Oncologie
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- Biologie du développement
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Inhibition de facteurs épigénétiques pour favoriser l’immunité anti-tumorale et surmonter la résistance au traitement du cancer du pancréas.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Soumises à une greffe de cellules tumorales pancréatiques par chirurgie, puis à des injections dans l'abdomen cinq jours par semaine pendant quatre semaines, 144 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur écrit qu'elles développeront "une pathologie potentiellement grave", le cancer du pancréas ayant chez l'humain un taux de survie à cinq ans inférieur à 7 %. Il avance qu'une hausse du taux de réponse de 1 % à 10 % bénéficierait à plus de 50 000 patients par an, chiffre posé sans étape intermédiaire entre ces souris et la clinique. Il conclut à un recours "indispensable" aux animaux, en s'appuyant sur le caractère très invasif des biopsies pancréatiques chez les patients.
Objectifs
L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l'une des formes de cancer les plus mortelles et dont le taux de survie à 5 ans des patients diagnostiqués avec cette maladie est inférieur à 7 %. Le PDAC est connu pour son environnement tumoral immunosuppresseur bien développé qui entraîne une résistance aux thérapies conventionnelles et ciblées. Cette barrière immunitaire est également l'une des principales raisons de l'absence de réponse aux inhibiteurs de points de contrôle immunitaire dans la plupart des cas. Il y a donc un besoin urgent de développer des thérapies durables pour restaurer la réponse immunitaire anti-tumorale chez les patients atteints de PDAC.
Bénéfices attendus
Nous exploiterons l'ensemble des résultats obtenus ici dans le but de comprendre, valider puis cibler les vulnérabilités immunitaires spécifiques de la PDAC afin de restaurer l'immunité anti-tumorale chez les patients. Étant donné que plusieurs des molécules testées sont déjà appliquées en clinique pour d'autres maladies, le succès d'une seule molécule dans nos modèles précliniques de PDAC pourrait propulser cette thérapie rapidement vers des essais cliniques chez l'homme. L'augmentation du taux de réponse de la PDAC, ne serait-ce que de 10 % contre 1 % actuellement, bénéficierait à plus de 50 000 patients par an grâce à l'amélioration de leur qualité de vie et de leur survie globale.
Procédures
Les animaux seront soumisent à 1 procédure chirurgicale (durée 20 minutes), des injections dans l'abdomen (durée 30 secondes) 5 fois par semaine pendant 4 semaines et enfin, un prélèvement de sang sous anesthésie juste avant le sacrifice pour nécropsie pour prélèvement des organes d'intérêt (donc 1 seul prélèvement par souris, qui dure 30 secondes au maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie potentiellement grave. L'anesthésie constituera une nuisance sur les animaux. Les manipulations, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse. D’autres nuisances éventuelles pourraient être induites lors l’injection éventuelle d’analgésiques en postopératoire, et les prélèvements sanguins.
Devenir
Le sort de tous les animaux sera la mise à mort sous anesthésie pour prélèvement d'organes en vue d'analyses cellulaires, biochimiques et histologiques.
Remplacement
Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. D’une part, pour cette étude mécanistique, les données expérimentales devront être en grande partie obtenues sur des échantillons de tumeurs et organes corporels, et cette démarche est limitée chez l’homme. Les gestes de prélèvement de tissu pancréatique sont très invasifs en clinique ; une seule biopsie est faite par endoscopie au diagnostic de cancer du pancréas, et seuls les moins de 20% de patients montrant une tumeur localisée dans le pancréas sont éligibles pour une résection de la tumeur par chirurgie qui n’est faite qu’une seule fois. Ainsi nous ne disposons pas d’échantillon tumoral pour plus de 80% des patients et un suivi dynamique n’est possible chez aucun. A l'inverse, l'utilisation de modèles tumoraux orthotopiques est très courante dans la littérature, elle permet d'étudier l'environnement tumoral et de reproduire l’hétérogénéité tumorale qui ne peut être recréé in vitro (i.e. un seul organe isolé) ou chez une espèce autre que les mammifères. De plus, leur utilisation dans de nombreux projets scientifiques a permis des avancées significatives et le transfert vers des essais cliniques.
Réduction
Nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 144 individus sur 2 années conformément à la règle de réduction. Ce chiffre a été déterminé par un calcul d'effectif prenant en compte les données statistiques connues pour ce modèle.
Raffinement
Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Les contraintes par rapport à la douleur, la souffrance et l’angoisse dans le cadre de l’expérimentation présentées dans le projet seront réduites par une surveillance accrue avec des points limites spécifiques et adaptés. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Une anesthésie générale et une analgésie périopératoire appropriée seront administrées aux animaux durant les procédures chirurgicales de transplantation des cellules tumorales.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L'espèce choisie est la souris C57BL/6, car elle permet le transfert adoptif de cellules immunitaires et tumorales. Elle est couramment utilisée en oncologie et dans la recherche sur les cellules souches. Les tumeurs pancréatiques qui se développent chez la souris montrent de nombreuses similarités avec les tumeurs humaines, faisant de la souris un très bon modèle d’étude. De plus, il est connu que plus de 80% de protéines (séquences nucléiques codantes) sont homologues entre la souris et l'homme y compris au niveau immunitaire, ce qui renforce l'utilité du modèle pour ce projet qui concerne le système immunitaire. Pour toutes ces raisons, le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les souris doivent être âgées de 6 à 10 semaines au moment de la greffe de cellules tumorales. Cet âge est nécessaire pour que les animaux soient d'une taille suffisant pour opérer et que système immunitaire soit mature.
Cibler le métabolisme lipidique et les cytokines pour traiter les cancers au stade primaire et métastatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
11 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de trente minutes, jusqu'à trois prises de sang mandibulaires, des injections intrapéritonéales deux à quatre fois par semaine sur quatre semaines, un gavage quotidien et de l'imagerie sous anesthésie deux fois par semaine. Le porteur indique que la croissance tumorale peut aboutir à une dégradation de l'état général des souris. Sur le remplacement, il consacre deux phrases à affirmer que ces études sont "essentielles" et qu'elles ne peuvent pas être remplacées par des analyses in vitro, sans autre argument.
Objectifs
Des modulations de la production de lipides et de cytokines jouent un rôle majeur dans le développement du cancer. En effet, les cytokines et lipides sont des acteurs essentiels de la régulation de la fonction et du déplacement des cellules immunitaires. Ils participent également à réguler la capacité qu'ont certaines cellules immunitaires à reconnaitre et détruire les cellules tumorales. Certains de ces facteurs peuvent donc constituer des cibles thérapeutiques. Notre projet a pour objectif général de clarifier le rôle de certains lipides et de certaines cytokines dans des phénomènes clés de l'initiation et de la progression des cancers: prolifération, réponse et résistance aux traitements anticancéreux, migration et dissémination, modulation du microenvironnement tumoral incluant les réponses immunitaires locales et systémiques.
Bénéfices attendus
Les thérapies visant à stimuler les réponses immunitaires ont permis d'augmenter de façon considérable la survie des patients atteints de divers cancers et particulièrement les thérapies ciblant des protéines inhibitrices de la réponse immunitaire anti-tumorale. Cependant, de nombreux patients résistent à ces thérapies ou rechutent dans les 5 ans suivant l'initiation du traitement. Nos travaux visent à identifier de nouvelles thérapies permettant de lever certaines de ces résistances et d'essayer de transposer ces stratégies en clinique. Identifier plus particulièrement le rôle joué par les cytokines et lipides est essentiel au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et à l'identification de potentiels biomarqueurs de réponse aux thérapies existantes.
Procédures
Les animaux inclus dans ces études pourront être soumis à des chirurgies. Une seule chirurgie sera pratiquée par animal et la durée n'excèdera pas 30 minutes. Les souris vigiles pourront également être soumises à des prélèvement de sang réalisés au niveau mandibulaire. Trois prélèvements maximum par souris espacés d'une semaine. Des injections au niveau de la peau (3 fois maximum par souris), intrapéritonéales (2 à 4 fois par semaine sur 4 semaines maximum) ou intraveineuses (1 fois pour chaque souris) pourront être pratiquées. Les souris pourront être imagées sous anesthésie à raison de 2 fois par semaine pendant 20 minutes maximum. Des traitements pourront être administrés par gavage à raison de 1 fois par jour maximum pendant la durée de l'expérience ou par injection intrapéritonéale à raison de 3 fois par semaines maximum pendant la durée de l'expérience.
Impact sur les animaux
Ce projet est associé à la réalisation de chirurgies pouvant induire des douleurs, une hypothermie, une déshydratation associées à l'opération. Les points de suture réalisés lors de la fermeture des plaies pourrons être associés à une gêne. Les traitements donnés aux animaux par voie orale et par injection pourront induire du stress, une gêne ou une douleur au point d'injection. Les traitements donnés aux souris auront également la possibilité de déclencher des troubles digestifs. Enfin, les modèles de croissance tumoraux peuvent provoquer une gêne et aboutir à une dégradation de l'état général des animaux. Le génotypage des souris élevées au sein de la structure sera réalisée selon une procédure générique standardisée du centre éleveur. Les nuisances associées sont décrites dans la DAP du centre éleveur (douleur légère et de courte durée).
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés.
Remplacement
Ces études, réalisées chez la souris, sont essentielles afin d'évaluer l'impact de nouvelles thérapies sur le traitement des cancers et la mise en place des réponses immunitaires anti-tumorales. Ces études ne peuvent être remplacées par des analyses in vitro.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, une étude approfondie de la littérature a été effectuée afin de définir au mieux les objectifs de nos travaux et ne pas reproduire des résultats déjà existants dans la littérature. Cela nous a permis de définir les meilleurs protocoles possibles afin d'adapter le nombre d'animaux à la réalisation de nos objectifs. Des études pilotes seront mises en place afin d'optimiser les conditions de chaque nouvelle expérience.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et quand nécessaire à la chirurgie. Nous porterons une attention particulière au stress et à la souffrance potentiellement ressentie par les animaux au cours de la réalisation des procédures. Les cages seront donc enrichies avec du sizzlenest pour la nidation, la préhension des souris sera réalisée grace à des tubes transparents ou des plateformes adaptées. Des narcoleptiques et analgésiques seront utilisés quand nécessaire. Les chirurgies seront réalisées sur des plaques chauffées à 37 degrés. Une injection sous cutanée de solution saline sera réalisée afin de prévenir la déshydratation potentielle des animaux. Le temps de chirurgie sera réduit au miximum (moins de 30 minutes). Des pots de gel diet seront ajoutés dans les cages pour faciliter la réhydration et la prise alimentaire des souris après chirurgie. Les volumes et les doses de traitements administrés sont optimisés et réduits au maximum afin de minimiser l'inconfort lors de l'administration et les potentiels effets indésirables. Des points limites spécifiques et adaptés à chaque procédure ont été définis. Cela permettra aux équipes des centres éleveur et investigateur de prendre une décision adaptée afin de stopper la souffrance des animaux.
Choix des espèces
De nombreuses thérapies maintenant utilisées en clinique pour le traitement de divers cancer ont été développées et optimisées en pré-clinique par utilisation de modèles murins génétiquement modifiés ou non. Cela inclus notamment les immunothérapies visant à bloquer les points de contrôle de l'immunité (Programmed cell-death1 [PD-1] et Cytotoxic T lymphocyte associated protein 4 [CTLA-4]). Non seulement l'efficacité de ces thérapies chez la souris a été confirmée chez l'Homme, mais de nouvelles combinaisons thérapeutiques développées chez la souris se montrent transposables à la clinique. Les animaux impliqués dans nos expériences seront âgés de 5 à 12 semaines. Les souris C57Bl6J et BalbC à cet âges là peuvent peser entre 16 et 21g. Tous nos traitements sont/seront optimisés (dose efficace et minimum d'effets indésirables) pour des souris rentrant dans cette fourchette de poids.
Suivi comportemental de trois espèces de poissons aux cycles de vie liés au fonctionnement d’un marais protégé, afin d’inscrire leurs besoins dans la gestion de l’eau
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Soumis à une anesthésie de trois à cinq minutes puis à une incision ventrale pour l'implantation d'un transpondeur, 1 800 poissons sauvages, brochets, lotes de rivière et lamproies de Planer, restent hors d'eau jusqu'à une minute, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un morceau de nageoire est prélevé sur les brochets, et tous les individus marqués sont remis à l'eau vivants, le porteur estimant la mortalité post-opératoire à moins de 2 à 3 %. L'objectif déclaré est d'ajuster la gestion de l'eau d'un marais protégé aux déplacements de ces trois espèces. Le porteur affirme qu'une expérimentation in situ reste "indispensable", aucune donnée n'existant sur les capacités de déplacement de la lote et de la lamproie.
Objectifs
L’objectif principal est d’évaluer le comportement de 3 espèces de poissons (brochet, lote de rivière et lamproie de Planer) caractéristiques d'un marais, afin : - D'améliorer les connaissances sur le fonctionnement du marais et le cycle de vie des espèces piscicoles cibles, en caractérisant les déplacements d’individus de ces espèces en fonction de leur stade de développement et de la saison ; - D'identifier d’éventuelles zones-refuges, en particulier thermiques, et s’il y en a des points de blocages aux déplacements ; - De mettre en relation ces déplacements avec la gestion actuelle de l’eau du marais pour améliorer la gestion ; - D'évaluer le bénéfice des actions correctives pour favoriser la résilience du marais face aux changements climatiques et permettre aux espèces de continuer à effectuer leurs cycles de vie. La méthodologie proposée implique l’implantation de transpondeurs électroniques (PIT tags) dans des poissons sauvages. Des dispositifs de détection fixes seront installés au niveau de 4 sites au sein de la réserve, et le suivi sera réalisé sur deux années minimum pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales et tester d’éventuelles mesures correctives. Si le quota d’animaux marqué n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante.
Bénéfices attendus
Le projet cherchera à mieux comprendre le fonctionnement des populations des 3 espèces cibles au sein de la réserve. Les résultats permettront d’évaluer si la gestion actuelle de l’eau dans le marais est adaptée (ouverture ou fermeture de vannages, entretien divers,…), ou au contraire si des mesures correctives sont nécessaires pour améliorer l’efficacité de la reproduction naturelle, la migration des juvéniles et leur croissance. Dans le cas de blocage avéré des individus ou d’assèchement précoce des zones de frayères, des aménagements seront envisagés pour permettre à ces espèces de rejoindre soit leurs zones de reproduction (adultes) soit des habitats de grossissement favorables (juvéniles). L’efficacité de ces mesures sera évaluée en appliquant le même protocole de marquage et de suivi.
Procédures
Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1800 poissons. Un petit morceau de nageoire sera prélevé sur les brochets pour des analyses génétiques. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.
Impact sur les animaux
La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, comme l’indiquent les retours d’expériences sur les autres espèces marquées, et la mortalité reste très faible sur les espèces visées.
Devenir
Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.
Remplacement
Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du comportement de poissons sauvages doit obligatoirement être réalisée in situ sur les espèces cibles. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants au niveau de la zone de capture. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes. A noter également que peu de données existent quant aux comportements et capacité de déplacement de la lote et de la lamproie. On ne peut donc pas se référer à la littérature ni avoir recours à des avis d’expert pour évaluer des comportements théoriques attendus de ces espèces : une expérimentation in situ reste indispensable.
Réduction
Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages sur 3 années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (100 / espèce et / an pour les adultes et 150 pour les juvéniles ; règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des comportements en fonction des lieux de captures. L’effectif est adapté à l’étendue spatiale du marais, ainsi qu’à la densité de population en place. Pour ces espèces, il est difficile voire impossible de préjuger des taux de migration, en particulier aux stades juvéniles, qui restent très rarement étudiés. L’effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : -L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,
Raffinement
Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront stockés dans un vivier placé dans la rivière. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et pour éviter l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie. L’expérience du personnel permet de réduire le temps global de manipulation à moins d’une minute. La taille des PIT tags sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière.
Choix des espèces
Le Brochet, la Lote de rivière et la Lamproie de Planer, sont des espèces patrimoniales présentes dans le marais. Ces trois espèces présentent des exigences importantes pour leur reproduction et/ou la survie de leurs juvéniles. La fraie du brochet et de la lote a lieu en hiver, dans des zones annexes inondées par la montée des eaux et périodiquement asséchées. La reproduction de la lamproie a lieu, directement dans la rivière, mais les larves une fois écloses s’enterrent dans le sédiment de zones spécifiques, fraîches, propres, bien oxygénées et avec un courant moindre. La connexion avec le marais peut offrir des zones refuges pour le développement des larves. Pour les brochets et les lotes, les juvéniles de plus de 80mm seront marqués ainsi que les adultes, avec des tailles de PIT tags adaptées aux tailles des animaux. Pour les lamproies de Planer, les individus adultes seront marqués dès 120 mm avec des petits PIT tags. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées et les juvéniles de lamproies seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.
Caractérisation et recherche d’indicateurs de la santé globale du veau en races Holstein et Normande
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Soumis à quatre prises de sang, cinq écouvillonnages rectaux, des écouvillons nasaux et buccaux et trois tontes dorsales, 270 veaux femelles Holstein et Normande sont maintenus au cornadis ou en cage de contention, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Aucun n'est tué dans ce projet, tous étant destinés à d'autres expérimentations qui prolongeront celle-ci. L'objectif déclaré porte sur des indicateurs de santé du jeune bovin, que le porteur rattache à la "durabilité" économique de l'élevage et à son "acceptabilité sociétale". Il revendique aussi l'une des premières utilisations mondiales d'un outil de biotechnologie, testé "à grande échelle" par comparaison avec la formule sanguine.
Objectifs
La santé a longtemps été considérée sous la forme d’un caractère binaire : l’animal est sain ou malade au regard d’une affection ou d’une maladie donnée, à un instant donné. Toutefois, l’état de santé général est multifactoriel et évolutif. Il possède un fort impact sur le bien-être de l’animal, de même que sur ses performances zootechniques et sa longévité. De ce fait, il s’agit d’un caractère clé pour la durabilité tant environnementale qu’économique de l’élevage, ainsi que pour son acceptabilité sociétale. Dans une optique de re-conceptualisation de la santé pour prendre en compte son caractère continu, explorer ses mécanismes biologiques, et étudier ses liens avec les autres performances, un collectif de scientifiques a défini ensemble les contours d’une nouvelle expérimentation de long terme en bovins laitiers. Le projet que nous vous soumettons aujourd’hui est la première brique de cette expérimentation et porte sur les veaux. Le jeune âge est un moment critique, marqué par des taux de mortalité importants et pouvant avoir une influence sur la vie entière de l’animal. L’objectif de ce projet est d’obtenir une caractérisation biologique fine et longitudinale (i.e. à plusieurs temps au cours des six premiers mois) des différentes couches de la variabilité individuelle, de manière à établir des liens entre ces paramètres et la santé de l’animal, à court et à long terme. Afin de pouvoir distinguer ce qui est liée à la génétique des animaux par rapport aux conditions environnementales, un effectif d’animaux important sera nécessaire. Toutefois, certains paramètres mesurés pourraient rapidement s’avérer inutiles à certains temps (absence de variabilité individuelle, corrélation très forte entre plusieurs paramètres…). Aussi, la présente demande possède un second objectif, celui d’identifier, sur la base des deux premières cohortes de veaux, les phénotypes (ce que l'on peut mesurer) et les temps de la vie du jeune animal les plus pertinents à analyser sur l’ensemble des cohortes et ainsi alléger le protocole.
Bénéfices attendus
Tout d’abord, nous attendons de ce projet des avancées de connaissances scientifiques, avec une meilleure caractérisation des phénotypes mesurés (variabilité individuelle, sensibilité environnementale, évolution au cours du temps), et des relations qui les unissent, afin d’identifier les synergies et les compromis entre fonctions physiologiques. L’ensemble de ces résultats servira également à déterminer quelles sont les mesures clés à reproduire dans les prochaines cohortes, et ainsi à raffiner le protocole. Par ailleurs, il s’agira de l’une des toutes premières utilisations mondiales d'un outil de biotechnologie. Il s'agira de tester à grande échelle ce nouvel outil et il pourra être validé par comparaison avec la formule sanguine. Si cette efficacité est vérifiée, il pourra à terme être utilisé sans nécessité d’avoir en parallèle la formule sanguine. Ce développement serait fort utile pour la gestion quotidienne des expérimentations, surtout dans le cadre de dates de vêlage étalées dans le temps. Par la diversité des phénotypes explorés et grâce à l’utilisation d’outils innovants, ce projet se positionne en front de science. Il représente également une opportunité forte pour tisser et renforcer des collaborations de manière concrète entre des scientifiques d’horizons différents de par son caractère transdisciplinaire.
Procédures
Pour la caractérisation fine des animaux, des prélèvements sanguins et des écouvillons nasaux, buccaux et rectaux seront effectués 4 fois (5 pour les rectaux) au cours de l’expérimentation sur les femelles vigiles, maintenues en cage de contention ou au cornadis. Une tonte dorsale sera effectuée 3 (ou 4 fois pour un sous-échantillon d’animaux) dans les mêmes conditions. Les mesures de poids (une fois tous les deux semaines) se feront sans geste technique autre que le déplacement et la contention des animaux. Voici le temps estimé pour chaque acte : Prise de sang : 2 minutes Microbiote : quelques secondes pour chacun des trois sites Poils : quelques secondes
Impact sur les animaux
Les prélèvements prévus (prises de sang, tonte de poils et écouvillonnages nasaux, rectaux et buccaux) seront réalisés dans le cadre d'une contention adaptée au poids des veaux (animal au cornadis ou animal bloqué dans une cage). Cette contention, ainsi que la simple présence humaine et la manipulation associée peuvent générer un stress ponctuel chez l'animal. Le prélèvement en lui-même (en particulier le prélèvement sanguin) peut générer sur le moment une douleur limitée et fugace. De part les interventions d'élevage, une phase d'imprégnation à l'homme est réalié dès la naissance de chaque veau. Cela réduit grandement le stress généré par la présence de l'homme lors des prélèvements, d'autant que ce sont les mêmes personnes qui interviennent. Il n'est attendu aucun dommage ni effet indésirable à moyen ou long terme. Il n'y a pas de mise à mort des animaux.
Devenir
Les procédures n’entravent pas le devenir de l’animal et n’ont qu’un effet limité et de court terme sur son bien-être. Aussi, l’ensemble des animaux inclus dans cette expérimentation va poursuivre une vie normale d’un animal de renouvellement dans un troupeau de bovins laitiers. La suite de leur vie fera l’objet de nouvelles expérimentations poursuivant celle-ci.
Remplacement
Les mécanismes étudiés mettent en jeu des interactions complexes au sein de l’hôte qu’il est impossible de reproduire dans un modèle cellulaire, de culture d’organe ou in silico.
Réduction
La présente demande porte uniquement sur la fin de la cohorte 2024 et sur les deux cohortes suivantes complètes, soit un total d’environ 270 veaux. Le choix de faire porter ce projet exploratoire sur 270 animaux a été déterminé à partir des éléments suivants : - la plupart des paramètres sont analysés en une seule fois pour tous les animaux à la fin de chaque campagne, il nous faut donc considérer des campagnes entières - Analyser une unique campagne représente un risque de non-représentativité si l’effet campagne est important - l’effectif de deux campagnes complètes (120*2=240 animaux) nous semble suffisant pour évaluer la redondance ou l’absence de variabilité. - la présente demande est formulée en cours de campagne 2024. Si une réponse positive était obtenue avant la fin des vêlages de cette année, nous estimons pertinent de réaliser également les prélèvements sur les dernières naissances de la campagne (maximum 30 femelles), aussi bien pour pouvoir mieux évaluer les variabilités annuelles que pour avoir des premiers a priori sur les paramètres. Les données de ces 270 premiers veaux s’ajouteront aux données de futures expérimentations afin de constituer une population assez grande pour une étude génétique (généralement 600 individus nécessaires pour une puissance statistique suffisante).
Raffinement
Plusieurs dispositions ont été prises afin de raffiner ce protocole. Tout d’abord, les différentes mesures ont été regroupées sur les mêmes temps afin de limiter le nombre d’interventions sur les animaux. Ensuite, chaque intervention a été pensée de manière à limiter les nuisances pour les animaux (limitation des volumes de sang prélevés, utilisation de tondeuse vétérinaire silencieuse pour limiter le stress…) Enfin, il est attendu, compte tenu du caractère exploratoire du projet et du nombre de paramètres mesurés, que certains caractères ne s’avèrent au final pas pertinents (redondance, absence de variabilité individuelle…). Une étape supplémentaire du raffinement sera, sur la base des résultats obtenus sur ces premières cohortes, de réduire le nombre et les volumes de prélèvements afin de ne garder que ceux apportant de l’information pour inscrire dans la durée un protocole allégé. La procédure impliquée dans le projet est de classe légère et appliquée par des opérateurs expérimentés. Les conditions d'hébergement et d'alimentation répondent aux normes d’élevage en intérieur avec une aire paillée et, suivant son âge, une ration de colostrum, de lait puis d’alimentation solide dans des distributeurs en accès libre. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. La prophylaxie et le traitement des animaux en cas d’affection ne sont pas modifiés par la mise en oeuvre du projet. Tout animal présentant un trouble de santé sera soigné en fonction de la pathologie conformément aux pratiques de l'élevage, et, au besoin, le vétérinaire praticien sera consulté. Les animaux sont gardés en vie en fin d'expérimentation.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est le bovin. Il s’agit de femelles de race Holstein et Normande, grandes races laitières françaises (et internationale pour la Holstein). Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Les animaux seront des veaux femelles de leur naissance à 6 mois d’âge car nous souhaitons étudier la santé du jeune bovin.
Analyse de l’impact de la signalisation CAR en réponse à des expositions aux xénobiotiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur expose les fœtus puis les nouveau-nés à un cocktail de molécules polluantes par l'alimentation pendant 33 jours, et suit les atteintes du foie et de la fertilité jusqu'à huit mois. Les femelles servant à entretenir la colonie sont tuées à six mois, et les animaux dont le génotype ne sert pas au projet sont tués vers trente jours, après génotypage. Il indique n'attendre aucun phénotype délétère majeur, tout en listant perte de poids anormale, hypoactivité, dos voûté et yeux enfoncés parmi les signes qu'il surveille.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de définir si les expositions à des polluants environnementaux lors de la grossesse ou bien lors de l'enfance peuvent entrainer des maladies à l'âge adulte et plus particulièrement des maladies du foie ou bien des troubles de la fertilité.
Bénéfices attendus
Les expositions environnementales sont suspectées d’être à l’origine d’un grand nombre de pathologies telles que les troubles de la fertilité ou l’apparition de maladies métaboliques. L'identification d'acteurs impliqués dans la prédisposition et la survenue de ces pathologies permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Cela est d’autant plus nécessaire que dans le cadre d’une exposition systémique, les communications entre les organes par des voies notamment endocriniennes, peuvent participer à l’apparition de pathologies multiples et parfois interdépendantes. Ce projet permettra de définir l’implication de ces signalisations cellulaires dans la survenue et/ou la progression des pathologies hépatiques et des troubles de la fertilité masculine, tout en définissant la part relative des dialogues bidirectionnels entre le foie et les testicules dans l’apparition de ces pathologies. De plus ce projet définira de nouveaux marqueurs de diagnostic, de pronostics ; voire de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de ces pathologies.
Procédures
Les animaux seront soumis au prélèvement d'une biopsies pour le génotypage entre 7 à 10 jours après la naissance. Certains animaux sont des animaux génétiquement modifiés avec une invalidation tissu spécifique pour le gène CAR, les conséquences pouvant toucher les pathologies hépatiques et les troubles de la fertilité seront suivies au plus jusqu'à 8 mois. Les animaux seront soumis à des expositions à des cocktails de molécules environnementales part voie alimentaire pendant 33 jours (à partir de 6.5 jours de vie embryonnaire et jusqu'à 20 jours après la naissance). Les conséquences seront suivi au plus jusqu'à 8 mois.
Impact sur les animaux
Il est à noter que selon la littérature sur le l'invalidation du gène étudié ne présentent pas de phénotype délétère majeur. Aussi, le ciblage de l'invalidation dans un organe en particulier ne devrait pas engendrer de phénotypes dommageables systémiques conduisant à une atteinte majeure de la santé de l'individu. Cependant, les signes observés seront la perte anormale de poids de l’individu ou bien des troubles au niveau de son activité (hypoactivité), dos vouté, yeux enfoncés.... Chaque souris sera surveillée de façon quotidienne par le personnel animalier.
Devenir
Les animaux surnumérères de génotypes qui ne sont pas intéressants pour le projet seront mis à morts. Les animaux utilisés pour les analyses seront mis à morts pour les prélèvements d'organes.
Remplacement
Afin d'analyser l'impact à long terme à l'âge adulte d'exposition à des polluants environnementaux survenues lors de la grossesse et pendant la petite enfance, il n'y a pas à l'heure actuelle de possibilité de remplacer les modèles in vivo. D'autant plus dans notre étude où en plus de la considération temporelle, nous analyserons également les impacts d'un point de vue des dialogues entre plusieurs organes (foie et testicule). Ces considérations de communications entre les organes combinées avec les aspects développementaux (embryons/enfants jusqu'à l'adulte) ne permettent donc pas d'utiliser les approches en culture cellulaire. Cependant des analyses de la littérature combinée à certaines approches en culture cellulaire ont quand même permis de définir les doses à utiliser, permettant cependant partiellement remplacer l'utilisation de l'animal sur certaines questions. Ce qui in fine a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Réduction
Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible dans le contexte des hypothèses des origines développementales de la santé et des pathologies (DOHaD) car aucune approche ne permettrait d'analyser les mécanismes de discussion bidirectionnelle entre les organes sur une cinétique de temps entre une exposition embryonnaire/néonatale et l'apparition de pathologies à l'âge adulte. Des analyses de la littérature combinée à certaines approches en culture cellulaire ont quand même permis de définir les doses à utiliser, permettant cependant partiellement remplacer l'utilisation de l'animal sur certaines questions. Ce qui in fine a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux à utilisés a été réduit au maximum Le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre les groupes a été évalué en amont grâce aux expériences précédentes, menées ces dernières années dans le cadre d'autres projets et qui nous ont permis d'évaluer les variations attendues dans la réponse des animaux aux expositions à des polluants environnementaux. De plus, sur les animaux qui seront mis à mort dans le cadre de cette étude, nous prélèverons un maximum d'autres tissus que ceux directement ciblés par le projet, afin de pouvoir permettre le partage de tissus avec d'autres collègues permettant ainsi d'alimenter d'autres projets de recherche sans utiliser d'animaux supplémentaires.
Raffinement
Le raffinement reposera sur un hébergement et une surveillance des animaux ainsi que l'élaboration de protocoles prenant en compte au maximum le bien-être animal. Cela reposera notamment avec un enrichissement (tunnel en carton et maisons à souris) des cages et un maintien de plusieurs animaux par cage. De plus, nous avons défini un arbre décisionnel (annexe) avec des critères adaptés d'arrêt de l'expérimentation en cas de souffrance de l'animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris mâles modifiés génétiquement pour lequel le laboratoire a une très forte expertise dans l'analyse des impacts de molécules environnementales tant sur la physiologie hépatique que sur la physiopathologie testiculaire et les retombées sur la fertilité. Il s'agit ici d'exposition à un mélange de molécules environnementales permettant de développer ce type de pathologies avec une incidence suffisante pour réaliser des études moléculaires et physiologiques donnant des résultats statistiquement fiables. Des femelles seront utilisées pour l'entretien de la colonie et seront mis à mort à 6 mois; Les femelles et mâles qui ne seront pas utilisées ou de génotype sans intérêt pour le projet seront mis à mort après génotypages soit à 30 jours postnataux. Des mâles de génotypes intermediaires seront utlisés pour l'entretien de la colonie. Pour les mâles du génotype d'intérêt, nous utiliserons des souris à 5 jours, 10 jours, 1 mois, 3 mois et 12 mois postnatal pour l'analyse des phénotypes. Ces différents temps d'analyse correspondent à des moments précis où se déroulent des étapes clefs de la mise en place des fonctions testiculaires et hépatiques ainsi que la mise en place et le maintien de la fonction de reproduction.
Evaluation préclinique de produit de santé utilisés en diabétologie après implantation dans l’organisme
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 900
Cochons : 150
Pour tester les dispositifs médicaux de diabétologie de fabricants qui passent commande, 900 souris, 900 rats et 150 cochons sont utilisés dans des procédures allant de la chirurgie sans réveil au niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Chaque animal subit une intervention de deux à trois heures pour implanter le dispositif, parfois une seconde du même ordre pour l'enlever et observer la cicatrisation, plus des séries de un à dix prélèvements sanguins renouvelables toutes les deux semaines. Le porteur annonce environ 35 études sur cinq ans, le total dépendant du nombre de contrats signés avec les donneurs d'ordre. Il invoque la réglementation et la "nécessité" d'organismes entiers, et cite des raisons économiques parmi les critères de choix des rongeurs.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en diabétologie. Chaque produit destiné à être mis en contact avec le corps humain doit être préalablement testé pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir son efficacité lors de l'utilisation clinique. Pour cela différents fabricants font appel à nous pour réaliser ces études, afin de tester un ou plusieurs de leurs produits de santé. Nous prévoyons environ 35 études sur 5 ans au regard de notre historique. La durée de l'étude est adaptée à l'utilisation clinique et à la durée d'implantation chez l'Homme (de quelques jours à plusieurs années). La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et de tolérance des produits de santé en diabétologie. Ainsi, il est possible d’étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester ou de récupérer des îlots de Langherans (interventions chirurgicale peuvent durer entre 2h00 et 3h00). Ces intervention ont toujours lieu sous anesthésie générale (par injection et gazeuse) et analgésie. Certains animaux peuvent être soumis à une intervention chirurgicale supplémentaire si le but de l'étude est aussi d'évaluer la cicatrisation après retrait du dispositif de son site d'implantation (cette intervention chirurgicale peut durer entre 2h00 et 3h00). Cette intervention aura lieu dans les mêmes conditions que celles précédemment citées. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude ou lors de la chirurgie (durée de prélèvements de quelques minutes maximum. Des sessions comprenant de 1 à 10 prélèvements peuvent être repetée maximum toutes les 2 semaines adapté à la durée de l'étude) . Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie si nécessaire (en général, en fonction de la durée de l'étude 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent être envisagées. L'anesthésie dans ce cas dure généralement moins d'1 heure).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie, contrôlée par la prise d’analgésique (morphinique) et par la réalisation d’une anesthésie générale. Un suivi a minima quotidien des animaux permet de détecter les signes de douleur et d’adapter le traitement analgésique en conséquence pour diminuer autant que possible ces nuisances. - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie, de la chirurgie et/ou du dispositif implanté, à court ou long terme, contrôlée par le suivi quotidien du transit et/ou de l’alimentation et la mise en place de mesures de soutien, jusqu’à la reprise d’un comportement alimentaire normal spontané. Les mesures mises en place peuvent être par exemple : mise à disposition d’aliments plus appétants (friandise), distribution d’un aliment de convalescence (prise spontanée ou assistée)... - risque infectieux lié à la chirurgie, contrôlé par la mise en place de mesures d’asepsie et la prise d’antibiotiques en peropératoire. - hématome ou œdème au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur.
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induits par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : évaluation de l’insulinémie, glycémie). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation (ex : suivi des exigences des normes). A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en diabétologie. Particulièrement dans le contexte de dispositifs utilisés pour le traitement de patients diabétiques la nécessité d'organismes entier est crucial, en effet les hormones de systèmes endocrine pancréatique (par exemple: insuline, glucagon...) jouent un rôle important dans le maintien de différent systèmes (tel que la glycémie) par le biais des organes périphériques (foie, mucles...).
Réduction
Par ailleurs, pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes", sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d’animaux est arbitré à partir du nombre de sites requis en analyse (par exemple pour les souris/rats/porcins, nous estimons 2 à 3 groupes expérimentaux par études à raison de n=10 animaux par groupe et d'une 30 aines d'étude rat/souris et 5 études porcins sur 5 ans répartie sur chaque procédure, ie pour rat/souris: 3 groupes x 10 animaux x 30 études = 900 animaux / pour porcins: 3 groupes x 10 animaux x 5 études = 150 animaux). Le nombre total d’animaux utilisés dépend directement du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet. De cette façon, le nombre d’animaux précisé ci-dessus constitue une estimation basée sur l’historique des essais conduits chez nous durant ces dernières années. De plus les normes requierent un nombre minimal d'animaux par produit analysé et par délai d'analyse, et le type de dispositif implanté ne permet pas toujours la réalisation d'un grand nombre de sites par animal.
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…). Lorsque l'hébergement est individuel un maintien des contacts visuels, auditifs, olfactifs est effectué avec la mise en place d'éléments compensatoires. - La douleur des animaux : En phase post-opératoire, les suivis sont renforcés et completée par des scores de suivi de la douleur. La présence d'un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Les signes cliniques servant de points limites sont établis en amont pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez les rongeurs. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le modèles porcins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Le choix du modèle animal peut également être défini selon la disponibilité et les caractéristiques des modèles diabétique génétique ou induit. Le choix entre les grands modèles repose aussi sur les similarités avec l’Homme : - Caractéristiques anatomiques, poids, propriétés endocrines - Caractéristiques anatomiques des rats et des souris. Ces espèces sont souvent utilisées également pour des raisons économiques et éthiques (exemple : réalisation d’études de faisabilités via la réutilisation d’animaux d’études précédentes ) Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requiert, le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. Nécessité d'utiliser des animaux doté d'un système immunitaire compétent. 3.Cas particulier des porcs Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet.
Développement d’un nouveau modèle murin pour étudier le cancer du foie chez l’enfant
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
40 souris très jeunes et fortement immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur implante des cellules de cancer du foie de l'enfant après incision de l'abdomen et pose de sutures, administre une chimiothérapie deux fois par semaine, mesure les tumeurs par imagerie trois fois par semaine, puis les tue pour prélever ces tumeurs. Il affirme que la majorité des nuisances n'aura pas d'effet sur les animaux puisque les manipulations se font sous anesthésie. L'objectif immédiat consiste à montrer que ce modèle fonctionne, afin de tester ensuite d'autres médicaments.
Objectifs
L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence utilise une chimiothérapie à l’aide d’un agent anticancéreux utilisé à l’hôpital. L’hépatoblastome est un cancer caractérisé par des mutations bien connues mais les mécanismes biologiques responsables de son émergence après la naissance chez l’Homme restent très mal comprises. La disponibilité d’un modèle de cancer du foie chez la souris très jeune permettrait de mimer la maladie observée chez les enfants et d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de son apparition et également de tester l’efficacité de futurs médicaments dans un contexte physiopathologique plus en adéquation avec le très jeune âge des patients atteints de ce cancer.
Bénéfices attendus
Montrer que les cellules d’hépatoblastome se développent dans le foie de souris très jeunes et forment des tumeurs identiques à celles décrites chez les enfants. Montrer que ces cellules répondent à une chimiothérapie et donc que ce modèle animal est utile et nécessaire pour tester de futurs médicaments. Disposer d’un modèle chez la souris très jeune qui permette d’étudier avec plus d’exactitude les mécanismes à l’origine de ce cancer pédiatrique.
Procédures
Implantation de cellules tumorales dans le foie après une incision de la peau au niveau ventral (1 seule incision et implantation, 10 minutes). Points de sutures au niveau ventral (3 points de sutures, 10 minutes). Administration de médicaments 2 fois par semaine (20 secondes par injection). Mesure de la tumeur par imagerie à bioluminescence 3 fois par semaine (10 minutes par analyse). Pesée des souris deux fois par semaine (20 secondes par pesée).
Impact sur les animaux
Les nuisances sont la manipulation des cages et des souris, l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille, un stress lors de manipulations répétées, une légère douleur au point de piqure, une légère douleur liée au medicament injecté, une légère sensation de froid lors du nettoyage de la peau à l’alcool. La moitié des animaux seront traités par une solution de médicament déjà administré à des enfants hospitalisés et dont les effets sont bien connus. Cependant, comme les souris sont manipulées sous anesthésie, la majorité de ces nuisances n’aura pas d’effet sur les animaux.
Devenir
Les 40 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse par des approches cellulaires, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude en boite de culture, car ces derniers ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, la communication et la diversité d’interactions entre les cellules normales et les cellules tumorales dans un animal entier.
Réduction
Nos effectifs sont déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour des raisons de réduction, nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie pour empêcher la douleur et le stress. Un analgésique sera utilisé 30 min avant toute opération. Les animaux sont hébergés en cages à raison de 3 mères et de 12 souriceaux par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. En cas de besoin et pour le bien-être des animaux, nous ajouterons de la nourriture humidifiée/ou du gel nutritif dans les cages ou feront des injections intrapéritonéales de sérum physiologique. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de Woodwoll. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera traité par des antalgiques. S’il n’y a pas d’amélioration, il sera euthanasié sans attendre. Enfin, nous appliquerons les points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 3. Nous utiliserons des souris très jeunes pour mimer le plus justement possible le contexte de la maladie chez les enfants très jeunes.
Elevage avec identification et génotypage invasifs
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système urogénital
Rats : 500
Réutilisés pour la plupart dans d'autres procédures, 24 500 souris et 500 rats subissent entre 7 et 12 jours de vie, sans anesthésie, un tatouage des doigts suivi d'une biopsie de la queue, dans des procédures d'un niveau de souffrance déclaré léger. Le porteur précise que les nouveau-nés dont le génotype ne convient à aucun projet sont tués dès le sevrage, et que d'autres sont tués pour prélever des organes. Il compte l'absence d'anesthésie parmi les avantages de ces deux gestes, et signale comme effets indésirables rares une hémorragie de la queue ou le rejet des petits par leur mère. Les essais de génotypage à partir de follicules pileux n'étant pas concluants, il conclut qu'il est "indispensable" de recourir à la biopsie caudale.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d'identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits par l'Etablissement Utilisateur (EU) pour répondre aux besoins des équipes de recherche. Il s'agit d'un double geste invasif consistant en une identification par tatouage digital selon un code de numérotation défini suivi d'une biopsie de queue pour le génotypage réalisés sur un animal de 7 à 12 jours. Pour les animaux adultes, seule une biopsie d'oreille est réalisée. Cette identification et ce génotypage se justifient par la nécessité de sélectionner les animaux d'intérêt pour l'expérimentation, sélectionner les géniteurs permettant l'amplification et l'entretien des colonies, sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences et les prélèvements d'organes ou de tissus pour des études ex vivo. Les animaux dont les génotypes ne conviennent pas pour les projets expérimentaux soumis et n'étant pas utilisés pour les prélèvements post-mortem, pour les activités d'élevage ou encore pour la formation ne seront pas conservés.
Bénéfices attendus
La procédure d'identification et de génotypage est nécessaire à la sélection d'animaux d'intérêt dans les projets de recherche autorisés. L'identification par tatouage permet d'identifier individuellement les animaux de manière permanente. Le tatouage permet également d'éviter d'avoir recours à l'anesthésie. Le génotypage par biopsie de l'extrémité de la queue permet d'obtenir des résultats fiables grâce à une faible quantité de matériel génétique et de minimiser les risques de contaminations des échantillons. Il permet également de ne pas recourir à l'anesthésie des animaux.
Procédures
Prélèvement sur animal vigile Tatouage et prélèvement pour génotypage: 1 seule procédure par animal n'exédant pas 2 minutes
Impact sur les animaux
La procédure d'identification et de génotypage consiste en deux actes succéssifs. Ces deux gestes induisent une douleur légère de courte durée. L'animal est maintenu en contention pendant ces deux actes ce qui est une source de stress. Celle-ci sera minimisée au maximum par l'expérience du zootechnicien réalisant les gestes. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : une légère hémorragie à l'extrémité de la queue ou le rejet des nouveuax-nés par la mère.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de la procédure. Leur devenir différe ensuite selon les résultats du génotypage : 1) Ils sont sélectionnés pour un projet, pour de la formation ou pour le maintien des compétences 2) Ils sont conservés pour l'entretien des colonies 3) Ils sont mis à mort pour des prélèvements post-mortem 4) Ils sont mis à mort dès le sevrage si leurs caractéristiques génétiques ne répondent pas aux besoins du projet expérimental et si aucune autre utilisation n'est possible.
Remplacement
Des essais sont en cours au niveau de la plateforme de génotypage afin de réaliser les génotypages à partir de prélèvements non invasifs de follicules pileux. Mais à ce jour, les résultats ne sont pas concluants et un doute sur des résultats conduirait à la nécessité de procéder à un nouveau prélèvement. En effet, une erreur de génotypage se traduirait par la mise en accouplement d'animaux n'ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : - une augmentation du nombre d'animaux produits inutilement - la naissance d'animaux avec un phénotype potentiellemnt délétère - l'utilisation d'animaux génétiquement sans intérêt dans des projets expérimentaux induisant des résultats erronés et non exploitables (si l'erreur n'est pas détectée précocement). Il est donc indispensable de recourir à une méthode de génotypage fiable. Or il n'existe pas actuellement de méthode de prélèvement non invasive aussi performante que la biopsie de l'extémité de la queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d'autres méthodes aussi efficaces nous permettant de sélectionner des animaux génétiquement altérés. Le responsable de l'EU établit un plan d'élevage en amont en concertation avec le/les porteur(s) de projet afin de réduire autant que possible le nombre d'animaux générés et donc d'animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l'utilisation des animaux avec un génotype sans intérêt dans d'autres projets ou pour des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre global d'animaux produits dns l'EU.
Raffinement
Des points limites précoses sont mis en place. De plus, les actes d'identification et de prélèvement pour génotypage sont réalisés par du personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par des agents qualifiés permet de réduire l'inconfort et le stress ressentis par l'animal. Ces identifications et biopsies sont réalisées avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des règles d'asepsie établies dans l'EU. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d'expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveaux-nés sont remis en présence de leur mère.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des espèces de choix pour les projets ayant cours dans l'EU. Ces espèces permettent d'obtenir aisément des lignées génétiquement altérées par différentes méthodes et donc créer des modèles murins de pathologies bien caractérisées. La très grande majorité des animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 jours. A cet âge, les animaux sont aisément manipulables, le cartilage est souple et les groupes sociaux constitués sont stables. Nous éviterons autant que possible les biopsies sur animal adulte.
Impact du blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA dans la pathologie de l’Accident Vasculaire Cérébrale (AVC).
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Soumises à une biopsie de la queue puis à l'induction d'un AVC ischémique ou hémorragique, 2 000 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit des pertes de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels ou cognitifs, avec mise à mort au-delà de 20 % du poids perdu ou d'un score supérieur à 7 sur l'échelle de grimace de la souris. Un groupe de 640 animaux cumule l'AVC provoqué et un diabète de type 1 servant de facteur de comorbidité. Le porteur affirme que ces procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et qu'aucune méthode sans animaux vivants n'apporterait le même niveau d'information.
Objectifs
Le tPA est une sérine protéase principalement connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des AVC ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques dont le développement cérébral, la plasticité synaptique, ainsi que dans des processus d’apprentissage et de mémoire. Grâce à ses différents domaines, le tPA interagit avec différents récepteurs tels que les N-methyl-D-aspartate (NMDAR). Cette interaction était impliquée dans certains processus physiologiques tels que la plasticité synaptique, la corticogenèse et pathologiques (AVC, sclérose en plaques/SEP, inflammation). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction tPA/NMDAR. Ainsi, l’objectif de ce projet est tout d’abord, d’évaluer l’impact du tPA endogène ou l’inhibition de son interaction avec le récepteur NMDA sur les lésions cérébrales, la réponse inflammatoire et la récupération fonctionnelle dans des modèles murins d’AVC ischémique ou hémorragique. De plus, il s’agit de démontrer l'effet ainsi que le potentiel thérapeutique de l’administration d’un anticorps monoclonal (le Glunomab®) dans ces modèles murins.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies où cette interaction joue un rôle crucial (AVC, SEP et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de cette interaction permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.
Procédures
Biopsie de queue faite vers 6 jours pour chaque animal (n=2000). Procédure 1 (n=640) : Modèle d’AVC. Procédure 2 (n=640) : Modèle d’AVC. Procédure 3 (n=640) : Modèle d’AVC accompagné d’un facteur de comorbidité (diabète de type 1). - J0 : Induction de l‘AVC +/- Traitements à 20 minutes ou 4 heures. -J0+6h : Evaluation de l’inflammation cérébrale par IRM. - J+1, J+5 : Evaluation du devenir cérébral (lésions, transformations hémorragiques, perméabilisation) post-AVC par IRM. - J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux. Procédure 4 (n=80) : Modèle d’AVC hémorragique. - J0 : Induction de l‘AVC hémorragique. - J+1, J+3 : Evaluation du volume de lésion hémorragique et de l’œdème, post-AVC par IRM. - J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : Biopsie de la queue (douleur légère de courte durée), une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines). Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires.
Rôle de la ligne mediane du thalamus dans la mémoire à long terme
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
402 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie cérébrale de deux heures trente sous anesthésie gazeuse, puis des tests que le porteur détaille, mesure de l'activité locomotrice pendant 24 heures en cage individuelle, test d'anxiété de dix minutes, et séances répétées de nage en labyrinthe aquatique à 21 degrés pour évaluer la mémoire à long terme. Le porteur reconnaît que l'isolement de 24 heures est une source de stress et que l'eau à 21 degrés provoque une sensation de froid. Il justifie le choix du rat par des capacités cognitives élaborées et un répertoire comportemental complexe, arguments qui décrivent aussi ce que ces individus ont à perdre.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier les structures cérébrales qui permettent aux souvenirs de persister dans le temps. Cette capacité est largement diminuée dans un grand nombre de pathologies cérébrales, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie à Corps de Levy, le syndrome de Korsakoff mais également dans des troubles psychiatriques tels que la schizophrénie ou encore la dépression. Pour maintenir les souvenirs, une réorganisation progressive de l’information dans des structures cérébrales qui soutiennent la mémoire à long terme, telles que l’hippocampe et le cortex préfrontal médian est nécessaire. Cette réorganisation semble également engager un relais thalamique de la ligne médiane du cerveau. Nos expériences chez le Rat vont nous permettre de comprendre le rôle de ce relai thalamique, et à quel moment de la réorganisation du souvenir il est nécéssaire. Nous questionnerons nos animaux gràce à des taches de comportement qui testent le souvenir de leur environnement spatial.
Bénéfices attendus
En utilisant une espèce animale avec de bonnes capacités d'apprentissage et de mémoire , le Rat, ce projet va nous permettre de mieux comprendre les mecanismses cérébraux de persistence des souvenirs anciens. Cette fonction mnésique représente un des socles de la cognition animale et humaine. Notre compréhension de ces processus neurobiologiques de la mémoire alimente nos seulement des domaines appliqués tels que la modélisation, les théories de l’apprentissage, les sciences de l’éducation mais aussi ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles ouvriront une piste de cible cérébrale nouvelle et précise pour comprendre les deficits de memoire chez l’Homme.
Procédures
Une chirurgie cérébrale sera réalisée sur tous les animaux de ce projet, sous anesthésie gazeuse contrôlée et continue pendant 2h30. Une analyse comportementale sera réalisée sur une cohorte de 120 animaux vigiles sur une période de 55-60 jours/animal. Ces analyses nous permettront d'étudier le phénotype locomoteur (1 seance de 24h dans un environnement où les mouvements sont quantifiés), l’anxieté (1 séance de 10 min), les capacités de flexibilité cognitive (6 séances, composées chacune de 4 x 1 min dans un environnement aquatique) ou de mémoire à long terme (9+1 séances composées chacunes de 4 x 1 min dans un environnement aquatique). Ces tests auront une durée de 1 à 9 jours consécutifs et seront séparés les uns des autres de 2 jours en moyenne. Une autre cohorte de 252 animaux vigiles participera à l'étude des différentes phases de la consolidation de la mémoire à long terme sur une période de 9 séances consécutives + 1 séance de rappel 5 ou 25 jours après (chaque séance est composée de 4 x 1 min dans un environnement aquatique).
Impact sur les animaux
Pour nos procédures, nous attendons un inconfort suite à la chirurgie intracérébrale. La douleur et l’inconfort pendant la chirurgie seront pris en charge par les anesthésiques, les antidouleurs locaux et la couverture anti-inflammatoire, prolongée après la chirurgie. Les animaux seront observés minutieusement et quotidiennement après la chirurgie par les expérimentateurs formés pour détecter des signes d’inconfort prolongé et les traiter. Suite aux expérience de comportement dans les labyrinthes aquatiques (21°) une sensation de froid peut être générée, mais seulement pour un temps court (1 min). Les animaux s’habituent et nagent très vite se qui raccourcit le temps dans l’eau pendant les phase d’apprentissage à moins de 20 sec. Ils sont ensuite séchés et réchauffés rapidement à la sortie de l’eau avant de retrouver leur cage habituelle et leurs congénères. Les rats seront isolés 24h dans des cages pour mesurer l'activité générale individuelle. Cette phase peut entrainer une nuisance d'isolement social, et peut conduire à un stress durant cette courte periode d'isolement. Pour limiter l'impact de cet isolement social les cages individuelles seront disposées de façon à maintenir le contact visuel, sonore et olfactif avec les congénères et un baton à ronger sera ajouté dans chaque cage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses des tissus post-mortem.
Remplacement
Ce projet étudie une fonction cognitive telle que la réorganisation des souvenirs pour les maintenir à très long terme, il ne peut pas être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être modélisé par l’informatique et l’I.A. Notons que les modèles murins possèdent des fonctions cérébrales proches de l’Homme, et que les processus pathologiques impliquant la mémoire sont particulièrement étudiés chez ces animaux. Ces modèles récapitulent également des altérations fonctionnelles de l’Homme comme celles de la maladie d’Alzheimer ou même de la schizophrénie. Les études chez le rat représentent ainsi des opportunités uniques pour l'étude de fonctions cognitives essentielles et pour l’ouverture vers de nouvelles approches thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes d’animaux expérimentaux avec leurs contrôles pertinents. L’impact de chaque traitement sera mesuré à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs faits tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Enfin, nous avons établi une progression dans les expériences qui nous permettra de ne pas réaliser les expériences suivantes si une cohorte d’animaux suffit à valider ou à invalider une de nos hypothèses de travail.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ils seront maintenus en groupe de 3 tout au long de ces procédures. Une exception pour le test d’activité locomotrice concernant 120 rats qui seront hébergés dans des cages individuelles pour 24h uniquement. Tous les rats bénéficieront de soins appropriés pour optimiser leur bienêtre et un élément (barre à ronger) est renouvelé dans les cages. Une observation soutenue du comportement spontanée dans la cage avec les congénères ou du comportement évoqué en interaction avec les expérimentateurs sera réalisé. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir tout au long des procédures et particulièrement pendant ou après la chirurgie cérébrale. Les rats sont habitués à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des expériences de comportement.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle Rat car il possède des capacités cognitives élaborée et un répertoire comportemental complexe. La question cognitive posée requiert un modèle animal possédant une structure neuro-anatomique comparable à celle du cerveau humain, c'est le cas du Rat, mais pas des organismes plus simples tels que c elegans, drosophila, zebra fish. Les structures cérébrales impliquées dans la réorganisation et le maintien du souvenir sont aussi celles qui sont sujettes à des dysfonctionnements et des dégénérescences dans le cadre de pathologie cérébrale et mentale telles que la maladie d’Alzheimer, mais aussi le stress post-traumatique ou la dépression, qui ont en commun de présenter des déficits de la cognition et de la mémoire en particulier. Les animaux arriveront à l'age de 7 semaines pour etre en expérimentation entre 9 et 18 semaines, soit le stade jeune adulte.
Evaluation d’un apport de cannabidiol sur l’activité mitochondriale et le maintien de la masse musculaire dans un modèle de cancer de la tête et du cou
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Inoculées d'un cancer de la tête et du cou puis traitées par chimiothérapie au cisplatine, 60 souris mâles seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur attend une fonte musculaire massive, une perte de poids, de la léthargie, de l'isolement social et une agressivité accrue, et prévoit des jeûnes de seize heures ainsi qu'une contention en tube pour mesurer la composition corporelle. La mise à mort sert à prélever les muscles squelettiques et la totalité du sang. L'hypothèse testée, un effet protecteur du cannabidiol sur le muscle, repose sur des effets que le porteur décrit comme démontrés "principalement in vitro".
Objectifs
La cachexie est un syndrome caractérisé par une fonte musculaire massive, responsable de 25% des décès chez les patients atteints de cancer de la tête et du cou (CTC). Cette perte de masse musculaire est prédictive de l’incidence des complications, de l’efficacité des traitements anticancéreux, et de la survie des patients à long terme. La cachexie est également associée à une augmentation de la fatigue et de la fragilité, à une diminution de l'activité physique entraînant une perte d'autonomie et une dégradation de la qualité de vie. Dans ce contexte, le maintien de la masse musculaire chez les patients atteints de cancer est un défi majeur pour l'amélioration de la réponse aux thérapies et l'amélioration de leur qualité de vie.
Bénéfices attendus
D'après la littérature, l'utilisation du cannabidiol (CBD) semble moduler la respiration mitochondriale, ainsi que le développement et le métabolisme musculaire. Il est largement documenté que la cachexie est associée à un dysfonctionnement mitochondrial et à une atrophie musculaire. Enfin, les effets antinéoplasiques du CBD ont été démontrés dans de nombreux types de cancers, principalement in vitro. Par conséquent, nous postulons que dans notre modèle préclinique de CTC, le traitement au CBD limitera l’atrophie musculaire en favorisant le maintien d'une fonction mitochondriale optimale, et ralentira la croissance tumorale. A l’heure actuelle, les indications retenues par la Haute Autorité de Santé pour l'utilisation du CBD concernent des pathologies neurologiques infantiles et un vaste champ d’expérimentations dans la prise en charge des douleurs cancéreuses est en cours. Notre projet s’intéressera à l’utilisation de cette molécule comme adjuvant à la nutrition et aux molécules de chimiothérapie antinéoplasiques. Malheureusement, seule une partie des patients atteints d'un cancer avancé bénéficient de manière optimale de cette chimiothérapie en raison de la résistance tumorale et des effets toxiques (toxicité hématologique, toxicité du tractus gastro-intestinal, neurotoxicité). Dans le présent programme, nous souhaitons utiliser le CBD comme adjuvant dans le traitement des CTC afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de CTC. L’apport de CBD en plus des traitements anti-cancéreux pourrait ainsi favoriser le maintien de la masse musculaire au cours de ces traitements, ce qui améliorerait leur tolérance et ainsi leur efficacité, et impacterait positivement la qualité de vie des patients. L’utilisation de CBD s’est aujourd’hui démocratisée dans le grand public et son utilisation clinique commence à se mettre en place dans le cadre de l’expérimentation du cannabis à usage médical (pilotée par l’ANSM). Certains traitements comme l’Epidyolex (CBD médical) sont disponibles, et de nombreux effets positifs du CBD sont démontrés. Ainsi, l’utilisation clinique du CBD apparait comme une approche thérapeutique adjuvante intéressante et innovante pour la prise en charge des patients atteints de CTC. Cette utilisation pourrait être facile à mettre en œuvre. Seules manquent des résultats précliniques pour organiser rapidement des études cliniques pour démontrer ces effets positifs chez l’Homme.
Procédures
Les souris incluses dans ce projet seront inoculées avec un cancer par une injection unique de cellules cancéreuses. Deux semaines après cette injection tumorale, un traitement de chimiothérapie par injection de cisplatine (une fois par semaine pendant 2 semaines), et un traitement par injection de CBD (trois fois par semaine pendant deux semaines) seront effectués. Les animaux seront soumis à différents tests permettant d'évaluer leur force musculaire et leur capacité locomotrice. A la fin de ce protocole, les animaux recevront une injection unique de traceurs isotopiques stables pour mesurer la vitesse de synthèse des protéines musculaires. Les animaux seront également soumis à des mises à jeun (de 16h) et à une contention en tube pour l'analyse de leur composition corporelle par echo MRI (imagerie par résonance magnétique nucléaire qui permet de déterminer la masse grasse, la masse maigre, l’eau libre et l’eau corporelle totale d’un petit animal).
Impact sur les animaux
Le protocole expérimental consiste à induire un cancer chez l’animal. Il comprend l'injection de cellules tumorales pour induire un développement tumoral et des injections sous cutanées de cisplatine, cannabidiol et traceurs isotopiques stables. La tumorigenèse peut s'accompagner d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité accrue ou des altérations de la locomotion. Les différentes mesures de fonctionnalité musculaire, et de composition corporelle réalisées ne seront quant à elles que très peu invasives.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet. En effet, le prélèvement des muscles squelettiques est nécessaire pour mesurer le niveau de synthèse protéique au sein de ce tissu. De même, l'ensemble du sang des animaux doit être prélevé pour pouvoir mesurer leur statut inflammatoire et réaliser leur bilan sanguin
Remplacement
L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, le développement de la cachexie est la résultante d’altérations métaboliques systémiques impactant de nombreux tissus et organes (muscle squelettique, foie, tissu adipeux, système immunitaire…). La complexité tumorale (mélange de cellules tumorales et immunitaires), la complexité du dialogue tumoral avec les différents tissus et la complexité du dialogue entre ces tissus eux même, ainsi que les conséquence de la croissance tumorale sur la fonctionnalité musculaire la mobilité ne peuvent être complètement reproduits in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Le nombre de souris nécessaire à l’étude est calculé pour une variation attendue de 25% du volume tumoral entre les souris porteuses de tumeur traitées au cisplatine ou au CBD et les souris porteuses de la tumeur uniquement. Ainsi, le nombre de souris nécessaire par groupe est de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaire à la réalisation de ce projet est donc de 60 souris.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Un enrichissement de l'environnement sera mis en place, correspondant en divers éléments (tubes en plexiglass, boules métalliques...). Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. L'atteinte d'un point limite grave entrainera la mise à mort de l'animal concerné . Les points limites et l’arbre de décision adapté à cette étude sont présentés en annexes.
Choix des espèces
Nous envisageons d'étudier l'impact d'une supplémentation en cannabidiol sur la mise en place de la cachexie en réponse au développement tumoral et à son traitement par chimiothérapie. Nous envisageons d'inoculer des cellules cancéreuse chez des souris pour induire un cancer qui sera ensuite traité par injection de cisplatine +/- cannabidiol. Les cellules cancéreuses utilisées dérivent de métastases pulmonaires produites chez la souris en réponse à l'implantation de carcinome épidermoïde de l'oropharynx. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique. Ce type d'expérimentation ne peut pas être menée chez l'Homme. De plus, ce protocole requière de nombreux prélèvements tissulaires dont certains sont très difficile à obtenir chez l'Homme (en particulier au niveau musculaire) et la recherche de métastases au niveau hépatique et pulmonaire. Pour réalisée ce protocole, nous utiliserons des souris mâles agées de 12 semaines. Des souris de cette âge sont couramment utilisées pour ce type d'inoculation de cancer. Nous avons choisi cet âge afin de valider que l'inoculation du cancer que nous décrivons est bien conforme à ce qui a été publié précédemment et pour faciliter la comparaison des résultats que nous obtiendrons avec ceux pré-cités.
Expérimentation en macrocosmes pour mesurer les effets écologiques des centrales photovoltaïques flottantes
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres poissons : 1800
Pour mesurer les effets écologiques de panneaux photovoltaïques flottants, 1 800 épinoches et 2 400 amphibiens sont capturés dans douze bassins expérimentaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance déclaré léger. Les poissons sont pêchés à l'électricité, anesthésiés, mesurés, et une partie de leur nageoire pelvienne est découpée, geste dont le porteur reconnaît qu'il implique "une douleur de sévérité moyenne". Les amphibiens, têtards de grenouilles vertes et tritons adultes, sont piégés puis amputés d'un fragment de nageoire caudale sans aucune anesthésie, au motif de raccourcir le temps de manipulation. Les animaux sont remis à l'eau dans leur bassin d'origine, le porteur prévoyant une mortalité inférieure à 0,5 %, et le projet vise à documenter des installations dont il indique lui-même que le déploiement est déjà engagé.
Objectifs
Les centrales photovoltaïques flottantes constituent une nouvelle alternative aux centrales photovoltaïques terrestres pour la production d’énergie, en vue de la transition énergétique. Les prédictions de croissance de ces installations sont exponentielles, ces dernières représenteront d’ici 2030 une part importante de la production d’énergie photovoltaïque. Ainsi, ces installations et projets d’installations sur les plans d’eau connaissent un fort développement sur le territoire national, sans que les impacts potentiels, négatifs ou positifs, sur la biodiversité aquatique et le fonctionnement des écosystèmes lacustres ne soit connus. En particulier, les plans d’eau de gravière et les retenues, écosystèmes artificiels, sont spécifiquement ciblés par les développeurs de panneaux solaires. Or, les connaissances sur les impacts écologiques de ces centrales sont extrêmement limitées. A ce jour, il n’existe aucune étude scientifique qui quantifie les effets écologiques de ces installations sur les écosystèmes aquatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances robustes et essentielles sur les effets des panneaux solaires flottants sur la structure des réseaux trophiques et la biodiversité. Les connaissances aquises auront des répercussions opérationnelles sur la configuration et le déploiement de nouvelles centrales. Elles pourront permettre d’étayer par des données scientifiques les autorisations que les services de l’Etat doivent accorder avant toute installation.
Procédures
L’objectif est d’évaluer l’effet de l’installation de panneaux solaires flottants sur le réseau trophique de 12 bassins expérimentaux peu profonds colonisés naturellement par des amphibiens et empoissonnés avec des épinoches. Pour cela, des captures d’épinoches adultes et juvéniles et de larves ou adultes d’amphibiens seront effectuées dans les 12 lacs une fois par an en utilisant la pêche électrique pour les épinoches et des pièges pour les amphibiens (3 pièges par bassin). Dans chaque bassin 30 individus épinoches maximum (15 adultes, 15 juvéniles) et 20 spécimens d’amphibien (principalement des tétards de grenouilles vertes et adultes tritons) seront utilisés. Les poissons seront mesurés et pesés et un fragment de nageoire pelvienne sera prélevé pour des analyses génétiques et isotopiques (régime alimentaire). Les amphibiens seront sexés, mesurés et le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale sera réalisé pour des analyses isotopiques. Les poissons seront anesthésiés. Les amphibiens ne seront pas anesthésiés afin de réduire le temps de manipulation. Un maximum de 360 épinoches et 240 spécimens d’amphibiens seront soumis à ces procédures chaque annéee.
Impact sur les animaux
La capture des poissons peut entrainer un léger stress. Les mesures morphométriques (prise de photographie) impliquent un stress léger dû à la manipulation des animaux. Le prélèvement d’un fragment de nageoire des poissons (‘fin clipping’) implique une douleur de sévérité moyenne. Pour les amphibiens, la priorité est donnée à la réduction maximale du stress des animaux et donc à la remise à l’eau le plus rapidement possible. Par conséquent, aucune anesthésie ne sera pratiquée.
Devenir
Seuls les animaux n’ayant pas subi de dommage au cours de la capture seront utilisés pour l’expérimentation. Les animaux seront remis à l’eau dans leur bassin d’origine à l’issue de la procédure. Nous pouvons prévoir une très faible mortalité consécutive à cette procédure (moins de 0,5% des animaux).
Remplacement
Ce projet a pour but de comprendre les effets des panneaux solaires sur le réseau trophique dans des conditions contrôlées mais réalistes. Ainsi, le réseau trophique expérimental doit être suffisamment complexe ce qui suppose d’intégrer au sein des bassins des espèces de chaque niveau trophique, dont des espèces de consommateurs. Par ailleurs, la caractérisation du réseau trophique implique l’échantillonnage le plus exhaustif possible des communautés présentes. L’espèce de poisson que nous avons retenue présente de nombreux avantages aussi bien pratiques que scientifiques. C’est une espèce facile à élever, utilisée comme espèce bioindicatrice en écotoxicologie, qui se reproduit bien et qui présente un comportement trophique assez plastique. Le développement d’une population bien établie et de fortes adaptations à l’installation de panneaux solaires sont attendues. Seront échantillonnés les amphibiens bien représentés dans les macrocosmes. Étant donné que les amphibiens sont protégés et ont un cycle de vie biphasique, il n’est pas envisagé(eable) de procéder à une introduction contrôlée d’individus et à leur confinement dans les dispositifs expérimentaux. Les premières observations faites en 2023 attestent d’une colonisation naturelle (et de la reproduction) significative des macrocosmes par la grenouille verte et le triton palmé. Par conséquent, nous fondons nos espoirs sur l’évaluation de la niche trophique de ces deux espèces, a minima, dans les macrocosmes, qui ont des régimes alimentaires différents (principalement consommateurs d’algues ou bien prédateurs) et occupent ainsi des positions différentes dans le réseau trophique. Échantillonner ces espèces est donc particulièrement informatif et complémentaire. Par ailleurs, les deux espèces en question sont particulièrement communes dans les plans d’eau de France.
Réduction
Les espèces cibles du projet sont les poissons et les amphibiens, ce qui implique un échantillonnage plus conséquent d’individus que les autres ressources des réseaux trophiques (macroinvertébrés, zooplancton et compartiment végétal). Le projet vise à évaluer les conséquences de l’installation de panneaux solaires dans un écosystème aquatique sur les poissons à l’échelle des individus. Or il existe une forte variabilité́ intraspécifique chez les poissons, liée à des variations entre individus et au cours de leur développement et de croissance. Selon le taux de capture, l’objectif d’un nombre maximal de 30 épinoches, tous stades de vie confondus (15 adultes et 15 juvéniles), par bassin permettra d’intégrer la variabilité ontogénique, phénotypique et génotypique de la population. Ce nombre permet de disposer d’un effectif suffisant pour prendre en compte la variabilité́ entre individus et représenter la population, tout en limitant le nombre d’animaux concernés par l’expérimentation. Ce nombre permettra notamment de mesurer la taille de la niche trophique des différentes cohortes, en utilisant des approches bayésiennes particulièrement robustes pour cela. Un maximum de 360 poissons (30 x 12 bassins) sera utilisé́ chaque année pour les analyses génétiques et isotopiques. Comme il a déjà été mentionné, l’objectif d’un prélèvement non létal de tissu de 20 individus par espèce (ou stade de vie) d’amphibien par macrocosme est recommandé d’un point de vue analytique afin de fidèlement caractériser la variabilité de niche trophique (isotopique) entre populations. Selon le taux de colonisation des macrocosmes, pourrait alors être échantillonné un maximum de 240 spécimens de chaque espèce d’amphibien, annuellement. Néanmoins, il est fort probable que l’échantillonnage soit inférieur, car les populations d’amphibiens (notamment de triton au stade adulte) sont généralement de petite taille dans ce type d’écosystème. Des effectifs sensiblement inférieurs ne remettraient pas en cause la robustesse de l’évaluation des métriques de niche isotopique, et, si les effectifs sont effectivement en deçà pour certains macrocosmes, nous évaluerons d’éventuelles répercussions de ces petits effectifs sur les métriques mesurées.
Raffinement
L’échantillonnage sera effectué dans des conditions météorologiques compatibles avec le maintien des animaux momentanément en captivité, c’est-à-dire, hors périodes de fortes chaleurs, et par journée non pluvieuse, de façon à manipuler les animaux dans de bonnes conditions. Les procédures seront réalisées à proximité des macrocosmes dans un espace isolé (barnum). La concentration en oxygène dissous sera contrôlée régulièrement dans les bacs de maintien, d’endormissement et de réveil des animaux et l’eau renouvelée très régulièrement. Concernant les amphibiens, une attention particulière sera portée sur la mise en œuvre des pièges de façon à limiter autant que faire se peut le stress de capture et de confinement. Seulement 3 pièges seront utilisés par bassin et les pièges ne seront pas déployés dans tous les bassins la même journée afin de limiter le temps de confinement de tous les animaux en seau. L’opération de recapture pourra être reconduite si les effectifs d’amphibiens sont insuffisants. Les épinoches seront anesthésiées (30 individus par bac) dans des bacs de 50 L, avant les prises de photo et le prélèvement du fragment de nageoire pelvienne pour limiter le stress et la douleur lies à la manipulation et au prélèvement. L’anesthésie des amphibiens étant une procédure délicate et longue, les amphibiens ne seront pas anesthésiés afin de réduire la durée de détention des animaux et ainsi leur stress (compromis stress/douleur). Une vigilance particulière sera portée à la bonne contention des individus lors du phénotypage et la biopsie de nageoire. L’exondation des animaux sera courte et durera moins d’1 minute (plutôt 30 secondes pour les amphibiens). Le niveau de cicatrisation consécutif au prélèvement du fragment de nageoire chez l’épinoche n’est pas connu précisément. Nous avons néanmoins constaté que le recouvrement de la plaie par du mucus permet une cicatrisation des nageoires pelviennes au bout d’une saison et qu’après un an, la nageoire pelvienne prélevée a repoussé totalement. Les observations réalisées en milieu naturel attestent d’une régénération complète de la nageoire chez le triton marbré (grand triton) en l’espace de trois semaines. A noter que la nageoire chez les amphibiens est un appendice transitoire amené à se résorber et qu’elle est très fréquemment attaquée par les prédateurs, donc naturellement endommagée.
Choix des espèces
L’épinoche est une espèce facile à élever, utilisée comme espèce bioindicatrice en écotoxicologie, qui se reproduit bien et qui présente un comportement trophique assez plastique. De fortes adaptations et des réponses rapides sont attendues chez cette espèce. Les amphibiens attendus dans les dispositifs expérimentaux sont des espèces particulièrement communes en France. Ainsi, les enseignements tirés de ce projet sur ces espèces seront aisément transposables aux plans d’eau visés par l’implantation de centrales photovoltaïques. Nous utiliserons des poissons aux stades juvéniles et adultes, pour intégrer l’effet de la croissance sur la réponse des individus. Il s’agira aussi de têtards de grenouilles et d’adultes de tritons, soit des stades de vie suffisamment présents dans le milieu aquatique pour jouer un rôle dans le fonctionnement des réseaux trophiques et donc susceptibles d’être affectés par les centrales photovoltaïques flottantes. L’échantillonnage non létal d’une quantité suffisante de nageoire des larves de tritons n’est techniquement pas possible, par conséquent ce stade de vie n’a pas été retenu dans le projet.