Oncologie

110 souris vont être utilisées, chacune passant deux heures sous une même anesthésie gazeuse pour une IRM d'environ 1 h 15, une échographie de 30 minutes et 15 minutes de mesures de pression au moyen d'un capteur en forme d'aiguille introduit au centre de sa tumeur. Auparavant, chaque souris reçoit sous anesthésie une injection de cellules de tumeur du sein ou du pancréas sous la peau du flanc, puis porte cette tumeur deux à trois semaines, avec une gêne et une perte de poids possibles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées après l'examen, et leur tumeur est disséquée pour comparer sa composition au microscope aux mesures d'imagerie. Le porteur présente le but comme une méthode "sans douleur qui pourrait prédire la sévérité d'un cancer" chez les patients, et la met au point en introduisant dans la tumeur de chaque souris le capteur qui sert de mesure de référence.

Objectifs

Les tumeurs solides sont principalement composées de cellules et d'autres éléments comme les fibres de collagène, qui affectent leurs caractéristiques physiques. Certaines caractéristiques sont connues pour rendre la tumeur plus sévère et plus résistante aux traitements médicaux. Parmi ces propriétés, seule la dureté de la tumeur peut actuellement être mesurée de manière précise et non invasive en imagerie. Il est alors intéressant de développer des techniques pouvant mesurer les autres caractéristiques tumorales, pour évaluer la sévérité tumorale de manière plus précise. La technique envisagée dans ce projet est l’élastographie par imagerie par résonance magnétique (IRM) sous compression. L’élastographie est la mesure des propriétés mécaniques du tissu comme l’élasticité, la dureté, etc… On utilise un dispositif vibrant pour générer des ondes à travers le tissu d’intérêt. Pour acquérir l’image de ces ondes qui se déplacent, on peut utiliser l’IRM (dont les images sont créées grâce à des champs magnétiques) ou l’échographie (dont les images sont créées grâce à des ultrasons). On peut également mesurer des propriétés plus complexes en réalisant un examen d’élastographie sous compression, c’est-à-dire en appuyant de manière continue sur le tissu pendant l’examen d’imagerie. Des études utilisant l’élastographie échographique sous compression ont été menées sur le foie en dehors du corps et ont montré que ces propriétés étaient liées à la manière dont sont organisées les fibres à l’intérieur du cancer, ce qui affecte sa sévérité. Le but de ce projet est de transposer cette méthode développée avec les ultrasons vers l’IRM. Ce type d’imagerie informe sur un volume entier, ce que ne fait pas l’échographie. Il y aura ainsi une information complémentaire et une meilleure précision dans les mesures. Cette nouvelle technique sera appliquée sur des tumeurs implantées chez la souris, avec deux modèles différents : des tumeurs du sein et des tumeurs du pancréas. Les valeurs obtenues seront ensuite comparées à des données provenant de la microscopie pour valider l’utilisation de cette méthode pour déterminer l’organisation des tissus et la sévérité de la tumeur. La validation de la méthode sera d’autant plus assurée que ces deux modèles possèdent des compositions et des propriétés physiques différentes. Cela permettra d’offrir une méthode sans douleur qui pourrait prédire la sévérité d’un cancer et adapter ensuite le traitement donné au patient.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’approfondir les connaissances fondamentales relatives aux propriétés mécaniques du cancer. En particulier, l’objectif est d’obtenir des marqueurs non-invasifs d’imagerie pouvant indiquer la sévérité tumorale qui est liée à la fois à la composition de la tumeur et à sa pression. Cette étude pourra notamment permettre de définir de nouvelles méthodes d’imagerie afin d’aider le clinicien dans le diagnostic du cancer et, également, adapter le traitement aux caractéristiques de la tumeur.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux seront anesthésiés pour une injection unique des cellules tumorales en sous-cutané dans le flanc. Cet acte aura une durée totale de 10 min par animal. Les animaux seront observés de manière bihebdomadaire pendant la croissance tumorale. Une fois que la tumeur aura atteint une taille suffisante (environ 2 à 3 semaines après l’injection des cellules), un examen complet sera effectué. Il comprendra un examen d’imagerie IRM, un examen d’imagerie échographie et une mesure de la pression tumorale, tous réalisés au sein d’une même anesthésie gazeuse. Pour la mesure de la pression tumorale, un capteur de pression ressemblant à une aiguille sera introduit au centre de la tumeur pour obtenir des mesures de pression qui seront comparées avec les mesures d’imagerie. Cette comparaison permettra de valider l’intérêt de l’imagerie IRM et échographie comme méthode de mesure de pression non-invasive. Au total, cette intervention aura une durée de 2h pour chaque animal, avec environ 1h15 d’acquisition d’images IRM, 30 min d’acquisition échographique et 15 min de mesures de pression.

Impact sur les animaux

Des cellules tumorales seront injectées dans le flanc droit de l’animal, ce qui peut occasionner un stress ou une légère douleur au point d’injection. La croissance tumorale peut engendrer une gêne, voire une perte de poids pour l’animal. Cette perte de poids sera en revanche limitée, car surveillée deux fois par semaine. De plus, la taille de la tumeur ne devrait pas excéder les 1000 mm3, ce qui limite de potentiels effets indésirables sur la mobilité de l’animal. Le fait d’être maintenu immobile pour l’imagerie et passer à l’intérieur d’un tunnel d’IRM avec un diamètre réduit peut être une source de stress pour l’animal. Cependant, les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress que l’examen peut engendrer. L’animal est surveillé et maintenu au chaud quand il est sous anesthésie, et la durée est limitée le plus possible, pour éviter d’éventuels effets indésirables de l’anesthésie tels que l’hypothermie (refroidissement de l'animal) et la diminution du rythme respiratoire.

Devenir

A la suite de l’examen complet (imageries et mesure de pression), les animaux seront euthanasiés et la lésion tumorale sera disséquée. Des analyses d’histologie seront réalisées pour obtenir des informations sur la composition tumorale. Ces analyses consistent en des coupes fines de la tumeur qui seront passées au microscope pour quantifier les éléments (cellules, fibres de collagène) qui composent la tumeur. Ces données seront corrélées avec les mesures obtenues en imagerie.

Remplacement

A notre connaissance, il n’y a pas d’alternatives en dehors d'un système vivant (construction de cellules ou morceaux de tumeurs) ou de modélisation numérique qui ont été validées et qui peuvent être utilisées comme solution de remplacement. Afin de valider l’imagerie comme solution non-invasive de mesure de la pression tumorale, les mesures doivent être effectuées sur des modèles animaux afin de reproduire l’environnement hétérogène et les propriétés tumorales qui pourront être retrouvés en clinique chez les patients atteints de lésions tumorales.

Réduction

Les dispositifs d’imagerie utilisés dans ce projet ont déjà été validés en amont, ce qui évite d’avoir une phase de test et de validation sur petit animal. Le nombre d’animaux par groupe a été défini selon des données obtenues précédemment et les données de la littérature.

Raffinement

En plus du suivi quotidien standard, un suivi clinique aura lieu deux fois par semaine : l’état de l’animal sera noté à l'aide d'une grille de score, avec surveillance du poids, de son apparence, de son comportement et de la taille de la tumeur. En cas d’atteinte des points-limites, l’animal sera euthanasié. En cas de score intermédiaire, une injection d’antidouleur sera réalisée et le suivi clinique sera réalisé quotidiennement. Tous les examens seront effectués sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress provoqués par les examens. La durée des examens sera réduite au maximum (temps total prévu de 2 heures au maximum) et tous les examens seront réalisés au cours de la même anesthésie pour éviter plusieurs anesthésies successives. Les animaux seront maintenus dans des cages de cinq maximum afin qu’ils aient suffisamment d’espace et qu’ils maintiennent un comportement social. Du matériau favorisant la nidification leur sera fourni. Les animaux seront hébergés en animalerie avec un statut adapté et manipulés sous hotte.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour cette étude, car elles permettent de greffer en sous-cutané des modèles de tumeurs humaines. Les dispositifs d’imagerie ont été développés pour les souris. De plus, la plupart des études d’imagerie sur tumeurs greffées en sous-cutané ont été réalisées sur des souris et il est donc plus aisé de trouver des informations dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés au stade adulte (au moins 8 semaines) afin de bénéficier d’animaux plus grands et plus à même de supporter les lésions tumorales étudiées. De plus, les cancers du sein et du pancréas sont généralement observés chez des patients adultes.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce volet étant mené dans le second établissement du même projet. Porteuses d'une mutation liée à l'autisme, elles sont génotypées, une partie des femelles gestantes tuée pour prélever les embryons et d'autres perfusées sous anesthésie terminale, pour caractériser l'effet de cette mutation sur le développement cérébral. Le porteur signale un "phénotype dommageable" avec mort subite entre quatre et six mois, poids réduit et cœur plus petit. Il affirme que seule une étude in vivo identifie l'effet de la mutation et qu'aucun autre modèle ne reproduit la maladie.

Objectifs

La mise en place des connections entre les neurones (synapses) sont des évènements critiques pour le développement et la fonction du cerveau. Nous travaillons sur un gène qui est essentiel pour le développement du système nerveux et la mise en place des synapses. Ce gène est un nouveau gène à risque pour l’autisme et la déficience intellectuelle. En effet, les patients ayant une mutation dans ce gène présentent une déficience intellectuelle ainsi que des troubles du spectre autistique. Pour mieux comprendre l’impact de cette mutation sur le fonctionnement cérébral, seule une étude in vivo permettra d’identifier comment elle perturbe le développement normal du cerveau. Dans ce but, nous avons créé un modèle de souris génétiquement modifiée porteur de cette mutation. Nous allons caractériser cette souris d’un point de vue morphologique et comportemental. De telles connaissances seront essentielles pour mieux comprendre les étapes du développement neuronal perturbés par la mutation, qui pourraient expliquer l’autisme et la déficience intellectuelle des patients. Cela permettra d’améliorer la prise en charge médicale des patients et d’identifier des cibles thérapeutiques pour cette pathologie pour laquelle il n’existe aucun traitement. Le but du projet est de comprendre si les problèmes de comportement et d’apprentissage observés chez les patients sont dus à l’impact de la mutation sur le développement neuronal embryonnaire qui aboutirait à des connections neuronales non fonctionnelles. Ce projet se déroulera dans deux Etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La souris permet l’utilisation d’approches génétiques pour reproduire les mutations trouvées chez l’homme. Le modèle transgénique que nous venons de développer n’existe pas et représente un outil très important pour pouvoir mimer la pathologie humaine de l’autisme. C’est le premier modèle de cette pathologie particulière. Grâce à ce projet, nous allons pouvoir déterminer quel est l’impact de la mutation identifiée chez les patients sur le développment neuronal embryonnaire et chez l’adulte. Personne ne connait les étapes du développement du système nerveux affectées par cette mutation. Une meilleure compréhension de l’effet de cette mutation aura un réel impact pour une meilleure prise en charge des patients et sur la recherche de cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux en élevage seront soumis uniquement à un tatouage pour identification et une biopsie pour génotypage. Une observation approfondie de leur bien-être sera réalisée. Types d'interventions auxquels seront soumis certains animaux: i) isolement temporaire des mâles (maximum 3 semaines). Leur environnement sera enrichi (coton, cabane) pour diminuer leur inconfort; ii) prélèvements d'embryons avec mise à mort de la femelle gestante. Cela concerne 210 femelles; iii) perfusion sanguine réalisée sous anesthésie terminale. Cela concerne 84 animaux.

Impact sur les animaux

Cette lignée nouvellement créée présente un phénotype dommageable. En effet, nous avons observé une mort subite chez ces animaux, dont nous ne connaissons pas la cause. Cette mort subite intervient entre 4-6 mois d'âge, mais les animaux ne présentent aucun signe avant-coureur permettant de prédire leur décès. On peut noter que les souris ont un poids inférieur à la normale, ainsi qu'un coeur plus petit. Pour les gestations datées, les mâles seront isolés de façon temporaire (maximum 3 semaines).

Devenir

A l'issue de la procédure 1, les animaux seront transférés sur les sites d'expérimentation. A l'issue des procédures 2 et 3, les animaux seront euthanasiés, car nous prélèverons des organes afin de réaliser des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé, car seule une étude in vivo permet d’identifier l’effet de la mutation identifiée chez les patients sur le développement neuronal et le fonctionnement cérébral. De plus, il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu d’utiliser au maximum 1200 souris sur une période de 5 ans, ce qui représente le nombre nécessaire d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Nous utiliserons des mâles et des femelles dans nos procédures expérimentales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux produits et non-utilisés.

Raffinement

Les souris seront hébergées selon la règlementation obligatoire. Pour réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement , ce qui permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée si des signes de souffrance sont détectés. Enfin, tous les gestes techniques seront réalisés par un personnel formé. Les animaux que nous allons perfuser recevront d'abord une anesthésie générale.

Choix des espèces

Seuls les modèles murins génétiquement modifiés permettent de cibler l’effet de la mutation identifiée chez les patients sur le développement neuronal et le fonctionnement cérébral. Il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie. Nous étudierons ce modèle du stade embryonnaire tardif jusq'à l'adulte

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour porter une mutation liée à l'autisme, elles sont génotypées, une partie des femelles gestantes tuée pour prélever les embryons et d'autres perfusées sous anesthésie terminale, pour caractériser l'effet de cette mutation sur le développement du cerveau. Le porteur signale que la lignée présente un "phénotype dommageable", avec une mort subite entre quatre et six mois sans signe annonciateur, un poids réduit et un cœur plus petit. Il affirme que seule une étude in vivo permet d'identifier l'effet de la mutation et qu'aucun autre modèle ne reproduit la maladie.

Objectifs

La mise en place des connections entre les neurones (synapses) sont des évènements critiques pour le développement et la fonction du cerveau. Nous travaillons sur un gène qui est essentiel pour le développement du système nerveux et la mise en place des synapses. Ce gène est un nouveau gène à risque pour l’autisme et la déficience intellectuelle. En effet, les patients ayant une mutation dans ce gène présentent une déficience intellectuelle ainsi que des troubles du spectre autistique. Pour mieux comprendre l’impact de cette mutation sur le fonctionnement cérébral, seule une étude in vivo permettra d’identifier comment elle perturbe le développement normal du cerveau. Dans ce but, nous avons créé un modèle de souris génétiquement modifiée porteur de cette mutation. Nous allons caractériser cette souris d’un point de vue morphologique et comportemental. De telles connaissances seront essentielles pour mieux comprendre les étapes du développement neuronal perturbés par la mutation, qui pourraient expliquer l’autisme et la déficience intellectuelle des patients. Cela permettra d’améliorer la prise en charge médicale des patients et d’identifier des cibles thérapeutiques pour cette pathologie pour laquelle il n’existe aucun traitement. Le but du projet est de comprendre si les problèmes de comportement et d’apprentissage observés chez les patients sont dus à l’impact de la mutation sur le développement neuronal embryonnaire qui aboutirait à des connections neuronales non fonctionnelles. Ce projet se déroulera dans deux Etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La souris permet l’utilisation d’approches génétiques pour reproduire les mutations trouvées chez l’homme. Le modèle transgénique que nous venons de développer n’existe pas et représente un outil très important pour pouvoir mimer la pathologie humaine de l’autisme. C’est le premier modèle de cette pathologie particulière. Grâce à ce projet, nous allons pouvoir déterminer quel est l’impact de la mutation identifiée chez les patients sur le développment neuronal embryonnaire et chez l’adulte. Personne ne connait les étapes du développement du système nerveux affectées par cette mutation. Une meilleure compréhension de l’effet de cette mutation aura un réel impact pour une meilleure prise en charge des patients et sur la recherche de cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux en élevage seront soumis uniquement à un tatouage pour identification et une biopsie pour génotypage. Une observation approfondie de leur bien-être sera réalisée. Types d'interventions auxquels seront soumis certains animaux: i) isolement temporaire des mâles (maximum 3 semaines). Leur environnement sera enrichi (coton, cabane) pour diminuer leur inconfort; ii) prélèvements d'embryons avec mise à mort de la femelle gestante. Cela concerne 210 femelles; iii) perfusion sanguine réalisée sous anesthésie terminale. Cela concerne 84 animaux.

Impact sur les animaux

Cette lignée nouvellement créée présente un phénotype dommageable. En effet, nous avons observé une mort subite chez ces animaux, dont nous ne connaissons pas la cause. Cette mort subite intervient entre 4-6 mois d'âge, mais les animaux ne présentent aucun signe avant-coureur permettant de prédire leur décès. On peut noter que les souris ont un poids inférieur à la normale, ainsi qu'un coeur plus petit. Pour les gestations datées, les mâles seront isolés de façon temporaire (maximum 3 semaines).

Devenir

A l'issue de la procédure 1, les animaux seront transférés sur les sites d'expérimentation. A l'issue des procédures 2 et 3, les animaux seront euthanasiés, car nous prélèverons des organes afin de réaliser des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé, car seule une étude in vivo permet d’identifier l’effet de la mutation identifiée chez les patients sur le développement neuronal et le fonctionnement cérébral. De plus, il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu d’utiliser au maximum 1200 souris sur une période de 5 ans, ce qui représente le nombre nécessaire d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Nous utiliserons des mâles et des femelles dans nos procédures expérimentales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux produits et non-utilisés.

Raffinement

Les souris seront hébergées selon la règlementation obligatoire. Pour réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement , ce qui permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée si des signes de souffrance sont détectés. Enfin, tous les gestes techniques seront réalisés par un personnel formé. Les animaux que nous allons perfuser recevront d'abord une anesthésie générale.

Choix des espèces

Seuls les modèles murins génétiquement modifiés permettent de cibler l’effet de la mutation identifiée chez les patients sur le développement neuronal et le fonctionnement cérébral. Il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie. Nous étudierons ce modèle du stade embryonnaire tardif jusq'à l'adulte

1 584 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité tuées à l'issue et 28 réutilisées. Immunodéficientes, elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome sur le flanc, puis des injections intraveineuses trois fois par semaine, jusqu'à seize prélèvements sanguins et une chimiothérapie, pour tester un anticorps bloquant une protéine du cancer. Le porteur décrit une possible nécrose de la tumeur à la surface de la peau, une cachexie avec forte perte de poids et une fragilisation des veines par les injections répétées. Il affirme que l'in vitro ne fournit ni microenvironnement tumoral ni hôte complexe, ce qui rend selon lui l'in vivo nécessaire.

Objectifs

Une protéine a été identifiée dans la survenue, la survie et la résistance du glioblastome, cancer très agressif d’un type de cellules du cerveau. Il sera vérifié ici ces rôles avec notamment le traitement par des anticorps bloquant la protéine.

Bénéfices attendus

Le cancer du cerveau étudié dans cette étude est l’une des plus fréquentes tumeurs originaire du cerveau, et en dépit des efforts de la recherche, cette pathologie reste incurable. Les traitements actuels sont très délétères et la survie des patients après diagnostic est de 14-15 mois. Cette étude apporterait une solution thérapeutique supplémentaire pour la prise en charge de ces patients. Par ailleurs, plus de 90% de la mortalité des patients atteints de cancer est attribuée à la résistance aux médicaments utilisés. Cette étude pourrait apporter une alternative dans les cas de résistance observée lors de traitement par chimiothérapie activant le suppresseur de tumeur.

Procédures

Les animaux recevront une greffe de cellules tumorales dans le flan (1x, 40sec). A la suite de cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine au maximum, l’animal est maintenu immobile environ 30 sec. Les composés sont administrés par injection intraveineuse (3x par semaine de traitement, 1min dont 3sec d’injection). Des prélèvements sanguins sont réalisés (16x maximum, 2 min dont 2x3sec d’insertion de l’aiguille de la seringue dans la queue). L’une des chimiothérapies sera injectée par voie intra-péritonéale (3x par semaine, 1min dont 5sec d’injection).

Impact sur les animaux

Un stress peut être observé lors de la contention des animaux (greffe, administration de composés, et pesées). Lorsque les animaux présentent des tumeurs sur le flanc, il est possible d’observer des phénomènes de nécrose des tumeurs à la surface de la peau. Plus rares sont les phénomènes de métastases pour la greffe de certaines lignées de cancer du cerveau qui seront mis en évidence par la perte de poids. Pour les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids) pourrait être observée. Les veines caudales peuvent finir par être fragilisées aux points d'injections des anticorps dû au caractère répétitif de ces injections.

Devenir

Les souris sont mises à mort pour le prélèvement - des tumeurs en vue d’analyses biomoléculaires, - d’organes pour évaluer la toxicité des molécules injectées. Les souris qui n’auront pas développées de tumeurs seront mises à mort, car elles ne peuvent pas être considérées comme naïves.

Remplacement

Les travaux menés in vitro montrent que la stratégie de blocage de la protéine X induit la mort des cellules cancéreuses. Mais ces tests ne bénéficient pas d’un microenvironnement tumoral et d’un environnement hôte complexes. Aussi il est nécessaire d’avoir recours à l’in vivo pour étudier la capacité du nouvel outil thérapeutique à atteindre la tumeur, pour analyser son comportement dans cet environnement complexe, évaluer son efficacité et pouvoir valider cet outil. Ces méthodes sont complémentaires d’expérimentations sur des cellules en culture qui sont largement utilisées en parallèle pour cette étude.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux lors de l’analyse pharmacocinétique du traitement, pour laquelle il y a besoin de prélever des échantillons sanguins sur plusieurs temps, une même souris sera être prélevée à 3 temps différents. De plus, chaque lot de souris permettra d’analyser 4 anticorps différents, en respectant un temps d’attente de 15 jours, nécessaire pour reconstituer le volume sanguin initial de la souris et éliminer le précédent anticorps. Par ailleurs, les différentes expériences se feront de façon séquentielle. L’optimisation des greffes pour chaque lignée cellulaire permettra de choisir la condition assurant le bon développement des tumeurs pour la réalisation des tests d’efficacité. Les lignées cellulaires qui ne pousseront pas seront exclues de l’étude ce qui réduira le nombre de souris utilisées dans ces tests. Un maximum de 5 anticorps candidats parmi les 8 analysés dans ces études sera étudié dans les tests d’efficacité. Ces tests d’efficacités permettront de sélectionner un seul anticorps sur les 5, soit celui qui aura la plus grande efficacité anti-tumorale avérée. Cet unique anticorps sera utilisé en combinaison avec la chimiothérapie. Le nombre d’animaux ainsi comptabilisé est le nombre maximum dans le cas où toutes les lignées cellulaires pousseraient, que 5 anticorps candidats seraient sélectionnés, et qu’il serait nécessaire de reproduire certaines expériences dû à des problèmes techniques.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur formé à cette technique. Il est important de noter qu’une surveillance adaptée (3 fois par semaine) permettra la détection et notation des signes de souffrance grâce à une feuille de scoring contenant des points d'arrêt objectifs, reproductible et standardisés et qui conduiront à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux si nécessaire. Les analyses de croissance des tumeurs seront non invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d’injection d’anesthésiant.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules, tout en permettant de faire des suivis de croissance tumoraux dans le cadre d’essais de nouveaux traitements. Par ailleurs les schémas d’administration des chimiothérapies sont biens standardisés (voie, doses, posologies...) contrairement à d’autres modèles tels que le Zebrafish. Les expérimentations seront effectuées sur des femelles de 6 à 7 semaines, âge où la prise de greffe est la plus efficace et la plus homogène. De plus les femelles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de la constitution de groupes expérimentaux homogènes.

Nourries douze semaines d'un régime standard ou d'un régime riche en graisses qui provoque obésité, diabète de type 2 et stéatose du foie, 640 souris passent ensuite par l'une des interventions prévues : un jeûne de 16 heures, ou six semaines de jeûne intermittent de 16 heures par jour, de régime cétogène, de retour au régime standard ou de régime gras maintenu. Les unes n'expriment pas la protéine PPARa dans le foie, les autres sont utilisées comme témoins, pour mesurer le rôle de cette protéine dans les effets des régimes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Au début et à la fin de chaque intervention, des tests de tolérance au glucose ou à l'insuline imposent six heures de jeûne, un gavage de glucose ou une injection d'insuline, puis sept gouttes de sang prélevées à la queue en deux heures, à raison d'un test ou d'une prise de sang par semaine. Le porteur écrit que le régime obésogène installe ces troubles "sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement", et cite pour le jeûne un risque d'hypoglycémie et d'hypothermie. Toutes sont tuées à l'issue, pour récolter leur sang et leurs organes.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie (stéatose hépatique non alcoolique, ou NAFLD pour non-alcoholic fatty liver disease) sont en expansion dans les pays industrialisés, parallèlement à la prévalence croissante de l’obésité. Le premier stade de la maladie correspond à une accumulation de graisses dans le foie et est bénin mais peut évoluer chez certains patients vers une forme inflammatoire, puis vers une cirrhose, à l’origine d’autres complications sévères telles que le cancer du foie. Les mécanismes de progression de ces maladies sont encore mal compris et aucun traitement médicamenteux efficace n’est disponible à ce jour. Dans une étude non publiée du laboratoire, nous avons récemment démontré que plusieurs stratégies alimentaires sont capables de diminuer l’obésité, le diabète et la stéatose hépatique chez la souris. Nous souhaitons à présent déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets bénéfiques. Nous émettons l’hypothèse que la protéine PPARa pourrait être impliquée dans ces effets. PPARa est principalement exprimée dans le foie où elle contrôle la dégradation des graisses, faisant d'elle une bonne cible thérapeutique pour traiter les maladies métaboliques. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles chez qui le gène PPARa est non fonctionnel dans le foie. Dans ce projet, nous utiliserons des souris mâles et femelles qui n'expriment pas PPARa dans le foie et comme contrôle, des souris chez qui PPARa s’exprime. Elles seront nourries par un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l’Homme. Une fois la pathologie installée, les animaux seront soumis à différentes stratégies alimentaires : un retour à un régime contrôle, un jeûne aigu ou intermittent, un régime cétogène (presque exclusivement constitué de graisses et contenant très peu de sucre). Les effets de ces différentes stratégies alimentaires seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes (foie, tissus adipeux brun et blanc).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l’importance de PPARa spécifiquement dans le foie dans les effets bénéfiques des différentes interventions sur la progression de l’obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. En conséquence, ce projet pourrait identifier un des mécanismes hépatiques pouvant être impliqué dans les effets de ces différentes interventions. En effet, aucun traitement de référence n’est disponible à ce jour pour les patients atteints de ces maladies chroniques du foie qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie du monde.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 12 semaines. A l'issue de ces 12 semaines, les animaux subiront l'une des interventions nutritionnelles suivantes : une mise à jeun pendant 16h, un jeûne intermittent de 16 h par jour pendant 6 semaines, un régime cétogène riche en gras et pauvre en sucre pendant 6 semaines, un régime standard pendant 6 semaines, un groupe contrôle qui restera nourri avec le régime obésogène pendant 6 semaines. Les animaux seront aussi soumis à des tests de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT) au début et à la fin de chaque intervention. Ces tests consistent en : 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie puis un gavage avec du glucose pour les OGTT ou une injection d'insuline pour les ITT, puis des mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2h. Pour les OGTT, le glucose est administré par gavage une fois et pour les ITT, l'insuline est administrée par injection une fois. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes. Pour les mesures de glycémie, le prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Les régimes obésogènes vont induire une obésité et des perturbations du métabolisme associées tels qu'un diabète et une stéatose, sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement. La mise à jeun peut entraîner une hypoglycémie et une hypothermie. Le prélèvement sanguin et le gavage oral de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car la pathologie étudiée (stéatose non alcoolique) est complexe et fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible de mimer la pathologie étudiée grâce à l’utilisation du régime gras.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Ainsi, les souris seront en hébergement collectif et dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, l’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (régime standard et aucune procédure réalisée).

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

1 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles sont greffées avec des cellules leucémiques humaines puis reçoivent des molécules candidates, avec des prises de sang hebdomadaires, pour mettre au point un modèle de leucémie liée au virus HTLV-1 et tester des traitements. Le porteur décrit les effets attendus de la greffe, amaigrissement, perte d'équilibre, difficultés motrices, gonflement du ventre et poils hérissés, suivis par une grille bi-hebdomadaire. Il juge de nouvelles approches thérapeutiques "indispensables" et affirme qu'il n'existe "pas de modèle cellulaire satisfaisant" pour cette maladie.

Objectifs

La leucémie/ lymphome T liée au virus HTLV-1 (ATLL) est une maladie du sang agressive qui est rapidement mortelle dans la majorité des cas malgré des protocoles de traitement intensifs. Ceci est principalement lié à une résistance des cellules leucémiques à la chimiothérapie chez environ 50% des patients. Il est donc indispensable de proposer aux patients de nouvelles approches thérapeutiques. Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATLL dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATLL de patients, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie induite. Par conséquent, il est nécessaire de tester l’efficacité de nouveaux traitements sur d’autres modèles, qui de plus représentent la diversité des mutations cancéreuses observées chez les cellules leucémiques des patients. Ce projet fait suite au précèdent projet dont l’objectif initial était l’établissement de lignées à partir de cellules primaires de patients atteints de lymphome/leucémie lié au virus HTLV-1 ou de cellules sur le même modèle de qui est réalisé dans d’autres maladies du sang. Depuis 2019, une vingtaine de cellules primaires d’ATLL ont été injectées à des souris fortement immunodéprimées. Il a été possible d’obtenir 4 lignées stables (après plusieurs réinjections). De manière intéressante, il a été possible de cultiver in vitro pendant quelques jours (2-3 semaines environ) 3 de ces lignées. Ce projet a un double objectif : 1. Mise au point d’un nouveau modèle de leucémie/lymphome T liée à HTLV pour permettre une meilleure compréhension de la maladie induite (poursuite de l’étude débutée en 2019). 2. Evaluer in vitro et in vivo l’efficacité de nouvelles thérapeutiques potentielles qui seront testées seules ou en association pour contrecarrer la résistance primaire des cellules d’ATLL à la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l’identification d’une ou plusieurs molécules d’intérêt qui a (ont) un effet potentiel anti-tumoral sur les cellules d’ATLL. Cette (ces) molécule(s) fera (feront) l’objet d’études approfondies sur son (leur) mécanisme d’action. Enfin à terme, l’objectif est de proposer une étude clinique étant entendu que l’ATLL est une maladie orpheline qui concerne moins de 50 nouveaux patients par an en France mais environ 1000 cas par an au Japon et que l’ATLL est un modèle pour d’autres maladies du sang.

Procédures

Les souris seront greffées avec des cellules leucémiques d’origine humaine par voie intrapéritonéale, intraveineuse (queue) ou sous-cutanée (durée du geste : quelques secondes). Ce geste ne sera réalisé qu’une seule fois. Des prises de sang (50 microlitres maximum) seront réalisées de façon hebdomadaire pour évaluer la prise de greffe (durée du geste : quelques secondes). Des candidats molécules thérapeutiques seront administrées aux souris selon un schéma propre déjà décrit dans la littérature dans le cadre d’autres études sur d’autres cancers ; les doses injectées et les fréquences décrites n’engendrent pas d’effets secondaires néfastes. Différents modes d’injections seront utilisés (en respectant les volumes maximaux associés à chaque voie) : - Intrapéritonéal (quelques secondes) - Intraveineux : sous anesthésie gazeuse ou médicamenteuse (durée quelques minutes entre l’anesthésie et l’injection) - Gavage (quelques secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à la greffe de cellules tumorales humaines ont été observés et mesurés au cours du projet précédent et ont conduit au développement d’une grille de suivi spécifique bi-hebdomadaire : amaigrissement, ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, perte de poils ou poils hérissés. L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. Les molécules candidates ont toutes déjà été utilisées dans des modèles murins et la quasi-totalité ont fait l’objet de publications scientifiques. Pour la majorité de ces molécules, il n’est pas rapporté d’événement indésirable notable en lien avec leur administration. Quelques-unes ont conduit à une dégradation de l’état des souris imputé à l’apparition d’un syndrome de lyse tumorale en cas d’administration à un stade de prise de greffe avancé ; pour ces molécules, nous privilégierons leur utilisation dans le cadre d’un traitement avant la prise de greffe afin de limiter ce risque et monitorerons de manière plus rapprochée les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car immunodéficients, infectés par le virus HTLV-1 et développant une tumeur.

Remplacement

Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATL (lignées TLOMI et MT1) dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATL primaires, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie liée au virus HTLV-1 (conclusion tirée après concertation entre laboratoires travaillant sur cette pathologie et analyse de la littérature). Les molécules que nous utiliserons auront toutes été préalablement testées et validées in vitro sur des cultures de cellules avant leur administration chez la souris. Cependant, cette étude in vitro, qui permettra de fortement limiter le nombre de molécules candidates à tester, ne peut remplacer une étude préclinique sur modèle animal pour tester leur efficacité in vivo.

Réduction

Nous utiliserons une double stratégie de réduction du nombre d’animaux utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un premier temps, toutes les molécules candidates seront testées in vitro sur des cultures de cellules, et seules les molécules ayant démontré une efficacité sur la viabilité des cellules tumorales in vitro seront utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un deuxième temps, nous évaluerons l’efficacité des molécules les plus efficaces dans le cadre d’un traitement avant greffe de tumeurs sur souris. Seules les molécules efficaces dans la procédure 2 seront ensuite éventuellement testées dans le cadre d’un traitement curatif (après la greffe), seules ou en association avec une chimiothérapie. Au niveau statistique, le nombre d’animaux prévu pour les procédures 2 et 3 est compatible avec la mise en évidence d’effets expérimentaux forts, ce qui est l’objectif recherché. Une hétérogénéité est attendue entre les différentes lignées (hétérogénéité génétique selon les patients), donc l’analyse des données devrait faire appel à des modèles statistiques spécifiques.

Raffinement

Une grille d’évaluation spécifique ainsi que des points limites spécifiques ont été développés au cours du projet précédent de génération des cellules, et seront utilisés afin de suivre de manière rapprochée et la plus précise possible la pris de greffe chez les animaux, et d’intervenir précocément en cas de signe de souffrance. Les points suivis sont : l’amaigrissement (grâce à l’aspect de la colonne vertébrale, le poids n’ayant aucune signification lors d’une prise de greffe), l’ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, l’aspect du pelage (perte de poils ou poils hérissés). L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. En lien avec les animaliers chargés du suivi, nous avons développé une grille d’intensité (+, ++ ou +++) de ces symptômes conduisant aux points limites des expériences. Toute observation inhabituelle est également répertoriée et évaluée. En cas d’injection de la tumeur par voie sous-cutanée dans dugel, le volume tumoral sera évalué par mesure au pied à coulisse deux fois par semaine.

Choix des espèces

Le projet précédent a permis d’établir qu’un modèle ce cellule était réalisable dans le cadre de l’ATLL sur des souris femelles immunodéficientes, en conservant la plupart des caractéristiques de la tumeur initiale, ce qui en fait un modèle très pertinent pour étudier la maladie HTLV-1 induite et rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous ne disposons pas à ce jour de modèle d’étude plus proche de la maladie initiale et représentatif de l’hétérogénéité clinique et moléculaire de la maladie. Les souris seront âgées de 7 à 15 semaines au moment de l’injection de cellules de patients ATLL (même stade de développement que dans le projet précédent de développement des lignées, et que dans d’autres projets d’études de leucémies/lymphomes). En l’absence d’apparition de signes de souffrance ou d’atteinte d’une prolifération suffisante de cellules cancéreuses dans le sang des souris, les animaux seront mis à mort au plus tard un an après injection.

688 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit la pose chirurgicale d'une chambre implantable et d'un cathéter, une injection sous-cutanée quotidienne jusqu'à vingt jours, une infection bactérienne et jusqu'à quatre prélèvements sanguins, pour évaluer des traitements contre les biofilms qui colonisent les cathéters. Le porteur décrit les nuisances attendues comme la chirurgie et une possible infection avec perte de poids et douleur. Il écarte le remplacement in vitro au motif qu'il ne reproduirait pas la complexité d'un "organisme entier" et sa réponse immunitaire.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le travail de notre laboratoire visant à mieux comprendre la physiologie distincte des bactéries grandissant au sein d’une communauté de biofilm, et ce afin de mettre au point des méthodes efficaces pour contrôler les infections dues aux biofilms. Les communautés bactériennes en biofilms sont particulièrement difficiles à éradiquer car elles sont à la fois protégées de l’action du système immunitaire par la structure physique du biofilm (présence de matrice extracellulaire) ainsi que de l’action des antibiotiques par la présence, au sein du biofilm, de sous-populations de bactéries particulièrement tolérantes aux antibiotiques, les bactéries « persistantes ». Ce projet vise donc à identifier chez certaines bactéries pathogènes les fonctions responsables de la colonisation de cathéters centraux, d’évaluer des traitements de type préventifs ou curatifs pour éviter la formation de biofilms ou éradiquer des biofilms existants, et enfin de déterminer si le traitement de ces biofilms par des antibiotiques peut entraîner la sélection de résistance à ces antibiotiques. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de fournir de nouvelles pistes sur les traitements à utiliser pour lutter contre les infections liées aux biofilms tout en prenant en compte le facteur sélection de résistance aux antibiotiques.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la formation de biofilms sur des cathéters centraux par certaines bactéries pathogènes et de la réaction de ces bactéries à certains traitements. Nous pourrions mieux appréhender si certaines bactéries peuvent développer des mécanismes de résistance, ou bien si les traitements préventifs ou curatifs appliqués sont efficaces pour éviter la formation de biofilms, ou traiter les biofilms dans le cas où ceux-ci sont déjà formés. Grâce à ces études qu’on peut estimer être pré-cliniques, on peut envisager dans le futur d’adapter certains traitements contre ces infections dues à la colonisation de matériel médical et ainsi réduire le taux de morbidité et mortalité des patients malheureusement infectés.

Procédures

Toutes les interventions en dehors de la contention seront faites sur animaux anesthésiés par anesthésie gazeuse. Chaque rat subira une injection sous-cutanée quotidienne rapide (quelques secondes) sur l’ensemble de la durée des procédures employée (au maximum sur 20 jours). Chaque rat subira une pose de chambre implantable dans le dos et une cathéterisation. L’intervention chirurgicale durera 45 min. Chaque animal subira au maximum 4 prélèvements de sang au niveau caudal chacun à plus de deux jours d’intervalle. Ceux-ci dureront moins de 3 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances causées aux animaux seront liées à la chirurgie nécessaire pour la pose du cathéter central et au possible développement d’une infection bactérienne (perte de poids et douleur dans le respect des points limites).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront tous subis une intervention chirurgicale avec pose d’un implant et été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, tous ces animaux seront sacrifiés pour analyser des organes vitaux.

Remplacement

Ce projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). La complexité des facteurs de l’hôte qui peuvent influencer le processus de colonisation des matériels médicaux est notamment trop importante pour être reproduite à ce jour in vitro.

Réduction

D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Pour ce qui est des traitements innovateurs qui seront testés, aucun d’entre eux ne sera évalué in vivo si celui-ci n’a pas d’abord démontré son efficacité in vitro. Les protocoles in vivo sont rédigés en amont pour éliminer le risque de réaliser une expérience non indispensable (rejet d’investigations discutables). Un maximum de 4 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 2 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ au niveau du cathéter central et en dehors de celui-ci, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Les Rats hébergés à 4 maximum par cage. Le fait d'avoir un hébergement de 4 animaux par cage au lieu d'un seul conduit à un meilleur confort pour les rats, moins d’anxiété et moins d’agitation lors des manipulations. Cette cohabitation n’est pas associée à un plus grand risque de difficultés de cicatrisation ni d’ablation intempestive des chambres implantables. Nous ferons une visite quotidienne durant la phase d’acclimatation, même en l’absence de manipulation, puis au moins une fois par 24h durant les jours suivant. Une attention particulière sera donnée après la phase de chirurgie et d’inoculation des cathéters par les bactéries.

Choix des espèces

Le choix de cette espèce s’est naturellement faite par le type de matériel implantable à utiliser dans nos expériences. Le cathéter intraveineux à chambre implantable de type pédiatrique est directement pertinent pour le traitement d’infections chez les patients dû au diamètre interne du cathéter ainsi qu’au type de matériau qui ont un impact majeur sur la formation du biofilm. Les dimensions d’un cathéter de type pédiatrique ne permettent pas une adaptation à des animaux plus petits comme la souris. Tous les animaux fournis seront des rats mâles de 8 semaines et d’environ 275-300 g. À ce stade, les veines ont atteint une taille suffisante pour faciliter la pose du cathéter, et le système immunitaire pleinement développé pour participer au contrôle des contaminations du matériel implanté.

5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une instillation de bléomycine dans la trachée déclenche une fibrose pulmonaire, puis les animaux reçoivent des traitements chroniques, pour tester les molécules de clients contre cette maladie respiratoire. Le porteur indique que le modèle provoque des difficultés respiratoires et une perte de poids massive qui mène généralement à la mort, une perte allant jusqu'à 30 % étant tolérée avant l'exclusion. Sur le remplacement, il reconnaît l'existence de cultures et de coupes de poumon in vitro en cours de mise en place, mais les juge insuffisantes et conclut au recours à l'animal "entier".

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique est une cicatrisation anormale du tissu pulmonaire (bronchioles, alvéoles et vaisseaux sanguins pulmonaires) à la suite à une agression violente (par exemple une infection virale ou bactérienne) et/ou chronique. Le tissu pulmonaire s’épaissit et se rigidifie et des cicatrices non fonctionnelles apparaissent que l’on appelle fibrose. La conséquence est principalement l’insuffisance respiratoire puis dans des stades plus avancés une insuffisance cardiaque droite. Elle peut nécessiter à terme la transplantation pulmonaire et/ou cardiaque. Aujourd’hui les causes de la maladie ne sont pas connues, d’où le terme idiopathique, mais la pollution semble être un facteur privilégié. Elle concerne aujourd’hui 5500 patients et 1800 nouveaux patients sont concernés par an en France. La maladie touche davantage les hommes et le risque augmente avec l’âge et les maladies métaboliques. Les deux traitements actuellement sur le marché, la pirfénidone et le nintedanib, ont pour but de ralentir la progression de la fibrose et donc de la maladie mais n’atténue pas les symptômes. Il est donc nécessaire de mettre en place des modèles animaux d’études précliniques dans le but de développer de nouvelles thérapies mais également comprendre les mécanismes moléculaires mis en place.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes mis en place dans le développement de la maladie, tout comme le développement de nouvelles thérapies

Procédures

Afin d’induire le développement de fibrose pulmonaire, nous devons instiller dans la trachée des souris, sous anesthésie gazeuse, la bléomycine, un anti-cancéreux utilisé en clinique actuellement et qui induit de la fibrose pulmonaire chez l’homme. Les animaux contrôles seront instillés avec de la solution saline. Les animaux sont ensuite replacés au milieu de leurs congénères dans leur cage d’origine placée sur un tapis chauffant. Une surveillance particulière est réalisée jusqu’au réveil de l’animal afin de déceler au plus tôt tout signe de souffrance ou de douleur (étouffement, détresse respiratoire, etc.). Tous les animaux du projet seront soumis à ce geste. Afin de tester les molécules de nos clients, les souris seront traités de façon chronique afin de montrer l'efficacité des dits traitements. Tous les animaux du projet seront soumis à cette phase de traitement.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont des difficultés respiratoires des animaux et la perte de poids massive qui est telle qu’elle mène généralement à la mort et le stress chronique liée à l'administration chronique des traitements. La perte de poids observée dans ce modèle est corrélée significativement au niveau d’atteinte pulmonaire et reste un criète à la fois d'acceptation de la pathologie et un critère d'exclusion si celle ci devenait trop importante.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Des alternatives non animale sont envisageable aujourd'hui comme la mise en place de culture de cellules pulmonaires in vitro mais ce modèle reste limitée car ne mime par l'organisation structurelle et cellulaire du poumons comme décrit dans un organisme. Cette dernière technique va être testée puis mise en place au sein de l'entreprise dans les prochains mois. Les tests de molécules peuvent être réalisé sur des coupes de poumons issue de l'animal évitant ainisi de traiter chroniquement ces derniers. Cependant, avec cette technique, la pathologie doit être induite chez l'animal vivant avant de réaliser les coupes de poumons. Bien que ces alternatives existent, elles ne sont pas suffisantes pour démontrer l'efficacité des traitements de façon complète. Comme la plupart des maladies et la validation des nouveaux traitements il est nécessaire d’utiliser des animaux à des fins expérimentales. En effet, les maladies qui se développent sont souvent la conséquence d’altérations multi-organes qui nécessitent l’utilisation d’un organisme dans son entier. De plus, ceci permet d’évaluer les conséquences des nouveaux traitements sur l’état général d’un individu et les possibles atteintes de certains organes.

Réduction

Afin d'obtenir des résultats interprétables et de montrer l'efficacité d'un traitement, il est nécessaire d'avoir un nombre d'animaux par groupe égale à 10 minimum.

Raffinement

La perte de poids tolérée pour ce modèle est de 30%. En effet, comme mentionné ci-dessous il s’agit d’un critère important pour évaluer l’atteinte pulmonaire. La mesure du poids étant faite 3 fois par semaine, le suivi est rapproché.Pour limiter la souffrance liée à la perte de poids, afin de faciliter la prise alimentaire, des croquettes humidifiées seront positionnées en fond de cages. Pour les souris âgées et obèses, des mangeoires suspensdus seront utilisés pour favoriser la prise alimentaire. Un ajout d'aspen brik permettra au souris âgées et obèses d'user leur dent et de favoriser la prise alimentaire. Pour favoriser la nidification et permettre une bonne régulation de la température corporelle souvant dérégulée en cas de perte de poids, de l'enirchissement supplémentaire sera apporté (sizzlenest, coton). Après l’instillation et pendant la phase de réveil, les animaux sont placés sur tapis chauffant. Enfin, lors de l'euthanasie, pour limiter la souffrance lors du prélèvement terminal du sang effectué par ponction intracardiaque ou en veine cave sera réalisé de deux possibles façon: en option 1, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane, une injection de lidocaine sera effectué en sous cutané à plusieurs endroits le long de la zone d'incision et une injection de buprénorphine en sous cutanée 60 minutes avant; en option 2, les animaux seront anesthésiés avec un mélange kétamine/xylasine en i.p. et une injection de lidocaine sera effectué en sous cutané à plusieurs endroits le long de la zone d'incision.

Choix des espèces

Trois types de souris seront utilisées : Des souris C57Bl6 mâles âgées de 8 semaines. Des souris mâles sont utilisées car la fibrose pulmonaire touche plus les hommes que les femmes. L’utilisation de souris jeunes permet d’avoir un modèle de souris moins fragiles pour subir l’instillation. Des souris C57Bl6 mâles âgées de 22 semaines et rendues obèses par ingestion d’un régime gras pendant 16 semaines. En effet, les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques du développement de la maladie. Des souris C57Bl6 mâles âgées de 22 mois. Afin de limiter le transport de souris trop âgées, elles seront livrées à 18 mois puis hébergées jusqu’à 22 mois dans nos locaux. L’utilisation de souris âgées est totalement adaptée car le risque de fibrose pulmonaire est accru lorsque l’on vieillit. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte afin de se rapprocher de ce qui est observé chez l'homme à l'âge adulte.

150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.