Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de l’incidence d’un gène sur le développement de la souris EU : 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Identifiées par ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, 1 320 souris subissent ensuite jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de leur vie, sur animal vigile sous contention. 880 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Le porteur qualifie la biopsie de phalange de non douloureuse au motif que les fibres nerveuses ne sont pas encore myélinisées à cet âge, et écrit que ces procédures n'entraînent "généralement pas de souffrance", tout en listant les signes qui déclenchent une mise à mort immédiate : posture inhabituelle, poil hérissé, dos voûté, retrait des congénères. Les souris dont le gène est inactivé dans l'intestin peuvent développer des diarrhées et des troubles de la croissance, et toutes sont tuées pour prélèvement d'organes.
Objectifs
L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.
Procédures
Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée, ces animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.
Devenir
Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.
Réduction
Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.
Role de Foxk1 dans le développement de la leucémie aigüe à cellules T
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Faire développer une leucémie aiguë lymphoblastique à des souris pour observer des étapes pré-leucémiques inaccessibles chez l'être humain : 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Les souris mutantes développent la leucémie vers 10 ou 11 semaines et en meurent à 20 semaines, avec perte d'appétit, perte de poids et perte de sociabilité. Une partie est tuée dès 10 ou 11 semaines, une autre est maintenue en vie au-delà pour une étude de survie, sous analgésiques. D'autres souris dépourvues de système immunitaire reçoivent une xénogreffe de cellules leucémiques humaines par injection rétro-orbitaire, et le porteur ramène ses groupes à six animaux pour répondre aux "exigences des tests statistiques nécessaires pour pouvoir soumettre à publication dans des journaux internationaux réputés".
Objectifs
Les leucémies aiguës lymphoblastiques T sont des cancers du sang caractérisés par la prolifération anormale et incontrôlée de cellules immatures à l’origine des lymphocytes T. Malgré l’amélioration de la prise en charge de ces leucémies, le pronostic de ces patients reste péjoratif avec environ 30% de rechute dans les deux ans suivant le diagnostic. Un des défis dans ce domaine est donc d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients et cela passe notamment par une recherche fondamentale qui vise à mieux définir les circuits moléculaires à l’origine de ce développement cancéreux. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mieux comprendre l’oncogénèse des leucémies aiguës lymphoblastiques T chez la souris en identifiant les réseaux activateurs de tumeur. Pour cela nous utiliserons des souris génétiquement modifiées au niveau d’un gène suppresseur de tumeur, qui est inactivé dans ~20% des leucémies aiguës lymphoblastiques T humaines et évaluerons le rôle d’un facteur de transcription identifié comme étant le régulateur majeur du métabolisme des lymphocytes T agissant sur la même voie de signalisation que ce gène suppresseur de tumeur.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de suivre les mécanismes responsables de la transformation d'une cellule sanguine normale en cellule leucémique. Nous pourrons analyser des souris aux étapes pré-leucémiques (absence de signe clinique), ces étapes sont impossibles à étudier chez l’homme. Le modèle murin de LAL-T permettra d’évaluer la fonction de Foxk1 dans ce type de leucémie et identifier dans quelle mesure ce facteur de transcription pourrait être une cible pour le développement de nouvelles thérapies.
Procédures
Les premiers modèles utilisés consistent en des souris déficientes soit uniquement pour un gène suppresseur de tumeur soit pour le gène suppresseur de tumeur et le facteur de transcription d’intérêt dans les lymphocytes T. Ces modèles générés par croisement à phénotype dommageable sont viables mais développent une leucémie aigüe lymphoblastique environ 10-11 semaines après leur naissance dont elles succombent à 20 semaines. Nous nous attendons dans ce modèle double mutant à un phénotype atténué par rapport à la lignée simple mutant et à un ralentissement voire une absence du développement de la leucémie aigüe lymphoblastique et une amélioration de la survie des souris ainsi générées. Le développement de la leucémie pourra entraîner une perte d’appétit, une perte de poids et une perte de sociabilité vis-à-vis de ses congénères. Un deuxième modèle consistera en une xénogreffe de cellules humaines leucémiques dans des souris dépourvues de système immunitaire réalisée par injection unique par voie rétro-orbitaire réalisée sous anesthésie gazeuse ne générant pas de stress supplémentaire et de courte durée (quelques minutes).
Impact sur les animaux
Le développement de la leucémie pourra entraîner une perte d’appétit, une perte de poids et une perte de sociabilité vis-à-vis de ses congénères. Les injections intraveineuses en rétro-orbitaire réalisées pour le transfert adoptif seront réalisées sous anesthésie gazeuse ne générant aucun stress. Les injections sont des piqures qui entrainent une douleur légère.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, les infiltrats cellulaires aux seins des organes lymphoïdes seront analysés. De manière générale, le suivie de la leucémie nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.
Remplacement
L’étude de processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un contexte leucémie ne peut être réalisée à ce jour qu’à l’aide de modèles in vivo. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est indispensable.
Réduction
Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits le plus possible. Nous travaillerons avec des souris de fond génétique pur, ce qui nous permet de réduire la taille des groupes expérimentaux à 6 souris, tout en répondant aux exigences des tests statistiques nécessaires pour pouvoir soumettre à publication dans des journaux internationaux réputés. Nous répéterons chaque expérience de façon indépendante 3 fois.
Raffinement
Les souris mutantes uniquement pour le gène suppresseur de tumeur à phénotype dommageable sont viables mais développent une leucémie aiguë lymphoblastique environ 10 à 11 semaines après leur naissance dont elles succombent à 20 semaines. Elles seront mises à mort dans la plupart des cas dès 10 à 11 semaines pendant les phases précoces de la leucémie sans atteinte particulière. Pour une petite portion d’entre elles impliquées dans une étude de survie, nous traiterons ces animaux avec des analgésiques dès l’âge de 10 semaines pour atténuer les douleurs, et souffrances éventuelles dues au développement de la maladie. Les souris double mutantes pour le gène suppresseur de tumeur et le facteur de transcription d’intérêt dans les lymphocytes T devraient présenter un phénotype atténué par rapport à la lignée simple mutant et à un ralentissement voire une absence du développement de la leucémie aiguë lymphoblastique et une amélioration de la survie de ces souris. Elles seront néanmoins lorsqu’elles seront impliquées dans l’étude de survie (au-delà de 10 semaines) traitées avec des analgésiques dès l’apparition de signes éventuels de souffrance.
Choix des espèces
Mus musculus, mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide, bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le système immunitaire adaptatif caractérisé par la présence de différentes populations de lymphocytes en interaction avec les cellules dendritiques est issu de l’hématopoïèse laquelle est observée chez les vertébrés uniquement et sur le plan immunitaire, il existe de nombreuses similarités entre l’homme et le modèle souris. Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour les études physiopathologiques de gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées Dans les modèles de souris doublement déficitaire pour les gènes impliqués dans la leucémie, nous utiliserons des souris entre 4 et 20 semaines. Notre but est d’analyser des souris à différents stades de la transformation d’une cellule sanguine en une cellule leucémique (de pré-leucémique à leucémique). Les souris génétiquement modifiées et injectées seront adultes (8-12 semaines).
Étude de la variabilité génétique et phénotypique au sein d’une colonie de ouistitis d’élevage.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Issus de deux colonies d'élevage que les établissements font grandir pour atteindre l'effectif visé, 150 ouistitis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun n'étant tué et tous réintroduits dans leur groupe. Chaque animal est mis à jeun, capturé à la main, au filet ou par conditionnement à entrer dans une boîte, puis anesthésié pour une heure environ de prélèvements et de mesures. Les expérimentateurs lui prélèvent un millilitre de sang, une biopsie cutanée refermée par un point de suture et une quarantaine de poils, avant des examens ophtalmologiques avec collyre, blépharostat maintenant chaque œil ouvert et pose de lentilles. Le porteur écrit que "le principe de réduction est donc difficilement applicable dans ce contexte", l'objectif étant de caractériser toute la colonie, et l'expansion de celle-ci sur cinq ans doit fournir les 150 individus.
Objectifs
Ce projet est un projet transversal réalisé dans deux EU qui hébergent chacun une colonie de ouistiti qui leur est propre. Les résultats seront mis en commun et analysés de façon globale. Ce projet a pour objectif d'étudier la variabilité génétique et phénotypique au sein de ces colonies. Cette variabilité au sein d’une espèce est un élément clé pour sa survie en milieu naturel. En captivité, les possibilités d’accouplement au sein d’une colonie sont limitées et le brassage avec des individus non apparentés (et donc suffisamment éloignés du point de vue génétique) n'est pas toujours possible. Au fils des années, des effets négatifs sur la fertilité et la santé (e.g. susceptibilité accrue aux infections) peuvent apparaitre et différentes études ont mis en évidence l'apparition de déficits chez des animaux hébergés en captivité. De même les conditions d’élevage peuvent influer sur la variabilité phénotypique (taille, poids, acuité visuelle..). Étudier la variabilité génétique et phénotypique au sein de colonies d'élevage est donc important pour mieux caractériser et contrôler génétiquement la diversité dans ces populations, raffiner la gestion et le bien-être des animaux et améliorer les études scientifiques futures. Pour atteindre les objectifs de ce projet, des prélèvements de sang et de poils ainsi que des biopsies cutanées seront effectuées chez tous les individus. En parallèle, des examens ophtalmologiques non-invasifs en imagerie multimodale permettant d'évaluer les caractéristiques anatomo-fonctionnelles de la rétine (mesure de la forme de l'oeil, de l'épaisseur de la choroïde, de la correction optique, du diamètre de la pupille, etc.) seront également réalisés.
Bénéfices attendus
Les données collectées dans le cadre de ce projet contribueront à caractériser la diversité génétique et phénotypique au sein de nos colonies de ouistitis. D'autre part, elles pourraient contribuer à affiner l'arbre décisionnel permettant de sélectionner les animaux qui seront mis en contact à des fins de reproduction. Enfin, la caractérisation phénotypique et fonctionnelle de l'oeil pourrait permettre la mise en place de mesures de raffinement complémentaires pour améliorer l’environnement des animaux.
Procédures
Conditionnement à la capture et à l’entrée volontaire dans une boite de capture. Mise à jeun des animaux (retrait de la nourriture et de l’eau respectivement 2h et 1h avant la capture et l’anesthésie). Capture des animaux (à la main/filet ou par entrée volontaire dans une boite de capture) et transport des animaux de leur espace d’hébergement vers la pièce d’anesthésie (au sein du même bâtiment). Anesthésie des animaux (protocole d’anesthésie gazeuse ou anesthésie fixe avec un relai en anesthésie gazeuse). Sous anesthésie, réalisation de différents prélèvements : un échantillon de sang total (environ 1 ml par animal), une biopsie cutanée de quelques millimètres de surface avec mise en place d’un point de suture (un échantillon par animal), et un prélèvement de poils (une quarantaine par animal). [Durée total de la phase de prélèvement des échantillons : environ 30 minutes]. Réalisation de mesures ophtalmologiques (dans le cadre de la même anesthésie que celle décrite précédemment lorsque ce sera possible) : application d’un collyre permettant une anesthésie locale de la cornée, mise en place d’un blépharostat pour maintenir chaque œil ouvert, application d’un collyre dans chaque œil pour induire une dilatation de la pupille, mise en place d’une lentille non corrigée sur chaque œil pour prévenir tout dessèchement de l’œil, puis réalisation d’une série de mesures non invasives sans contact direct avec les yeux. [Durée total de la phase de tests ophtalmologiques : environ 30-40 minutes]. Fin de l’anesthésie avec maintien de l’animal sur tapis chauffant et sous surveillance jusqu’au réveil. Retour de l’animal dans la zone de stabulation en boite de capture et ré-introduction de l’animal dans son groupe sous surveillance le jour de la session et le jour suivant.
Impact sur les animaux
Stress potentiel durant la phase de conditionnement et lié à la capture des animaux et à leur transport de la zone de stabulation vers la pièce de prélèvements/tests. Inconfort lié à l’anesthésie mise en place pour effectuer les prélèvements et les tests ophtalmologiques, complications potentielles au niveau local des suites de la biopsie cutanée (inflammation, infections), conséquences du prélèvement sanguin (hématome localisé), de la pause et du retrait du blepharostat utilisé pour maintenir les paupières ouvertes lors des examens ophtalmologiques, inconfort associée à l'instillation de collyre et à la pose de lentilles non corrigées sur la cornée au cours de l'anesthésie, stress potentiel lié au retour de l'animal dans le groupe.
Devenir
Le projet ne prévoit pas de mise à mort et tous les animaux seront maintenus en vie. A l'issue du projet les animaux seront ré-introduits dans leur groupe.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthodes in vitro permettant d’étudier les comportements sociaux et les effets de médicaments neurologiques/psychiatriques sur ces fonctions.
Réduction
Il s'agit ici de caractériser d'un point de vue phénotypique et génétique l'ensemble de notre colonie de ouistitis. Le principe de réduction est donc difficilement applicable dans ce contexte. La colonie de ouistitis actuellement hébergées compte une centaine d'individus. L'expansion de cette colonie, durant la durée d'autorisation du projet de 5 ans, permettra de produire un nombre d'animaux compatible avec l'objectif d’échantillonnage fixé à 150 individus
Raffinement
Captures et manipulations représentent des stress importants. Les captures seront effectuées par les personnes régulièrement en contact avec les animaux (personnel de zootechnie ou en charge du suivi de la colonie). Si d'autres personnes devaient effectuer des captures, des visites seront préalablement organisées pour que les animaux s'y habituent. Deux protocoles pourront être utilisés pour la capture selon la tolérance des animaux au contact humain et le type d'hébergement dont ils seront issus : capture à la main/filet ou conditionnement à entrer dans une boite de transport. La seconde option sera privilégiée dès que possible et fera l’objet de séances d’habituation (entraînement à entrer dans la boite avec récompense (gomme arabique)). S’ils sont capturés à la main/filet, de la gomme arabique leur sera proposée immédiatement après capture lors de l'entrainement. Durant les transports un tissu opaque sera placé sur la boite pour limiter le stress. Si possible, les collectes d’échantillons et les mesures ophtalmologiques seront réalisées dans le cadre d’une anesthésie unique. Le protocole d'anesthésie utilisé permet de raccourcir les phases d’endormissement et de réveil et évite le stress associé à la contention et à l’administration. Pour ce faire, nous utiliserons une boite de capture spécifique, de faible volume et ajourée, qui sera placée dans une boite d’induction thermostatée. Une fois l’anesthésie induite, l’animal sera maintenu au masque sous anesthésie gazeuse pendant toute l’intervention. Lors des mesures ophtalmologiques, les animaux seront placés sur un coussin de contention. La réalisation des biopsies s’effectuera sous anesthésie avec analgésie locale préalable. Un petit échantillon de peau sera collecté et un traitement analgésique et anti-inflammatoire sera administré. La plaie, d’éventuelles irritations des yeux seront suivies jusqu’à la cicatrisation. Les interactions sociales seront monitorées attentivement dans les heures et les jours suivants l’intervention pour s’assurer qu’aucun conflit ne survienne ; dans le cas contraire une surveillance accrue sera mise en place.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs ont largement montré leurs limites quant à la modélisation des troubles psychiatriques. Le ouistiti, en raison de ses caractéristiques comportementales et sociales et de la présence de variations génétiques identifiées chez l’Homme en lien avec les pathologies psychiatriques, est un modèle de choix. Tous les individus de notre colonie de plus de 1 an seront étudiés. Cette limite d'âge a été fixée car, bien que dès la naissance les yeux aient quasiment atteints leur taille définitive chez tous les primates, au niveau fonctionnel (au niveau des aires visuelles supérieures notamment) il faut dépasser un an pour que les neurones figent la vision binoculaire, après ce laps de temps on peux considérer le système visuel comme entièrement développé.
Etude de l’incidence d’un gène sur le développement de la souris EU : 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Toute souris qui montre une posture inhabituelle, le poil hérissé, le dos voûté ou un retrait de ses congénères est sortie de l'étude et tuée immédiatement. 1 320 souris vont être utilisées, 880 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Chaque animal est identifié par l'ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, puis peut subir jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de sa vie, sur animal vigile sous contention. Le porteur indique que les souris produites servent d'abord au maintien des lignées et à la fabrication des cohortes nécessaires aux expériences, pour un gène dont il annonce ne pas connaître précisément le rôle.
Objectifs
L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.
Procédures
Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Les animaux issus des croisements sont identifiés amputation de la première phalange. Cette procédure est réalisée entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Le prélèvement de la biopsie est alors non douloureux. La phalangectomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.
Devenir
Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.
Réduction
Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.
Effets métaboliques et cognitifs des variations d’apport en tryptophane et des fibres alimentaires dans l’alimentation (Multisite 2/2).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tués à la fin de l'expérimentation pour prélever contenu intestinal, foie, muscle, tissu adipeux, sang et cerveau, 650 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 450 mères et petits. 200 rats vivent en cage individuelle pendant six semaines pour la mesure de la consommation alimentaire, avec deux heures de regroupement par jour, et passent jusqu'à sept tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, après des jeûnes de 15 heures et des privations d'eau de 6 heures. Quarante rates sont anesthésiées, séparées de leur portée pendant trois heures et traites à la main après injection d'une hormone, l'opération étant répétée une seconde fois. Le porteur justifie le choix de l'espèce par une recommandation de la FAO citant l'être humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines, l'enjeu déclaré étant l'effet de la végétalisation de l'alimentation.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.
Bénéfices attendus
Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.
Procédures
Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.
Impact sur les animaux
Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.
Réduction
A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.
Raffinement
Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.
Etudes des mécanismes impliqués dans l’immunosurveillance précoce des tumeurs mammaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Sept injections et neuf prélèvements sanguins sous anesthésie par animal, sur des souris chez qui une tumeur mammaire est déclenchée : 166 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La pousse tumorale peut provoquer une gêne ou une douleur locale, les injections intrapéritonéales, intraveineuses et sous-cutanées une douleur au point d'injection. L'objectif déclaré est d'identifier les cellules immunitaires qui éliminent les cellules en cours de transformation tumorale, que le porteur présente comme une piste de prévention des cancers et des rechutes. Parmi les animaux tués figurent les mâles reproducteurs et les souriceaux au "génotype non relevant car inutilisés", et le point limite est évoqué comme un "volume tumoral trop important" sans que le seuil soit donné.
Objectifs
Le cancer du sein est le premier cancer féminin en terme de fréquence et la première cause de décès par cancer chez les femmes, avec plus de 600 000 décès estimés en 2018 dans le monde. Sans amélioration dans la prise en charge du cancer du sein, le taux de mortalité lié à cette pathologie aura augmenté de 58% en 2040, pouvant atteindre environ 1 million de décès (OMS). L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques est donc primordiale pour faire face à ce problème majeur de santé publique. Au cours des dernières années, certaines thérapies ciblant le système immunitaire ont déjà démontré des efficacités thérapeutiques sans précédent dans certains types de cancer (mélanome, cancer du poumon). Cependant, à l’heure actuelle, seulement un faible nombre de patients répondent à ces immunothérapies innovantes. Ainsi, l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques ciblant les cellules du système immunitaire des patientes atteintes de cancer du sein reste primordiale. Notre projet a pour objectif de déterminer, en utilisant un modèle de tumeur spontanée mammaire chez la souris, les acteurs du système immunitaire qui pourraient être impliqués dans l'élimination des cellules qui sont en train de se transformer en cellules tumorales.
Bénéfices attendus
La compréhens ion des mécanismes impliqués dans la détection précoce et l’élimination, par les cellules du système immunitaire, des cellules en transformation tumorale devrait permettre de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques représentant une piste majeure de prévention des cancers et des rechutes.
Procédures
- Pousse tumorale suite à l'induction du phénotype dommageable. - Injections (x7, 2min) ; -Prelèvements de sang, x9, 5min incluant l'anésthésie
Impact sur les animaux
Le développement de la tumeur peut occasionner une gêne, et/ou une douleur locale. Les injections par voies IP, IV et SC peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection. Le prélèvement de sang peut entrainer un stress causé par l’anesthésie générale et une douleur locale.
Devenir
A l'issu des procédure, les animaux seront mis à mort pour les raison suivantes : - Les mâles reproducteurs ainsi que les souriceaux issus des accouplements avec un génotype non relevant car inutilisés; - afin de réaliser des analyses de biologie ex vivo sur les tissus mammaires au cours de la progression tumorale, les animaux seront mis à mort avant prélèvement des tissus pour éviter toute souffrance. - atteinte d'un point limite (par exemple volume tumoral trop important...).
Remplacement
À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables. Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier les interactions cellulaires des étapes précoces de détections des cellules en transformation tumorale par le système immunitaire.
Réduction
Grâce à des données de la littérature, issues d'expériences pilotes sur un faible nombre d'animaux, ou de par notre exeprience, le nombre de souris a été déterminé au minima, notamment grâce à un test de statistique afin d'assurer l'obtention de résultats significatifs avec un minimum d'animaux utilisés. Au final, un total de 166 souris sera utilisé dans ce projet.
Raffinement
Certaines procédures (injections, Prélèvements) peuvent induire une douleur/un stress chez les animaux. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse, via notamment l’anesthésie gazeuse et un anesthésique local. Un suivi adapté des points limites spécifiques au projet, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la souffrance des souris. Le comportement, l’apparition des tumeurs et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. En cas de douleur détectable,un anti-douleur sera administré.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de souris transgéniques nous permettant de caractériser l’infiltrat immunitaire au cours du développement tumoral. De plus nous avons pour objectif d’effectuer une analyse détaillée du microenvironnement tumoral ; les outils que nous souhaitons utiliser ne sont disponible que chez la souris.
Identification et genotypage des souris en élevage
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
690 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, au sein d'un élevage de lignées modélisant des malformations cardiaques congénitales. Chaque animal est saisi par la queue une dizaine de secondes, le temps d'une biopsie caudale de cinq secondes destinée à vérifier la transmission du gène modifié. Le porteur indique que ces souris sont maintenues en vie pour une utilisation continue dans d'autres autorisations de projet, l'élevage servant à produire les cohortes des expériences suivantes. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe "aucune alternative" et que le recours à l'animal est "incontournable", cellules in vitro et organoïdes ne rendant pas compte du développement du cœur.
Objectifs
Elevage de souris à des fins de recherches sur les pathologies cardiaques congénitales ( malformations du coeur à la naissance) Nous élevons des souris qui modélisent des pathologies cardiaques congénitales telles que la cardiomyopathie dilatée (dilatation du ventricule gauche ) ou le Syndrome de Cornelia de Lange, une maladie du développement affectant la formation et la fonction de nombreux organes. Ces deux souris modèles nous ont permis de mettre en évidence des pistes thérapeutiques pharmacologiques (identification de médicament utilisés pour la cancérologie) qui feront l' objet de projets cliniques dans un futur proche. Ces souris plus généralement nous permettent également de mieux comprendre la formation du coeur et de chercher l 'origine des malformations qui sont susceptibles de se produire.
Bénéfices attendus
un génotypage (c'est à dire la vérification de la transmission du gène modifié dans le modèle de souris à partir des parents) adéquat très important pour la rigueur de nos recherches
Procédures
les souris seront soumises à une légèrepréhension par la queue pendant 10 secondes pour la biopsie de queue qusi ne dure que 5 secondes ce qui pourrait événtuellement entraîner une légère et courte douleur
Impact sur les animaux
les gestes sont très rapides et n'apportent à la souris qu'une gêne à la préhension
Devenir
Ces souris sont élévées pour une recherche continue sur les malformations cardiaques congénitales apparaissant de novo ou associéees à des maladies rares. Les souris sont maintenus en vie, pour une utilisation continue dans des DAP d'expérimentation. Dans seulement les 5 dernières années, nous avons pu mettte en évidence deux cibles médicamenteuses grace à l utilistion de ces souris. Ceci a permis en collaboration avec nos collègues cliniciens le design actuel de deux essais cliniques chez des patients.
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la regle des 3R. L’étude des pathologies cardiaques congénitales nécessite de recourir a l’animal car il n’existe aucune alternative. Il n’est pas possible d’obtenir ces informations par des cellules in vitro ou des organoides qui ne peuvent rendre compte fidèlement du développement, de la maturation et du fonctionnement du coeur
Réduction
Le recours a l’animal etant incontournable, nous avons reduit le nombre d’animaux au minimum pour le strict maintien de la colonie pour chaque allèle
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid, cartons à ronger)
Choix des espèces
3.4.3. Justifiez la pertinence des espèces animales choisies La souris peut être facilement modifiée génétiquement. Nos modèles murins récapitulent parfaitement le phenotype des patients. Elle est un bon modèle de biologie du développement, un avantage pour les pathologies cardiaques congénitales
Impact de l’interaction entre le microbiome respiratoire et le glycome sur la sensibilité des bovins aux infections
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Des veaux de 15 à 30 jours sont retenus parce que l'immunité transmise par le colostrum commence alors à décliner, ce qui les rend plus vulnérables à l'infection qu'on va leur inoculer. Ils sont 28, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, l'autre d'un niveau modéré. Chacun subit huit prises de sang, huit sessions d'écouvillonnage nasal profond à trois écouvillons par narine, huit écouvillonnages rectaux et huit lavages broncho-alvéolaires, quatorze d'entre eux recevant en plus une co-infection virale et bactérienne par masque puis huit administrations d'antibiotique. Tous sont tués par injection à la fin du projet, pour des analyses post mortem sur leurs organes.
Objectifs
Le complexe respiratoire bovin revêt une importance capitale, tant en France que sur le plan international, en raison de son impact sur la santé et le bien-être des animaux, ainsi que des pertes économiques significatives qu’il entraîne. Les principaux agents pathogènes de cette affection sont des bactéries et des virus qui agissent de concert de façon synergique. Chez les animaux en bonne santé, le mucus des voies respiratoires forme une barrière protectrice, composée de mucines et d’un écosystème microbien diversifié, qui joue un rôle crucial dans la prévention de l’invasion pathogène et dans la facilitation de leur élimination. Ces pathogènes exploitent souvent les glycanes présents sur les cellules eucaryotes et les mucines (le « glycome ») pour infecter l’hôte. Alors que chez l’homme, des études indiquent un rôle essentiel du complexe microbiote-glycome respiratoire dans la modulation de la colonisation par les agents pathogènes, les données relatives aux animaux restent encore limitées. Dans ce cadre, l’objectif principal de notre projet est d’explorer les interactions régulatrices entre le microbiome et le glycome des voies respiratoires chez les veaux, et leur réponse à une infection polymicrobienne ainsi qu’à un traitement antibiotique précoce. De manière plus spécifique, ce projet vise à : (1) caractériser les variations temporelles du microbiote et du glycome des mucines respiratoires, (2) identifier les profils de glycome et microbiens post-infection qui sont indicatifs de processus moléculaires liés à l’adhésion et la réplication virales, à la réponse immunitaire, à la guérison ou à la résilience, (3) décrire la dynamique du résistome microbien, et (4) confirmer la corrélation entre les profils de glycanes et le tropisme viral.
Bénéfices attendus
Notre projet se distingue par trois innovations majeures. Tout d’abord, il vise à identifier des biomarqueurs microbiens et glycomiques qui sont associés à la réaction, la récupération ou la résilience face aux infections respiratoires et à l’administration d’antibiotiques. Ces biomarqueurs viendront compléter les stratégies conventionnelles telles que la vaccination, les mesures de biosécurité, une nutrition et une hygiène adéquates, le contrôle des vecteurs et les soins vétérinaires réguliers. Ensuite, nous évaluerons les biomarqueurs glycomiques tant in vitro qu’ex vivo, notamment en testant la capacité des virus à se lier aux glycanes et leur potentiel de transmission entre espèces, une donnée actuellement inexistante pour les pathogènes affectant le bétail. Enfin, l’analyse comportementale et l’utilisation de capteurs pour le suivi du bien-être animal pourraient mener à l’identification de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce des maladies. Au-delà de ces avancées, les biomarqueurs glycomiques et microbiens issus d’animaux résistants pourraient conduire au développement de glycanes à effet prébiotique et à la création de consortiums microbiens synthétiques (SynComs), qui seront expérimentés en tant que probiotiques de nouvelle génération.
Procédures
1/ co-infection expérimentale par voie nasale, à l'aide d'un masque : n = 14 veaux, une seule fois, durée : 8 à 12 minutes ; 2/ administration d'un antibiotique (tilmicosine) par voie orale : n = 14 veaux, 2 fois par jour pendant 4 jours soit 8 administrations au total, durée : 2 minutes maximum par administration ; 3/ prises de sang : n = 28 veaux, 8 prélèvements sanguins/veau, durée : 2 minutes maximum/prélèvement, 4/ écouvillonnages nasaux profonds : n = 28 veaux, 8 sessions/ veau avec, pour chaque session, 3 écouvillons dans chaque narine, durée : 3 minutes maximum/session ; 5/ écouvillonages rectaux : n = 28 veaux, 8 prélevements/veau, avec 2 écouvillons par veau, durée : 15 secondes//prélèvement ; 6/ lavages broncho-alvéolaires : n = 28 veaux, 8 prélèvements/veaux, durée : entre 5 et 10 minutes par prélèvement (en fonction de la acilité d’introduction de la sonde dans la trachée).
Impact sur les animaux
La co-infection IDV/BCoV/Mycoplasma bovis, peut provoquer des effets indésirables potentiels sur la santé et le bien-être des veaux : 1/ signes cliniques de maladie respiratoire : toux, écoulement nasal, augmentation de la fréquence respiratoire, difficultés à respirer, hyperthermie, baisse de l'apport alimentaire. 2/ Perte de poids : les veaux peuvent connaître une perte de poids en raison de la combinaison d'une diminution de l'apport alimentaire et des dépenses énergétiques liées à la lutte contre l'infection. 3/ Déshydratation : la fièvre et l'augmentation du rythme respiratoire peuvent contribuer à la déshydratation chez les veaux infectés. 4/ infections bactériennes secondaires (bronchopneumonie alvéolaire) consécutives à un affaiblissement du système immunitaire et aggravant les troubles respiratoires initiaux. 5/ Stress : la manipulation/contention et la collecte d'échantillons peuvent induire du stress chez les veaux. 6/ Changements comportementaux : les veaux infectés peuvent présenter des changements de comportement, tels qu'une activité réduite et des interactions sociales diminuées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par injection à la fin du projet., afin de réaliser des analyses post mortem sur leurs organes, dont les résultats viendront compléter les données obtenues de leur vivant.
Remplacement
Il n'existe pas de système in vitro capable de simuler fidèlement l’interaction complexe entre les pathogènes respiratoires, le microbiote et les mucines respiratoires. Les cultures in vitro ne permettent pas de reproduire les conditions nécessaires pour l’étude des virus, des mycoplasmes et de l’ensemble des microorganismes et mucines du système respiratoire.
Réduction
Un effectif de 7 veaux par lots expérimentaux assure la faisabilité de l’étude tout en permettant d’obtenir des données statistiques robustes pour observer un effet potentiel. Cette stratégie s’appuie sur les données d’une étude précédente, dans laquelle un modèle de coinfection IDV-M. bovis avait été utilisé sur de jeunes veaux. Malgré une variabilité individuelle notable dans la réponse clinique, un effectif de 5 animaux avait suffi à démontrer des différences significatives par rapport à des veaux témoins non infectés. Une ANOVA à un facteur a été utilisée pour comparer les moyennes des aires individuelles sous les scores cliniques quotidiens (ACS). Lorsque l’effet du facteur “traitement” était significatif, un test de Newman-Keuls a été utilisé pour comparer les effets des traitements à chaque point de temps. Un test t (test de Mann-Whitney) a également été effectué pour ces paramètres.De plus, les données virologiques et bactériologiques s'étaient révélées relativement homogènes entre les individus, offrant une corrélation directe avec la pathogénicité dans l’appareil respiratoire profond. Par sécurité, nous avons choisi d'inclure 2 veaux supplémentaires par lot afin de pallier d'éventuelles exclusions d'individus pour des raisons sanitaires (infections intercurrentes) ou éthiques (atteinte des points limites).
Raffinement
Les veaux seront logés dans un bâtiment divisé en quatre aires paillées, chacune accueillant 7 animaux et mesurant 60 m². L’environnement sera enrichi avec des jouets robustes et flexibles de différentes matières et couleurs, ainsi qu'avec des bidons et des cônes de chantier pour stimuler leur curiosité. Avant le début de la procédure expérimentale, ils bénéficieront d'une période d'acclimatation à leur nouvel environnement de 14 jours. Si l'un des veaux manifeste des signes de détresse ou d’inconfort lors de l'inoculation intranasale, la nébulisation sera immédiatement interrompue et l’animal sera réconforté puis surveillé jusqu'à récupération complète. Lors de la procédure, les prélèvements seront effectués par des personnes préalablement formées. A chaque point d'étape, les 3 types de prélèvement (prise de sang, écouvillons nasaux, écouvillons rectaux, lavages broncho-alvéolaires) seront réalisés à la suite, de manière à attraper et à contenir une seule fois les animaux. Les prises de sang seront effectuées en alternance à la veine jugulaire droite et à la veine jugulaire gauche, de manière à minimiser les risques de phlébite. Lors des lavages broncho-alvéolaires (LBA), un anesthésique local (lidocaïne) sera pulvérisé sur la muqueuse nasale (Xylocaine spray 10%, 50mL), 2 minutes avant introduction de la sonde dans le naseau et l'extrémité de celle-ci sera enduite d'une pommade anesthésique composée de lidocaïne et prilocaïne, agissant par diffsion et induisant una anesthesie de quelques millimètres (EMLA). Les animaux présentant des symptômes respiratoires marqués à sévères seront exemptés de LBA. Suite à l'infection expérimentale, le comportement et le bien-être des animaux seront évalués quotidiennement. Une surveillance sanitaire rigoureuse sera également assurée par un personnel qualifié : un vétérinaire évaluera l’état clinique de chaque animal deux fois par jour, mesurant la température rectale, la fréquence cardiaque et respiratoire, et notant tout comportement anormal tel que le refus de s’alimenter, l’agressivité, le retrait social ou l’abattement.
Choix des espèces
Le projet visant à étudier l'impact de l'interaction entre le microbiome respiratoire et le glycome sur la sensibilité des bovins aux infections, il est nécessaire d'utiliser un modèle bovin. Des veaux âgés de 15 à 30 jours seront sélectionnés pour notre étude. Ils seront infectés entre 30 et 45 jours, ce qui correspond à la période critique où les bronchopneumonies infectieuses se manifestent fréquemment dans les élevages bovins sous des conditions naturelles. L’âge de 22-30 jours est particulièrement significatif car il marque le début de la diminution de l’immunité maternelle colostrale, rendant les veaux plus susceptibles aux infections et donc un moment idéal pour étudier la réponse immunitaire face aux agents pathogènes. Cette fenêtre temporelle est donc stratégique pour reproduire les conditions d’apparition des maladies respiratoires et pour évaluer l’efficacité des interventions thérapeutiques.
Effets de la radiothérapie FLASH sur la réponse vasculaire tumorale EU2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
90 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de prostate humaine, passent au scanner puis sous radiothérapie FLASH sous anesthésie gazeuse, et sont suivies deux semaines pendant la croissance de la tumeur, avec des injections intrapéritonéales et rétro-orbitaires avant la mise à mort. Le but est de mesurer la réponse des vaisseaux tumoraux et l'oxygénation du tissu, données recueillies post mortem. Le porteur justifie l'espèce en indiquant que la souris est "le plus petit animal répertorié" sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne tout en autorisant une greffe tumorale suivie deux semaines.
Objectifs
La radiothérapie est un traitement contre le cancer utilisé chez plus de la moitié des patients. Une méthode récente ultra-rapide, dite "FLASH", a montré une toxicité inférieure sur les tissus sains tout en maintenant la même efficacité anti-tumorale dans différents modèles animaux. Le niveau d'oxygénation tissulaire semble être un paramètre qui influe sur le ratio bénéfice/risque de cette radiothérapie. De nombreuses études attestent du rôle de l'O2 dans les tissus sains mais aucune ne s'est intéressée aux tissus tumoraux dans ce contexte. Pourtant, le niveau d'O2 tumoral est un facteur qui est bien connu pour jouer sur l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie. En effet, lors de la radiothérapie conventionnelle, l'oxygénation tumorale augmente dans les premières semaines de traitement. L'oxygène présent facilite des réactions physicochimiques qui augmentent la destruction des cellules tumorales. Le projet a donc pour but d'étudier la réponse des vaisseaux sanguins tumoraux à la radiothérapie FLASH, et la conséquence en termes d'oxygénation du tissu tumoral. Le nombre de vaisseaux, la fraction d'aire hypoxique (sans oxygène) et le pourcentage de vaisseaux perfusés seront déterminés post-mortem. La taille des tumeurs sera également suivie. Cette connaissance est essentielle pour appréhender la réponse clinique globale et envisager les étapes ultérieures d'application de la méthode FLASH chez l'homme. Pour des raisons techniques, le projet se déroulera dans deux établissements.
Bénéfices attendus
La réoxygénation du tissu tumoral entre plusieurs séances de radiothérapie constitue l'un des piliers théoriques des procotoles cliniques actuels de radiothérapie. Il est en effet très important d'augmenter l'oxygénation de la tumeur, habituellement défectueuse, car la quantité d'oxygène dicte une grande partie des effets physico-chimiques de la radiothérapie et donc son efficacité. Il est donc crucial d'établir si les vaisseaux sanguins tumoraux répondent à la radiothérapie FLASH de la même manière qu'à la radiothérapie conventionnelle. Les données sur la réponse des vaisseaux ainsi que l'oxygénation tumorale permettront d'établir la pertinence des protocoles cliniques fractionnés actuels, ou dans le cas inverse de proposer de nouveaux protocoles de traitement. Les données permettront d'évaluer la performance globale de la radiothérapie FLASH sur la tumeur. Elles pourront permettre également d'envisager des combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies anti-angiogéniques ou immuno-modulatrices. Enfin, elles apporteront des connaissances fondamentales sur les cellules du microenvironnement vasculaire, utiles à la communauté scientifique de la radiothérapie FLASH.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 procédures: 1- injection (seringue insuline) sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (2 min) 2- imagerie scanner CT-scan sous anesthésie gazeuse (15 min max) 3- radiothérapie sous anesthésie gazeuse (15 min) 4- suivi tumoral pendant 2 semaines puis injections ip et rétroorbitale (2 min) sous anesthésie gazeuse avant sacrifice endormi. Les actes 1-2-4 se déroulent dans l'Etablisssement 1. L'acte 3 dans l'établissement 2.
Impact sur les animaux
Lors des phases de transport et d'acclimatation, de préhension, contention ou anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La greffe tumorale sous-cutanée produira une douleur légère et passagère (quelques minutes). La radiothérapie est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. La croissance tumorale, en particulier lors des deux dernières semaines, peut engendrer une détresse telle que: atteinte de la mobilité, fatigue. Ces signes sont cependant facilement détectables en amont et interviennent peu dans ce modèle. De plus, le modèle n'est pas métastatique et n'engendre pas d'autre risque.
Devenir
Les animaux suivent tous les même parcours: greffe tumorale, imagerie, radiothérapie, suivi. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, le but étant de prélever les tissus tumoraux pour analyse.
Remplacement
Les premières phases du projet scientifique global se sont déroulées sur des cellules, notamment endothéliales, constituants des vaisseaux sanguins. Tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait. Néanmoins l'oxygénation tissulaire ne peut être étudié que dans un tissu perfusé et régulé physiologiquement.
Réduction
La stratégie en trois expériences indépendantes successives permettra de n'utiliser que la quantité d'animaux nécessaire à l'atteinte de la significativité statistique en fonction de la taille d'effet réellement observé: dès la significativité atteinte, les lots d'animaux suivants seront annulés.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, la socialisation et l'environnement seront optimisés: groupes de 5 invariables, maintient des cages et litières penant les transports, cycle jour-nuit adapté, eau-alimentation à volonté et sans changement de régime entre les établissements, frisottis en quantité pour nidification. Les dômes seront exclus car ils ont tendance à créer des comportements de domination chez la souris nude mâle. Une habituation à la manipulation et en creux de main sera réalisée progressivement. Pour éviter le stress, l'injection tumorale sous-cutanée, l'imagerie et l'irradiation seront réalisées sous anesthésie générale. Une stabulation sur tapis chauffant permettra à l'animal un réveil plus rapide et une meilleure stabilité physiologique pendant les procédures. Enfin, les animaux seront observés périodiquement selon un barème décisionnel qui évaluera le stress et la douleur, avec des critères d'arrêt d'expérimentation.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus décrit en tumorigenèse. Les phénotypes des lignées et leurs particularités génétiques sont répertoriés ("mouse phenome database"). Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme: 23 000 gènes codants contre 30 000 chez l'homme, avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. La souris tolère l'homozygotie, ce qui permet de travailler sur des lignées et d'obtenir des résultats scientifiques très reproductibles. Le modèle immunodéprimé utilisé ici permet la greffe de cellules tumorales humaines. Plus précisément pour ce projet, la souris représente le plus petit animal répertorié sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne et permettant la greffe tumorale avec un suivi suffisamment long (2 semaines post-radiothérapie). L'efficacité du faisceau de particules particulier que nous utilisons a été montrée chez la souris préalablement, ce qui rend ce modèle fiable. Le cancer de prostate est un cancer de l'adulte et les animaux utilisés seront donc adultes (>8 semaines).
Évaluation de composés dans des modèles de cancer chimiquement induit chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Tatouées une fois, imagées trois fois sous anesthésie, isolées douze fois en cage individuelle pour la récolte des fèces, 17 600 souris développent des cancers du poumon ou du côlon provoqués par des produits chimiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Certaines subissent en plus des micro-biopsies du côlon à la pince flexible, à six jours d'intervalle. Les signes attendus vont de la perte de poids aux lésions cutanées, à la diarrhée sanglante et au prolapsus en phase terminale. Toutes sont tuées par dislocation cervicale sous anesthésie, après un prélèvement de sang par voie intracardiaque, pour récupérer poumon, foie, rein, ganglions et peau.
Objectifs
Le projet regroupe différentes stratégies dont l'objectif d’évaluer des solutions thérapeutiques innovantes dans modèles murins de cancers chimiquement induits. D’après un nombre croissant d'études publiées, le cancer induit par des produits chimiques chez les animaux est le meilleur modèle pour comprendre l'étiologie et la cancérogenèse du cancer, car il reproduit fidèlement l'exposition chronique à des cancérogènes environnementaux. Les modèles décrits permettent un développement tumoral lent, correspondant à la progression des tumeurs humaines, et sont donc pertinents pour étudier l'impact des nouvelles thérapies à tous les stades de développement de la tumeur. De plus, ils présentent des caractéristiques histologiques, pathologiques et moléculaires similaires aux tumeurs humaines. En outre, les modèles induits chimiquement sont reproductibles expérimentalement et se fondent sur l'utilisation des souris immunocompétentes, ce qui permet également d'évaluer l'effet du système immunitaire sur l'efficacité des nouveaux médicaments testés. L’objectif de ce projet est de pouvoir tester à la fois des des thérapies prophylactiques qui peuvent empêcher ou retarder l’apparition de tumeurs mais également des thérapies pouvant bloquer l'évolution de tumeurs d'une phase précoce à une phase avancée (terminale, plus agressive et difficile à traiter).
Bénéfices attendus
Le projet fournira des informations aux agences réglementaires pour les aider à décider de la mise sur le marché d'un médicament chez l'homme ou chez l'animal. Le projet contribuera à la mise sur le marché de médicaments sûrs et protégés chez l'homme et l'animal pour des maladies dont les besoins thérapeutiques ne sont pas encore satisfaits.
Procédures
Procédure 1 : Modèle de carcinome épidermoïde pulmonaire chimiquement induit chez la souris Le prélèvement de différents organes (poumon, foie, rein, ganglions lymphatiques, peau) pour les études ex vivo sera effectué à la fin de l'étude : lorsque les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale après avoir été anesthésiés à l'isoflurane. Au cours de l'étude, des échantillons de sang peuvent être prélevés par microprélèvement au niveau de la queue sur des animaux vigile et dans la phase terminale de l'étude pour injection intracardiaque sur des animaux anesthésiés à l'isofluorane. Le maximum de prélèvements de sang est limité au volume totale de sang prélévé sur une semaine qui doit être infèrieure à 20% du volume de sang total. Procédure 2 : Evaluation de nouvelles thérapies sur le modèle cancer colorectal associé à la colite induite par le Azoxymethane (AOM) et Dextran Sulfate Sodium (DSS) chez la souris. Le tatouage est réalisé une seule fois dans l’étude et dure un maximum de 10 secondes. L’imagerie est réalisée 3 fois et dure 15 minutes maximum sous anesthésie. La mise en cage individuelle pour la récolte des fécès est réalisée 12 fois sur toute l’étude pour une durée de 30 minutes maximum par jour. Du microsampling à la veine de la queue est réalisée en fin d’étude sur plusieurs time point, le volume maximum prélevé correspond à 20% du volume total sanguin estimé de l’animal. Les organes sont prélevés en fin d’études sur des animaux préalablement anesthésiés puis euthanasiés. Des micro biopsies (maximum 2 micro biopsies par prélèvement sur le colon qui seront réalisés avec un espacement de 6 jours) pourront être réalisées à l'aide d'une pince flexible (diamètre de 3 Fr.). La durée de l'examen ne durera pas plus de 15 minutes par animal. Le prélèvement de différents organes (poumon, foie, rein, ganglions lymphatiques, peau) pour les études ex vivo sera effectué à la fin de l'étude : lorsque les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale après avoir été anesthésiés à l'isoflurane. Au cours de l'étude, des échantillons de sang peuvent être prélevés par microprélèvement au niveau de la queue . sur des animaux vigile et dans la phase terminale de l'étude pour injection intracardiaque sur des animaux anesthésiés à l'isofluorane. Le maximum de prélèvements de sang est limité au volume totale de sang prélévé sur une semaine qui doit être infèrieure à 20% du volume de sang total.
Impact sur les animaux
Après un traitement au NTCU, les souris peuvent présenter une perte de poids, des lésions cutanées, une déficience respiratoire. Après le traitement par l'AOM-DSS, les souris peuvent présenter une perte de poids, une diarrhée, du sang dans les fèces, un prolapsus (dans la phase terminale de l'étude). Ces signes cliniques seront surveillés quotidiennement et, à l'aide d'une fiche de suivi de scores de signes cliniques délétères, il sera décidé si l'animal est suspendu du traitement, si de la nourriture molle sera ajoutée à la cage pour faciliter l'alimentation, ou s'il est euthanasié et retiré de l'étude prématurément.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude car des prélèvements terminaux d'organes sont nécessaires pour réaliser les analyses permettant de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Les composés testés auront été sélectionnés en amont par des tests in vitro, in silico ou par modélisation sans recours à l’animal afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les systèmes biologiques mis en œuvre, qui aboutissent au développement de tumeurs, sont des systèmes complexes et ne peuvent pas être remplacés par des méthodes in vitro ou in silico.
Réduction
La sélection de composés d’intérêt pendant la phase in vitro permet de réduire le nombre d’études in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. De plus, des études statistiques, sont menées afin d’optimiser et de réduire le nombre d’animal dans chaque groupe. Enfin, avant de commencer les études sur les deux modèles décrits, une phase de mise en place des deux modèles est prévue pour déterminer les conditions expérimentales optimales et évaluer la possibilité de réduire le nombre d’animaux à utiliser dans les études futures.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d’enrichissement, dans des locaux appropriés, conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé et compétent. Des critères d’arrêt anticipé spécifiques pour les animaux porteurs de tumeurs sont mis en place dans les études pour limiter la souffrance des animaux. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress (imagerie, biopsie) se feront sous anesthésie générale gazeuse.
Choix des espèces
Le recours à des animaux est justifié par le besoin de disposer de données pertinentes tant sur la compréhension de l’étiologie et des mécanismes physiopathologiques lors de l’apparition et du développement de certains cancers que sur la mise au point de solutions thérapeutiques innovantes. Selon un nombre croissant d'études, le cancer induit par des produits chimiques chez les animaux est le meilleur modèle pour comprendre l'étiologie et la cancérogenèse du cancer, car il reproduit fidèlement l'exposition chronique à des cancérogènes environnementaux. Les souris seront adultes ou adultes matures. Le stade adulte ou adulte mature est celui où la majorité des pathologies cancéreuses se développent.
Étude de la variabilité génétique et phénotypique au sein d’une colonie de ouistitis d’élevage.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Issus de deux colonies d'élevage internes, 50 ouistitis de plus d'un an vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, puis réintroduits dans leur groupe sans mise à mort prévue. Chacun est mis à jeun, capturé à la main, au filet ou par entrée conditionnée dans une boîte, puis anesthésié pour un prélèvement d'environ un millilitre de sang, une biopsie cutanée suturée et le prélèvement d'une quarantaine de poils. Suivent trente à quarante minutes d'examens oculaires, paupières maintenues ouvertes par un blépharostat, pupilles dilatées au collyre et lentilles posées sur chaque œil. La colonie compte aujourd'hui une trentaine d'individus, et le porteur indique que son expansion sur cinq ans permettra "de produire un nombre d'animaux compatible avec l'objectif d'échantillonnage fixé à 50".
Objectifs
Ce projet est un projet transversal réalisé dans deux EU qui hébergent chacun une colonie de ouistiti qui leur est propre. Les résultats seront mis en commun et analysés de façon globale. Ce projet a pour objectif d'étudier la variabilité génétique et phénotypique au sein de ces colonies. Cette variabilité au sein d’une espèce est un élément clé pour sa survie en milieu naturel. En captivité, les possibilités d’accouplement au sein d’une colonie sont limitées et le brassage avec des individus non apparentés (et donc suffisamment éloignés du point de vue génétique) n'est pas toujours possible. Au fils des années, des effets négatifs sur la fertilité et la santé (e.g. susceptibilité accrue aux infections) peuvent apparaitre et différentes études ont mis en évidence l'apparition de déficits chez des animaux hébergés en captivité. De même les conditions d’élevage peuvent influer sur la variabilité phénotypique (taille, poids, acuité visuelle..). Étudier la variabilité génétique et phénotypique au sein de colonies d'élevage est donc important pour mieux caractériser et contrôler génétiquement la diversité dans ces populations, raffiner la gestion et le bien-être des animaux et améliorer les études scientifiques futures. Pour atteindre les objectifs de ce projet, des prélèvements de sang et de poils ainsi que des biopsies cutanées seront effectuées chez tous les individus. En parallèle, des examens ophtalmologiques non-invasifs en imagerie multimodale permettant d'évaluer les caractéristiques anatomo-fonctionnelles de la rétine (mesure de la forme de l'oeil, de l'épaisseur de la choroïde, de la correction optique, du diamètre de la pupille, etc.) seront également réalisés.
Bénéfices attendus
Les données collectées dans le cadre de ce projet contribueront à caractériser la diversité génétique et phénotypique au sein de nos colonies de ouistitis. D'autre part, elles pourraient contribuer à affiner l'arbre décisionnel permettant de sélectionner les animaux qui seront mis en contact à des fins de reproduction. Enfin, la caractérisation phénotypique et fonctionnelle de l'oeil pourrait permettre la mise en place de mesures de raffinement complémentaires pour améliorer l’environnement des animaux.
Procédures
Conditionnement à la capture et à l’entrée volontaire dans une boite de capture. Mise à jeun des animaux (retrait de la nourriture et de l’eau respectivement 2h et 1h avant la capture et l’anesthésie). Capture des animaux (à la main/filet ou par entrée volontaire dans une boite de capture) et transport des animaux de leur espace d’hébergement vers la pièce d’anesthésie (au sein du même bâtiment). Anesthésie des animaux (protocole d’anesthésie gazeuse ou anesthésie fixe avec un relai en anesthésie gazeuse). Sous anesthésie, réalisation de différents prélèvements : un échantillon de sang total (environ 1 ml par animal), une biopsie cutanée de quelques millimètres de surface avec mise en place d’un point de suture (un échantillon par animal), et un prélèvement de poils (une quarantaine par animal). [Durée total de la phase de prélèvement des échantillons : environ 30 minutes]. Réalisation de mesures ophtalmologiques (dans le cadre de la même anesthésie que celle décrite précédemment lorsque ce sera possible) : application d’un collyre permettant une anesthésie locale de la cornée, mise en place d’un blépharostat pour maintenir chaque œil ouvert, application d’un collyre dans chaque œil pour induire une dilatation de la pupille, mise en place d’une lentille non corrigée sur chaque œil pour prévenir tout dessèchement de l’œil, puis réalisation d’une série de mesures non invasives sans contact direct avec les yeux. [Durée total de la phase de tests ophtalmologiques : environ 30-40 minutes]. Fin de l’anesthésie avec maintien de l’animal sur tapis chauffant et sous surveillance jusqu’au réveil. Retour de l’animal dans la zone de stabulation en boite de capture et ré-introduction de l’animal dans son groupe sous surveillance le jour de la session et le jour suivant.
Impact sur les animaux
Stress potentiel durant la phase de conditionnement et lié à la capture des animaux et à leur transport de la zone de stabulation vers la pièce de prélèvements/tests. Inconfort lié à l’anesthésie mise en place pour effectuer les prélèvements et les tests ophtalmologiques, complications potentielles au niveau local des suites de la biopsie cutanée (inflammation, infections), conséquences du prélèvement sanguin (hématome localisé), de la pause et du retrait du blepharostat utilisé pour maintenir les paupières ouvertes lors des examens ophtalmologiques, inconfort associée à l'instillation de collyre et à la pose de lentilles non corrigées sur la cornée au cours de l'anesthésie, stress potentiel lié au retour de l'animal dans le groupe.
Devenir
Le projet ne prévoit pas de mise à mort et tous les animaux seront maintenus en vie. A l'issue du projet les animaux seront ré-introduits dans leur groupe.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthodes in vitro permettant d’étudier les comportements sociaux et les effets de médicaments neurologiques/psychiatriques sur ces fonctions.
Réduction
Il s'agit ici de caractériser d'un point de vue phénotypique et génétique l'ensemble de notre colonie de ouistitis. Le principe de réduction est donc difficilement applicable dans ce contexte. La colonie de ouistitis actuellement hébergées compte une trentaine d'individus. L'expansion de cette colonie, durant la durée d'autorisation du projet de 5 ans, permettra de produire un nombre d'animaux compatible avec l'objectif d’échantillonnage fixé à 50 individus
Raffinement
Captures et manipulations représentent des stress importants. Les captures seront effectuées par les personnes régulièrement en contact avec les animaux (personnel de zootechnie ou en charge du suivi de la colonie). Si d'autres personnes devaient effectuer des captures, des visites seront préalablement organisées pour que les animaux s'y habituent. Deux protocoles pourront être utilisés pour la capture selon la tolérance des animaux au contact humain et le type d'hébergement dont ils seront issus : capture à la main/filet ou conditionnement à entrer dans une boite de transport. La seconde option sera privilégiée dès que possible et fera l’objet de séances d’habituation (entraînement à entrer dans la boite avec récompense (gomme arabique)). S’ils sont capturés à la main/filet, de la gomme arabique leur sera proposée immédiatement après capture lors de l'entrainement. Durant les transports un tissu opaque sera placé sur la boite pour limiter le stress. Si possible, les collectes d’échantillons et les mesures ophtalmologiques seront réalisées dans le cadre d’une anesthésie unique. Le protocole d'anesthésie utilisé permet de raccourcir les phases d’endormissement et de réveil et évite le stress associé à la contention et à l’administration. Pour ce faire, nous utiliserons une boite de capture spécifique, de faible volume et ajourée, qui sera placée dans une boite d’induction thermostatée. Une fois l’anesthésie induite, l’animal sera maintenu au masque sous anesthésie gazeuse pendant toute l’intervention. Lors des mesures ophtalmologiques, les animaux seront placés sur un coussin de contention. La réalisation des biopsies s’effectuera sous anesthésie avec analgésie locale préalable. Un petit échantillon de peau sera collecté et un traitement analgésique et anti-inflammatoire sera administré. La plaie, d’éventuelles irritations des yeux seront suivies jusqu’à la cicatrisation. Les interactions sociales seront monitorées attentivement dans les heures et les jours suivants l’intervention pour s’assurer qu’aucun conflit ne survienne ; dans le cas contraire une surveillance accrue sera mise en place.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs ont largement montré leurs limites quant à la modélisation des troubles psychiatriques. Le ouistiti, en raison de ses caractéristiques comportementales et sociales et de la présence de variations génétiques identifiées chez l’Homme en lien avec les pathologies psychiatriques, est un modèle de choix. Tous les individus de notre colonie de plus de 1 an seront étudiés. Cette limite d'âge a été fixée car, bien que dès la naissance les yeux aient quasiment atteints leur taille définitive chez tous les primates, au niveau fonctionnel (au niveau des aires visuelles supérieures notamment) il faut dépasser un an pour que les neurones figent la vision binoculaire, après ce laps de temps on peux considérer le système visuel comme entièrement développé.
Combinaison de deux inhibiteurs dans un modèle de xénogreffe chez des souris immunodéficientes et des modèles d’hypercroissance 4/5
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Poids, comportement et aspect du poil servent de points limites déclenchant la mise à mort anticipée. 12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties sur cinq établissements. Chaque animal peut recevoir un implant d'œstrogène posé sous anesthésie, une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines, huit prélèvements sanguins, cinq gavages au tamoxifène, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et des gavages quotidiens pendant jusqu'à trente semaines, plus une ligature vasculaire. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage restant en vie pour la reproduction, à l'exception des mâles immunodéficients.
Objectifs
Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.
Bénéfices attendus
Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements
Procédures
Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)
Impact sur les animaux
Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.
Devenir
Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.
Raffinement
Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.