Oncologie

5 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyées vivantes à l'animalerie des clients ou collaborateurs via un transporteur. Elles arrivent porteuses de tumeurs greffées par des tiers et reçoivent une à dix séances de radiothérapie sous anesthésie gazeuse, l'établissement facturant ces irradiations comme une prestation de service à des sociétés privées ou des collaborateurs. Le porteur affirme qu'aucun effet secondaire n'est attendu de la radiothérapie et que la douleur ne justifie pas d'analgésique, tout en prévoyant la mise à mort des souris qui se dégraderaient. Sur le remplacement, il conclut que l'étude des médicaments ne peut se passer d'un "organisme entier" aux fonctions physiologiques intactes.

Objectifs

L’objectif des projets nécessitant de la radiothérapie (RT) préclinique est de développer l’association de la RT avec des traitements anticancéreux de types chimiothérapie, thérapie ciblée, nano médicaments ou encore immunothérapie. Ces projets nécessitent d’optimiser les schémas d’association (administrations simultanés ou en décallé, et dans ce cas optimiser l'ordre d'administration) et les fractionnements (dose et nombre de séances) optimums de la RT afin de pouvoir proposer en essai clinique des schémas d’associations les plus efficaces. Notre équipe possède un appareil de RT 3D guidée par l’image permettant de délivrer des traitements par RT similaires à ceux délivrés pour les patients. Ce type d’installation et de savoir-faire restent rares sur notre territoire Français et unique dans un rayon de 200km autour de notre établissement. C’est pourquoi des collaborateurs ou sociétés privées, évaluant ce type de combinaisons, font appel à nos services pour délivrer des traitements de RT sur leur souris. Ce projet concerne donc exclusivement le traitement par radiothérapie qui sera délivré pour nos clients ou collaborateur. Ces éances de radiothérapie sont réalisées sur des souris anesthésiés (anesthésie gazeuse) afin d'éviter les mouvements durant le traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer et optimiser de nouvelles combinaisons et sera une base solide pour le développement d’essais cliniques.

Procédures

Les animaux seront traités par Radiothérapie externe (+/- imagerie par scanner pour des technique complexe de radiothérapie), sous anesthésie gazeusev(Isoflurane 2.5%). Ces séances pourront durer entre 5 minutes et 50 minutes selon la technique utilisée. Les animaux pourront recevoir de 1 à 10 séances de radiothérapie.

Impact sur les animaux

Les tumeurs formées par certianstypes de cellules peuvent former des nécroses en surface. En cas d’apparition de nécrose rune évaluation de potentielle de douleur sera réalisée par palpation de la tumeur nécrosée. Aucun effet secondaire ou nuisance dû à la Radiothérapie n’est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront renvoyés à l’animalerie d’origine des collaborateurs / clients à l’issue de la procédure via un transporteur spécialisé.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des médicaments ou des nanoparticules ne peut se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’étude sur animaux. De plus, pour l’étude d’association avec des immunothérapies nécessites l’étude sur des animaux présentant un système immunitaire efficace. Enfin, il est largement décrit dans la littérature que l’effet de la radiothérapie dépend du niveau d’oxygénation (hétérogène uniquement en clinique et sur le modèle animal) et du microenvironnement tumoral composé à la fois de cellules cancéreuses, de cellules immunitaires, de fibroblastes, collagène et vaisseaux sanguins. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour ces études. Toutefois des études préalables de l'activité des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permettront de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT).

Réduction

Les effectifs des animaux qui seront irradiés seront calculés et justifiés dans les DAPs de nos collaborateurs/clients. Ceux-ci seront calculés en fonctions des souches d’animaux utilisés, modèles tumoraux et des efficacités attendues de leurs combinaisons.

Raffinement

La totalité de la procédure expérimentale sera réalisée sous anesthésie isoflurane afin maintenir les animaux immobile et de réduire leur niveau de stress. La douleur associée à cette procédure ne nécessitera donc pas l’emploi d’analgésique. Après une séance de RT, les animaux sont réveillés sous lampe chauffante pour prévenir toute hypothermie puis replacés dans leur cage. Si besoin (cas de traitement par plusieurs séances de RT avec un les animaux pourront être hébergés dans notre animalerie afin de limiter le stress induit par les transports. Sinon les animaux, hébergés dans leur cage d'origine, avec les mêmes congénères, retourneront à l'animalerie des collaborateurs via un transporteur spécialisé, garantissant le maintien d'une tempéraure stable. Le trajet dure entre 5 minutes et 15 minutes. Dans le cas d'un hébergement dans notre animalerie, les souris seront maintenues dans des cages de 8-10 individus en présence d’enrichissement. Aucune toxicité n’est attendue suite à la RT délivrée. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), les animaux seront mis à mort après anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le modèle murin est parfaitement approprié car les expérimentations in vitro ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. En oncologie, la plupart des modèles expérimentaux de cancers humains sont développés chez la souris. Dans le cas d’étude avec de l’immunothérapie, la souris porteuse de tumeurs syngéniques reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire anti-tumoral. La prise tumorale dans des souris avec un fonds génétique stable et homogène permet de travailler avec un nombre d’animaux relativement réduit et de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Les animaux seront utilisés à l’âge déterminé par l’équipe qui greffe les tumeurs (âge dépendant du modèle, de la nécessité ou non d’avoir un système immunitaire mature…)

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées et porteuses d'une tumeur greffée, elles reçoivent des injections sous anesthésie, des prélèvements de sang et des séances d'imagerie, pour tester un composé associant anticorps et anticancéreux dit "théranostique". Le porteur indique qu'une gêne liée à la tumeur, jusqu'à un début de nécrose, est possible. Il affirme qu'aucune méthode alternative, "même les plus complexes", ne remplace ce modèle animal, l'efficacité étant déjà validée in vitro.

Objectifs

Certains composés anticancéreux sont très toxiques et peu solubles : ils sont couplés à des anticorps, spécifiques des tumeurs, afin de faciliter leur accumulation principalement dans la tumeur. Ces composés appelés ADCs (antibody- drug conjugates) peuvent être marqués par un fluorophore afin de suivre en temps réel la substance active : ils deviennent alors des composés dits "théranostiques" (Possédant une activité thérapeutique et un marqueur de monitoring). Dans ce projet, nous souhaitons apporter la preuve de concept d'une nouvelle association anticorps-composé anticancéreux (ou ADC). Nous souhaitons tout d'abord étudier la pharmacocinétique et la distribution de nouveaux ADCs, puis en étudier l'efficacité anti-tumorale et la toxicité globale. Nous projetons de travailler avec un maximum de 4 ADCs différents.

Bénéfices attendus

Selon l'anticorps utilisé, plusieurs types de cancers peuvent être ciblés. Aujourd'hui nous démarrons le projet avec un anticorps ciblant les tumeurs du sein et de l'ovaire. Notre principal objectif est de valider la nouvelle construction chez l'animal car les essais sur cellules sont très favorables. Nous souhaitons obtenir un composé théranostique (thérapeutique et diagnostique), avec une forte activité anti-tumorale et une bonne tolérance générale. Il est crucial d'améliorer la thérapie antitumorale en général, et en particulier dans le cadre des cancers qui métastasent rapidement dans le cerveau comme les tumeurs du sein. Un agent théranostique permet en plus de son activité de valider le ciblage de l'ensemble des lésions.

Procédures

Les animaux seront soumis à des préhensions, des anesthésies et des injections (sous cutanée (x1) et intraveineuse (maximum 3)) sous anesthésie gazeuse. 24 animaux seront soumis à 4 prélèvements de 50 uL de sang sous anesthésie gazeuse. Les imageries seront réalisées sous anesthésie gazeuse : elles durent quelques secondes. L'ensemble de ces gestes a une durée individuelle inférieure à 5 minutes.

Impact sur les animaux

L'immunodéficience des souris pourrait être source de nuisance. Lors des anesthésies, préhensions, injections IV, du stress et/ou des douleurs légères pourraient survenir. Le composé en lui meme pourrait entrainer des nuisances : toutefois la dose choisie sera testée sur un nombre restreint d'animaux (1ere étude d'imagerie), ce qui devrait nous assurer de sa tolérance. Cette dose est, de plus, choisie par rapport à l'état de l'art qui utilise principalement ce dosage (voire des doses supérieures). Une gêne liée à la tumeur en sous cutané pourrait subvenir telle qu'un défaut de marche, ou un début de nécrose, ce qui sera pris en compte dans les points limites.

Devenir

Tous sont anethésiés puis mis à mort en vue du prélèvement et de l'analyse des organes ex vivo.

Remplacement

L'efficacité des composés est déjà validée in vitro sur des cellules qui expriment l'antigène reconnu par l'anticoprs et son inefficacité est démontrée lorsque les cellules n'expriment pas la cible. Pour aller plus proche de la clinique humaine, notre projet étant une investigation thérapeutique et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, et microenvironnement tissulaire, système d'élimination de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.

Réduction

La stratégie de réduction a été réalisée grâce aux études préliminaires in vitro. De plus, nous avons choisi de réaliser les expériences de cinétique sanguine et de biodistribution avec 3 animaux par groupe pour obtenir des résultats fiables et permettre une analyse statistique, tout en limitant le nombre d'animaux utilisé. Chaque composé sera testé individuellement afin de maitriser le nombre d'animaux à gérer; lorsqu'un composé sera validé comme "ADC théranostique pertinent", l'étude sera arrêtée ce qui pourrait réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin d'employer au mieux les animaux, les protocoles présentés ont été optimisés afin d'obtenir le maximum d'informations sans augmenter la douleur infligée aux animaux. La collection d'échantillons post-mortem permettra notamment des études à postériori des organes.

Raffinement

Des mesures de raffinement ont été prises afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse notamment en mettant en place des points limites (mesures de la taille tumorale, état général de l'animal, suivi du poids de l'animal). De plus, toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effectuées sous anesthésie gazeuse, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux sont hébergés par groupe, dans des cages qui comportent des objets permettant de se cacher et de faire des abris (tunels, coton etc). L'ensemble des personnels qui manipulent les animaux ont été formés au respect et au bien être des animaux, ou sont sous surveillance de personnes qui ont été formées. Les souris immunodéprimées étant fragiles, elles sont maintenues dans un environnement protégé (portoir ventilé).

Choix des espèces

Les souris permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ce modèle de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Souris de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale, avant le pic de production de leucocytes NK natural killer à l’âge de 8 semaines.

2304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont inoculées avec des souches du virus de la fièvre de la vallée du Rift, par injection ou par voie nasale sous anesthésie, puis subissent jusqu'à quatre prélèvements de sang, pour comparer la pathogénicité de souches isolées sur le terrain. Le porteur indique que l'infection est "le plus souvent mortelle" et provoque perte de poids, prostration, signes d'encéphalite et convulsions, les souris étant mises à mort dès les premiers signes cliniques. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable" du fait de sa sensibilité au virus.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer la pathogénicité de nouvelles souches de virus de la fièvre de la Vallée du Rift isolées sur le terrain (pays africains) lors de foyers infectieux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'obtenir des indications pertinentes et importantes (différences de sévérité clinique et de virémie - niveau et cinétique) sur le niveau de pathogénicité des nouvelles souches virales isolées, dans un contexte expérimental parfaitement contrôlé, par comparaison avec une ou deux souches de référence. Ces données pourront être confrontées avec des observations de terrain lorsqu'elles seront disponibles.

Procédures

Les souris seront soumises : - à l'inoculation d'une suspension virale soit par injection (une fois, 2 secondes), soit par voie intranasale après anesthésie par injection (une fois, 2 secondes, durée d'anesthésie 20 minutes); - au maximum à 4 prélèvements de sang de faible volume (durée 15 secondes) espacées de 3 jours.

Impact sur les animaux

L'infection par inoculation intrapéritonéale n'engendre qu'une sensation légèrement douloureuse très brève. L'inoculation par voie intranasale est réalisée sous anesthésie générale et n'a aucun impact au réveil de la souris. Les prélèvements de sang entraînent une douleur de piqûre au point de prélèvement qui dure moins de 10 secondes. Les volumes prélevés ont été réduits pour n'entraîner aucun risque d'anémie. La réalisation de ces gestes par un opérateur expérimenté contribue à réduire l'effet indésirable ressenti par les souris. L'inoculation du virus de la fièvre de la Vallée du Rift à des souris de laboratoire induit une infection le plus souvent mortelle. Cliniquement, une perte de poids apparaît au bout de 3-4 jours avant que les souris développent des symptômes sévères (prostration, signes d'encéphalite, convulsions) qui précèdent la mort de quelques heures. Néanmoins, les animaux n'attendront jamais ce stade et seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes cliniques.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort car elles seront infectées par un agent infectieux dangereux pour la santé humaine.

Remplacement

La caractérisation des nouvelles souches virales impose d'établir leur niveau de pathogénicité par comparaison avec des souches de référence. Ce sera fait in vitro sur des cultures de cellules, qui ne permettent toutefois pas de prédire la pathogénicité in vivo (en particulier la répartition du virus entre les organes, qui peut varier d'une souche à l'autre). Le recours à un modèle animal est indispensable et la souris est le plus adapté en raison de sa sensibilité au virus et de la somme de connaissances accumulées sur ce modèle d'infection.

Réduction

Les nombreuses données que nous avons déjà produites au laboratoire nous permettent d'estimer que des groupes de 7 à 10 souris seront nécessaires et suffisants pour obtenir des informations fiables dans des expériences de suivi clinique. L'effectif sera ajusté en fonction des résultats (sévérité clinique et charge virale). Afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser, les expériences seront d'abord réalisées sur des femelles, chez qui l'infection est moins rapide. Seules les doses et souches intéressantes seront ensuite répliquées chez les mâles. De même, une première voie et première dose sera testée en priorité, d'autres doses et voie d'administration ne seront pas systématiquement réalisées

Raffinement

Les souris seront entretenues dans des conditions d'hébergement normales (isolateurs, cages de 5 souris pour les femelles et autant que possible en petits groupes de 2-3 pour les mâles). Les gestes techniques seront réalisés par un opérateur très expérimenté les maîtrisant parfaitement. Les sourisseront suivies chaque jour, puis deux fois par jour après l'apparition des premiers symptômes pour mettre en œuvre des points limites précoces mais qui ne perturbent pas les conclusions des expériences. De l'aliment gélifié sera mis à disposition des souris sur la litière pour les aider à s'alimenter dès observation de difficultés locomotrices.

Choix des espèces

La souris est une espèce adaptée à l'étude du virus de la fièvre de la vallée du Rift en raison de sa sensibilité spontanée et des nombreuses connaissances produites sur ce modèle d'infection. Elle est compatible avec un hébergement en isolateur indispensable compte tenu du niveau de risque associé à ce virus. Nous utiliserons des jeunes adultes (9-12 semaines), âge auquel le modèle d'infection a été validé dans les études antérieures.

Une lignée de souris du syndrome de Wolfram, qui perd la vue et l'audition vers un mois et développe un trouble vestibulaire source d'hyperactivité, est exploitée pour tester cinq composés chimiques fournis par des chimistes. 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs organes. Après un marquage à l'oreille, elles reçoivent des injections quotidiennes dans le péritoine pendant quinze jours, un test de vision éveillées à un mois et deux anesthésies à trois jours d'intervalle pour un test d'audition d'une heure et un test de vision de 30 minutes, des tests que le porteur dit tous "indolores". Le texte justifie des lots de 10 souris par groupe par plus de vingt ans de mesures, sans détailler comment ces groupes aboutissent à 800 souris pour cinq composés.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par des diabètes ,une surdité , une cécité, et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de cette maladie n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur les pertes visuelles et auditives de ce modèle murin de la maladie.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur un modèle murin de la maladie.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - tests fonctionnels d'évaluation de la vision et de l'audition sous anesthésie et sur animal vigile. Chaque animal sera identifié une fois. Les injections quotidiennes en intrapéritonéales seront effectués pendant 15 jours consécutifs. Un test de vision sur animal vigile sera effectué à un mois (test de 30min). Les animaux seront anesthésiés 2 fois, à 3 jours d'intervalle pour les tests d'exploration fonctionnelle (test de surdité, test d'une heure et test de vision, test de 30min).

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Les souris vont développer en plus de la cécité et de la perte d'audition, un trouble vestibulaire qui entraine une hyper activité et qui peut générer un inconfort des souris Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Une feuille de suivi a été mise en place afin de garantir le bien être animal. Les animaux présentant au moins un des points limites seront systématiquement euthanasiés. Les injections en intrapéritonéal n'entrainent généralement pas de complication. Si l'animal présentait une perte de poids importante, ou un mauvais état du pelage, les injections seraient interrompues. Tous nos tests d'explorations fonctionnelles sont indolores.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs organes collectés pour procéder aux analyses permettant la compréhension des mécanismes mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation de modèle murin du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle est le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies rapidement permettant l'élaboration d'un traitement curatif. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Notre expérience de plus de 20 années de mesures fonctionnelles chez la souris (vision et audition), nous montre que des lots de 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour assurer des tests statistiques fiables. Les mêmes lots d'animaux seront utilisés pour des tests de vision et d'audition afin de réduire le nombre total d'animaux, sans impacter sur leur bien être. Enfin les analyses biochimiques et histologiques seront réalisées sur les mêmes animaux.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations sensorielles (vision, audition) et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. L'injection de molécule à tester sera réalisée tous les jours, pendant 2 semaines consécutives. Des tests d'audition et de vision seront réalisés à un mois, age auquel les souris perdent la vision et l'audition, afin d'évaluer l'efficacité de ces molécules sur les pertes neurosensorielles du modèle souris du syndrome de Wolfram.

6620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des flavivirus neurotropes par injection, voie orale ou injection intracrânienne, subissent des biopsies de queue, des prises de sang et des tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour étudier l'influence du fond génétique sur la sensibilité à l'infection. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, apathie et paralysie, et que les animaux sont tués parce qu'infectés par des pathogènes dangereux pour l'humain. Il affirme que ces phénomènes se développent à l'échelle de l'"organisme entier" et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’objectif global de ce projet est d’étudier le rôle de la composition génétique de l’individu dans sa sensibilité à l’infection par les flavivirus neurotropes. En particulier, la survenue de formes sévères de la maladie et l’apparition de troubles neurologiques et comportementaux secondaires à l’infection restent à élucider. Plus spécifiquement, ce projet prévu pour les 5 années à venir, a pour objectif de répondre aux questions scientifiques suivantes : 1. Quels sont les mécanismes responsables des différences de lésions cérébrales induites par l’infection par un flavivirus neurotrope ? 2. Quelles sont les conséquences neurocomportementales de l’infection par un flavivirus neurotrope ? 3. Quelle est la variation de capacité à s’infecter (« infectabilité ») des souris en fonction de la souche de flavivirus ? 4. Quelle est l'influence du fond génétique des souris dans chacune des questions précédentes ? 5. Quels sont les variants génétiques de l’hôte responsables des différences de sensibilité chez la souris ?

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’identifier de nouveaux modèles de souris qui pourront être utiles pour étudier la physiopathologie des infections virales neuroinvasives ou pour le développement de mesures préventives et thérapeutiques. De plus, ce projet permettra de comprendre l’influence de la composition génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection. La caractérisation poussée de l’infection par les flavivirus neurotropes dans des lignées de souris sensibles ou résistantes permettra d’identifier de nouveaux gènes responsables de ces différences de sensibilité et d’infectivité. A plus long terme, ce projet permettra de faire progresser les connaissances fondamentales importantes pour comprendre le développement des infections virales neuroinvasives. Il s'agit d'enjeux majeurs au regard de l’émergence ou la réémergence actuelle des flavivirus en Europe et dans le monde et des conséquences neurologiques dramatiques causées par ces infections.

Procédures

Des biopsies de queue seront effectuées sur certaines souris pour connaitre leur statut génétique, une fois au moment du sevrage pour une durée de quelques secondes. La majeure partie des souris seront infectées avec un flavivirus neurotrope par injection une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec un flavivirus neurotrope par administration orale dans la bouche à l’aide d’une seringue une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec flavivirus neurotrope par une injection intracraniale sous analgésie et anesthésie générale d’une durée de 15 minutes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 8 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. Des tests d’évaluation du comportement non invasifs seront effectués sur certaines souris avec une durée de moins de 40 minutes et au maximum 2 fois par semaine (1 test par séance).

Impact sur les animaux

Le projet s'articule autour de 4 procédures de sévérité modérée. Dans certains cas, l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids faible et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Des souris feront l’objet de tests d’évaluation du comportement non invasifs qui pourront générer un stress limité et transitoire (quelques heures).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront infectés par des pathogènes dangereux pour l’Homme et/ou feront l’objet de prélèvements de tissus post-mortem.

Remplacement

Les phénomènes biologiques que nous devons étudier se développent au niveau de l'organisme entier (développement de l'infection, réponse immunitaire, conséquences neurocomportementales) et imposent donc de recourir à des modèles animaux vivants. De plus, notre expérience sur le virus Zika montre que les résultats obtenus avec des cultures de cellules ne prédisent pas intégralement ce qui se passe dans un organisme entier. Les modèles animaux utilisables sont peu nombreux (primates non-humains, hamsters et souris). Ce projet utilisera des souris car cette espèce permet de réaliser des études génétiques puissantes à l'aide de lignées génétiquement modifiées ou de lignées génétiquement très variées.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure dépendra de la nature des variables et de la question posée. La conception de chaque expérience reposera sur une analyse statistique préalable pour optimiser la nature et l'effectif de chaque groupe, et éviter les biais expérimentaux. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques appropriés. Aussi souvent que nécessaire, il sera fait appel à des experts en biostatistique. L'évaluation de la charge virale dans une lignée ne devrait pas nécessiter plus de 5 souris du même sexe d'après notre expérience avec le virus Zika. L’évaluation du comportement des souris requiert des nombres d’animaux un peu plus grands (10 à 12 souris du même sexe) du fait d’une variabilité intra-groupe plus importante. Ces éléments nous ont permis de calculer les effectifs pour chaque procédure en conciliant réduction du nombre d'animaux et puissance statistique pour conclure. Les analyses incluront des groupes d’animaux des 2 sexes. Certaines expériences feront l'objet de réplication mais uniquement lorsque ce sera nécessaire pour conforter la validité des conclusions. Ceci est mentionné et justifié dans chaque procédure.

Raffinement

Les inoculations et les prélèvements de sang entraînent une douleur passagère et légère qui ne justifie pas d'anesthésie ou d'analgésie. Certaines inoculations seront réalisées sous anesthésie générale et sous analgésie générale. Dans certains cas, l'infection se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Les animaux infectés seront surveillés quotidiennement pendant la période symptomatologique avec plusieurs points limites : i) score clinique sur la base de 5 critères, ii) suivi de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement ou une parésie/paralysie pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire.

Choix des espèces

1. Nous disposons de bons modèles d'infection par les flavivirus neurotropes chez la souris. 2. La souris fait partie des espèces « réservoir » des virus de l’encéphalite à tiques. 3. La souris est la seule espèce permettant de réaliser des analyses génétiques du niveau requis. 4. La dangerosité des flavivirus neurotropes impose d'héberger les animaux en isolateurs, ce qui est facilement réalisable dans cette espèce et beaucoup plus difficile dans d'autres espèces. Pour la plupart des procédures, nous utiliserons des jeunes adultes (5-6 semaines) ou adultes (6-12 semaines) en nous basant sur la littérature et sur notre propre expérience. Nous utiliserons des souris jeunes de 1-3 semaines qui permettront d’étudier les effets de l’infection par les flavivirus neurotropes sur le développement post-natal du cerveau.

7 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que 3 630 d'entre elles seront mises à mort dès le départ parce que leur génotype ne convient pas, les autres subissant un régime gras de douze semaines, des jeûnes, de nombreuses injections et prélèvements sanguins, une chirurgie abdominale et une perfusion intracardiaque. L'objectif déclaré est d'étudier le dialogue entre les macrophages et les nerfs des îlots du pancréas, en conditions normales et de diabète. Il affirme que ce dialogue entre organes ne peut s'étudier que sur des modèles animaux.

Objectifs

Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation de la glycémie. Ces micro-organes ont pour fonction de produire les hormones permettant de réguler la glycémie. Les macrophages jouent une rôle important dans la fonction des ilots. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, leur rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. En particulier, l’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux n’a jamais été étudié. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes d’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces interactions dans la fonction des ilots en condition normal, ainsi que dans trois contextes de stress glycémique: le jeun, l’altération des ilots et le diabète, une maladie caractérisée par une dérégulation de la glycémie. Ce projet se déroulera dans deux établissement utilisateurs.

Bénéfices attendus

Il est aujourd'hui admis que les macrophages jouent un rôle primordial dans la régulation de la glycémie par le gras et le foie. Les macrophages résidant dans les ilots pancréatiques n'ont eux été décrits que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'ils restent encore largement ignorés. L'interaction entre les macrophages et le système nerveux a été montré comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant de part la difficulté d'étudier les macrophages des ilots pancréatiques, cette interaction n'est pas encore décrit dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les interaction macrophage/réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans le stress glycémique.

Procédures

Etablissement utilisateur 1: 1 biopsie de queue, 1 prélèvement de sang à la joue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 jeun (6h ou 16h) , 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésies gazeuses (10min), 1 perfusion intra-cardiaque. Etablissement utilisateur 2: 1 anesthésie gazeuse (2h), 1 chirurgie abdominale (2h).

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. -Chirurgie abdominale : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Prélèvement de sang à la joue : douleur légère. -Biopsie de queue : douleur modérée.

Devenir

Procédure 1 : 3630 souris seront mises à mort car leur génotype ne sera pas utilisable. 2280 souris auront le génpotype requis et seront utlisées dans les procédures 2 à 5. Procédure 2 à 5 : Toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier l'interaction des macrophages avec le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de stress glycémique, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ainsi que des études pilotes avec des petits nombres d’animaux ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.

1 800 poissons sauvages, des truites, blageons et chabots, vont être capturés et utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés vivants. Chaque individu est anesthésié, mesuré, pesé, puis incisé au ventre pour l'implantation manuelle d'un transpondeur, en restant hors de l'eau de trente secondes à une minute. L'objectif déclaré est d'évaluer si une passe à poissons aménagée sur un cours d'eau alpin laisse remonter ces espèces vers leurs zones de reproduction. Le porteur affirme que l'étude comportementale in situ est "indispensable" et sans alternative, et prévoit une mortalité post-opératoire faible ainsi que des pertes de marqueurs.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer la franchissabilité d’une passe à poissons (rampe à plots) aménagée pour rétablir la migration piscicole dans un cours d’eau alpin. La méthodologie proposée implique l’implantation de transpondeur passifs dans des poissons sauvages. Les espèces cibles sont la truite et deux espèces accompagnatrices (blageon et chabot). Le suivi sera réalisé sur deux années minimum pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales. Si le quota d’animaux marqué n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante. Le projet doit permettre d’évaluer scientifiquement le fonctionnement de cet ouvrage piscicole.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en lumière la « transparence » de l’ouvrage à la migration des truites, et des petites espèces accompagnatrices (blageon et chabot), c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer encore davantage la migration piscicole et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles favorables à l’amont, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1800 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des dispositifs de montaison/dévalaison doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière, le blageon et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval de l’ouvrage étudié. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes. A noter également que peu de données existent quant aux comportements et capacité de montaison du blageon et du chabot. On ne peut donc pas se référer à la littérature ni avoir recours à des avis d’expert pour évaluer une franchissabilité théorique : une expérimentation in situ reste indispensable.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Pour le blageon et le chabot, il est difficile de préciser un taux de montaison, ces espèces étant encore trop rarement étudiées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 120 mm à l’aide de tags de 23 mm par exemple). Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un bac oxygéné et refroidi, avant transfert dans un vivier placé dans la rivière.

Choix des espèces

Les espèces cibles sont la truite commune (Salmo trutta), le blageon (Telestes souffia) et le chabot (Cottus gobio). La truite est l’espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. Le blageon et le chabot sont des espèces accompagnatrices de la truite, régulièrement capturées en pêche de sondage au niveau du site d’étude. Ces espèces sont moins bonnes nageuses que la truite et leur étude permet de nuancer l’évaluation de l’efficacité de la rampe à plots. Autrement dit, le franchissement du seuil par ces espèces confirmera le bon fonctionnement du dispositif de franchissement. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués, à l’aide de PIT tags 23 mm. Cette taille minimale assure un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière. Pour les blageons et les chabots, les individus seront marqués avec des tags de 13 mm, la taille minimum de marquage étant alors calée à 80 mm. Pour ces espèces, cette taille correspond à des animaux de 2 ans et plus, considérés comme adultes et reproducteurs. Tout comme la truite, les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime riche en graisse pour reproduire une obésité, elles subissent des mises à jeun de quatorze heures, dix-sept contentions pour quatorze prélèvements sanguins en quatre jours, des administrations orales et des injections, avant un prélèvement de sang et d'organes terminal. Le porteur décrit comme seuls effets attendus le stress lié à l'identification, à l'anesthésie, à la contention et aux prélèvements. Il revendique l'identification des cellules intestinales de l'action de l'insuline comme "essentiel" pour concevoir des stratégies thérapeutiques, retombée formulée au futur.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre l'implication de l'intestin dans le déclenchement des désordres métaboliques associés à l'obésité, grâce à l'utilisation de divers modèles de souris soumises à un régime riche en graisse afin de mimer l'obésité nutritionnelle chez l'Homme. L’intestin, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote, assure entre autres, un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Cette altération de la barrière intestinale a été proposée comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité, cet état inflammatoire favorisant la prise de poids et certains désordres métaboliques associés. L’insuline contrôlant la fonction barrière de l'intestin chez la souris, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action intestinale de l’insuline favorise ou accélère la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, hyperglycémie) chez des souris soumises à un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre l'implication de l'intestin dans le déclenchement des désordres métaboliques associés à l'obésité. Nous espérons montrer que le dévéloppement d'un diabète (perte d'action de l'insuline) entraine une détérioration de la fonction barrière de l'intestin qui favorise ou accélère la prise de poids et l'augmentation de la glycémie. Notre projet identifiera les cellules intestinales impliquées dans l'action de l'insuline, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Identification ( 1 contention de 30 secondes pour 1 prélèvement ), Sur animaux vigiles : 1 mise a jeun de 14h, 1 mise à jeun de 4h, 17 contentions de 30 secondes pour 14 prélèvements de sang (en 4 jours), 1 administration orale de 45 secondes de produit et 2 injections de 45 secondes de produit. Sur animaux anesthésiés : un prélèvement sanguin (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Il y a un stress lors de l'identification, de l’anesthésie, de la contention, des prélèvements sanguins et des injections.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but de mimer certaines caractéristiques de pathologies métaboliques et inflammatoires (obésité/diabète). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique in vitro qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée sous régime et les tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés et l’application des points limites établis.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines à chaque début de procédure. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.