Oncologie

480 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué et une inflammation ou une infection intestinale induite, avec jeûnes prolongés, gavages, injections, prélèvements sanguins et pose d'une pompe sous la peau, pour étudier si la résistance à l'insuline fragilise la barrière intestinale. Le porteur décrit des signes de souffrance possibles, poil hérissé, perte de poids, léthargie, dos courbé, ataxie et tremblements. Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais conclut que la complexité des dialogues entre organes impose le recours à l'animal.

Objectifs

L’intestin est directement en contact avec le bol alimentaire et les bactéries de la flore intestinale. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) la sécrétion d’hormones et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage concomitant de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2 (DT2), les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit indépendemment de l'obésité et de l'hyperglycémie, à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline contribue, indépendemment de l'obésité, à l'hyperperméabilité intestinale et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Sur animaux vigiles : 240 animaux: (1 mise a jeun de 16h, 6 à 7 contentions de 45 secondes pour 1 administration orale de produit, 3 prélèvements de sang (2 caudal de 30 secondes, 1 mandibulaire de 1 minute) et 2 à 3 injections de produit de 45 secondes), 240 animaux : (1 mise à jeun de 4h, 1 mise a jeun de 16h, 7 à 8 contentions de 45 secondes pour 2 administrations orale de produit, 3 prélèvements de sang (2 caudal de 30 secondes, 1 mandibulaire de 1 minute) et 3 à 9 injections de produit de 45 secondes). Sur animaux anesthésiés : 240 animaux (un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)). 240 animaux (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique (20min par souris) et un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)).

Impact sur les animaux

L’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Les souris rendues diabétiques présenteront une augmentation de leur prise hydrique et de leur volume urinaire. Les incisions cutanées chirurgicales peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). Concernant l’induction d’une inflammation intestinale, l’infection par des bactéries pathogènes, ou l’induction d’un diabète, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux issus de souris diabétiques pour démontrer que la résistance à l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests statistiques adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser la réponse des cellules épithéliales intestinales à l'insuline à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas à l’insuline. Cette technique ne nécessite donc aucun traitement chez la souris. Elle permet également à partir d'une seule souris d'étudier plusieurs parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Les souris utilisées seront âgées de 12 à 14 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

498 rongeurs, souris et rats, vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du cartilage leur est implantée sous anesthésie, puis suivie par imagerie, la croissance tumorale pouvant perturber la locomotion et l'accès à la nourriture, pour évaluer deux molécules ciblant les macrophages associés aux tumeurs dans le chondrosarcome. Le porteur situe le bénéfice pour les patients à long terme. Il indique que des essais sur cellules ont déjà été menés mais que la culture cellulaire ne reproduit pas la complexité du tissu tumoral, rendant selon lui l'évaluation animale inévitable.

Objectifs

Le chondrosarcome, ou tumeur maligne du cartilage, représente 20 % des tumeurs malignes osseuses et se place en deuxième position, en termes de fréquence, après l’ostéosarcome. Caractérisé par un microenvironnement peu favorable, le chondrosarcome est radio- et chimio-résistant. Actuellement, le seul traitement efficace est la chirurgie. Dans le cadre d’un nouveau projet de recherche, notre unité s’intéresse à la présence de cellules immunitaires dans le tissu tumoral et plus particulièrement aux « macrophages associés aux tumeurs », ou TAMS qui jouent un rôle important dans le développement de la tumeur et la résistance à la chimiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons évaluer l’intérêt de deux molécules ayant un impact sur les TAMs. Les évaluations seront réalisées dans deux modèles de chondrosarcome chez le rongeur (un chez la souris et un chez le rat).

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra de juger de la pertinence de stratégies thérapeutiques ciblant les macrophages associés aux tumeurs dans la prise en charge du chondrosarcome pour, à plus long terme, améliorer la prise en charge de cette pathologie chez le patient.

Procédures

Induction du modèle d’étude sous anesthésie. La durée de l'intervention dépend du modèle : 3 à 4 minutes d'anesthésie pour le modèle souris et 10 minutes d'anesthésie pour le modèle rat. Les examens d'imagerie permettant de suivre la volume tumirol se dérouleront sous anesthésie. La durée de l'anesthésie dépendra de l'examen et durera entre 10 minutes et 1h30.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait perturber la locomotion ce qui pourrait gêner la prise de nourriture. Des solutions pourront alors être apportées telles qu’un accès facilité à la nourriture et à la boisson. De plus, les injections répétées des traitements pourraient être à l’origine d’un stress chez les animaux. Pour éviter cela, une période d’habituation sera systématiquement réalisée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en vue des analyses histologiques du tissu tumoral.

Remplacement

Des études préliminaires sur cellules ont déjà été réalisées et les résultats semblent prometteurs. Toutefois, la culture cellulaire ne représente pas totalement la complexité du tissu tumoral. Ainsi, une évaluation chez l’animal est donc inévitable pour juger de façon optimale l’effet des molécules étudiées.

Réduction

Du fait de l’hétérogénéité des tumeurs propre à l’expérimentation chez l’animal, un nombre de 6 animaux par stade a été défini pour les analyses histologique. Ce nombre est le nombre d’animaux minimal permettant une analyse statistique puissante. D’autre part, l’imagerie est une méthode qui permet de réaliser un suivi longitudinal sur un même animal ce qui permet une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, hébergement en groupe pour les souris ou par 2 pour les rats, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliqués si besoin.

Choix des espèces

Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale notamment en cancérologie. L’évaluation des molécules sera réalisée sur un modèle souris et un modèle rat. En ce qui concerne le modèle souris. Il s’agit d’une tumeur d’origine humaine implantée sur un animal immunodéprimé. Des études préliminaires ont été réalisées au sein du laboratoire et ont permis de valider la pertinence du modèle. Pour ce qui est du modèle rat, il s’agit d’une tumeur de rat implanté sur un rat. Ce modèle est largement utilisé dans la littérature pour l’étude du chondrosarcome. Concernant les rats, ils seront commandés à 150 g (3-4 semaines) et les souris à 4 semaines afin de permettre le développement tumoral qui est relativement long (3 à 4 semaines chez le rat, jusqu'à 8 semaines chez la souris).

736 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une amputation de l'extrémité de la queue sert au génotypage, puis un virus est injecté sous anesthésie, un régime gras est imposé douze semaines, avec gavages de glucose, injections d'insuline, sept prélèvements de sang à la queue et trois jours d'isolement en cage calorimétrique, pour étudier le rôle d'un dérivé lipidique du foie dans le diabète de type 2. Le porteur situe les retombées au conditionnel, l'identification de possibles cibles thérapeutiques. Il justifie la souris par le fait que l'homme partagerait 95 % de son génome avec elle et que le diabète de type 2 y serait bien reproductible.

Objectifs

Chez les personnes en bonne santé, l'équilibre entre la production du glucose et son utilisation est finement contrôlé. Lorsque la glycémie atteint un seuil critique, les cellules beta pancréatiques sécrètent de l'insuline qui a pour action de diminuer les concentrations circulantes de glucose en facilitant son stockage, principalement dans le muscle squelettique et le foie, tout en inhibant sa production par le foie. En cas d'obésité, lorsque l'action tampon du tissu adipeux pour stocker les acides gras est altérée, les tissus non adipeux comme les cellules musculaires, hépatiques et beta pancréatiques, accumulent des acides gras et cette accumulation conduit à un phénomène appelé lipotoxicité et finalement au diabète de type 2. Au cours de l'obésité, les acides gras ectopiques accumulés dans les tissus non adipeux sont métabolisés sous forme de dérivés de de dérivés lipidiques spécifiques. Alors que le rôle de certains de ces lipides dans le développement du diabète de type 2 est bien établi, l'effet d'autres sphingolipides dérivés des céramides sur la résistance à l'insuline et le diabète de type 2 n’est pas bien caractérisée. Les objectifs du projet sont donc au nombre de deux. la relation d'autres lipides avec la résistance à l'insuline et le diabète de type 2 n’est pas bien caractérisée. Des études ont montré que ces derniers auraient un effet positif ou négatif sur la lipotoxicité selon les tissus. Les objectifs du projet sont donc au nombre de deux. D'une part, il s'agit d'étudier l'impact de la modulation des concentrations de ces lipides sur les tissus périphériques tels que les tissus adipeux, muscles squelettiques, cœur et cellules bêta pancréatiques au niveau métabolique durant l'obésité. D'autre part, nous essaierons de déterminer l'effet de la modulation des concentrations de ces lipides sur les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de l'insulino-résistance dans le diabète de type 2.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’ouvrir de nouvelles perspectives pour lutter contre le développement d’une résistance à l’insuline des tissus périphériques en comprenant mieux les mécanismes intracellulaires mis en jeu en réponse à la modulation de certains dérivés lipidiques hépatiques. Ces informations seront précieuses pour contrôler le développement de l’insulinorésistance dans le foie, et donc le diabète de type 2. Elles pourraient permettre notamment l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, préalable au développement de molécules susceptibles de combattre le diabète de type 2.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux sont pucés dès l’âge d'une semaine et un bout d'extrémité de la queue de moins de 0,5 cm est prélevé entre 7 et 10 jours après la naissance pour génotypage. Une injection intraveineuse d'un virus adénoassocié sous anesthésie durant quelques secondes. La mise en place d’un régime hyperlipidique durant 12 semaines. Un gavage au glucose pour le test de tolérance au glucose sur animal vigil durant quelques secondes. Une injection intrapéritonéale d’insuline pour le test de sensibilité à l'insuline sur animal vigil durant quelques secondes. 7 prélèvements sanguins à la queue de 1 à 10 µL sur animal vigil lors des tests de tolréance au glucose et sensibilité à l'insuline durant quelques secondes. Une injection intrapéritonéale d'un mélange d'anesthésique et analgésique pour anesthésie durant quelques secondes. Un isolement de la souris pour mesures calorimétriques individuelles pendant 3 jours. Un placement en tube de contention pour mesure de la masse corporelle qui dure moins de 2 minutes. Les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires en fonction des besoins expérimentaux.

Impact sur les animaux

Le prelèvement d'un bout d'extrémité de la queue pour génotypage peut entrainer une douleur de courte durée. L'anesthésie gazeuse peut entrainer une perte de chaleur et un stress thermique. La mise à jeun des animaux pendant 4 heures lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent être stressant et entrainer une légère faim. Le gavage de glucose et l’injection intrapéritonéale d’insuline peuvent aussi être stressant à cause de la contention de l'animal. L'injection d'insuline lors du test de tolérance à l'insuline peut induire une douleur de courte durée au niveau de la piqûre de l'aiguille et une hypoglycémie. Le prélèvement du sang à la queue pour mesurer la glycémie des animaux est un geste peu stressant pour l’animal. Une microcoupure de 1mm de l’extrémité de la queue peut entrainer un léger inconfort et une douleur de courte durée. Les mesures de masse grasse et maigre par l'analyseur peuvent entrainer un stress lors de la contention de la souris dans le tube de l'appareil. La mise en cages calorimétriques pour 3 jours afin d’évaluer l’apport alimentaire et hydrique ainsi que la consommation métabolique de O2 et production de CO2 peuvent entrainer un stress à cause de l'isolement d'une souris par cage.

Devenir

A l’issue des différents actes, les animaux seront euthanasiés par deux méthodes réglementaires différentes en fonction des analyses à réaliser sur les organes/prélèvements.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les conséquences métaboliques d’une modulation de la concentration hépatique d'un dérivé lipidique chez la souris. Il s’agit d’un projet de physiologie intégré dans lequel tous les organes de régulation de l’homéostasie glucidique sont impliqués. C’est la raison pour laquelle le modèle de souris a été privilégié. Il serait difficile de mener à bien ce projet en utilisant qu’un seul modèle cellulaire car nous pensons que la modulation de la concentration hépatique du dérivé lipidique aura des conséquences intrahépatiques, mais sûrement aussi sur le métabolisme lipidique et glucidique d’autres tissus périphériques tels que les muscles squelettiques, les cellules beta pancréatiques et les tissus adipeux.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique, nous avons utilisé un programme informatique pour calculer le nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Nous nous sommes basés sur des résultats obtenus précédemment sur la mesure des variables. De plus, nous utiliserons un test statistique adapté à notre étude pour déterminer si des différences existent entre les groupes des animaux après traitement ou régime. Nous utiliserons 736 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Pour atténuer le stress de la manipulation des souris dans le temps, le même expérimentateur effectue toutes leurs pesées régulières afin que les souris soient familiarisées au même expérimentateur. Quand vient l’heure des injections, nous gardons les animaux dans un environnement calme avec le minimum de personne dans la pièce pour éviter tout stress additionnel et inutile aux souris. Si un animal reste prostré dans sa cage pendant 48h maximum, ou montre une anomalie importante de la qualité du poil on ne le laisse pas souffrir et il est euthanasié. Les animaux sont observés tous les jours, y compris le week-end. Une grille de suivi sera mise en place avec comme contrôle une pesée hebdomadaire des animaux. Pour une souris sous régime normal, une perte de poids de 20 pour cent entre 2 suivis hebdomadaires consécutifs sera considérée comme point limite et entrainera l’euthanasie de la souris. Idem, pour une souris sous régime gras, une perte de poids de 20 pour cent entre 2 suivis hebdomadaires consécutifs sera considérée comme point limite et entrainera l’euthanasie de la souris. L'injection de virus adénoassocié est réalisée sous anesthésie et analgésie. Durant toute anesthésie, les animaux seront gardés sous une lampe chauffante pour éviter toute perte de chaleur. Des protocoles d’enrichissement de l’environnement de l’animal sont mis en place avec notamment la présence de nids végétaux et de tunnels.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris C57B6J génétiquement modifiées de 6 semaines, âge où les animaux sont sevrés et pubères et sont dans les conditions métaboliques stables. Le fait que l’homme partage 95 pour cent de son génome avec celui de la souris valide l’utilisation de cet animal. De plus, le diabète de type 2 est une pathologie humaine bien reproductible chez la souris.

Toutes tuées à l'issue pour des analyses de leurs tissus et organes, 1 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une prise de sang par ponction sous anesthésie générale, une injection de cellules tumorales et jusqu'à cinq injections de traitement sous anesthésie locale, certaines deux gavages, et une partie d'entre elles une irradiation localisée à faible dose sous anesthésie générale, que le porteur dit sans "nuisance". L'hypothèse vient d'un essai clinique de l'équipe associant radiothérapie et immunothérapie, où les patients dont l'intestin avait reçu une irradiation non voulue comptaient davantage de survivants à long terme, et le projet cherche chez la souris si cette irradiation renforce l'immunothérapie en modifiant le microbiote intestinal. Pour le choix de l'espèce, le porteur décrit les souris comme "génétiquement proches de l'Homme" et de "parfaits organismes-modèles", du fait de "leur petite taille, leur reproduction rapide et leur espérance de vie" plus courte.

Objectifs

Les principales méthodes de traitement du cancer sont la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie et l'immunothérapie. La radiothérapie tue les cellules cancéreuses en provoquant directement des dommages définitifs à l'ADN. Elle peut également déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale. La combinaison de la radiothérapie et de d'une immunothérapie pourrait donc avoir un effet antitumoral synergique. Cette nouvelle combinaison thérapeutique a d'abord été testée dans des modèles précliniques, puis validée dans quelques essais pionniers chez l'Homme avec des résultats prometteurs. Depuis, des centaines d'essais ont été lancés pour examiner cette combinaison thérapeutique dans divers cancers. Toutefois, il convient de noter que seuls 10 à 30 % des patients participant à ces essais ont présenté une réponse objective à ce traitement. Les mécanismes qui sous-tendent la résistance des patients au traitement restent insaisissables. De nouvelles stratégies sont nécessaires pour améliorer les résultats pour les patients. Nous avons mené un essai clinique de phase II pour évaluer l'efficacité thérapeutique d'un type de radiothérapie en combinaison avec l'immunothérapie dans le cancer métastatique. Le suivi à long terme suggère qu'environ 20 % des patients bénéficient du traitement avec une survie globale supérieure à 24 mois. L'objectif du projet est de tenter de déterminer les mécanismes de résistance mis en cause et d'améliorer la proportion de patients répondant bien au traitement.

Bénéfices attendus

L'étude de l'ADN des échantillons fécaux des patients traités indique que les répondeurs sont associés à un enrichissement de l'abondance des espèces bactériennes immunogènes. En outre, la moitié des patients recrutés dans cet essai ont subi une exposition hors cible de la zone intestinale à l'irradiation lorsque l'irradiation a été administrée à des métastases hépatiques. Il est frappant de constater que le nombre de patients ayant une survie à long terme est plus élevé dans le sous-groupe des patients ayant subi une irradiation non voulue que dans le sous-groupe des patients n'en ayant pas subi (38 % contre 5). Notre hypothèse est que cette irradiation pourrait stimuler la réponse des patients à l'immunothérapie en modulant la composition du microbiote intestinal. L'étude de cette irradiation pourrait fournir des indications importantes sur le traitement personnalisé du cancer et ouvrir la voie à de nouvelles thérapies. Nous nous attendons à trouver que la combinaison de cette irradiation et une immunothérapie conduisent à un effet synergique sur le contrôle de la tumeur. Cette étude fournira donc des informations importantes sur le traitement individualisé du cancer pour les patients et aidera à développer de nouvelles thérapies pour améliorer leurs résultats.

Procédures

Nous prélèverons le sang des souris par ponction (1 fois) sous anesthésie générale, durée une minute. Les souris recevront également une injection de cellules tumorales (1 fois, durée une minute), les souris recevront jusqu'à 5 injections pour traitement (durée 1 minute), sous anesthésie locale. Certains animaux auront des administrations par gavage (n=2), durée 1 minute. Les souris recevront une irradiation localisée sous anesthésie générale (durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans certaines procédures les souris seront irradiées localement à faible dose. L'irradation limitée et localisée n'induit pas de nuisance. L'implantation tumorale (1 fois) par injection sous anesthésie locale entraîne une douleur légère et transitoire. Les traitements peuvent entraîner des pertes de poids (assez rare, car selon nos études précédentes, il n'y a pas eu de perte de poids notable). Les administrations orales entraînent une contrainte transitoire de courte durée due à la préhension et au geste lui même.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Il n'y a pas de modèle de remplacement, car il est impossible de récapituler et reproduire toutes les interactions immunologiques dans l'organisme in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un cadre de cancer du colon, avec toutes les interactions nécessaires notamment les effets de l'irradiation sur la partie intestinale, impossible à reproduire in vitro. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet de l'administration orale d'un composé sur différents organes, sur l'expression de gènes et protéines mais surtout sur la migration de cellules immunitaires entre ces différents organes.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D Après un calcul de puissance, nous avons pu déterminer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. Les tests statistiques utilisés pour suivre la croissance tumorale et la survie des animaux ont été préalablement définis. Au vu du nombre d'animaux utilisé par groupe, des tests statistiques non paramétriques seront utilisés.Les concentrations de traitements ont déjà été établies par notre laboratoire et sont donc optimisés pour réduire au maximum les animaux en procédure.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis quotidiennement pour effectuer un examen clinique et observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement adéquat. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

Les souris comme les humains font partie des Mammifères, ce qui les rend génétiquement proches de l’Homme. De plus, leur petite taille, leur reproduction rapide et leur espérance de vie étant plus petite, font d'elles de parfaits organismes-modèles. Les modèles tumoraux existants sont issus de lignées cellulaires murines et plus particulièrement avec un fond génétique utilisé. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, c'est à partir de cet âge, qu'elles sont catégorisées comme adulte et donc ayant un métabolisme fonctionnel et une immunité normale.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie développe un diabète, et chaque animal reçoit jusqu'à 112 injections d'un composé, des contrôles de glycémie et un test de tolérance au glucose avec cinq heures de jeûne et six prélèvements à la queue, avant d'être tué pour examiner le pancréas, pour tester cinq variantes d'un composé censé régénérer les cellules bêta. Le porteur décrit un inconfort modéré lié aux piqûres, aux prélèvements et au jeûne, et un diabète qu'il annonce sans souffrance particulière. Il affirme que le diabète s'exprime à l'échelle de l'organisme entier et que son étude "ne peut être remplacée".

Objectifs

Le pancréas joue un rôle clef dans le maintien du taux de sucre sanguin. Cet organe contient de nombreux types cellulaires dont les cellules bêta sécrétant de l'insuline, une hormone permettant de diminuer le taux de sucre sanguin en cas d'apport sucré. Notre recherche se concentre sur le diabète de type 1, une maladie qui se caractérise par la perte sélective de cellules bêta. Sans traitement, cette maladie peut avoir de graves conséquences telles que des dommages vasculaires, des risques de cécité, d’amputation, ou même la mort. Les traitements actuels consistent en l’injection d'insuline pour compenser la déficience en cette hormone. Cependant, des facteurs environnementaux (l'alimentation, l’âge, le stress, etc...) peuvent provoquer de fortes variations des niveaux de glucose sanguin, malgré un traitement à l'insuline, et donc éventuellement conduire aux complications présentées précédemment. Dans le but de pallier aux limitations des thérapies actuelles, nous nous intéressons à la régénération des cellules bêta. Nous avons ainsi récemment identifié un composé pharmacologique capable d'induire la régénération des cellules bêta pancréatiques. Le but de notre projet est donc de tester 5 différentes variations de ce composé (visant à le rendre encore plus efficace) dans un modèle de diabète. Nous utiliserons 600 souris afin d’évaluer et comparer les capacités de ces composés à contrer un diabète. Une attention particulière est portée sur l’application stricte de la règle des 3R.

Bénéfices attendus

Le but de ces travaux est de démontrer une activité accrue de l’une (ou plusieurs) de nos protéines afin d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques et ainsi contrer les effets de la perte des cellules beta pancréatiques. il s’agit donc de travaux dont la finalité est le traitement thérapeutique du diabète.

Procédures

Les animaux recevront des injections quotidiennes ou hebdomadaires de protéines (le nombre total d’injections intrapéritonéales reçues par les animaux sera au maximum de 112 pour les seuls traitements, chaque injection durant une dizaine de secondes). Des prélèvements sont prévus pour suivre la glycémie des animaux (1 fois par semaine, 1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures de glycémie) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont un inconfort modéré dû aux piqures, aux prélèvements et à la mise à jeun de 5 h. Une partie des animaux développeront un diabète modéré n’entrainant pas de souffrance particulière.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour examen post-mortem des organes et du pancréas en particulier.

Remplacement

Le diabète est une maladie complexe. C'est une pathologie qui s’exprime à l’échelle d’un organisme et qui fait intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose (la plupart donc). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques nous a permis de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables et sans prévoir de répétition des expériences.

Raffinement

Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en oeuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé ou la souffrance des animaux seront observés selon des grilles d'évaluation. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi (maisonettes et buchettes), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le diabète est une maladie d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Les souris utilisées ici représentent un modèle de choix pour nos travaux visant à contrer un diabète : il est en effet très difficile de trouver une autre espèce animale développant un diabète provenant d'une attaque des cellules beta pancréatiques. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines, cet interval d'âges correspondant à une période sans diabète. Nous souhaitons en effet initier nos traitements avant l'apparition du diabète (et ainsi contrer son développement).

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit cinq injections d'une protéine de microsporidie avec adjuvant de Freund, avant d'être tué par prélèvement cardiaque sous anesthésie pour récupérer tout son sang, afin de produire des anticorps servant à détecter ces parasites dans l'eau ou les aliments. Le porteur signale que l'adjuvant peut provoquer une inflammation au point d'injection et, dans de rares cas, des ulcérations et des abcès. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'est "aussi fiable" que la production d'anticorps chez l'animal et écarte les approches in vitro faute de compétences et d'équipement.

Objectifs

Les microsporidies sont des champignons se développant dans les cellules de leur hôte. Chez l’Homme, elles peuvent causer divers syndromes, dont notamment des troubles digestifs responsables de diarrhées aqueuses profuses, qui évolueront vers la chronicité voire la mort chez les sujets ayant un système immunitaire affaibli. La contamination se fait essentiellement par voie orale lors de l’ingestion d’eau ou d’aliments souillés par des microsporidies. Les quantités de microsporidies dans les prélèvements, en particulier environnementaux (aliments, stations d’épuration), sont souvent faibles ce qui est problématique pour les études épidémiologiques. Nous souhaitons développer une méthode d’enrichissement/purification par l’utilisation de billes magnétiques recouvertes d’anticorps dirigés contre des protéines présentes à la surface des microsporidies. Ainsi les anticorps permettront la capture des microsporidies, puis par l’intermédiaire d’un aimant, les billes magnétiques préalablement fixées aux anticorps seront récupérées, permettant ainsi la purification des microsporidies. Pour mener ce projet, nous avons donc besoin de produire des anticorps dirigés contre les microsporidies. Des protéines de surface des microsporidies ont été reproduites en amont, elles seront injectées à des souris, qui vont alors s’immuniser contre ces protéines étrangères. En effet, des anticorps sont produits par le système immunitaire des animaux vertébrés en réponse à l’entrée d’un antigène dans l’organisme de l’animal. Ils sont libérés dans le sang de l’animal à partir duquel ils sont facilement purifiables pour obtenir des anticorps dits polyclonaux, c’est-à-dire un mélange d’anticorps dirigés contre plusieurs fractions de la protéine d’intérêt. La production d’anticorps polyclonaux implique donc l’injection répétée de la protéine d’intérêt à un animal, puis la récupération de la totalité du sang lors du sacrifice de l’animal. Ce projet d’une durée de 5 ans, utilisera un maximum de 150 souris. A notre connaissance, aucune méthode alternative et aussi fiable que la production d’anticorps polyclonaux chez l’animal n’est disponible. Comparés aux anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux (dirigés contre une seule fraction de la protéine d’intérêt) sont très spécifiques, mais également moins sensibles et ne peuvent donc pas répondre à notre objectif final qui est de capturer dans une matrice complexe des microsporidies présentent en faible quantité.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux obtenus grâce à ce projet devraient nous permettre d’enrichir et purifier les spores de microsporidies présentes dans différentes matrices. En effet, la charge en microsporidies est souvent très faible. Dans l’exemple d’une station d’épuration, cela permettra de déterminer si les eaux d’entrée et de sortie de station sont positives, et si oui, d’identifier les génotypes présents grâce à des outils de séquençage et d’établir une surveillance de la circulation des microsporidies. Dans l’exemple des aliments, en cas d’épidémie suspectée dans la population, il sera possible de tester différents aliments, pour identifier celui responsable de l’épidémie. Ainsi de nombreuses applications pourront découler de la mise au point de cet outil d’immunocapture.

Procédures

Manipulation des animaux lors de l’identification par micro-tatouage à la phalange à l’aide d’une seringue hypodermique. Manipulation des animaux lors de l’injection intra-péritonéale : contention et injection. Ces 2 interventions prennent en moyenne moins de 5 minutes par animal. Les animaux seront soumis à 5 injections sur la durée du projet. Manipulation des animaux lors de la mise en boîte à induction pour la réalisation de l'anesthésie gazeuse. Anesthésie gazeuse, puis prélèvement cardiaque sur animaux endormis, avant euthanasie de ces derniers. Ces interventions prennent en moyenne 10 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Une inflammation liée à l'adjuvant de Freund peut survenir au site d'injection, et des lésions, de type ulcération et abcès, peuvent apparaître dans de très rares cas. Certains animaux peuvent avoir une modification de leur activité, et de leur aspect physique (pelage terne ou hirsute).

Devenir

A l'issue de l'expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer la totalité du sang et donc les anticorps produits.

Remplacement

Pour pouvoir réaliser des expériences d’immunocapture, nous avons besoin de sondes ayant une forte spécificité et une bonne affinité envers nos protéines cibles. Les anticorps permettent de répondre à ces exigences. Nous ciblons des protéines spécifiques des agents pathogènes étudiés pour lesquelles aucun anticorps n'est disponible dans le commerce. Les alternatives non animales seraient de produire des anticorps monoclonaux selon une approche de fabrication d’anticorps synthétiques d’emblée (anticorps sources) par la technique de phage display. Cette technique nécessite un travail secondaire in vitro pour améliorer la spécificité et la sélectivité. Il est aussi à noter qu’il peut être plus difficile d’obtenir des anticorps synthétiques contre des protéines dénaturées, or nos protéines que nous avons produites étant très peu solubles, nous sommes contraints de les extraire en condition dénaturantes. Une autre alternative animale serait la production d’anticorps monoclonaux in vitro, où la production d’anticorps sources se fait par immunisation d’animaux. La sélection des anticorps puis leur production en culture in vitro est une procédure complexe pour laquelle nous n’avons pas les compétences et les équipements. De plus comme précisé précédemment, les anticorps monoclonaux sont peu adaptés pour notre projet. Comparés aux anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux sont très spécifiques, mais également moins sensibles et ne peuvent donc pas répondre à notre objectif final qui est de capturer dans une matrice complexe des microsporidies présentent en faible quantité.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux, il est prévu d'immuniser 2 animaux par antigène étudié, ce qui permet d’obtenir un volume de sérum suffisant. Si les sérums des animaux immunisés ne sont pas spécifiques de l'antigène étudié, une purification des immunoglobulines sera réalisée. Une deuxième série d'immunisation contre le même antigène sera envisagée si les anticorps ne détectent pas l'antigène même après purification. Si des anticorps produits chez le 2ème couple d’animaux venaient également à ne pas répondre à l'antigène, l'étude portant sur cet antigène sera définitivement abandonnée. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux générés, nous utiliserons autant que possible des animaux sur-numéraires provenant de reproductions issues d’un autre protocole apafis obtenu au laboratoire et ces souris sont de fond génétique C57BL6/J.

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux, ceux-ci seront acclimatés deux semaines dans l'animalerie avant le début des expérimentations. Ils seront hébergés selon les normes en vigueur. Ils seront hébergés par groupe de 4 avec un enrichissement de leur environnement (maison en plastique). Une surveillance des animaux sera réalisée quotidiennement. Les animaux présentant une modification de comportement, d'aspect physique ou de poids seront euthanasiés afin d'éviter toute souffrance, Une liste de points limites sera à vérifier quotidiennement. Les injections seront réalisées alternativement sur les côtés gauche et droit de l’animal afin de limiter l’apparition de lésions au site d’injection.

Choix des espèces

Deux raisons principales nous ont amenés à choisir la souris pour cette production d'anticorps. 1- les anticorps polyclonaux que nous envisageons de produire seront utilisés exclusivement à des fins de recherche pour des expériences (expériences d'immunolocalisation, d’immunocapture, mise au point d’ELISA) qui nécessitent de faibles volumes d’anticorps ; 2- les antigènes proviennent d'espèces éloignées phylogénétiquement de la souris, ce qui limite les risques de réactions croisées et la non validité des anticorps obtenus. De plus, aucune approche in vitro ne permet de produire des anticorps polyclonaux même s'il est possible en théorie, de créer des préparations "polyclonales" par mélange d'anticorps monoclonaux, eux-mêmes d'origine synthétique, mais ces mélanges (parfois appelés "multiclonaux") ne reprennent jamais la totalité des performances des anticorps polyclonaux. Nous utiliserons des animaux nés à l'animalerie. A l'âge de 6-8 semaines, la première injection sera réalisée. Ainsi les 4 rappels seront réalisés entre 8-10 et 11-13 semaines. Cela nous permet de travailler sur des souris jeunes adultes qui ont une réponse immune suffisamment développée et qui ne sont pas encore (trop) affectées par des challenges immuns. De plus, la robustesse de la réponse immune diminue avec l'âge après le début de l'âge adulte.

100 souris mâles adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue selon la déclaration, le texte prévoyant le prélèvement de leur prostate pour analyse. Toutes reçoivent pendant cinq jours des injections dans l'abdomen pour provoquer des lésions précancéreuses de la prostate, et 40 d'entre elles reçoivent en outre deux semaines d'injections quotidiennes d'une molécule active ou de son adjuvant. L'équipe veut mesurer l'effet d'une inhibition simultanée des facteurs Hif1a et p53 sur l'évolution de ces lésions vers des tumeurs invasives. Le porteur écrit que les lésions "restent indolores jusqu'à 5 mois après injection du premier composé" et n'attend pas d'effets indésirables du second, "décrit comme bien toléré dans la littérature", sans nommer aucun des deux produits ni dire combien de temps les souris vivent avec ces lésions.

Objectifs

Le cancer de la prostate est la 3ème cause de mortalité par cancer chez l'homme. Dès lors qu'il est invasif, il conduit inévitablément au décès du patient par échappement aux traitements. Notre laboratoire s'intéresse aux mécanismes de progréssion des lésions précancéreuses indolores et benignes vers les tumeurs invasives et agressives. Nous avons auparavant identifié le Hif1a (facteur inductible par l'hypoxie 1 alpha) comme facteur qui promeut la plasticité de cellules épithéliales de lésions précancéreuses prostatiques en les protégeant contre la mort cellulaire. En parallèle, nous avons démontré le rôle protecteur de la protéine p53 contre la plasticité de ces cellules. Par ailleurs, les intéractions entre ces deux facteurs ont été décrites dans les systèmes cellulaires dans la littérature et indiquent que les deux facteurs pourraient intéragir pour contrôler l'agressivité des cellules cancéreuses, mais aucune étude in vivo n'a été conduite dans le cas du cancer de la prostate. Dans ce projet, nous voudrions évaluer l'impact de l'inhibition simultanée de Hif1a et de p53.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les intéractions entre les facteurs clefs contrôlant la survie, la sénescence et éventuellement l'agressivité des cellules précancéreuses prostatiques. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la tumorigénèse ouvre des perspectives thérapeutiques et diagnostiques et ainsi, une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Tous les animaux de ce projet (100) seront sujets à des traitements par des injections au niveau de l'abdomen pendant 5 jours pour induire l'apparition de lésions précancéreuses prostatiques. Cette procédure prend 10 secondes comprenant la préhension de la souris et l'injection en elle-même. Une partie d'animaux sera soumise à un traitement pharmacologique (40) soit avec la molécule active, soit avec son adjuvant. Ces solutions seront également administrées par des injections au niveau de l'abdomen, le traitement durera deux semaines avec les injections quotidiennes. La procédure prendra 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Les lésions précancéreuses restent indolores jusqu'à 5 mois après injection du premier composé, nous ne nous attendons donc pas à une agressivité et donc une douleur. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables suite au second traitement, car le composé a été décrit comme bien toléré dans la littérature et a été utilisé pour des traitements plus longs que ceux prévus dans notre étude.

Devenir

Une fois les procédures terminées, les prostates des animaux seront prélevées pour les analyses ultérieures.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique de la transition cancéreuse ni la complexité cellulaire impliquée dans l'évolution des lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences dans les modèles animaux pour comprendre ce phénomène et en disséquer les méchanismes moléculaires.

Réduction

Etant donné la variablité inter-individuelle observée dans nos études précédentes, nous avons estimé que 10 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement. Ainsi, nous avons prévu les groupes de souris de sorte à avoir 10 souris par analyse effectué pour le groupe expérimental donné. Nous allons profiter des données obtenues précédemment dans le laboratoire sur d'autres modèles murins pour effectuer les comparaisons et reduire le nombre de nouvelles souris utilisées.

Raffinement

Tout le long des traitements par injections intra-péritonéales, la souris sera surveillée afin de détecter les irritations ou l'inflammation du site d'injection. De plus, les injections seront réalisées en altérnant les côtés d'injection. Les souris seront surveillées quotidiennement, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Elles seront également pésées quotidiennement pendant les traitements. Tout animal en souffrance sans possibilité de soulagement sera sorti de l'étude. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l'animalerie et/ou les chercheurs.

Choix des espèces

Nos modèles de souris récapitulent de manière fidèle l'apparition et l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques chez l'homme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'effet d'un traitement et que le microenvironnement tumoral joue le rôle clé dans l'évolution des lésions, nous sommes dans l'impossibilité d'utiliser les systèmes cellulaires qui ne récapitulent pas la complexité d'un tissu. Seuls les souris mâles adultes seront utilisés pour ce projet car l'induction de lésions précancéreuses doit se faire sur des prostates matures et donc après la puberté.