Oncologie

Pour étudier des combinaisons de radiothérapie, d'immunothérapie et d'un modulateur de la matrice tumorale, 2 696 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue ou dans le gras mammaire, des mesures de tumeur au pied à coulisse, des séances d'imagerie sous anesthésie et, pour certaines, une ouverture du thorax suivie de trois heures et demie d'imagerie sans réveil. Le porteur indique que la croissance tumorale dégrade la condition physique, provoque des douleurs et peut entraîner la mort, et que l'anesthésie prolongée peut causer une détresse respiratoire jusqu'à l'arrêt cardio-respiratoire. Il reconnaît que le remplacement est "la notion la plus limitante" du projet, tout en concluant que l'utilisation d'animaux non-humains est "nécessaire".

Objectifs

Notre programme de travail repose sur l’observation fondamentale que deux populations du système immunitaire, sont impliquées dans le développement tumoral et la résistance aux thérapies anti-cancéreuses. L'étude de l'impact des thérapies conventionnelles ainsi que les nouvelles immunothérapies sur ces populations immunitaires sont nécessaires pour comprendre comment elles interviennent dans les résistances à ces thérapies et donc à la rechute tumorale. Les objectifs du projet sont ici de caractériser les effets combinatoires de la radiothérapie avec une immunothérapie qui stimule l'activité d’une de ces deux populations ou une pharmacothérapie qui perturbe la structure de soutien entourant les cellules tumorale pour faciliter l'activité anti-tumorale qui est, dans la plupart des cas, empêchée par l'interaction entre les deux populations immunitaires.

Bénéfices attendus

Les thérapie anti-cancéreuses (radiothérapie, chimiothérapie) sont utilisées depuis les débuts de l'identification de la pathologie cancéreuse. Elles ont considérablement augmenté en qualité, plus précises, plus variées et l'émergence des immunothérapies a suscité un nouvel espoir pour les cancers incurables. Cependant dans encore trop de cas, ces thérapies ne font que prolonger la durée de vie et entrainent des effets secondaires très lourds. En effet les cancers répondent très rapidement à ces thérapies et développent des résistances. Ce projet de recherche vise à mettre en lumière les mécanismes par lesquels les cellules du système immunitaire participent à la croissance tumorale et la résistance aux thérapies anti-cancéreuses. Cette compréhension permettra dans un premier temps de tester efficacement des nouvelles combinaisons de thérapies anti-cancéreuses afin d'améliorer leur efficacité mais aussi de réduire les effets secondaires chez le patient. Nous pensons également qu'il permettra d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de ces cancers.

Procédures

Dans le cadre de notre étude, nous effectuons plusieurs procédures pour évaluer la croissance tumorale et les effets des traitements. Tout d’abord, nous réalisons des biopsies de tissus pour l’identification génétique, en utilisant une méthode rapide et peu invasive. Ces biopsies sont issues de l’extrémité de la queue de l’animal ou d’une goutte de sang prélevée par poinçon à la joue. Le processus dure environ une minute sur animal vigile. Ensuite, nous procédons aux injections de lignées tumorales. Pour cela, nous avons deux options : une injection au niveau de la veine caudale sur l’animal vigile, ou une injection dans le gras mammaire sur animal anesthésié. Cette étape prend environ deux minutes. Pour surveiller la croissance tumorale, nous utilisons une technique d’imagerie sur animal anesthésié (environ dix minutes) ou mesurons directement la masse tumorale à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile (cinq minutes pour cinq souris). Nous administrons également des traitements cellulaires par injection, avec deux injections par animal sur deux jours consécutifs, chacune prenant environ une minute. Enfin, nous réalisons des procédures chirurgicales sous anesthésie générale pendant quatre heures accompagnée d'un traitement analgésique par injection (1min) pour l’imagerie, impliquant une chirurgie de trente minutes suivie d’une imagerie de trois heures et demie. Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour procéder aux prélèvements des tissus et analyses. Ces étapes sont essentielles pour notre recherche sur les tumeurs et les thérapies associées.

Impact sur les animaux

Dans un premier temps, les animaux subiront très tôt une biopsie de l’extrémité de la queue et/ou un prélèvement de sang (une goutte) pour identification génétique. Ces gestes peuvent engendrer des douleurs de courte durée et un stress chez l’animal. Les effets indésirables les plus lourds pouvant survenir chez les animaux sont majoritairement dus à la croissance tumorale. Les animaux vont alors subir le développement d'une ou plusieurs tumeurs entraînant une dégradation de la condition physique, des douleurs et pouvant provoquer la mort. Aussi, la procédure d’imagerie peut engendrer des effets indésirables de par l’utilisation prolongée d’anesthésique pouvant provoquer un stress thermique ainsi qu’une détresse respiratoire pouvant conduire à un arrêt cardio-respiratoire. La thoracotomie est également une chirurgie lourde même si celle-ci sera sans réveil. Dans une moindre mesure, les anesthésies répétées des animaux pour le suivi de croissance tumorale par imagerie ou pour la radiothérapie ainsi que les injections de solutions contenant les traitements peuvent également être une source de stress pour l'animal et provoquer des douleurs de courte durée.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure. Dans la majorité des cas il n'est pas attendu de rejet tumoral complet ainsi les animaux seront euthanasiés suivant les points limites à l'issu de la récidive tumorale ou suivant les besoins de l'étude. De plus, des prélèvements pour analyses post-mortem sont nécessaires dans le cadre du projet et implique donc l’euthanasie des animaux.

Remplacement

Le sujet reposant essentiellement sur des réponses aux traitements anti-tumoraux par le système immunitaire, l'utilisation d'animaux est nécessaire. La notion de remplacement est la plus limitante dans le cadre de ce projet, cependant nous avons mis au point des expériences de cocultures in vitro des cellules tumorales avec des lignées de macrophages permettant d'analyser les interactions avec les cellules tumorales. De plus, nous complémentons nos études sur des échantillons humains ce qui nous permet de focaliser sur des cibles ayant un minimum de relevance déjà établie chez l'homme.

Réduction

Notre approche la plus efficace dans la réduction des animaux repose sur l'utilisation de techniques moderne d'analyse à haute dimension permettant d'avoir un jeu de données le plus large d'un seul coup sur les mêmes animaux. La deuxième approche est de réaliser les expériences sur l’ensemble des groupes d’étude en même temps afin de comparer les différents groupes par rapport au même groupe contrôle. Nous mettons aussi en place une stratégie d’optimisation des animaux euthanasiés. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver les données pour l’ensemble des tissus. Enfin mâles et femelles sont utilisés indépendamment dès que possible. Bien que l'uniformisation du sexe puisse améliorer l'homogénéité des lots, l'utilisation des deux sexes permet de réduire la génération d'animaux qui ne seraient jamais utilisés. Selon notre expérience, cela représente une option majeure de Reduction des animaux. Le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet s’élève à 2696 sur 5 ans. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance, il sera donc nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les conditions de notre établissement avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour,nuit 12-12, avec au maximum 5 animaux par cages. La génération de ces modèles tumoraux est sans risque infectieux. Chaque cage contient au moins un élément d'enrichissement : nid en carton, tunnel ou maisonnette. La surveillance quotidienne est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation et un suivi complémentaire (points limites : mesure de la charge tumorale, mesure de poids, détection de signes clinique) fréquent allant de tous les 5 jours en début de procédure (avant les risques d'apparition de signe de souffrance) à 3 x/semaine en milieu de procédure (lorsque le risque d'apparition de signes d'inconforts peut survenir). Cette surveillance permet de réduire la souffrance animale. Dans la plus grande majorité des cas nos approches de raffinement reposent sur l'utilisation d'anesthésiant/analgésiant pendant les procédures. Pour diminuer le stress, les conditions globales d'hébergement des animaux ne changent pas outre des conditions de raffinement supplémentaires dans certains cas.

Choix des espèces

Nous étudions la mobilisation d'un grand nombre de cellules immunitaires à travers les tissus et l'impact de traitements anti-tumoraux sur l'organisme entier. Les modèles de souris utilisés sont l'unique moyen d'obtenir les outils permettant de suivre les cellules d'intérêts par des techniques d'imagerie. Le projet utilise différentes lignées de souris qui combinent un certain nombre de gènes d’intérêts ainsi que des cellules tumorales murines justifiant le choix de cette espèce. On distingue les modifications génétiques qui apportent une fluorescence sur les cellules ne générant pas de caractéristiques génétiques néfastes, à l’exception du modèle développant des tumeurs mammaires spontanées. Ce modèle représentatif des tumeurs humaines pour lequel, malgré l’apparition de la tumeur, aucune souffrance animale n’est observée tant que la tumeur est contrôlée. Les animaux sont utilisés entre 10 et 14 semaines d’âge (maturité immunitaire) sauf pour le modèle de tumeur spontanée du sein dont la progression est lente qui seront utilisés entre 6 et 12 mois d’âge (à l'apparition de tumeur palpable).

Pour chercher des marqueurs sanguins précoces de la neuropathie provoquée par les anticancéreux, 96 rats reçoivent huit injections en 25 jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements. Le porteur écrit que l'induction de la neuropathie constitue "une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l'étude", et que les douleurs qu'elle provoque seront mesurées par des tests d'allodynie pouvant durer une heure par animal. Il présente le recours à des stimulations moins intenses comme un raffinement, alors que la douleur reste l'objet même de la mesure. Les résultats seront comparés à une étude menée chez des patients traités par oxaliplatine ou paclitaxel.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques (taxanes, sels de platine…). Cette neuropathie est une atteinte des nerfs périphériques qui se caractérise par des désordres sensitifs distales et symétriques, altérant la qualité de vie des patients. Aucun traitement préventif n’est recommandé et seule la duloxétine (un antidépresseur) est recommandée pour traiter les douleurs neuropathiques. Enfin, le repérage précoce de cette neuropathie est un autre enjeu, car il est admis qu’un repérage précoce des patients permet de limiter la sévérité et les séquelles à de la neuropathie. Le repérage de la neuropathie repose idéalement sur l’association d’un examen médical et d’autoquestionnaires, mais très chronophage en routine. Récemment des marqueurs sanguins, comme le neurofilament light chain, permettrait un diagnostic des neuropathies et des désordres neurologiques. Cependant, selon la littérature scientifique, ce marqueur sanguin n’est pas assez précoce (les modifications de ce marqueurs sanguins apparaissent quand des lésions des nerfs sont déjà bien établies). Enfin et actuellement, aucun marqueur sanguin ne peut être recommandé en routine. Plus récemment, des petits ARN (acide ribonucléique relargué par les cellules) représentent de nouveaux marqueurs d’intérêt, notamment dans le cas de la douleur, et probablement plus précoces. L’objectif de cette étude sera d’explorer les modifications d’expression de ces petits ARN dans le sang d’animaux exposés à des anticancéreux neurotoxiques responsables de neuropathie.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouveaux marqueurs de neurotoxicité chez l'animal. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des neuropathies induites par les anticancéreux est très limitée, et qu’à défaut un repérage précoce des patients permettrait une meilleure prise en charge de la neuropathie (réduction de dose, arrêt ou switch d'anticancéreux) afin de limiter l'évolution et la sévérité de la neuropathie. Les résultats de ce projet seront confrontés à une étude clinique similaire chez des patients atteints de cancer et exposés à de l'oxaliplatine (cancer colorectal) ou du paclitaxel (cancer bronchopulmonaire). De plus, en identifiant des nouveaux biomarqueurs sanguins communs au rongeur et à l'Homme, ces marqueurs sanguins permettrait d’affiner (« refine ») la qualité des études réalisées chez l'animal, avec un meilleur potentiel de transposition clinique (recherche translationnelle).

Procédures

Tous les animaux recevront des injections d’anticancéreux. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours, voie intraveineuse ou intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront au maximum 60 minutes pour un animal.

Impact sur les animaux

L’induction de la neuropathie chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La neuropathie sera associée à des douleurs qui seront mesurées dans le cadre de ce projet. Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg et mesure bihebdomadaire), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des 4 expérimentations/temps de mesure afin d’effectuer des prélèvements.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de ces neuroapthies, qui n'est-elle même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux permettant l'analyse des résultats à l'aide de tests statistiques adéquates. Dans ce type d'étude exploratoire, il est difficile de trop réduire le nombre d'animaux au risque de ne pas pouvoir conclure (tests statistiques moins fiables, perte du bénéfice de l'étude et utilisation inutile des animaux).

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles douloureux seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant des seuils de douleurs pour des stimuli non douloureux pour un individu sain (on parle d’allodynie). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire (stimulation douloureuse moins intense). Les animaux seront stabulés dans des conditions standards de 3 animaux par cage, dans une salle climatisée (température et hygrométrie controlées) avec un cycle lumière /obscurité 12/12h et un libre accès à la boisson et à la nourriture. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille, et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide.

Choix des espèces

Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanées tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux. Les animaux seront agés de 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6-9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.

Traitées 21 jours par deux médicaments anticancéreux, avec sept injections intrapéritonéales et une administration orale un jour sur deux, 96 souris mâles seront toutes tuées pour prélever leurs organes reproducteurs, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que la toxicité peut provoquer une perte de poids et une inactivité, et que l'administration orale peut entraîner des fausses routes, les animaux perdant 15 % de leur poids étant retirés du projet et tués. Le projet vise à décrire l'effet de ces médicaments sur la production de spermatozoïdes, à partir d'une hypothèse sur l'augmentation des mutations. Sur le remplacement, le porteur se borne à affirmer que la spermatogenèse est trop complexe pour un système in vitro.

Objectifs

Dans ce projet, nous examinerons les effets de 2 médicaments anticancéreux sur la différenciation de cellules sexuelles mâles (spermatogenèse). Nous visons à révéler comment les médicaments anticancéreux affectent la division cellulaire et aussi comment ils affectent la réparation de l'ADN. Nous étudions les médicaments qui ont reçu beaucoup d'attention en raison de leur efficacité dans le traitement du cancer, mais les mécanismes de leur action sur la spermatogenèse normale ne sont pas bien compris. Nous émettons l'hypothèse que les perturbations des mécanismes épigénétiques (qui modifient l'expression des gènes sans altérer la séquence génétique) conduiront à une augmentation des mutations. L'objectif de ce projet est de révéler l'impact des médicaments épigénétiques sur la spermatogenèse normale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des médicaments épigénétiques sur la spermatogenèse normale afin de développer de meilleures stratégies pour les thérapies anticancéreuses. Nous identifierons également les cibles potentielles affectées par ces médicaments.

Procédures

Les animaux seront traités avec 2 médicaments , séparément, pendant 21 jours. L'administration de la première molécule se fait par injection intra-péritonéale (durée de l'injection : 30 secondes) à la fréquence d'un jour sur 3 (au total 7 injections). le traitement au second médicament se fera par administration orale (durée de l'administration: 30 secondes), à la fréquence d'un jour sur 2, pendant 21 jours.

Impact sur les animaux

L'injection intrapéritonéale et la toxicité du médicament 1 pourrait avoir des effets indésirables, tels que la douleur et le stress. Nous avons réduit le nombre d'injections, de sorte que les souris ne recevront que 7 injections au total. L'administration orale du second médicament pourraient induire des effets négatifs tels que des fausses-routes. La toxicité de la deuxiéme molécule pourrait induire une perte de poids, une inactivité. Des points limites adaptés sont mis en place.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin du projet: les organes reproducteurs seront prélevés pour les analyses moléculaires.

Remplacement

Le modèle de la souris est couramment utilisé dans les études sur la méiose. Nous ne pouvons pas reproduire les effets sur le système reproducteur dans un système in vitro en raison de la complexité de la spermatogenèse et du développement embryonnaire, ce qui n'est possible qu'in vivo.

Réduction

Nous réduirons le nombre d'animaux en utilisant un nombre minimal de souris pour garantir des résultats statistiquement significatifs. La méthode d'injection du premier médicament chez l'animal nécessite 12 animaux par lot (traités et contrôles), en raison du risque d'effets indésirables, liés à sa toxicité. Pour l'exposition au second médicament, nous utiliserons deux groupes de 12 souris ( traités et contrôles), ce qui est suffisant pour les tests statistiques, car les souris consanguines donnent des résultats plus homogènes. Nous prévoyons de répéter une fois l'expérience.

Raffinement

Les composés seront administrés par des personnes formées et compétentes dans cette procédure technique. Les souris ne seront traitées qu'un jour sur deux, ou un jour sur trois ,pendant 21 jours, ce qui permettra de réduire le stress dû à l'administration. Application des points limites : perte de poids maximale de 15% (comparaison avec le groupe contrôle), les animaux seront pesés 3 fois par semaine. Pour minimiser les effets indésirables, les animaux seront hébergés par lots de 4. Si l'animal montre des signes de souffrance (selon notre grille de suivi des points limites) le traitement sera interrompu et l'animal sera euthanasié. Normalement, les doses de médicament sont faibles (15 fois inférieur à la dose maximale) et les souris la tolèrent bien. Si le traitement provoque des effets limités tels qu'une perte de poids corporel, une réduction des activités et que l'animal montre des signes de souffrance, le traitement sera interrompu.

Choix des espèces

Nous utiliserons une souche de souris pour laquelle de nombreuses données publiques sont disponibles. Nous utiliserons le mâle adulte parce que la méiose est bien établie chez le mâle adulte et que les souris sont sexuellement matures pour produire des gamètes. Le modèle souris est l'un des meilleurs pour étudier la méiose et la recombinaison homologue parce que le mécanisme est très conservé entre l'homme et la souris. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 5 semaines car les jeunes animaux sont plus sensibles aux effets. Nous utiliserons des animaux adultes lorsque la première vague de spermatogenèse sera accomplie et que les animaux seront capables de produire des spermatozoïdes.

Pour reproduire l'endométriose chez la souris, 1 287 individus sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements terminaux. Des cellules endométriales injectées dans la cavité péritonéale forment des lésions sur la vessie, l'intestin et le tissu adipeux, puis les souris reçoivent jusqu'à 46 gavages et subissent des tests de douleur par pression sur les pattes et sur l'abdomen, ainsi qu'un labyrinthe en croix pour mesurer le stress. Le porteur s'appuie sur la littérature pour affirmer que le modèle produit des lésions chez 100 % des souris injectées et une sensibilité accrue à la douleur sans perte de poids. Les thérapies annoncées pour les patientes, à base de composés bactériens, restent renvoyées à des développements ultérieurs.

Objectifs

L’endométriose est une pathologie qui touche environ 10% des femmes et qui est définie par la présence de tissu endométrial à l’extérieur de la cavité utérine. Les mécanismes à l'origine de l’endométriose sont encore largement débattus. Parmi les nombreux symptômes associés à l’endométriose, on retrouve des douleurs pelviennes pendant les menstruations, des douleurs pelviennes et/ou abdominales chroniques, des troubles du transit gastro-intestinal, ainsi que l’anxiété et la dépression. L’endométriose est une maladie chronique, multi-organique, hormonale et inflammatoire dont le traitement reste largement symptomatique, avec la chirurgie en dernier recours. Par conséquent, la compréhension des symptômes et des mécanismes devrait fournir une base pour développer des approches thérapeutiques. Dans ce contexte, le microbiote intestinal et urogénital peut contribuer à des symptômes tels que la douleur et la sensibilisation. En effet, Le dialogue entre le microbiote et les organes est régulé par des composés dérivés de bactéries agissant au niveau de la barrière épithéliale intestinale. Par conséquent, notre projet vise 1) à déterminer si l’induction de lésions d’endométriose chez la souris entraine l’apparition de symptômes identiques à ceux des femmes atteintes d’endométriose, 2) Rechercher des signatures du microbiote intestinal et urogénital associées aux dysfonctionnements intestin-vessie-cerveau au cours de l’endométriose, 3) à identifier la contribution du microbiote intestinal dans ces dysfonctionnements, et 4) tester des composés bactériens pour leurs effets thérapeutiques potentiels.

Bénéfices attendus

L’endométriose représente un problème de santé majeur pour la santé des femmes avec un impact profond sur leur qualité de vie. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes de la maladie et en particulier identifier le microbiote intestinal et /ou le microbiote urogénital comme un acteur clé dans les symptômes associés à l’endométriose. Il vise également à proposer des thérapies innovantes basées sur l’utilisation de composés dérivés de bactéries pour améliorer la santé des patientes et traiter cette maladie inflammatoire chronique multi-organes.

Procédures

1 groupe de souris sera soumis à une injection d’estradiol en sous-cutanée et ce geste durera 10 sec. Le métabolite bactérien selon sa stabilité et sa solubilité pourra être administré soit dans l’eau de boisson, soit par gavage quotidien sur animal en contention douce à l’aide d’une sonde de gavage pour rongeurs. Dans le second cas, cela représente 46 gavages du métabolite ou bien de la solution utilisée pour solubiliser le métabolite sur la durée totale de l’expérience et chaque gavage durera moins de 15 sec. Lors des 4 séances d’explorations in vivo nous réaliserons : 1- Une étude de comportement composée de plusieurs tests. le comportement exploratoire des animaux durera 10 min par animal et sera monitoré par une caméra (Pas de contention, pas d’inconfort). Pour l'évaluation du stress, la souris sera positionnée 5 min dans le labyrinthe en croix et son activité sera monitorée par une caméra (Pas de contention, pas d’inconfort). Pour l'évaluation de la douleur, les souris subiront une pression sur les pattes et chaque pression durera 10 sec max. Les souris pourront avoir jusqu’à 3 pressions/test. La même chose sera effectuée sur l’abdomen et les souris subiront 3 pressions de 10 sec chacune. 2- Une exploration des fonctions digestives, pour cela les souris seront gavées (contention+gavage moins de 15 sec) puis 2h après, elles seront à nouveau manipulées avec anesthésie locale (max 30 sec). Les animaux seront ensuite positionnés en cage individuelle pendant 2h supplémentaires.

Impact sur les animaux

Ce modèle murin mime l’endométriose qui peut toucher la femme. Les cellules de l’endomètre injectées dans la cavité péritonéale vont se fixer sur diférents organes (vessie, tissu adipeux, intestin…) et produire des lésions caractéristiques de la maladie. La littérature décrit une sensbilité accrue à la douleur mais pas de perte de poids. Stress et douleur peuvent également être générés par les différentes expérimentations (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux)

Devenir

Mise à mort de toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour divers analyses

Remplacement

L’endométriose est une maladie qui va toucher l’ensemble des organes présents dans la sphère péritonéale. Les lésions provoquées par cette pathologie induisent chez la femme des douleurs, des altérations du fonctionnement des organes pelviens et impacte la qualité de vie. Notre objectif est de mettre en place un modèle murin d’étude de cette maladie afin de caractériser les altérations digestives, la sensibilité à la douleur et les troubles du comportement associés. Cette pathologie met en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, flore microbienne intestinale, système immunitaire ...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée par une approche in vitro et justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer cette complexité d’interactions et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.

Réduction

Des études réalisées au laboratoire sur des selles de patientes ont permis d’identifier des métabolites bactériens et des vésicules extracellulaires issus du microbiote et potentiellement impliqués dans l’apparition et l’agravation de la maladie. Des expériences de motricité réalisées ex vivo sur des segments d’intestins ont permis d’identifier et sélectionner seulement les métabolites et les vésicules extracellulaires présentant les effets les plus grands. Cette préselection permet de réduire significativement le nombre d’animaux nécessaire. Parallèlement, des expérimentations similaires menées chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir des résultats fiables et pertinents. Enfin, ce modèle est décrit dans plusieurs publications comme présentant des lésions de type endométriose dans 100% des souris ayant été injectées avec des cellules endométriales par voie intra-péritonéale.

Raffinement

Le bien-être animal sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Les animaux seront réceptionnés 15 jours avant le début des expérimentations afin de réaliser une période d’acclimatation pour les animaux. Les animaux seront hébergés collectivement (max 5) dans des cages avec frisottis et tunnels ou dômes plastiques transparents. L’évaluation des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique (pelage, posture), activité, comportement, fréquence respiratoire). Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés 3 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place et décrits dans chacune d’elle.

Choix des espèces

Apres une recherche bibliographique sur les modèles murins d’endométriose, le modèle d’injection de cellules endométriales chez la souris est apparu comme le plus pertinent pour notre projet. En effet, d’après la littérature, 100% des souris injectées présentent des lésions qui apparaissent dès le 10 ème jour. De plus, le modèle souris est utilisé dans de nombreux projets au laboratoire. Notre unité possède ainsi une expertise reconnue pour l’étude des fonctions digestives et l’étude du comportement chez la souris. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines. Cet âge correspond à de jeunes adultes et c’est à cette période que cette maladie se déclare chez la femme.

Toutes tuées à l'issue, 264 souris femelles subissent une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire et un prélèvement sanguin rétro-orbital, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que la tumeur peut gêner leur mobilité lorsqu'elle atteint sa taille maximale. Les tumeurs sont collectées pour analyse et les organes des souris qui n'en développent pas alimenteront une banque de tissus. L'objet du projet reste de valider dans un organisme entier des gènes déjà identifiés sur cellules, le porteur jugeant cette vérification "nécessaire" avant d'envisager des traitements préventifs du cancer du sein.

Objectifs

Le vieillissement est un processus physiologique. En effet après un certain nombre de divisions les cellules arrêtent de proliférer, on parle alors de sénescence. Les cellules sénescentes sont alors éliminées par l’organisme. Depuis de nombreuses années maintenant un processus de sénescence accélérée, sous l’impact de différents stimuli dont le stress oncogénique (expressions anormales de gènes retrouvées dans de nombreux cancer) a été décrit. Si la sénescence est aigüe, sporadique elle a un effet bénéfique en participant à l’élimination de cellules qui ne peuvent plus remplir leur fonction correctement. On parle alors de mécanisme de sauvegarde. Toutefois il arrive également que dans ces cellules une seconde modification empêche l’élimination de cette cellule sénescente qui redevient alors active, se multiplie et peut alors être à l’origine de l’initiation tumorale. C’est dans ce contexte qu'il est important de découvrir des gènes qui permettent l’échappement à la sénescence induite par le stress oncogénique pour ensuite étudier leur implication dans l’initiation tumorale. Le but étant de mettre en évidence de potentielles cibles afin de pouvoir proposer soit des traitements préventifs contre l’initiation tumorale soit des traitements potentiellement curatifs. Les gènes identifiés sont soumis à une série de tests sur cellules pour valider leur implication. L'étape finale de validation de l'implication de ces gènes dans l'initiation et la croissance tumorale passe par l'utilisation d'un modèle animal complexe comme la souris.

Bénéfices attendus

L’un des axes de lutte contre le cancer est d’empêcher l’initiation tumorale par des traitements préventifs chez les sujets à risque. En validant l'implication potentielle de gênes dans l'initiaton tumorale, une des retombées de ce projet sera de pouvoir proposer des cibles thérapeutiques pour un traitement préventif contre le cancer du sein. De plus des études ont montré que ces protéines restent à des niveaux élevés au niveau des tumeurs, c'est pourquoi une autre retombée de ce projet serait de proposer également des traitements curatifs en ciblant ces deux protéines lorsque le cancer est bien établi. Enfin avec ce protocole un nouveau modèle expérimental permettant de tester les solutions thérapeutiques sera alors mis au point. Il permettra également de tester l'implication d'autres gènes dans l'initiation tumorale.

Procédures

Les animaux seront soumis à un seul prélèvement sanguin, réalisé sous anesthésie générale. Le prélèvement durera moins de deux minutes entre l'endormissement de l'animal et la fin du prélèvement . Lors de la greffe des cellules dans la glande mammaire les animaux subiront une chirurgie légère. Pour la chirurgie les animaux seront anesthésiés. L'intervention chirurgicale en elle-même durera au maximum 8 minutes, depuis le maintien de l'anesthésie gazeuse au masque jusqu'à la fin de la suture de l'épiderme avec deux points de suture.

Impact sur les animaux

Lors de ce protocole les animaux subiront un stress lors du prélèvement rétro-orbital, lié à l'anesthésie et au prélèvement lui-même. Ce prélèvement pourra causer de la douleur. De plus lors de la greffe orthotopique les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale qui pourra générer du stress. L'incision de la peau et les sutures pourront générer de la douleur. Les deux injections en sous-cutané d'analgésique pourront causer une légère couleur. La greffe de cellules dans la glande mammaire générera potentiellement une gêne. La croissance tumorale au niveau de la glande mammaire pourra entraîner une gêne pour la mobilité de l'animal lorsque la tumeur atteindra sa taille maximale.

Devenir

A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort. Les tumeurs seront collectées pour les analyses mloléculaires. Le sang des animaux sera également prélevé afin d'obtenir du sérum. Les organes des animaux ne présentant pas de tumeurs seront prélevés afin de réaliser une banque de tissu d'animaux d'âge différents.

Remplacement

La recherche de gènes responsables des mécanismes de l'initiation tumorale est importante afin de mieux comprendre l'apparition de la tumeur. Des analyses poussées sur des modèles cellulaires ont pu permettre l'identification de certains de ces gènes. il y a un processus important de validation des résultats in vitro. Reproductibilité des données, tests de transformation en 3D, formation de sphéroïdes en condition de culture non adhérente. Toutefois il est nécessaire pour pouvoir valider les candidats potentiels comme cible thérapeutiques de vérifier si dans un organisme complexe, génétiquement très proche de l’Homme, les cibles se comportent comme attendu par rapport aux observations in vitro.

Réduction

Pour ce protocole le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum. Pour cela une première partie permettra de mettre au point les conditions expérimentales. L'expérimentation sur un modèle sera réalisée en une seule fois afin de minimiser le nombre d'animaux dans les groupes contrôles. Si la mise au point permet de mettre en évidence les conditions expérimentales optimales alors dans une seconde partie l'implication des gènes ciblés dans l'initiation tumorale ainsi que dans la croissance de la tumeur sera étudiée. Sinon le protocole s'arrêtera à la fin de la première partie. Dans la seconde partie des tests moléculaires seront réalisés et la croissance de la tumeur observée. Le nombre d'animaux utilisé dans cette procédure est calculé grâce à un logiciel statistique, en tenant compte des conditions les plus défavorables (% de prise tumorale dans les groupes attendus). Il s'agit bien d'un nombre maximum d'animaux qui pourra être réduit en fonction des observations réalisées pendant la première partie permettant la mise au point du modèle.

Raffinement

Dès leur arrivée dans l’animalerie les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) expérimentateurs de 7 jour(s). Les animaux seront alors pesés une fois par semaine. Cette pesée entre dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Les animaux seront observés lors du change par le personnel animalier et deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs. Une grille de scoring sera alors utilisée afin d’évaluer si les animaux présentent des signes de souffrance ou d’atteinte d’un point limite. Les animaux seront hébergés dans des cages présentant des enrichissements comme du coton de nidation, des batonnets de bois et éventuellement des tunnels.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour les études sur l’animal car le génôme de la souris est très proche de celui de l'Homme. De plus de nombreux modèles ont été développés chez la souris. Pour cette étude un modèle de greffe de cellules dans la glande mammaire de la souris sera mis au point avec deux modèles cellulaires différents. Des souris femelles âgées de 8 semaines (jeunes adultes) seront utilisées afin que les glandes mammaires soient mâtures. De plus cette étude portant sur le cancer du sein, dans lequel le contexte hormonal est important, seules des souris femelles seront greffées.