toutes les souris étant tuées pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Le système immunitaire est l’ensemble des éléments du corps qui surveillent et détruisent les cellules anormales. Malheureusement les cellules cancéreuses arrivent souvent à passer outre ce système. L’immunothérapie a été développée ces dernières années afin de réactiver le système immunitaire contre les tumeurs et de très bons résultats cliniques ont été rapportés. En utilisant une technique appelée thérapie cellulaire adoptive, nous permettons à certaines cellules du système immunitaire de reconnaitre spécifiquement la tumeur. Elles sont ensuite perfusées chez les patients cancéreux dans le but de reconnaître, de cibler et de détruire les cellules tumorales. L'immunothérapie cellulaire a montré récemment des résultats extrêmement prometteurs en utilisant des cellules modifiées et particulièrement dans le cas des cancers hématologiques (certains lymphomes et leucémies). Cependant, des résultats moins encourageants ont été observés dans certains cancers. Dans ce projet, nous allons génétiquement modifier les cellules immunitaires afin de les rendre plus efficaces et élargir leur utilisation à d’autres cancers. Les expériences proposées vont permettre d’identifier de nouveaux mécanismes anti-tumoraux et de nouvelles méthodes de traitement qui seront directement applicables dans le domaine d’immunothérapie des cancers.
Bénéfices attendus
De façon générale, la thérapie cellulaire adoptive correspond à l’expansion in vitro de cellules qui reconnaissent spécifiquement les tumeurs avant leur réinjection chez les patients. Ce nouveau type de stratégie thérapeutique anti-cancéreuse a montré des résultats prometteurs dans les essais cliniques récents mais des améliorations doivent encore être apportées pour notamment augmenter l'activité et la persistance des cellules immunitaires modifiées en évitant les effets indésirables tels l'épuisement (rendant les cellules insensibles à une activation ultérieure) Dans notre laboratoire, nous avons identifié un gène agissant comme un régulateur clé de la différenciation et formation de la mémoire immunologique de ces cellules. Nous avons observé que des cellules modifiées où ce gène a été génétiquement désactivé, sont beaucoup plus efficaces pour éradiquer des cellules tumorales dans un modèle de leucémie aigüe. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les bénéfices de ces modifications, dans des modèles de tumeurs solides. Dans un premier temps, nous travaillerons sur des tumeurs associées à un mauvais pronostic chez les patients : comme le lymphome cérébral primitif (LCP) et le glioblastome. Les cellules modifiées que nous allons développer dans cette étude représentent une option thérapeutique intéressante pour ces patients mais des travaux précliniques restent nécessaires. Le projet permettra de faire des avancées majeures dans le domaine de la thérapie cellulaire adoptive dans le but d’améliorer le pronostic des patients atteints par ces cancers.
Procédures
Dans un premier groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectés dans le cerveau des animaux anesthésiés (durée anesthésie 30min). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Dans un second groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral sera installé (durée de l’anesthésie environ 1h30). Une semaine après l’intervention, les souris vigiles recevront des traitements directement dans le cerveau grâce au dispositif intracérébral (injection unique – durée du geste 5 min) Dans un troisième groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral relié à une pompe sous-cutanée implantée au niveau du dos de l’animal seront installés (durée de l’anesthésie environ 1h30). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Les trois groupes d’animaux seront suivis par imagerie à raison de 2 à 3 imageries/semaine. Les imageries seront réalisées sur animaux anesthésiés et dureront environ 15 min. De plus, nous prélèverons du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale (3 prélèvements à au moins deux semaines d’intervalle, durée du geste 30 min) ainsi que du sang sur animal vigile (1prélèvement toutes les deux semaines, durée du geste inférieur à 20sec) Concernant les greffes intraoculaires de cellules tumorales, les cellules seront injectées dans le vitré, sous anesthésie générale et avec antalgie adaptée. La procédure dure entre 10 et 15 minutes par œil. L’évaluation de la croissance tumorale sera réalisée de façon non invasive, soit par examen ophtalmologique (ophtalmoscopie indirecte ou par photographie du fond d’œil, quotidiennement pendant 3 jours après la greffe puis 1 fois par semaine, durée de l’examen 15 min) soit par bioluminescence (2 fois par semaine, durée de l’examen 15 min), sous anesthésie. Le traitement sera délivré 1 fois par voie intraveineuse sur animal vigile (durée du geste inf à 20 sec), ou par injection intravitréenne sur animaux anesthésiés ((durée 15 min). L’évaluation de la réponse au traitement sera réalisée de façon identique à l’évaluation de la croissance des cellules tumorales greffées.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales au niveau du cerveau vont développer des tumeurs. Les souris peuvent perdre du poids dans les jours qui suivent la chirurgie et/ ou présenter, dans de rares cas, des troubles moteurs (comportement rotatoire et/ou troubles de l’équilibre). Le traitement des souris par voie intraveineuse provoque uniquement la douleur de l’aiguille utilisée pour l’injection. Dans certains cas, des dermatites peuvent se développer 3 semaines après l’injection provoquant une perte de poils à long terme. Le traitement des souris par voie intracérébrale peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2-3 jours. Le prélèvement sanguin provoque la douleur de l’aiguille et dans de rares cas une perte de poids de l’animal. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2 jours. Les animaux greffés au niveau de l’œil développeront une tumeur dont la croissance n’est pas douloureuse mais qui entrainera une baisse de la vision. Cette baisse de la vision n’aura pas de conséquence sur les animaux (sociabilisation, alimentation), ni sur le poids de l’animal, la vue n’étant pas l’organe sensoriel prédominant chez les rongeurs. Dans de rares cas, des réactions inflammatoires ou infectieuses pourront être observées suite à la greffe ou l’administration de traitements
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture. En résumé, on a découvert que certaines modifications comme l’inactivation d’un gène spécifique induit une survie prolongée de certaines cellules immunitaires, appelés les lymphocytes T. L’association de plusieurs modifications génétiques sur ces cellules devrait améliorer l’effet antitumoral des cellules modifiées. D’autre part, un grand nombre d’études ont montré l’effet délétère de certains messagers, appelés cytokines, sur le système immunitaire . Le fait de bloquer certains de ces messagers, en ajoutant des inhibiteurs de cytokines au traitement, devrait améliorer, in vivo, l’effet antitumoral des cellules modifiées. Pour valider cette hypothèse, le modèle animal est nécessaire. En effet, après la validation in vitro des bénéfices de ces traitements par différents types de cellules, il est nécessaire de les évaluer dans un système plus physiologique avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. A ce stade, l’utilisation d’animaux est indispensable pour valider les mécanismes de régulation et d’action de ces traitements, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est de 10 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, car de notre expérience, il y a toujours une certaine hétérogénéité entre souris. Ce nombre d’animaux tient compte de la nécessité d'utiliser le moins de souris possible et de pouvoir effectuer des statistiques fiables pour valider les effets biologiques observés. Pour finir, le suivi de croissance tumorale et évaluation de la réponse au traitement se fait in vivo, par imagerie de façon longitudinale et répétée, ce qui évite de devoir prévoir des animaux pour différents time points précis. Les deux yeux sont greffés afin de diminuer par deux le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, un délai minimal de 7 jours est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Toutes les expérimentations sont réalisées sur tapis chauffant, et le réveil est réalisé sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante. Pour les animaux ayant subis une chirurgie cérébrale ou une injection intraoculaire des soins pré et post-opératoires sont appliqués pour prévenir et/ou gérer la douleur. Un supplément alimentaire hydratant est mis à disposition dans les cages jusqu’au rétablissement complet de la souris (récupération du poids, absence de signes extérieurs de souffrance, absence de troubles moteurs). Pour limiter les effets secondaires dus à l’injection des cellules modifiées, comme les dermatites, nous étudierons l’effet de la délétion d’un gène potentiellement responsable de ces effets secondaires. Ces animaux sont surveillés quotidiennement pour évaluer leur état général et deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans une grille bien définie. Cette grille de score permet d’évaluer, de façon objective et spécifique, l’état global de l’animal (poids, état physique général, comportement moteur). Elle est adaptée à chaque type de procédure. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie anti-cancéreuse car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées.
Mécanismes l’infection et de la transmission de Plasmodium
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 125
Quinze à trente minutes de piqûres de moustiques sur un animal profondément anesthésié, une ponction cardiaque, ou une perfusion du foie qui tue: 5 025 souris et 125 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 150 d'entre eux anesthésiés et tués avant tout réveil. Infectés par une injection unique, ils subissent ensuite une ponction quotidienne de la queue pendant sept jours au maximum, jusqu'à ce que la parasitémie voulue soit atteinte. L'objet est d'amplifier un parasite du paludisme murin pour étudier ses formes dormantes dans le foie, le porteur écrivant que la souris et le rat servent de "simples flacons de culture cellulaire" à une étape du cycle parasitaire, et reconnaissant que le projet "ne comporte pas de considérations statistiques". Les rats sont retenus pour le volume de sang qu'ils fournissent, et les animaux sont inoculés à trois ou quatre semaines parce qu'ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de comprend la biologie du parasite Plasmodium et de ses interactions avec l'hôte, en particulier dans le foie. Le foie est le premier organe humain ciblé par les parasites du Paludisme dès leur entrée dans le corps par la piqûre de moustiques Anopheles infectés, où une première phase d'amplification massive aura lieu avant que les parasites matures ne soient libérés dans le sang pour causer la maladie. Le foie est également le réservoir des formes dormantes du parasite, qui provoquent des rechutes et maladie chronique. Malgré son importance reconnue pour les stratégies d'éradication, le développement de médicaments antipaludiques ciblant les formes hépatiques du parasite est entravé en raison de l'accès limité aux échantillons de parasites et aux moustiques infectés avec des souches humaines. Le modèle murin de paludisme surmonte ces limitations et permet de recréer l'ensemble du cycle de vie du parasite dans un environnement in vivo. Le projet concerne spécifiquement l'utilisation d'animaux de laboratoire.
Bénéfices attendus
En utilisant les parasites produits dans ce projet, nous espérons : 1) identifier les mécanismes moléculaires codés par les parasites impliqués dans l'induction et le maintien de la dormance, de l'activation et de la conversion sexuelle dans le foie, et 2) établir les relations bidirectionnelles entre le métabolisme de l'hôte et les développements cellulaires distincts du parasite et leur impact sur les résultats des traitements. Ce projet révélera les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dormance, aux rechutes et à la transmission des parasites du paludisme, et posera les bases du développement futur de biomarqueurs et nouvelles thérapies ciblant les réservoirs d'infection hépatique.
Procédures
Les animaux vigiles sont infectés par une injection unique. Une goutte de sang est prélevée à l'extrémité de la queue par ponction avec une aiguille à usage unique. Ce prélèvement est effectué quotidiennement, sur animal vigile, généralement à partir du troisième jour après l’injection et pour une durée maximale de 7 jours et nécessite moins d’une minute pour être réalisé. Lorsque la parasitémie désirée est atteinte, les animaux pour des prélèvements sanguins (par les moustiques pendant 15 à 30 minutes ou par ponction cardiaque). Les animaux non infectés utilisés pour la perfusion de foie sont profondément anesthésiés avant de procéder à la perfusion qui est létale.
Impact sur les animaux
Au cours de nos expériences, les animaux pourront subir quelques effets indésirables suite à des injections ou à des prélèvements sanguins. Ces effets indésirables sont de sévérité légère de courte durée. Le rongeur vigile ne souffrira que de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané et intraveineuse), ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue. Ces effets seront limités par l’utilisation d’aiguilles à la taille adaptée et à usage unique pour chaque animal. De plus, des analgésiques et un anesthésique local seront utilisés pour réduire les effets indésirables liés à l’injections. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort par des méthodes validées par le CEEA avant que l'infection palustre ne devienne symptomatique. Un prélèvement de sang sans réveil par piqûre des moustiques ou par ponction cardiaque sera réalisé dans l’animal profondément anesthésié. La perfusion hépatique sera réalisée uniquement sur des animaux profondément anesthésiés et constitue une classe sans réveil.
Devenir
Les animaux injectés avec le parasite ne peuvent pas être réutilisés. Les animaux utilisés pour le repas sanguin des moustiques sont anesthésiés puis mises à mort par dislocation cervicale avant leur réveil. Les animaux non infectés utilisés pour fournir des hépatocytes sous mis sous analgésie et profondément anesthésiés avant d’être perfusés ce qui est un acte létal.
Remplacement
Le modèle animal ne sera utilisé qu'à trois fins : 1) démontrer la transmission précoce des formes parasitaires sexuelles issues du foie, 2) générer des lignées de parasites transgéniques exprimant les régulateurs de la dormance ou de l'activation, et 3) produire des cellules hépatiques sauvages et transgéniques exprimant des biosenseurs métaboliques. Dans le cas où une nouvelle méthodologie est établie et devient disponible pour produire des lignées de parasites transgéniques dans le parasite du paludisme humain causant des rechutes (Plasmodium vivax), le modèle animal sera remplacé par des modèles de foie humain in vitro infectés par les lignées de parasites transgéniques humaines.
Réduction
Les animaux seront utilisés uniquement dans les situations où les expériences sur les animaux sont inévitables. Les protocoles de ce projet sont optimisés pour minimiser l'utilisation d'animaux et réduire au maximum la souffrance pendant les procédures expérimentales. Nous sommes conscients de l'impératif de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la recherche scientifique et la majeure partie de nos activités de recherche est réalisée in vitro. Cependant, certaines étapes nécessitent encore l'utilisation d'animaux, car il n’existe pas actuellement de système qui permette de reproduire le cycle de vie complet de Plasmodium berghei in vitro. Ce projet ne comporte pas de considérations statistiques, car l'utilisation des animaux se justifie principalement par la nécessité d'amplifier les populations de parasites Plasmodium chez les rongeurs. En termes simples, la souris ou le rat sont utilisés comme de simples "flacons de culture cellulaire" pour accomplir une étape très spécifique du cycle de vie du parasite – la réinfection des globules rouges – qui ne peut être réalisée ni in vitro ni ex vivo. Mis à part cette étape, toutes les autres phases du cycle de vie du parasite seront effectuées in vitro, en accord avec le principe de réduction. Des procédures similaires sont approuvées pour d'autres équipes de recherche à l'Institut Pasteur ainsi que dans des laboratoires à travers le monde. Nous adopterons des protocoles expérimentaux issus de publications largement citées et nous travaillerons à les améliorer en réduisant le nombre d'animaux nécessaires grâce à l'utilisation de nouvelles technologies plus efficaces pour éditer le génome du parasite.
Raffinement
La conception des protocoles prendra toutes les mesures appropriées pour éviter ou soulager la souffrance, la douleur, la détresse et l'inconfort. Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés, ainsi les animaux sont mis à mort avant l'apparition des symptômes et des complications physiologiques potentiellement mortelles. De plus, nous surveillons le comportement des animaux tous les jours en utilisant une échelle de détresse pour détecter d'éventuels problèmes de santé non prévus afin d'améliorer rapidement leur bien-être. Si nécessaire, du dietgel ou un enrichissement supplémentaire seront fournis. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses sont réalisées sous anesthésie générale profonde et analgésie, et les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort sera utilisée. Le poids sera enregistré une fois avant de démarrer l'expérience et ensuite tous les jours dès qu'un score dans l'Apparence ou le poids corporel est >0. Prises de décision : dès qu'un score est à 2, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei sont des espèces de rongeurs sauvages telles que Grammomys et Thamnomys, originaires d'Afrique centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et aux rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est largement reconnu dans la communauté scientifique que l'infection des rongeurs par ces parasites constitue un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l'homme. Ainsi, la valeur d'une recherche rigoureuse sur les rongeurs pour éclairer ou orienter la recherche chez l'homme est désormais solidement établie. L’utilisation de rats, tout aussi susceptibles à l’infection que les souris, a essentiellement pour but d’obtenir un volume sanguin important tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires pour préparer de grandes quantités d’érythrocytes infectés. Les animaux sont acclimatés pendant une période de 7 jours. Les inoculations de parasites seront effectuées sur des souris et des rats jeunes adultes âgés de 3 à 4 semaines, car ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection par le parasite.
La sécrétion d’un transgène par le muscle pour traiter l’ensemble de l’organisme
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
366 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une injection intraveineuse ou intramusculaire, puis cinq prélèvements sanguins sous anesthésie à deux, sept, quatorze, vingt-et-un et vingt-huit jours, avant d'être tuée au bout d'un mois pour prélèvement du foie, du cœur, des muscles et du cerveau. L'objet réel est de comparer des peptides de sécrétion pour qu'un médicament développé au laboratoire diffuse mieux depuis le muscle, l'un des transgènes testés étant déjà engagé dans ce développement. Le porteur affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire pour suivre la sécrétion du muscle vers le sang puis l'absorption par les autres tissus, et revendique le "besoin" de mesurer la réponse immunitaire contre le médicament.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de faire sécréter une protéine d’intérêt par le muscle via une approche de thérapie génique. La thérapie génique consiste à introduire du matériel génétique dans un tissu ciblé afin de restaurer une protéine manquante ou non fonctionnelle. Le traitement des maladies musculaires est souvent complexe, car il nécessite des doses élevées de médicaments pour cibler efficacement l’ensemble des muscles, ce qui conduit généralement à une réponse immunitaire élevée ou à des complications cardiaques ou hépatiques. Pour améliorer l’efficacité de la thérapie génique ciblant les muscles, nous souhaitons développer un médicament qui sera exprimé et produit dans un tissu, puis fortement sécrété vers la circulation sanguine pour être réabsorbé par des tissus plus difficiles à atteindre. Cette approche permettra d’améliorer l’efficacité du médicament tout en réduisant les doses injectées. Pour augmenter la robustesse des résultats générés, nous évaluerons les peptides de sécrétion couplés à deux transgènes sécrétés utilisés dans notre laboratoire, dont un médicament est actuellement en cours de développement.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de sélectionner un ou plusieurs peptides de sécrétion efficaces dans le muscle cardiaque ou squelettique afin d’augmenter la sécrétion de notre médicament par le muscle et, par conséquent, d’accroître sa disponibilité pour l’ensemble de l’organisme. Une protéine-médicament plus disponible permettra d’augmenter l’efficacité de notre traitement et de réduire les doses nécessaires ainsi que les effets indésirables potentiels. Dans un cadre plus large, ces peptides de sécrétion seront utilisés pour développer un traitement pour des pathologies étudiées dans notre laboratoire.
Procédures
Pour les deux procédures, chaque animal sera soumis à une injection (intraveineuse ou intramusculaire, en moins de 30 secondes). Chaque animal subira 5 prélèvements sanguins (J2, J7, J14, J21, J28 après l'injection) après anesthésie (en moins de 30 secondes). Chaque animal sera euthanasié après anesthésie, à la fin de l'étude (1 mois).
Impact sur les animaux
Les souris subiront une injection, ce qui induira un stress (contention ou anesthésie) et une douleur due à la piqûre liée à l’injection. Les souris subiront également des prélèvements sanguins répétés (J2, J7, J14, J21 et J28), ce qui induira un stress lié à la contention et une douleur due à la piqûre ; un minimun de sang sera prélevé. Les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude (1 mois), et elles subiront un stress lié à la contention et à l’anesthésie.
Devenir
Après chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin que nous puissions prélever différents tissus (foie, cœur, muscles, cerveau, etc.) pour mesurer la présence du médicament en fonction de la sécrétion.
Remplacement
Le nombre de peptides de sécrétions musculaires a été préalablement été réduit grâce à des tests in vitro, permettant d’éliminer les candidats non fonctionnels. Néanmoins, le modèle animal ne peut être remplacé, car le muscle est un tissu complexe, difficile à reproduire en laboratoire. De plus, nous avons besoin d'un organisme entier pour étudier certains paramètres, tels que la sécrétion du muscle dans la circulation sanguine, puis l’absorption du médicament dans les tissus périphériques. Il est également nécessaire de suivre la réponse immunitaire contre le médicament, ce qui n’est pas possible in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. Les souris témoins seront mutualisées pour les différentes études.
Raffinement
Les deux procédures seront réalisées uniquement sur des mâles afin de limiter la variabilité des résultats et d’obtenir des données plus robustes. Une période d'acclimatation d’environ une semaine avant de débuter l'étude sera mise en place pour permettre aux souris de s'adapter à leur nouvel environnement. Les prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine faciale sur des souris préalablement anesthésiées, afin de réduire leur stress. Le nombre de mâles par cage sera limité à 5 souris pour éviter les bagarres et les éventuelles blessures. Si des bagarres sont tout de même observées, les mâles agressifs seront séparés. Raffinements prévus pour l'hébergement : Afin de garantir le bien-être des animaux utilisés dans ce projet, plusieurs mesures seront mises en place pour optimiser leurs conditions d'hébergement. Les souris seront logées dans des cages équipées de litière et de matériel d'enrichissement (roues, tunnels, abris) pour encourager les comportements naturels et réduire le stress. Un accès libre à la nourriture et à l'eau sera assuré en permanence. L'environnement sera contrôlé en termes de température, avec un cycle lumière/obscurité respectant les besoins physiologiques des animaux (12h/12h). De plus, une surveillance régulière permettra de s'assurer du bon état de santé et du confort des animaux tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle murin pour étudier l’efficacité de nos peptides de sécrétion car c’est un modèle facile d’accès et pour lequel nous avons déjà démontré la capacité de sécrétion de notre médicament en utilisant une approche par le foie. En utilisant le même modèle, nous pourrons comparer l’efficacité de la sécrétion par le muscle versus le foie en utilisant nos données internes. Les animaux seront injectés à l’âge de jeune adulte (environ 6 semaines).