Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
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- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude des mécanismes comportementaux liés aux troubles de la prise alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Deux ponctions à la queue à trois semaines d'intervalle, un rationnement maintenant les souris à 90 % de leur poids libre, des isolements de une à deux heures et un régime riche en gras et en sucre pendant quatre à six semaines : 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objectif déclaré est de relier des traits comportementaux, anxiété, prise de risque, capacités cognitives, prise de décision, au risque de développer un trouble du comportement alimentaire, avec l'idée de transposer les résultats à l'humain. Aucun prélèvement d'organe n'est prévu, et les souris sont tuées à la fin de la procédure parce que leur âge, plus de neuf mois, et leur régime empêchent de les réutiliser ailleurs. Sur la réduction, le porteur écrit seulement que "tous les efforts seront faits" et que le minimum sera utilisé, sans indiquer comment il arrive à 400 animaux.
Objectifs
L’objectif du projet est de faire ressortir des liens entre traits comportementaux et comportement face à la prise alimentaire. Plus spécifiquement, il s'agit de faire ressortir certains profils (caractère anxieux, prise de risque, capacités cognitives, choix et prise de décision) comme pouvant être à l’origine, voir prédictifs de trouble du comportement alimentaire. Nous nous intéresserons tout particulièrement au lien entre les trois processus suivants : Le décisionnel, le motivationnel, et le mnésique. Ces différents processus seront étudiés par divers études comportementales telles que : la mesure de l'anxiété, de la cognition, de la prise de décision par l'association d'un son à une action pour obtenir une récompense. Il s’agira in fine d’offrir une analyse originale et détaillée qui pourrait s’appliquer à divers modèles animaux de désordres alimentaires. Par la suite, l'idée est de transposer ces résultats chez l’Homme afin de connaître le lien entre caractère comportementaux et risque de déclencher un trouble alimentaire. Ce savoir permettrait à l’avenir, d’anticiper au maximum le développement de troubles alimentaires touchant aujourd’hui près de 600 000 jeunes en France.
Bénéfices attendus
Les troubles du comportement alimentaire sont des pathologies mentales graves caractérisées par d’importantes perturbations du comportement alimentaire et de la corpulence. Elles peuvent causer des dommages physiques et émotionnels pouvant conduire malheureusement à la mort. Elles touchent une part importante de la population, avec une augmentation considérable depuis ces 15 dernières années, et constituent un réel problème de santé publique. Il est donc indispensable d’approfondir nos connaissances sur cette physiopathologie afin d’identifier des perspectives thérapeutiques mais aussi préventives. Dans ce projet, la confrontation de l’étude comportementale avec l’étude métabolique permet de déterminer une éventuelle corrélation entre certains traits comportementaux (anxiété, impulsivité, habitude) et paramètres consommatoires et/ou métaboliques spécifiques. Il s’agira donc d’offrir une analyse originale et détaillée qui pourrait s’appliquer à divers modèles animaux de désordres alimentaires. Transposé à l’humain, ce projet apportera des connaissances sur les mécanismes à la base du comportement alimentaire et de ses altérations, afin d’éviter, le plus tôt possible (aspect préventif), l’apparition de pathologies liées à la consommation alimentaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang par ponction à la queue (ne durant que quelques secondes, le temps de prélever une goutte de sang) afin d’analyser leur taux de glucose et le métabolisme de chaque individu. Deux prélèvements à 3 semaines d'intervalle seront effectués au total sur chaque souris pour toute la procédure. Aucune autre intervention de type chirurgicale ne sera effectuée sur ces animaux.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable majeur n'est attendu dans cette procédure. Principalement car elle est constituée de tests classiquement reconnus pour leur innocuité. Il est à noter tout de même que de légères nuisances sont à prévoir : stress, rationnement alimentaire léger (maintien à 90% du poids ad libitum). Les animaux seront également amenés à subir une isolation ponctuelle et de courte durée (pas plus de 2h), nécessaire notamment à la mesure de leur consommation individuelle. Cela peut entrainer un stress léger, qui sera diminué par l'utilisation de séparateurs de cage, permettant la conservation d'un contact visuel, auditif et odorant avec leur congénères. Dans la deuxième partie, la prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisances, qui restent moindres, pour les souris. Comme par exemple : une prise de poids de 15% maximum, une augmentation de la masse grasse, une augmentation modérée des niveaux circulants d’insuline et de glucose induisant un début d'intolérance au glucose mais pas de diabète avéré. De plus, cette nuisance, identique à celle rencontrée chez l’Homme, est l’object précis de cette étude. Enfin, le suivi des paramètres intéressants, comme le taux de glucose, pendant toute la phase du régime hyperlipidique inclu deux prélèvements de faible quantité de sang (100microL) en utilisant la méthode de prélèvement la moins invasive possible (légère ponction à la queue).
Devenir
A la fin de la procédure, les souris sont agées de plus de 9 mois, et auront déjà suivi une batterie de tests comportementaux. De plus, les animaux auront consommé un régime riche en sucre et gras pendant près de 4 à 6 semaines, empéchant toute réutilisation auprès d'un autre projet. Aucun prélèvement de tissu ou organe n'est prévu dans ce projet. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l’utilisation de modèles animaux puisqu’il s’intéresse à des dimensions comportementales, et s’adresse donc au vivant. Ceci est particulièrement vrai pour des tests d’anxiété, cognitifs, ou de prise de décision, visant à observer des différences inter-individus. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle souris par des modèles in-vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux et le minimum de souris nécessaires pour atteindre une signification statistique sera utilisé.
Raffinement
Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire. Les souris seront hébergées tout au long de leur vie en cage collective avec un environnement enrichi et dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit. Lors d’expériences spécifiques et nécessaires impliquant une courte individualisation, des solutions sont mises en place pour réduire au maximum le stress de l'animal : une poignée de sciure de leur cage d’hébergement contenant une odeur familière et celle des congénères versée dans leur cage individuelle, ou encore la mise en place de séparateurs de cage pour garder un contact visuel, auditif et odorant avec un autre congénère. L'isolement est ponctuel et ne dure pas plus de 1-2h. La mise sous restriction alimentaire, nécessaires au bon fonctionnement des expériences mesurant l’aspect motivationnel lors de tests en conditionnement opérant seront réduites au maximum, et un suivi tout particulier sera effectué sur l’évolution du poids des souris. Hormis ces deux cas de figure, tout au long de leur hébergement, les souris recevront de l’eau et de la nourriture ad libitum, et seront changées régulièrement (1 fois par semaine) afin de conserver un environnement de vie propre et confortable. Elles seront également observées minutieusement de manière quotidienne par un personnel qualifié. Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et recevra un suivi renforcé (surveillé deux fois par jour). Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être (perte de poids de plus de 15%, poils hérissés, prostration…), la mise en place de mesures appropriées sera effectuée en fonction des besoins de l’animal. Il sera si besoin isolé de sa cage et les soins nécessaires lui seront administrés. Si, suite aux soins effectués, l’animal ne montre aucune amélioration significative dans les 48h suivant sa prise en charge, il sera mis à mort. De plus, si des signes d’agressivités sont présents dans une cage collective, l’agresseur est identifié et isolé du reste du groupe.
Choix des espèces
Le modèle de rongeur permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Le comportement du vivant en réaction à l’anxiété, aux fonctions cognitives, sociales ou décisionnelles sera particulièrement exploité dans notre étude, d’autant plus que les tests comportementaux utilisés font appel à des comportements innés chez les rongeurs. La souris a tout particulièrement été choisie car les effets du régime utilisé dans la seconde partie de notre étude sont bien caractérisés chez cette espèce. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 semaines). Ils seront livrés au sein de l’animalerie par un établissement agréé dès l’âge de 3 semaines (après le sevrage). Puis hébergés en collectivité (par 4 ou 6), le temps d’atteindre leur âge adulte. Ils débuteront ensuite les premiers tests comportementaux à l’âge de 8 semaines (adulte). Puis ils seront utilisés pour une durée totale de 6 mois.
Activité constitutive des canaux calciques : une cible thérapeutique dans les cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour tester des inhibiteurs de canaux calciques contre la leucémie aiguë lymphoblastique et le neuroblastome, 150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules cancéreuses en boîte de contention, puis des molécules dans l'abdomen une fois par jour pendant cinq jours, et passent deux séances d'imagerie par semaine pendant quinze jours. Le porteur indique que les souris témoins surtout, mais aussi les souris traitées, vont développer le cancer, avec une restriction des mouvements des pattes arrière et une perte d'appétit pour la leucémie, une tumeur sous-cutanée qui progresse pour le neuroblastome. Une échelle de gravité fixe le seuil à partir duquel la souffrance doit être arrêtée, et la mise à mort intervient quand ce seuil est atteint ou quand les prélèvements l'exigent.
Objectifs
Bien que la prise en charge des patients atteints de cancer soit considérablement améliorée au cours des dernières décennies, les patients qui rechutent deviennent résistants à un certain nombre des traitements par chimiothérapies. Ces derniers reposent sur un ou une combinaison de plusieurs traitements (chirurgie, chimiothérapie, immunothérapie ou traitement ciblé). L'enjeu d'identifier l'origine et les mécanismes de cette résistance pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques reste aujourd'hui un objectif stratégique. Le cancer se caractérise par une survie accrue des cellules cancéreuses et une résistance à leur mort. Ces deux mécanismes sont associés à des défauts de régulation de la signalisation du calcium. Dans des études récentes, il a été mis en évidence des perturbations de la signalisation calcique dans deux types de cancer : le neuroblastome et la leucémie aiguë lymphoblastique (LAL). Par exemple dans la LAL, il a été observé une augmentation du niveau de base du calcium dans les cellules résistantes en comparaison aux cellules sensibles aux traitements. Ces études in vitro ont permis d'identifier des molécules qui sont responsables de cette dérégulation calcique pour ce type de cancer et que leur inhibition étaient efficaces pour rétablir l'équilibre calcique. Ce projet a pour objectif principal de proposer une alternative thérapeutique en utilisant des inhibiteurs ou anticorps spécifiques qui ciblent ces molécules responsables de cette dérégulation calcique dans ces cancers. Et l’objectif secondaire est de déterminer l'efficacité thérapeutique de ces anticorps ou inhibiteurs spécifiques en combinaison avec les agents pharmacologiques conventionnels utilisés en première ligne de traitement.
Bénéfices attendus
Il est attendu une efficacité des différents inhibiteurs ou modulateurs avec un effet bénéfique sur le ralentissement de la progression tumorale et, le pouvoir de ces inhibiteurs à ameliorer la sensibilité des drogues. Le but est de permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuse.
Procédures
Prélèvement sanguin sur animaux anesthésiés (anesthésie générale gazeuse) : 1 prélèvement, moins de 10 secondes. Injection en intra-veineuse sur souris vigile maintenue en boite de contention : 1 injection de cellules, moins de 10 secondes par injection. Injection de molécules thérapeutiques en intra-péritonéal sur souris anesthésiée : 1 fois par jour sur 5 jours, moins de 10 secondes par injection. Suivi du développement des tumeurs sur souris anesthésiée par utilisation d'un bioimageur, acquistion du signal durant 2 minutes, 2 fois par semaine sur 15 jours.
Impact sur les animaux
Les souris contrôles surtout mais également celles traitées vont développer un cancer, leucémie ou neuroblastome. L'avancée de la maladie va conduire dans le cas de la leucémie à une restriction des mouvements des souris notamment des pattes arrière, une perte d'appétit et de poids et pour le neuroblastome une tumeur qui va progesser en sous-cutané. Une échelle de gravité des symptômes observés permet d’établir un point limite dans l’ensemble des expériences. Ces points limites permettant d’identifier le moment à partir duquel la souffrance et /ou la détresse de l’animal doit être arrêtée. Lors des 2 procédures les animaux recevront des injections et seront soumis à des prélèvements de sang, source de légère douleur liée à la piqure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort , car point limites atteints et/ou nécessité de prélevements (sang, organes)
Remplacement
Au préalable, plusieurs screening et évaluations (efficacité, cytotoxicité, etc.) in vitro des différents traitements ont été effectués sur des lignées cellulaires. Cependant, pour se rapprocher des conditions physiologiques chez le patient, une étude de l'efficacité dans un modèle in vivo reste indispensable et incontournable avant leur utilisation en thérapeutique clinique. Le choix de la souris repose sur la connaissance du système immunitaire de cette espèce, sur l’abondance des outils d’analyse des réponses immunitaires à disposition et par sa proximité phylogénétique avec l'homme qui permet d’envisager la transposition en clinique des stratégies évaluées.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux en expérimentation, ne seront utilisés que les inhibiteurs ou modulateurs des canaux calciques ayant démontré une efficacité dans une étude de non-toxicité cellulaire in vitro (dans un modèle cellulaire préalablement validé). Le nombre d’animaux nécessaire est réduit au minimum en tenant compte de la variabilité des mesures entre les souris du même groupe permettant une analyse statistique significative. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement. La croissance tumorale sera suivi en ayant recourt à de l'imagerie non invasive rendu possible grâce à l'utilisation de cellules tumorales bioluminescentes. Un tel suivi longitudinal sur l'animal permet une réduction du nombre d'animaux par groupe.
Raffinement
L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, statut SPF (Specific Pathogen Free) : ce statut SPF considère les principaux pathogènes chez les rongeurs et permet donc d’établir un état sanitaire pour des animaux « en bonne santé » et indemnes des principaux pathogènes. Les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement. Les souris seront élevées en communauté dans des cages avec enrichissements. Pour les animaux présentant des difficultés de locomotion, la nourriture et l’eau seront apportés directement dans la cage sous forme de gel. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse en respiration spontanée. Toutes les interventions sur les souris seront réalisées sous hotte à flux laminaire pour éviter tout risque d'infection. Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale. Les volumes de sang prélevés aux différentes étapes seront réduit au strict minimum. Nous avons optimisé notre procédure en définissant des points limites permettant d’identifier le moment à partir duquel la souffrance et /ou la détresse de l’animal doit être arrêtée. Le suivi de la croissance tumorale se fera par un système d'imageur par bioluminescence, suivi longitudinal non invasif pour l'animal.
Choix des espèces
Le modèle animal le plus couramment utilisé dans le développement et dans l’évaluation thérapeutique en oncologie est la souris, en effet elle constitue un modèle préclinique implantable ou de greffe, dans lesquels la culture de cellules humaines sont greffés sur des animaux immunodéficients ou immunocompétents. Ce modèle constitue donc un outil pour des études physiopathologiques et le développement thérapeutique expérimental susceptibles d’améliorer le diagnostic, les connaissances physiopathologiques et nosologiques. Les souris utilisées seront agées au minimum de 6 semaines au début du protocole. Les tests débutent classiquement à 8 semaines de vie.
L’Influence du Système Nerveux Périphérique sur les Pancréatites
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Huit injections de céruléine par jour, une cinquantaine au total sur cinq à sept semaines, provoquent chez les souris une pancréatite chronique. 234 souris vont être utilisées, dont 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue puis disséquées pour prélever le ganglion cœliaque et le pancréas. Les résultats attendus portent sur les mécanismes de l'innervation tumorale, les applications médicales dans le traitement du cancer étant renvoyées au plus long terme. Le porteur écrit que la pancréatite ainsi provoquée "ne cause pas d'inconfort observable chez l'animal", alors que 180 souris sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Dans nos recherches récentes, nous avons examiné l'influence du système nerveux périphérique (SNP), en particulier la croissance des nerfs autour des tumeurs, sur le développement du cancer du pancréas et des pancréatites chroniques. Nous avons découvert que les fibres nerveuses subissent un remodelage spécifique et progressif au cours de ces pathologies, et que la suppression de ces nerfs peut affecter leur progression. Il est maintenant crucial de comprendre les mécanismes derrière ces changements des fibres nerveuses et d'explorer d'autres aspects du SNP. Pour cela, nous avons identifié des paires de molécules (ligands et récepteurs) qui jouent un rôle dans ce processus, tant du côté des nerfs que des cellules environnantes dans la tumeur. Parmi ces paires de molécules, nous avons repéré plusieurs candidats importants qui pourraient influencer l'innervation (croissance des nerfs).
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux régulant l’innervation tumorale. A plus long terme, les résultats pourraient avoir des applications médicales concrètes dans le traitement du cancer.
Procédures
Les animaux recevront des injections dans le ventre sur une période de 5 à 7 semaines. Il y aura une cinquantaine d'injections pendant cette période, chaque injection dure environ 2 secondes.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales peuvent causer de la douleur suite à la pénétration de la peau avec l’aiguille au moment de l’injection. Des aiguilles à insuline sont utilisées, la douleur de l’injection IP est donc légère et furtive. Pour les injections de céruléine, les souris sont injectées 8 fois par jour. Ces injections entraînent progressivement une pancréatite chronique qui ne cause pas d'inconfort observable chez l'animal. Nous avons observé qu'il est plus stressant pour les souris d'être anesthésiées plusieurs fois par jour durant la procédure. Une analgésie locale est effectuée aux sites d’injection avec de la lidocaïne sous forme de gel dermique. Une grille de score servira de repère pour vérifier l’état de l’animal.
Devenir
Ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures. Par conséquent, à la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés puis disséqués pour récupérer différents organes tels que le ganglion coeliaque et le pancréas, afin d’être analysés.
Remplacement
Les souris sont particulièrement pertinentes pour notre étude car elles développent des pancréatites de manière similaire aux humains, et les modèles murins de pancréatite et de tumeurs pancréatiques sont bien établis et largement acceptés. Cette similarité permet d'obtenir des résultats plus pertinents pour la compréhension des maladies humaines. Par conséquent, l'utilisation de souris, qu'elles soient sauvages ou génétiquement modifiées, est cruciale pour étudier de manière intégrée les interactions entre les cellules tumorales et le système nerveux périphérique, ce qui est essentiel pour notre projet. Il n’existe pas d’alternative non animal pour ce modèle.
Réduction
Des stratégies sont mises en place afin de limiter l'utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire, afin de comparer de façon significative 2 groupes de petite taille (4 à 8 animaux). Le nombre d’individus à avoir par lot est fixé à 5 animaux par groupe. Toutefois, 20 % des animaux peuvent ne pas être analysables à cause de la perte de matériel biologique au cours des différentes étapes réalisées entre la procédure expérimentale et l’observation. Nous avons donc besoin de 6 animaux par groupe. Le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire des animaux permet également de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de l’institut et sont maîtrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Ce projet nécessitera au maximum 234 souris.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, avec un nombre maximal de 5 individus par cage d’une surface de 500 cm², dans un environnement enrichi pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal, afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les enrichissements varient au sein de l’animalerie en fonction des périodes (cotons, dômes, tubes en carton, barrettes de bois, etc.). Il y a toujours au minimum deux types d’enrichissement disponibles pour pouvoir alterner. Les souris boivent et se nourrissent ad libitum. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé, où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et à l’entretien des élevages. Ainsi, l’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. De plus, une analgésie est administrée lorsque les expériences ou l'état des animaux le nécessitent.
Choix des espèces
Les souris sont particulièrement pertinentes pour notre étude car elles développent des pancréatites de manière similaire aux humains, et les modèles murins de pancréatite et de tumeurs pancréatiques sont bien établis et largement acceptés. Cette similarité permet d'obtenir des résultats plus pertinents pour la compréhension des maladies humaines. Par conséquent, l'utilisation de souris, qu'elles soient sauvages ou génétiquement modifiées, est cruciale pour étudier de manière intégrée les interactions entre les cellules tumorales et le système nerveux périphérique, ce qui est essentiel pour notre projet. Il n’existe pas d’alternative non animal pour ce modèle. Nos expériences seront réalisées sur des souris âgées de 8 à 14 semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux
Thérapie génique du syndrome de Prader Willi chez le nouveau-né de souris – Étape 1 : injection intracérébroventriculaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Une injection dans le cerveau, à l'âge d'un jour, sur des souriceaux éveillés retirés de leur mère : 50 nouveau-nés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le geste dure quinze secondes, après application d'une crème anesthésiante sur la peau du crâne. Le projet porte sur l'apprentissage de ce geste par le praticien, avec une solution colorée, la thérapie génique du syndrome de Prader-Willi restant l'objet d'un projet ultérieur. Chaque souriceau est tué deux minutes après l'injection pour que son cerveau soit prélevé et la diffusion du colorant vérifiée.
Objectifs
Nos travaux préliminaires ont permis d’identifier le rôle d’une famille de gènes dont l’absence est une cause principale du syndrome de Prader Willi. Il s'agit d'une maladie génétique rare sans traitement curatif qui réduit drastiquement l’espérance et la qualité de vie des patients - le syndrome de Prader Willi est suspecté après la naissance par des signes caractéristiques de faible tonicité, de difficulté de tétée puis des troubles de la croissance et comportementaux ; en cas de suspicion un test génétique permet de confimer ou infirmer la pathologie. Nos travaux sur cultures cellulaires ont permis de développer une molécule de thérapie génique qui semble capable d’exécuter les rôles des gènes manquants. Avant d'envisager des tests chez l'humain, il convient maintenant de tester cette thérapie sur la souris chez qui une modification génétique reproduit le syndrome de Prader Willi. Ces études sont indispensables avant d’envisager des essais chez l’humain. Pour être efficace, le traitement par notre thérapie génique doit se faire rapidement après la naissance. Cependant, du fait qu'elle ne peut être injectée dans le système sanguin, elle doit être injectée directement dans le cerveau des souris nouveau-nées. Le présent pré-projet vise à acquérir et valider dans notre structure le geste technique d’injection de solution chez la souris nouveau-née de un jour.
Bénéfices attendus
Acquisition d’un geste expérimental permettant l’injection d'une thérapie génique chez la souris nouveau-née, ce qui représente un intérêt pour les projets qui visent à la compréhension/correction de mécanismes cérébraux normaux et pathologiques.
Procédures
Une intervention : les souris subiront une injection intracrânienne à l'âge de 1 jour. Cette injection s'effectuera sur une durée de 15 secondes.
Impact sur les animaux
- Stress lié au retrait transitoire des souriceaux nouveau-nés de la portée - Stress léger maternel - Stress lié à la contention et douleur lié à l'injection intracranienne chez souriceaux nouveau-né vigile
Devenir
Deux minutes après l'injection intracrânienne, chaque nouveau-né sera mis à mort pour prélèvement du cerveau et observation de la bonne diffusion de la molécule colorée dans le cerveau.
Remplacement
Des études préalables sur modèles cellulaires ont permis de développer une thérapie génique du syndrome de Prader Willi. Il convient maintenant de l’administrer sur le souriceau nouveau-né chez qui l’efficacité du traitement sera évaluée en mesurant plusieurs paramètres biologiques et comportementaux, qui ne sont pas évaluables sur modèle non-animal. Ce pré-projet vise à acquérir et valider le geste expérimental d’administration intracranienne de cette thérapie génique chez le souriceau agé de un jour.
Réduction
Pour ce projet, il est prévu d’utiliser au maximum 50 nouveau-nés issus de 4 à 10 femelles souris. Nous estimons que deux vagues de dix nouveau-nés séparées d’au moins une journée seront nécessaires à la bonne acquisition du geste technique par le praticien. Si le rendement afin de valider le geste est de 90% dès la 2ième cohorte de 10 animaux (minimum 20 animaux en tout, vagues 1 et 2), le projet sera arrêté. Dans le cas contraire, une ou deux nouvelles vagues seront réalisées jusqu’à 50 animaux maximum avant de conclure au succès ou à l’échec de l’acquisition du geste.
Raffinement
Les mères seront hébergées avec des éléments d’enrichissement et de nidification (igloo en carton, bloc de coton) jusqu’à la mise bas, puis avec des éléments d'enrichissement classiques (buchettes; frisures de papier kraft) une fois le sevrage des nouveau-nés surnuméraires atteint. Pour les nouveau-nés utilisés, l’injection sera précédée d’une application sur la peau du crâne d'une crème anesthésiante. Dans le cas ou des juvéniles manifesteraient une agitation désordonnée continue considérée comme point limite, leur mise à mort sera réalisée sans attendre les 2 minutes de diffusion de la solution colorée.
Choix des espèces
La souris est l’animal pour lequel des modèles du syndrome de Prader Willi existent. Le développement pathologique chez la souris est proche de l’humain. Dans notre modèle animal, les animaux seront injectés dès le lendemain de leur naissance, afin de mimer le traitement précoce des patients SPW. En effet, le SPW implique des troubles neurodéveloppementaux dont les premières manifestations prennent place à la naissance.
Mesure du pH tumoral à l’aide de nouveaux agents de contraste: application aux modèles murins MDA-MB231 et 4T1 de cancer du sein (1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées sont immunodéficientes, un phénotype que le porteur qualifie lui-même de dommageable. 920 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, cent étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans la mamelle, des agents de contraste par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, et jusqu'à deux heures d'imagerie par séance sous anesthésie, pour mesurer l'acidité de la tumeur. Le porteur affirme qu'aucune modélisation ne reproduit la complexité des tumeurs et conclut que l'étude ne peut se faire que sur un "organisme vivant entier".
Objectifs
Malgré les avancées dans le dépistage et le développement de thérapies, le cancer du sein reste un problème de santé public majeur. Il s’agit du cancer le plus fréquent chez la femme. L’incidence du cancer du sein est en constante augmentation dans la plupart des pays malgré les efforts fournis pour la prévention de cette maladie. Une caractérisation tissulaire du cancer du sein est indispensable pour une détection plus précoce, ce qui permettra d’augmenter les chances de réussite du traitement, mais aussi de minimiser les séquelles. Il est connu que le pH extracellulaire des tumeurs est plus acide que celui du tissu sain. Ceci est dû à une augmentation de la production d’acide lactique. Nos collaborateurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au pH. L’objectif de ce projet est dans un 1er temps d’étudier l’efficacité de nouveaux agents de contraste pour mesurer les variations du pH tumoral au cours du développement de la tumeur. Une fois injectés par voie intraveineuse, l’intensité du signal de la tumeur sur l’image IRM va varier en fonction de la valeur de son pH. Ceci permet de calculer le pH tumoral et d’étudier sa variation tout au long du développement de la tumeur mammaire. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. Dans un 2nd temps, nous allons étudier la biodistribution ex vivo (prélèvements d'organes post mortem à des temps précis) de ces mêmes agents de contraste, sur souris saines et souris modèles de cancer du sein triple négatif qui est très agressif et difficile à soigner, à l'aide des analogues marqués soit à l'111In soit avec un autre radiométal. Ce projet se fera sur 2 EU.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de nouveaux agents de contraste sensibles au pH pour mesurer les variations du pH tumoral au cours du développement de la tumeur et de quantifier la biodistribution de ces agents de contraste dans les différents organes. Ce projet devrait permettre d'améliorer la connaissance sur le développement du cancer triple négatif puisque le pH est directement lié à l’agressivité tumorale et au développement de métastases.
Procédures
Dans l'EU1 (IRM), certaines souris vont recevoir une injection intra mammaire unique pour l’induction des tumeurs (durée moins de 2 minutes). Tous les animaux vont recevoir 1 injection intraveineuse ou intrapéritonéale pour l’injection des agents de contraste à étudier en imagerie par résonnance magnétique (IRM). Dans l'EU2, tous les animaux vont recevoir 1 injection intraveineuse ou intrapéritonéale pour l’injection des agents de contraste à étudier en biodistribution. Certaines souris venant de l'EU1 serviront pour les études de biodistribution dans l'EU2 et recevront au maximum 2 injections à 24h d'intervalle. Le temps d'injection est de 5 secondes environs. L’induction tumorale et les examens d’imagerie seront effectués sous anesthésie générale. Le temps total d'examen d'imagerie est de 2 heures maximum. Certaines souris vont avoir un prélèvement de sang qui se fera juste avant la mise à mort de l’animal sous anesthésie générale. (Dans l'EU1 ou l'EU2)
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sont liées au développement des tumeurs mammaires. Si des signes de souffrance apparaissent, ils feront l'objet de points limites. L’injection intraveineuse d'agents de contraste ne provoque pas de douleur, juste celle équivalent à une piqure d’aiguille. Notre expérience de l’injection d’agents de contraste fait que nous n’utilisons pas d’antalgiques pour ce geste. Les acquisitions IRM sont totalement indolores et atraumatiques. De plus les souris sont sous anesthésie gazeuse pendant toute la durée des acquisitions IRM et durant la ponction cardiaque. Les souris immunodéficientes utilisées présentent un phénotype dommageable dû à leur immunodéficience. Ces souris sont Exempt d'organismes pathogènes spécifiés et ce statut est garanti par l’hébergement en portoir ventilé et n’est pas altéré durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…).
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris anesthésiées seront mises à mort pour pouvoir récupérer la tumeur et les organes d'intérêt.
Remplacement
Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisque à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs et la distribution des agents de contrastes in vivo. Pour ces raisons, l’étude préclinique de biodistribution des agents de contraste et l’induction de tumeurs mammaires ne peuvent se faire que sur un organisme vivant entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) pour le suivi du développement des tumeurs mammaires ainsi que la Spectroscopie par Résonnance Magnétique (SRM) permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.
Raffinement
Pendant toute la durée de l’expérimentation, les souris sont hébergées par 5 dans des cages en portoir ventilé ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes, avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h et des objets d'enrichissement du milieu (maison transparent rouge, celluron, granulés dans la cage). Les souris auront une période d’acclimatation de 7 jours minimum avant le début de la procédure. Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler toute souffrance. Des points limites prédictifs (perte de poids, volume tumoral, aspect de la tumeur, détérioration de l'aspect général ou de la locomotion) nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. Toutes les tumeurs seront induites dans la 1ere EU. 24h après l'imagerie d'IRM, certaines souris seront transportées dans la 2eme EU (situé sur le même campus, distance ~1km) dans un véhicule dédié et climatisé, avec du personnel compétent. Les animaux sont transportés dans leurs cages d’hébergement à couvercle filtrant, en conservant leur enrichissement. Des procédures strictes sont appliquées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…) évitant la contamination des animaux durant les séances d'imagerie.
Choix des espèces
Certains types de cellule de tumeurs mammaires utilisées sont injectées à des modèles immunodéficients ce que l’on ne retrouve pas chez toutes les espèces mais quasiment uniquement chez la souris. Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines et murines. On utilisera des souris femelles adultes de 8 à 10 semaines; âge auquel tous les organes sont arrivés à maturation, ce qui est important pour l’élimination des agents de contraste (en particulier les reins).
Maintien et élevage de lignées de souris dans le cadre de l’étude de la réponse immune B et des lymphoproliférations
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 044 souris seront tuées pour n'avoir pas hérité de la bonne modification génétique. Elles font partie des 3 480 animaux que ce projet d'élevage prévoit de faire naître en cinq ans, à raison de trois accouplements par an pour chacune de vingt-neuf lignées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris subit au sevrage un prélèvement du bout de la queue ou une prise de sang sous anesthésie pour son génotypage, les 2 436 qui portent le bon génotype retournant à l'élevage en attente d'expériences ultérieures. Le porteur décrit la souris comme un modèle "incontournable" pour l'étude des lymphomes B et affirme que le recours à des animaux vivants est "indispensable", le mélange cellulaire en cause n'étant pas reproductible en culture.
Objectifs
Notre laboratoire étudie la réponse immunitaire normale et pathalogique des cellules spécifiques appelées Lymphocytes B avec différents objectifs: • fondamentaux : mécanismes moléculaires régulant la production des anticorps / étude du remodelage génétique / biologie de la transformation tumorale des cellules et devellopement de cancers / physiologie du lymphocyte B normal… • appliqués à des questions de médecine expérimentale : réalisation de modèles mécanistiques d’étude des pathologies de l’immunité / participation à des travaux de recherche clinique / mise en place de nouveaux outils diagnostiques pour les lymphomes ; • finalisés : approches visant notamment à l’amélioration du diagnostic ou du traitement de pathologies tumorales ou immunitaires / développements technologiques autour des méthodes de détection des cellules immunitaires… Toutes ces études nécessitent l'utilisation de différents modèles murins dont le maintien, l'élevage et le génotypage sont décrits ici. Dans les conditions de maintien des lignées (élevage), le phénotype tumoral ne s'exprime pas. Les différentes techniques de génotypage décrites sont : soit par PCR (amplification en chaîne par polymérase) via une biopsie de la queue de la souris qui permet de mettre en évidence la modification génétique sur l'ADN de l'animal ou par ELISA (technique d'immunoadsorption par enzyme liée) via un prélèvement de sang qui permet de mettre en évidence la présence d'anticorps spécifique.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de maintenir différentes lignées de souris génétiquement modifiées permettant ainsi aux chercheurs de l'unité d'avoir différents modèles d'étude pour mener à bien leur projet de recherche. Les modèles murins génétiquement modifié permettent d'intègrer une modification génétique précise au sein d'un organisme possèdant un système immunitaire physiologique complet. La modification spécifique d'un géne cible permet d'analyser et de comprendre la physiopathologie de nombreuses maladies en lien avec le dysfonctionnement du système immunitaire et particulièrement les lymphomes ou les maladies de depôts.
Procédures
Les animaux subiront au moment du sevrage un prélèvement de bout de queue ou de sang après anesthésie.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de bout de queue sous anesthésie entraine une douleur de courte durée aprés le reveil de l'animal. Le prélèvement de sang sous anesthésie induit une douleur de courte durée chez l'animal au reveil. Les animaux immunodéprimés sont maintenus dans des conditions particulières afin que leur phénotype dommageable ne s'exprime pas et qu'ils ne soient pas en contact avec des pathogènes.
Devenir
Pour les 5 ans à venir, 3 accouplements seront lancés chaque année pour renouveller le stock d'animaux avec en moyenne 8 petits par portée soit au total 3 accouplements x 29 lignées x 8 petits x 5 ans = 3480 animaux. Sur la totalité des animaux, 70% auront le bon génotypes et seront replacés dans l'elevage soit 2436 aniamux. Les 30% n'ayant pas le bon génotype seront euthanasiés, soit 1044 animaux.
Remplacement
La réponse immune B et le développement des maladies lymphoprolifératives sont étroitement liés à la présence et à l'interaction de populations cellulaires et d’un microenvironnement adapté (cellules stromales de différents types, facteurs de croissance, chimiokines…). Ce mélange complexe n’est pas reproductible in vitro et c’est pourquoi le recours à des animaux vivants est indispensable pour pouvoir étudier ces mécanismes.
Réduction
Notre laboratoire possède une grande expérience dans l’élevage des lignées murines destinées à la recherche ce qui permet d’anticiper le nombre d’animaux reproducteurs nécessaires au maintien de chaque lignée ainsi que le nombre de portées nécessaires pour obtenir un nombre suffisant d’animaux pour effectuer les diverses expériences. Ce projet comprend un grand nombre d'animaux car il décrit l'ensemble des lignées de souris élevées par notre laboratoire pour une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux produits est réduit au minimum afin d'être suffisant pour maintenir la lignée et effectuer les expérimentations ultérieures tout en évitant de produire des animaux inutilement.
Raffinement
L’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux : les prélèvements de sang et de tissus seront tous réalisés sous anesthésie générale gazeuse et par du personnel qualifié maitrisant ces gestes. Les animaux sont maintenus sous surveillance jusqu’à leur réveil. L'observation régulière des animaux et le suivi de leur comportement permettra d’avoir un contrôle sur leur état de santé et tout animal présentant des signes de souffrance sera immédiatement euthanasié.
Choix des espèces
Il existe une très forte homologie de structure et fonction entre les locus IgH humain et murins faisant de la souris un modèle expérimental incontournable pour l'étude des disfonctionnements oncogéniques aboutissant à la genèse des lymphomes B et pour le developpement de nouvelles stratégies thérapeutiques. La souris est également l'espèce de référence internationale pour l'étude des lymphomes. La réponse immune B et le développement des maladies lymphoprolifératives sont étroitement liés à la présence et à l'interaction de populations cellulaires et d’un microenvironnement adapté (cellules stromales de différents types, facteurs de croissance…). Ce mélange complexe n’est pas reproductible in vitro et c’est pourquoi le recours à des animaux vivants est indispensable pour pouvoir étudier ces mécanismes. Dans ce projet, les animaux seront mis en reproduction à partir de l’âge de 8 semaines, âge auquel mâles et femelles sont sexuellement matures et jusqu’à l’âge de 20 semaines car les animaux plus âgés (en particulier les femelles) commencent à présenter des difficultés à se reproduire. Le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage, c’est-à-dire à l’âge de 4 semaines.
Phénotypage métabolique d’une lignée de souris invalidée pour une protéine intervenant dans le stress du réticulum endoplasmique au niveau de l’hypothalamus.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées d'abord pour n'avoir pas le bon génotype, tuées ensuite à la fin de chaque procédure pour que leurs organes soient prélevés, 1 920 souris vont être utilisées, 1 440 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 480 au niveau modéré. Le bout de leur queue est coupé aux ciseaux pour le génotypage, une partie d'entre elles est rendue obèse et diabétique par trois mois de régime gras et sucré, et sept prélèvements de sang sont faits à la queue. Certaines sont opérées quarante-cinq minutes pour la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire, puis soumises à un test de deux heures avec quinze mesures de glycémie et huit prises de sang, d'autres isolées cinq jours en cage de mesure, d'autres perfusées au paraformaldéhyde par le cœur. Le porteur justifie ses effectifs par des lots de douze souris par condition, sans expliquer comment ces lots conduisent à 1 920 animaux.
Objectifs
L'obésité entraîne une inflammation au niveau du cerveau qui perturbe son fonctionnement et modifie le comportement alimentaire des patients obèses. Ainsi ils sont moins sensibles à la satiété et ont tendance à manger plus qu'ils ne devraient. Nous étudions une protéine anti-oxydante qui agit au niveau de l'hypothalamus (une zone précise du cerveau, qui régule le comportement alimentaire) mais aussi sur d'autres organes comme le pancréas ou le foie . Cette protéine a la particularité de protéger contre l'inflammation due à l'obésité. Pour étudier cette protéine nous utiliserons un modèle animal, la souris, elle sera génétiquement modifiée et ne produira plus cette protéine anti-oxydante au niveau de l'hypothalamus. Les animaux seront nourris avec un régime alimentaire gras et sucré, afin de les rendre obèses et diabétiques, puis ils passeront plusieurs tests durant lesquels nous mesurerons la quantité de nourriture qu'ils mangent et leur activité physique. Enfin nous mettrons à mort les animaux pour prélever leurs organes et les étudier.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre la mise au point d'un nouveau traitement contre l'obésité et le diabète de type 2, qui connaissent une progression significative depuis 30 ans de sorte que la pandémie actuellement observée au niveau mondial constitue un réel enjeu de santé publique.
Procédures
Le bout de la queue des animaux sera coupé (de 2 ou 3 mm) une seule fois, afin de réaliser un génotypage. Une partie des souris sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 3 mois, ainsi ces animaux deviendront obèses et diabétiques. Des prélévements de sang seront effectués à partir de la queue des animaux qui resteront libres de leurs mouvements (7 prélèvements par animal, chacun des prélévements prendra moins d'une minute). Certains animaux seront opérés pour placer un cathéter dans la veine jugulaire. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale durera 45 minutes. Après 1 semaine de repos ces animaux suivrons un autre test : ils seront libres de leurs mouvements et porteront un collier. Pendant 2 heures nous mesurerons leur glycémie 15 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 8 fois). Il n’y aura qu’un seul test de ce type pour ces animaux. Une partie des animaux seront placés dans une cage individuelle qui mesurera en temps réel leurs déplacements, leur prise de nourriture et d'eau. Ils seront également scannés pour évaluer leur quantité de muscles et de graisses.
Impact sur les animaux
#1. Régime hypercalorique : Après 3 mois de régime hypercalorique les animaux ont un surpoids et présentent les premiers signes d'apparition du diabète de type 2, ces nuisances sont modérées. #2. Test de tolérance au glucose et à l'insuline : Le gavage, l’injection intra-péritonéale et les prélèvements sanguins peuvent stresser les animaux (nuisances légères). La queue des animaux sera coupée au ciseau, cela entraine une douleur considérée comme légère. #3. Pose d’un cathéter dans la veine jugulaire : Plusieurs effets indésirables sont possibles. Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie. La chirurgie peut entrainer des douleurs modérées et des problèmes de récupération modérés. #4. Analyse de calorimétrie indirecte : les animaux seront individualisés pendant 5 jours, cela entrainera un stress et une possible perte de poids (nuisance modérée). #5. Mesure du renouvellement du glucose : le risque principal est de créer une hypoglycémie lors du test, si les niveaux de perfusion d’insuline et de glucose ne sont pas optimaux. Cet effet indésirable sera considéré comme modéré. #6. Perfusion intra-cardiaque de paraformaldéhyde ET #7. Prélèvement de sang intra-cardiaque : Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie (effet indésirable modéré).
Devenir
Les animaux de génotype non adéquat pour les expériences ou le maintient de la lignée seront mis à mort. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.
Remplacement
Afin de comprendre, de façon globale, le rôle de la SELENOT dans le contrôle de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2, nous utilisons une lignée de souris transgéniques obtenue par le système Cre-Lox, afin de pouvoir inhiber l'expression de la Sélénoprotéine T, de façon sélective, au niveau des neurones POMC de l'hypothalamus.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, les procédures n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux intercalées avec des périodes de repos de 7 jours au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entraîner une douleur (tatouage, génotypage, actes chirurgicaux) sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront un traitement analgésique avant l'acte qui peut être poursuivi après l'acte si nécessaire pour prévenir la douleur. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par la mesure des prises de nourriture et de boisson, et le suivi du poids de chaque animal. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle physiologique de notre protéine d'intérêt dans le contrôle de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité, associée au diabète de type 2; et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme.
Evaluation de l’efficacité de l’ORFADIN pour le traitement du cancer pancréatique avec des métastases
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Greffées de cellules tumorales dans la rate au cours d'une chirurgie de vingt-cinq minutes, puis suivies par imagerie sous anesthésie, 191 souris vont être utilisées, dont 161 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie reçoit trois injections de chimiothérapie par semaine pendant deux semaines. L'objet est d'évaluer un médicament commercialisé depuis 2001 pour une maladie héréditaire du foie, l'ORFADIN, contre le cancer du pancréas métastatique, les résultats devant être intégrés à un brevet protégeant cette nouvelle indication. Le porteur indique que l'usage d'anti-inflammatoires et de morphiniques est "proscrit" dans ce protocole parce qu'ils modifient le métabolisme tumoral, la seule réponse prévue à la douleur étant alors la mise à mort de l'animal, par dislocation cervicale.
Objectifs
L'ORFADIN est un médicament utilisé en clinique depuis 2001 pour le traitement d’une maladie héréditaire du foie engendrée par la dégradation incomplète de la tyrosine, un acide aminé apporté par les protéines alimentaires. Des travaux de l’équipe montrent que la voie de dégradation de la tyrosine par les cellules métastatiques est exacerbée et qu’elle est essentielle à leur survie et à leur expansion (in vitro). Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de l’inhibition de la dégradation de la tyrosine par l’ORFADIN et/ou de l’apport de tyrosine par l’alimentation (i.e. régime déficient en tyrosine) dans le traitement du cancer du pancréas avec des métastases. Ce projet comportera 3 objectifs : Obj. 1 : Evaluer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non à la chimiothérapie, le FOLFIRINOX (abréviation FFX utilisée dans la suite de la saisine) dans le traitement des métastases du foie : - administré seul l’ORFADIN prolonge-t-il l’effet de la chimiothérapie sur les métastases, - combiné à la chimiothérapie est-il plus efficace que la chimiothérapie, - si ce schéma thérapeutique est poursuivi par l’administration d’ORFADIN, maintient-on l'effet anti-métastatique du traitement combiné ? - combiné à un régime sans tyrosine, le traitement combiné ORFADIN+chimiothérapie est-il plus efficace ? Obj. 2 : Evaluer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non au FFX dans le traitement des tumeurs primaires pancréatiques. Les 3 questions posées dans l’objectif 1 seront adressées afin d’évaluer l'efficacité des différents schémas thérapeutiques sur la progression/régression de la tumeur pancréatique. Obj. 3 : Etude de la toxicité de l'ORFADIN. Les modèles expérimentaux utilisés seront des souris développant des métastases du foie (Obj.1 et 3) et des souris développant des tumeurs pancréatiques (Obj. 2 et 3).
Bénéfices attendus
Cette étude pré-clinique a pour but de confirmer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non au FFX dans le traitement des cancers pancréatiques avec des métastases et d’évaluer la toxicité de ce traitement combiné. Les résultats obtenus permettront seront inclus dans le brevet visant à protéger l’utilisation de l’ORFADIN pour le traitement du cancer pancréatique avec des métastases. Elle permettra également de proposer un essai clinique aux patients atteints de cancer pancréatique avec des métastases, qui sont actuellement inéligibles à la chirurgie, seul traitement curatif disponible en clinique.
Procédures
Les souris de la procédure 1 seront soumises à une procédure chirurgicale de greffes de cellules tumorales dans la rate, une seule procédure chirurgicale par souris sera effectuée. Cette procédure chirurgicale durera 25 min max. (temps d'endormissement, chirurgie et réveil de l'animal). Les souris traitées au FOLFIRINOX recevront 3 injections par semaine de cette combinaison de chimiothérapie et ce pendant 2 semaines. La durée de ce geste est de 1-2 min. Le suivi de l’évolution des métastases du foie par de l’imagerie en bioluminescence a une durée estimée par animal de 15 min (temps d'endormissement, imagerie et réveil de l'animal).
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont pour la procédure 1 : avant l’acte chirurgical : contention et injections sous-cutanées d’antalgique et d’anesthésique local qui peuvent générer un léger stress ; au cours de l’acte chirurgical : l’anesthésie gazeuse peut engendrer une hypothermie et une détresse respiratoire si elle est mal contrôlée ; en post-chirurgie : des complications post-opératoires (rupture des points de sutures, infection de la plaie) peuvent survenir et engendrer de la douleur qui doit être rapidement prise en charge ; les animaux devront être isolés de leurs congénères ce qui génère un stress. Pour les procédures 1 et 2, les nuisances au cours du développement de la tumeur primaire et des métastases sont les suivantes : douleur, perte de poids, mobilité réduite, apparences et/ou comportements anormaux, celles-ci sont grâce à notre expertise du modèle rapidement détectées et en fonction du score déterminé, la procédure adaptée sera mise en œuvre.
Devenir
Afin d'évaluer la prise métastatique au sein du foie et la régression de la tumeur primaire en fonction des traitements administrés aux animaux, ceux ci seront euthanasiés par dislocation cervicale et autopsiés.
Remplacement
Le recours à des animaux est absolument indispensable pour mener à bien ce projet qui vise à inhiber le dialogue entre les cellules cancéreuses des métastases de foie et les cellules du foie avoisinantes. Ceci, en utilisant un médicament déjà sur le marché pour une autre indication thérapeutique que le cancer du pancréas, et à évaluer son effet anti-cancéreux sur la tumeur du pancréas et sur les métastases du foie, et sa toxicité sur les organes sains. Ce projet fait suite à des expériences de culture de cellules de métastases de foie cultivées avec des cellules de foie validant la pertinence d’inhiber le dialogue entre ces deux types cellulaires pour limiter l’expansion des métastases. Ainsi, il est à présent nécessaire de démontrer au sein d’un hôte vigile, porteur de métastases et avec des fonctions du foie non-altérées, qu’un médicament associé ou non à un régime alimentaire spécifique, combiné à la chimiothérapie de référence des patients, permettrait de réduire la progression des métastases sans entrainer d’importants effets secondaires, qui ne peuvent être appréhendés que sur des modèles animaux de cancer pancréatique avec des métastases.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention d’un effet anti-tumoral significatif de chaque traitement par rapport aux animaux non-traités a été défini en utilisant le test statistique d’analyse de la variance suivi de comparaisons multiples. La diminution attendue de l’incidence/taille des tumeurs primaires/métastases et les différences inter-individuelles ont été estimées sur la base de données bibliographiques et de résultats antérieurs de l’équipe. Ainsi, pour la procédure 1, le nombre d’animaux nécessaire est de 13/groupe alors que pour la procédure 2, il est de 10/groupe.
Raffinement
Les personnes compétentes (formations en expérimentation animale + chirurgie) réaliseront les injections d’antalgiques pré et post-opératoires et de l’anesthésique local avant l’incision, l’incision et l’injection des cellules tumorales dans la rate. Ceci afin d’éviter toutes complications post-opératoires et limiter ainsi le nombre d’animaux à opérer. Une grille de points limites sera quotidiennement remplie pour chaque modèle : souris avec une tumeur pancréatique ou des métastases dans le foie, et des mesures adéquates seront prises : euthanasie directe si nécessaire car l’utilisation d’anti-inflammatoires non stéroïdien ou de dérivé morphinique pour limiter la douleur est proscrite dans le cadre de ce protocole. En effet, les données bibliographiques montrent que leur administration altère le métabolisme tumoral, limite la croissance tumorale et/ou potentialise l’action de la chimiothérapie. Un enrichissement matériel de l’environnement des animaux (cocon, nid, maisonnette, etc…) est mis en place dans toutes les cages afin que les souris expriment un répertoire diversifié de comportements normaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris, modèle d'étude de référence dans le domaine du cancer pancréatique et dont les caractéristiques morphologiques et génétiques des tumeurs récapitulent fidèlement la maladie chez l’homme. De plus, cette espèce se caractérise par de nombreux avantages, notamment leur développement rapide, une descendance nombreuse et une facilité d’entretien et d’élevage. Les souris développant des tumeurs pancréatiques seront traitées ou non dès l’âge de 6 semaines pour une durée de 4 semaines. Elles seront euthanasiées au stade de jeune adulte (environ 10 semaines après la naissance), stade à partir duquel les tumeurs prélevées sont dites de haut grade, comme la majorité des tumeurs pancréatiques diagnostiquée chez les patients. Ce dernier argument est requis pour notre étude qui vise à améliorer à terme l’efficacité des traitements des tumeurs pancréatiques à fort potentiel métastatique . L'implantation des cellules tumorales dans la rate des souris saines, seront réalisées chez des souris âgées de 5 semaines, puis traitées ou non pendant 4 semaines, la semaine suivant l'implantation. Elles auront un âge similaire aux souris avec tumeur pancréatique lorsque les traitements débuteront, à ce stade, l’impact du métabolisme sur la progression métastatique ne sera pas impacté par une prise de poids ou tout autre facteur lié au vieillissement de l’animal. Elles seront euthanasiées au même âge que les souris avec des tumeurs pancréatiques.
Approches thérapeutiques dans une maladie inflammatoire chronique (lupus érythémateux)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes les souris sont tuées avant l'âge de quatorze semaines, avant que le lupus dont elles héritent n'atteigne le stade où il abîme sérieusement leur organisme. 720 souris femelles vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont tatouées sous anesthésie, reçoivent des injections dans le ventre trois fois par semaine pendant deux à quatre semaines ou un gavage quotidien pendant deux semaines, avec des prélèvements de sang à la joue ou dans l'œil et un prélèvement d'urine. Le porteur écrit que "ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus", pour un projet qu'il déclare lui-même en gravité sévère sur l'ensemble des 720 animaux.
Objectifs
Le projet a pour but de tester des approches thérapeutiques spécifiques contre une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (lupus). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques innovantes pour améliorer la prise en charge des patients. Dans ce but, un modèle de souris qui développent spontanément cette maladie sera utilisé et des facteurs responsables de certains paramètres de la maladie seront ciblés. Les patients atteints de lupus développent des anticorps dirigés contre des molécules présentes dans l’organisme (autoanticorps). Ces autoanticorps activent des cellules du système immunitaire, ce qui va induire une inflammation importante dans tout le corps, et notamment au niveau des reins. Nous testerons ici des molécules permettant soit de diminuer la quantité d’anticorps, soit d’empêcher l’augmentation de la production de ces autoanticorps.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du lupus et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cibles thérapeutiques dans le lupus permettra de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’humain. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.
Procédures
Un génotype (gène mutant dans une lignée de souris) dommageable est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent un lupus lorsqu’elles sont adultes qui ressemble à la maladie observée chez les patients qui se développe également chez des sujets adultes. Toutes les souris seront utilisées (et donc euthanasiées) avant de pouvoir développer une gravité de la maladie altérant leur état général. Tous les animaux seront tatoués sous anesthésie générale (acte durant 2 minutes). Des groupes/lots d’animaux éveillés recevront un traitement thérapeutique différent soit par des injections dans le ventre (15 secondes/injection) 3 fois par semaine sur une durée de 2 ou 4 semaines soit des administrations quotidiennes par voie orale (gavage - 30 secondes/gavage) pendant 2 semaines. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur animal anesthésié avant le début des traitements soit au niveau de la joue soit au niveau de l’œil (2-3 minutes par prélèvement) ainsi qu’un prélèvement urinaire (1 à 2 minutes par prélèvement). Certains animaux auront un 2e prélèvement sanguin trois jours après l’administration d’un traitement.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sur les animaux lors des procédures seront de plusieurs catégories : L’anesthésie générale peut induire un inconfort de 2-3 minutes au réveil (étourdissement). Les prélèvements sanguins peuvent induire une démangeaison le temps de la cicatrisation (moins de 24 heures). Un stress passager sera induit lors des contentions nécessaires aux actes. Une légère douleur brève de piqûre sera induite lors des injections intrapéritonéales (15 secondes). Un stress et un inconfort passager (30 secondes) seront induits lors des gavages. Les souris ayant la maladie (le lupus) développent des symptômes inflammatoires au niveau de la peau et des articulations ainsi qu’une insuffisance rénale entre 20 et 30 semaines d’âge qui peuvent modifier leur comportement. Toutes les procédures se terminent quand les souris ont l’âge de 14 semaines soit avant que ces symptômes ne se soient développés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour analyse des tissus prélevés (reins, rate, ganglions) afin de déterminer les paramètres inflammatoires dans ces tissus.
Remplacement
Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de l’efficacité de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers vivant avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observée que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des sytèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.
Réduction
Le présent projet vise à tester différentes approches thérapeutiques qui ont été identifiées préalablement tant dans des modèles animaux que chez des patients. Cela a permis de réduire le nombre d’hypothèses de travail et donc de diminuer le nombre d’animaux prévus dans le présent projet. Le nombre d’animaux est calculé en fonction des besoins du projet afin de pouvoir conclure scientifiquement et cliniquement (être sûr des effets observés). Le but est de valider nos approches thérapeutiques afin de pouvoir les développer pour la pathologie humaine. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum mais est suffisant pour pouvoir obtenir des conclusions scientifiques solides.
Raffinement
Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Le modèle de lupus utilisé induit une maladie pouvant entraîner des douleurs inflammatoires passagères mais qui porte atteinte sérieusement à l’intégrité physique des animaux au-delà de 20 semaines d’âge. Tous les animaux seront utilisés avant d’atteindre l'âge de 15 semaines. Afin de s’assurer du bien-être des animaux et qu’aucun ne développe une atteinte sévère avant la fin des procédures, une grille de score clinique a été établie afin de suivre l’état général des animaux et d’identifier ceux nécessitant une intervention rapide d’interruption des procédures car ils auraient atteint les points limites déterminés. Cet examen clinique des animaux est réalisé trois fois par semaine. Les animaux n’ayant pas un score nul (mais inférieur au point limite) se verront apportés une attention particulière, notamment avec l’apport d’eau et de nourriture humide directement dans la cage afin d’optimiser leurs conditions d’hébergement. Par ailleurs, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, jamais isolés, toujours avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher) et sont observés quotidiennement.
Choix des espèces
Les études d’une approche thérapeutique innovante dans une pathologie humaine doivent être réalisées sur des modèles animaux afin de justifier le passage aux tests chez l’Homme. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et toutes les mesures permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés ainsi que les éventuelles souffrances subies par ces animaux seront entreprises. La souris est le seul modèle de mammifère pertinent pour les objectifs scientifiques de notre projet. Les souris du projet seront toutes des femelles adultes comme les patients humains qui sont à 90% des femmes en âge de procréer.
Effets métaboliques et cognitifs des variations d’apport en tryptophane et des fibres alimentaires dans l’alimentation (Multisite 1/2).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
650 rats vont être utilisés, chacun logé seul en cage pour que sa consommation alimentaire soit mesurée, quatre jours par semaine pendant six semaines, avec deux heures de retrouvailles quotidiennes ou un week-end en binôme. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue. Jeûne de quinze heures, privation d'eau de six heures, sept passages au maximum dans des tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, jusqu'à cinq prises de sang, quarante-huit heures en cage de collecte d'urines et de fèces, et pour quarante rates deux traites manuelles sous anesthésie après trois heures de séparation de leurs petits. L'enjeu déclaré est d'évaluer les effets de la végétalisation de l'alimentation humaine sur le métabolisme et le comportement, les résultats devant alimenter une collection de données utile aux pouvoirs publics.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.
Bénéfices attendus
Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.
Procédures
Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.
Impact sur les animaux
Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.
Réduction
A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.
Raffinement
Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.
Etude préclinique de transplants de microbiotes fécaux humains : tests d’efficacité d’implantation de différentes formulations de transplants chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Des formulations de transplants de microbiote fécal humain, mises au point par un partenaire industriel, sont testées sur 120 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit un gavage puis cinq prélèvements de fèces, obtenus en le maintenant jusqu'à cinq minutes dans un pot en plastique. Toutes sont tuées à l'issue pour le prélèvement des organes et des analyses histologiques. Le porteur détaille son calcul, quatre à six souris par groupe suffiraient selon la littérature, il en prévoit huit, puis ajoute par précaution un groupe entier de huit animaux par série en cas de contamination accidentelle, ce qui porte l'effectif à 120.
Objectifs
Le partenaire industriel de ce projet développe des thérapies de restauration du microbiote à écosystème complet pour des patients atteints de cancer. Il cherche à traiter les dysbioses (déséquilibre des relations entre le microbiote et l’organisme) modérées à sévères afin d’améliorer les chances de survie. Pour cela, il a déjà conçu plusieurs produits et voudrait développer d’autres formulations afin de cibler une plus large gamme de pathologies. Il souhaite également tester plusieurs méthodes de conservation de produits déjà existants. L’objectif de ce projet est de tester plusieurs produits en les inoculant à des souris pour étudier (i) l’efficacité de l’implantation de ces microbiotes complexes humains, (ii) les répercussions sur l’organisme.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’améliorer les performances des thérapies de restauration du microbiote chez les patients atteints de cancer ou d’autres pathologies. En améliorant le traitement des dysbioses dont ils souffrent, leurs chances de survie pourront être augmentées.
Procédures
Les 120 animaux (nombre maximum) subiront un seul gavage (durée < 1min), ainsi que 5 prélèvements de fèces à plusieurs jours d’intervalle, pour une durée de 5 minutes chacun, le temps que les souris émettent spontanément des fèces.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lors des gavages et lors des prélèvements de fèces (5 minutes de séjour au plus dans un grand pot en plastique transparent).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.
Remplacement
Actuellement, aucun autre modèle que l’animal n’existe pour caractériser l’implantation de microbiote complexe dans le tractus intestinal et en évaluer les effets sur différents organes.
Réduction
Les nombreuses analyses de composition du microbiote intestinal par biologie moléculaire publiées dans la littérature scientifique indiquent qu’un nombre réduit de souris par groupe et par sexe, de l’ordre de 4-6, est suffisant. Dans notre projet, nous utiliserons 8 souris/groupe (4 mâles et 4 femelles), ce qui conduit à 32 souris/série. Cependant, nous ajoutons par précaution un groupe de 8 animaux à chaque série, en cas de contamination accidentelle d’un groupe par d’autres micro-organismes que ceux étudiés (ce groupe serait alors à refaire). Cette précaution porte l’effectif à 40 souris/série, soit 120 souris au total (nombre maximal). Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques.
Raffinement
L’expérience commencera après une semaine d’acclimatation aux nouveaux groupes sociaux et aux nouvelles conditions environnementales (passage des élevages des fournisseurs à l’animalerie d’expérimentation, constitution des groupes étudiés). Il y aura une observation quotidienne des animaux depuis l’extérieur des cages, une observation individuelle et une pesée hebdomadaire à l’occasion des prélèvements fécaux, ainsi qu’une observation accrue dans les heures qui suivront les inoculations orales. Dans la semaine qui précède ces inoculations, les souris seront prises en main quotidiennement pour les habituer à être manipulées et ainsi diminuer le stress le jour de l’inoculation. Les animaux seront hébergés dans des cages standards par groupe de 4 souris du même sexe. Du papier absorbant ou des nids de papier kraft à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. En cas d’accident ou de maladie, les points limites définis pour cette étude seront appliqués.
Choix des espèces
La souris est un modèle établi pour la recherche sur le microbiote intestinal avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des souris jeunes adultes âgées de 6 à 8 semaines car les produits étudiés sont pour l’instant destinés à des adultes, il est donc logique d’utiliser des animaux adultes pendant la phase d’étude préclinique.
Etude de l’implication des neurones sensoriels dans le cancer du côlon et immunité
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Laparotomie pour injecter des produits dans la paroi intestinale ou directement dans des adénomes, injections entre les vertèbres, dépôt de cellules tumorales dans le rectum, biopsie de queue : 458 souris subissent ces gestes, dont 252 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à l'issue. Le porteur indique que les tumeurs intestinales peuvent provoquer douleur et prolapsus rectal, et que les chirurgies peuvent entraîner des délabrements. L'objet déclaré est de comprendre le rôle des neurones sensoriels dans la croissance des tumeurs du côlon, une étape amont dont les retombées thérapeutiques restent à l'état d'hypothèse. Une grille de score doit repérer les 16 % d'animaux susceptibles de perdre du poids et de développer une anémie, sans que le RNT dise d'où vient cette proportion.
Objectifs
Les tumeurs solides sont souvent infiltrées par des fibres nerveuses, qui peuvent participer dans l'initiation et/ou la progression tumorale. Par exemple, dans les cancer de la peau, les cellules cancéreuses interagissent avec les terminaisons nerveuses sensorielles en produisant des neuropeptides, qui influencent la croissance tumorale par divers mécanismes incluant le contrôle de l'activité des cellules immunitaires infiltrées. Par ailleurs, l'absence des fibres nerveuses sensorielles dans des modèles animaux de colites exacerbe l'inflammation et la pathologie, et l'inflammation chronique intestinale est établie comme un facteur de risque du cancer colorectal. Néanmoins, le rôle des neurones sensoriels reste à identifier précisément dans le cadre du cancer colorectal, et des intéractions entre ces neurones et les cellules immunitaires restent à examiner dans le cadre de cette pathologie. Nous avons donc proposé d'étudier le rôle des neurones sensoriels dans la croissance tumorale et la surveillance immunitaire au cours du cancer colorectal. La présente saisine couvre donc des aspects initiaux de notre projet, incluant la création de modèles animaux de carcinogénèse intestinale et de co-cultures cellulaires in vitro.
Bénéfices attendus
Sur le plan fondamental, le rôle du systeme nerveux sensoriel dans la croissance tumorale intestinale sera comprise chez la souris. Sur le plan translationnel, les résultats permettront d'envisager d'utiliser l'activité nerveuse, pour modifier la croissance tumorale au cours du cancer colorectal. Parmi les hypothèses, l'identification des neuropeptides sécrétés par les neurones sensoriels pourraient suggérer des traitements afin d'agir sur le système immunitaire, sur les tumeurs, ou potentialiser des traitements déjà connus.
Procédures
Nous réaliserons les gestes suivants: Traitement pour l'induction des tumeurs intestinales : durée 3 minutes incluant la prise en main (1x/jour pendant 5 jours). Injections inter-vertebrales: durée 10 minutes par souris ; Injections dans le parois intestinale ou dans des adénomes intestinaux: durée 30 minutes comprenant la laparotomie (1/souris) ; Injections de cellules tumorales dans le rectum : durée 20-25 minutes incluant le positionnement sur le masque d'anesthésie (1/souris). Biopsie de queue à 14j pour génotypage: durée 30sec/souris (1/souris)
Impact sur les animaux
Le modèle animal que nous utiliserons développent des tumeurs dans l'intestin qui peuvent provoquer de l'inconfort et/ou de la douleur lorqu'elles sont trop nombreuses et/ou trop grosses, voire induire un prolapsus rectal. De même, l'implantation dans le rectum de cellules tumorales de stade plus avancé peut provoquer de la douleur dûe à la croissance de la tumeur, voire un prolapsus rectal. Les chirurgies nécessaires à la réalisation des injections intra-tumorales ou dans la paroi intestinale ou intrathécales, peuvent induire des délabrements et/ou des douleurs post-chirurgicales. Les différents traitements en i.p. peuvent générer un stress et une douleur légère transitoire. Les biopsies de queues pour le génotypage peuvent générer une douleur légère de courte durée.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort
Remplacement
Les expériences in vitro ont permis d'identifier des intéractions de terminaisons nerveuses avec des cellules tumorales et/ou immunitaires, et nous exploitons ces données. Nous reprendrons cette approche pour une partie de notre projet, ce qui limitera le nombre d'animaux requis et le caractère invasif de certaines experiences in vivo (susceptibles de générer des informations équivalentes). Des analyses de bases de données publiques in silico permettront de sélectionner des candidats moléculaires. Néanmoins, certaines observations ne peuvent être réalisées en dehors du contexte de l'animal, telles que les études des intéractions multicellulaires, de la morphologie des structures. Enfin, le contrôle sélectif des neurones sensoriels in vitro requiert au préalable la manipulation génétique des neurones sensoriels matures, in vivo, afin d'obtenir des phénotypes les plus fidèles à la physiologie.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser pour chaque obejctif a été rigoureusement calculé pour réduire un maximum le nombre d'animaux tout en gardant une puissance statistique adaptée qui permettra de conclure sur les résultats. Pour ce projet nous pouvons utiliser les mâles et les femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées avec un enrichissement (frizottis, rouleaux de coton, lambeaux de papier, abri en carton ou en plastique rouge) qui sera modifié qualitativement après chaque change. Afin de lutter contre l'isolement de mâles, notre première mesure est de conserver un frère pour compagnie. Quand cela n'est pas possible (un mâle sans frère), notre animalerie propose un hébergement avec une femelle de compagnie n'étant plus en âge de mettre bas. Pour la chirurgie abdominale, les animaux seront habitués au chirurgien pendant quelques jours avant la chirurgie et des conditions d'asepties seront rigoureusement appliquées pour éviter la perte d'animaux dûe à des infections post-chirurgicales et pour éviter d'utiliser plus d'animaux afin d'obtenir un résultat significatif. Les prises en charge avant les chirurgies sont une analgésie locale, une analgésie générale et un traitement anti-inflammatoire. Après la chirurgie abdominale, les animaux recevront pendant 5j consécutifs d'un anti-inflammatoire et un analgésique contre la douleur. Une grille de score sera également utilisée. Le raffinement spécifique au phénotype dommageable consiste à étudier les animaux avant qu'ils développent les signes d 'inconfort. De plus, une grille de score sera utilisée pour identifier les 16% d'animaux qui pourraient développer des signes de mal être tels que perte de poids et anémie et ces animaux seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les souris présentent plusieurs avantages pour l'étude. Certaines lignées récapituleront la tumorigenèse précoce observée chez l'homme et seront utilisées lorsque les tumeurs sont développées (120-150j). Le contrôle de la génétique de la souris permet d'identifier des types cellulaires précis (dans cette saisine les neurones sensoriels) et ainsi de limiter le nombre d'animaux utilisés. Elles seront utilisées à l'âge adulte, entre 7 et 15 semaines afin que l'intestin soit mature totalement.