Oncologie

3 320 souris vont être utilisées dans ce projet sur le glioblastome, chacune pouvant passer par une chirurgie intracérébrale de 30 à 40 minutes, cinq injections quotidiennes consécutives, jusqu'à cinq cycles de traitement renouvelés toutes les deux semaines, deux séances d'imagerie par bioluminescence par semaine et quatre prélèvements sanguins, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La tumeur cérébrale provoque perte de masse musculaire, prostration, déshydratation et lésions cutanées, et les souris immunodéprimées utilisées courent un risque accru d'infection. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau, la voûte crânienne et les ganglions lymphatiques. Le porteur travaille en parallèle sur des organoïdes de glioblastome intégrant microglie et monocytes, et conditionne le remplacement d'une partie des expériences in vivo aux résultats de ce projet collaboratif.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’étudier les modifications du microenvironnement tumoral après l’administration de traitements diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules (type de traitement appelé sénothérapie) dans trois modèles murins de glioblastome (GBM). Ces modèles complémentaires récapitulent les altérations moléculaires identifiées dans un sous-type de GBM de patients dit mésenchymateux. Ce projet comprend trois volets : (1) Évaluation de l’effet de nouvelles drogues ciblant les cellules sénescentes ou leur activité sur la survie des souris après avoir vérifier que ces molécules sont perméables à la barrière hémato-encéphalique ; (2) Analyse en 3D des réseaux vasculaires sanguin et lymphatique méningé au niveau du cerveau entier et de la voûte crânienne, après marquage des protéines des vaisseaux par des anticorps fluorescents ; (3) Analyse du compartiment immunitaire de la tumeur en utilisant 4 approches : (i) analyse de l'expression des protéines et des ARN messagers (intermédiaires en le gène et la protéine) sur coupes de tissus ; (ii) analyse de l'expression des ARN messagers de cellules dissociées de la tumeur ; (iii) trie de cellules dissociées après marquages fluorescents spécifiques de type cellulaires, de la tumeur, des ganglions lymphatiques cervicaux et des méninges ; (iv) étude de l’action combinée de sénothérapie et d’immunothérapie (thérapie stimulant le système immunitaire).

Bénéfices attendus

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale adulte primitive la plus fréquente et agressive avec une médiane de survie des patients inférieure à 15 mois après diagnostique. Les résultats issus de ce projet permettront de comprendre les mécanismes sous-jacents de l’action bénéfique d’une sénothérapie en étudiant les compartiments immunitaire et vasculaire, au sein de la tumeur et en périphérie. Selon nos résultats, notre projet pourrait proposer une nouvelle approche thérapeutique en combinant une sénothérapie (traitement diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules) et une immunothérapie (traitement stimulant le système immunitaire). Cette dernière de donnant pas à ce jour, de résultats positifs dans la vaste majorité des GBM.

Procédures

La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 7 actes techniques incluant une injection pré-opératoire, une injection au niveau du cerveau de virus ou de cellules tumorales nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par utilisation d’imagerie par bioluminescence, des traitements, des prélèvements sanguins puis finalement une euthanasie. L'ensemble de ces 7 actes techniques ne sera pas effectué sur la totalité des animaux du projet. L'injection unique pré-opératoire sera d'une durée de 10-20 secondes. La chirurgie prendra environ 30-40min sur animal anesthésié (anesthésie générale et locale) et analgésié en pré et post-opératoire. Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs sur animal vigil. La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines sur animal anesthésié. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min. Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés sur souris vigiles pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. Les animaux recevront au maximum 5 cycles de traitement. L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines sur souris vigile. Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigil (durée de quelques secondes, 4 fois par animal).

Impact sur les animaux

Ce projet comporte deux étapes majeures où des effets indésirables sont attendus sur les animaux, la procédure chirurgicale et la charge tumorale. La procédure chirurgicale consiste en une injection de virus ou de cellules tumorales dans des zones précises du cerveau. Ces injections sont effectuées sous anesthésie/analgésie qui peut entraîner des nuisances, par exemple des risques anesthésiques, des douleurs post-opératoires ou des risques infectieux. De plus, lors de cette étape comme lors de l'imagerie par bioluminescence des risques d'hypothermie et de détresse cardiorespiratoire sont possibles. Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration, déshydratation, lésions cutanées). En outre, les traitements par injections peuvent engendrer une douleur de courte durée, un risque d'irritation du tube digestif et un risque d’inflammation du péritoine. De même, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie lors des prélèvements sanguins. Dans de très rares cas un hématome ou une perte de sang hémorragique pourrait être observée. Par ailleurs, nous utiliserons des souris immunodéprimées qui présentent un risque acru d'infections

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris contenant une tumeur, la voute crânienne et les ganglions lymphatiques afin de les analyser au niveau moléculaire, histologique et cellulaire.

Remplacement

En parallèle de ce projet in vivo, nous caractérisons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patients collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare et est obtenu grâce à la collaboration avec des neurochirurgiens et des neuropathologistes. Cette étude fondamentale demeure néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans des modèles animaux précliniques. Dans un souci de remplacement et réduction, nous avons initié la génération des tumoroides (ou explants de tissus en suspension) à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire et le réseau vasculaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle de tumoroides conservant de façon fidèle la présence et l’activité du microenvironnement. Un projet collaboratif vise à générer des organoides de glioblastome incluant de la microglie et des monocytes infiltrants. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.

Réduction

Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, nous utiliserons dans ce projet 3320 souris. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 10-18 animaux par groupe. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Pour cette raison, nous visons à obtenir des résultats robustes en utilisant plusieurs modèles murins de glioblastome complémentaires. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, voute crânienne, ganglions lymphatiques, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescente localisée dans le cerveau sera disséquée à la loupe binoculaire. Nous réaliserons plusieurs types d'analyses sur chaque tumeur. Dans certains cas, immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Pour réduire le stress post-opératoire, les animaux seront logés par groupes pendant une période d'acclimatation de 7 jours minimum avant la procédure chirurgicale. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l'hypothermie, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter leur déshydratation. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et le poids des animaux deux fois par semaine. En fin de processus d’expérimentation, si une souris femelle est isolée nous regrouperons cet animal avec des animaux sujets au même traitement et lorsque cela ne sera pas possible nous regrouperons cet animal avec un animal de compagnie. Pour les mâles isolées (modèle 3), nous rajouterons un enrichissement (maison en carton) et nous notifierons sur la cage ‘animal isolé’. Lors des prélèvements sanguins, si le saignement ne stoppe pas rapidement, une compression plus longue avec un papier essuie tout propre sera directement effectuée sur le point de prélèvement. En cas d'apparition de prostration et de difficulté à récupérer (anomalie cardiorespiratoire), l'animal sera pris en main pour effectuer des frictions afin de le stimuler. De la nourriture hydratée sera déposée à côté de lui dans la cage. Si cet état perdure plus de quelques minutes, l'animal sera euthanasié. Pour les souris immunodéprimées la litière et les aliments seront irradiés, les enrichissements seront autoclavés, et ils boiront de l'eau osmosée afin de réduire les risques d'infections qui sont élevés dans ces modèles.

Choix des espèces

Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Aussi, de nombreuses données de multiomics réalisées à partir de modèles murins de glioblastome sont disponibles et nous aideront à comprendre et analyser nos propres résultats. Les lignées de souris génétiquement modifiées utilisées pour ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour générer des glioblastomes car cette tumeur se développe chez l’adulte à partir de 30 ans. Ce projet qui vise à évaluer les modifications du microenvironnement tumoral (système immunitaire et architecture des vaisseaux sanguins et lymphatiques) après l’administration de traitements diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules (type de traitement appelé sénothérapie) dans des modèles murins de glioblastome utilisera des souris mâles et femelles. En effet, de nombreuses études ont montré que l’activité du système immunitaire varie selon le sexe.

Créer une lignée de souris qui développent spontanément des tumeurs du cerveau, puis mesurer l'effet de très faibles doses de rayonnements ionisants sur leur apparition : 240 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un seul des génotypes obtenus par croisement développe des tumeurs cérébrales agressives, avec perte de poids, baisse d'activité, troubles de la coordination et retard de croissance. Les autres serviront surtout à fournir des cellules pour des analyses en laboratoire, et les animaux gardés pour la reproduction sont tués lorsqu'ils franchissent un point limite. Le RNT affirme qu'"en dehors des effets liés à la tumeur elle-même, ces souris ne ressentent ni douleur ni stress du fait de leur modification génétique", alors que la tumeur cérébrale est précisément ce que la lignée est construite pour produire.

Objectifs

Nous créons une lignée de souris spécialement modifiée pour étudier les tumeurs du cerveau. Ces modifications n’agissent que dans les cellules nerveuses et permettent de mieux comprendre comment les cancers du cerveau se développent, afin d’aider à trouver de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

L’objectif est de disposer de souris qui développent spontanément des tumeurs du cerveau afin de mieux comprendre pourquoi ces cancers, notamment chez les enfants, sont en augmentation. Le projet étudiera en particulier l’impact de très faibles doses de rayonnements ionisants. Pour cela, différentes conditions d’irradiation seront testées, sur le cerveau ou d’autres parties du corps, afin de mesurer leur influence sur l’apparition des tumeurs cérébrales.

Procédures

Les souris utilisées dans ce projet portent des modifications génétiques qui les rendent susceptibles de développer spontanément des tumeurs du cerveau. Ces tumeurs peuvent apparaître au cours de leur croissance et entraîner progressivement différents signes de maladie, comme une perte de poids, une baisse d’activité, des difficultés de coordination ou un retard de croissance. Ces animaux ne présentent pas de déficience immunitaire particulière, mais le risque principal pour leur bien-être est lié au développement de la tumeur cérébrale, qui peut provoquer des troubles neurologiques. Pour cette raison, ils font l’objet d’une surveillance rapprochée, permettant d’identifier rapidement tout signe d’inconfort ou d’atteinte de leur état général. Des critères d’arrêt stricts sont définis afin d’éviter toute souffrance prolongée. En dehors des effets liés à la tumeur elle-même, ces souris ne ressentent ni douleur ni stress du fait de leur modification génétique. Elles sont élevées dans des conditions standards de bien-être animal, avec des soins adaptés et une manipulation précautionneuse, afin de garantir les meilleures conditions de vie possibles tout au long de l’étude.

Impact sur les animaux

Parmi les différentes catégories de souris obtenues après les croisements, une seule développe des tumeurs cérébrales agressives. Ces animaux peuvent présenter des signes de maladie susceptibles d’affecter leur bien-être, comme un retard de croissance. Les autres groupes ne développent pas de symptômes importants. Ils restent en bonne santé et seront surtout utilisés pour obtenir des cellules destinées aux analyses en laboratoire.

Devenir

Tous les animaux seront gardés soit pour le maintien de la lignée ( hors groupe 3) soit à destination de l'expérimentation. Les animaux mis à mort dans le cadre de cette gestion de lignée sont les animaux qui préseront l'un des points limites cités précédement.

Remplacement

Les effets de certaines mutations sur le développement du cerveau, et en particulier les changements qui apparaissent lorsqu’une tumeur se forme, ne peuvent être compris qu’en observant comment le cerveau évolue dans un organisme vivant. Aujourd’hui, il n’existe pas encore de méthodes uniquement réalisées en laboratoire (in vitro) capables de reproduire toutes les interactions complexes qui se déroulent dans le cerveau. Les neurones, les cellules gliales, les vaisseaux sanguins et même la réaction inflammatoire travaillent ensemble d’une manière très précise, et ces processus sont encore impossibles à recréer complètement dans un modèle artificiel. C’est pour cette raison que l’étude sur l’animal reste nécessaire pour comprendre correctement la formation et la progression des tumeurs cérébrales.

Réduction

Le nombre de souris élevées est calculé avec soin pour répondre exactement aux besoins des projets scientifiques et pour maintenir la lignée, sans produire d’animaux inutiles. La reproduction est planifiée et ajustée en continu selon les demandes réelles. Des outils de suivi permettent d’éviter toute production excessive, et lorsque c’est possible, les animaux sont partagés entre plusieurs projets ayant des besoins similaires. Si des animaux ne sont pas utilisés, les prochaines portées sont réévaluées pour éviter de reproduire inutilement.

Raffinement

Le suivi sanitaire des animaux est réalisé quotidiennement, avec une surveillance renforcée des individus porteurs du génotype 3 (altérations de P53, PTEN et NBS sous le contrôle de Nestin-Cre), susceptibles de développer un phénotype délétère, notamment neurologique et/ou tumoral. Une attention particulière est portée à la détection précoce de toute altération de l’état général (perte de poids, piloérection, modifications du comportement, troubles locomoteurs). Des mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de limiter la douleur, la souffrance et le stress. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux stables lorsque leur état le permet, avec enrichissement du milieu (matériaux de nidification, abris). Les manipulations sont limitées au strict nécessaire et réalisées par du personnel formé, afin de réduire le stress lié à la contention. Pour les animaux présentant des signes cliniques, les conditions d’hébergement sont adaptées afin de limiter les contraintes et prévenir toute aggravation : accès facilité à la nourriture et à l’eau (dispositifs abaissés si nécessaire), réduction de la compétition alimentaire et surveillance accrue. Un isolement temporaire peut être réalisé lorsque nécessaire afin de prévenir les interactions délétères, tout en veillant à limiter le stress induit. La durée de maintien des animaux présentant un phénotype altéré est réduite au strict minimum nécessaire. La prise en charge de la douleur et de la souffrance repose sur une détection précoce et une adaptation rapide des conditions d’hébergement. En cas de dégradation de l’état général dépassant le niveau de gravité défini, une mise à mort réglementaire par CO₂ est réalisée conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

La souris permet la modification aisée du patrimoine génétique avec une facilitée et une rapidité de reproduction. Dans ce contexte ce modèle n’est pas remplaçable. Sagissant de reproduction d'animaux, ils seront utilisés à l'âge minimum de 9 semaines de vie. Pour le developpement de tumeurs les souris seront utilisees entre 20 semaines et 52 semaines.

Le fer injecté dans la tumeur est chauffé par impulsions de radiofréquences pour léser le tissu environnant sur environ un millimètre cube, trois jours de suite, chez 258 souris immunodéficientes porteuses d'un glioblastome humain, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe sous anesthésie pour l'injection, quinze minutes d'imagerie, trente minutes d'hyperthermie, puis une IRM de trente minutes une semaine après la dernière séance. Le projet annonce des tumeurs contrôlées entre 150 et 200 mm³ qui "ne provoquera pas de perte de poids ou de motricité", tout en fixant un point limite à 1 500 mm³, et décrit l'injection des nanoparticules tantôt en intratumoral tantôt en intraveineux. Les souris sont tuées sans reprise de conscience à la fin de l'IRM, pour chercher dans les tissus la nécrose de la tumeur.

Objectifs

Sur la base d'études in vitro réalisés fin 2025, visant à démontrer la bioaccumulation des nanoparticules dans la tumeur à une quantité jugée suffisante pour une efficacité in vivo supplémentaire par activation par hyperthermie magnétique, et d'études in vitro qui sont réalisées fin 2025, des études de preuve d'efficacité de l'hyperthermie seront menées. L’hyperthermie magnétique se base sur une impulsion de radiofréquences ciblée. Ceci permet de faire une hyperthermie localisée augmentant la température autour de l’endroit où il y a présence de fer. Injectant le fer à l’intérieur de la tumeur, cela fait une cible dans le tissu autour de la localisation de fer d’environ 1 mm3. Dans ce sens, l'hyperthermie est utilisée comme outil afin d'atteindre et léser par augmentation contrôlée de température exclusivement le tissu tumoral. Ainsi, pour atteindre cet objectif, un modèle tumoral humain et une voie d'administration du composé intra tumorale sont envisagés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour le projet global sont de valider une nouvelle nanoparticule en lien avec l’hyperthermie magnétique, approche thérapeutique en plein essor. Ce projet nous aidera à démontrer la bioaccumulation des nanoparticules dans la tumeur en quantité suffisante pour une efficacité in vivo par activation par hyperthermie magnétique. L'hyperthermie est utilisée comme outil afin d'atteindre et léser par augmentation contrôlée de température exclusivement le tissu tumoral. De plus, la robustesse du processus de fabrication de cette molécule d'intérêt pourra être validée également avec un duplicat d'expériences.

Procédures

Les animaux auront une acclimatation à l’animalerie avec marquage et pesées. L’inoculation de la tumeur est prévue 10 jours environ après l’arrivée à l‘animalerie. Deux mesures de poids et de volumes de tumeurs seront faites par semaine avant d’atteindre le volume tumoral ciblé (environ 6 mesures qui se feront avec une légère contention) et réaliser la randomisation des groupes. L’injection intra tumorale des produits d’intérêt sera faite sous anesthésie au gaz et le suivi par imagerie des particules magnétiques et hyperthermie suivra à J0 puis J1 et J2 respectant 30 minutes de repos entre l’injection et imagerie puis hyperthermie. Les pesées et mesures du volume tumoral seront faites encore à J0 ; J2 puis J6 et J9. Une semaine après la dernière séance d’hyperthermie (J9), une IRM sera faite pour vérifier la présence de nécrose tumorale. Sans reprise de conscience, la mise à mort permettra de réaliser des examens post-mortem sur les tissus collectés. Les acquis en imagerie des particules magnétiques dureront environ 15 minutes et se feront sous anesthésie, les séances d’hyperthermie dureront environ 30 minutes et se feront sous anesthésie, la séance d’IRM durera environ 30 minutes et se fera sous anesthésie également ; la mise à mort se fera sans reprise de conscience à la fin de l’IRM.

Impact sur les animaux

D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Cette étude vise des tumeurs controlées et réduites, entre 150 et 200mm³ qui ne provoquera pas de perte de poids ou de motricité. Néanmoins, nous prévoyons un point limite si les tumeurs atteignent 1500m³. L’inoculation de la tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs juste après l’inoculation. L’injection des nanoparticules véhiculées dans les cellules est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Concernant l'imagerie et l'hyperthermie, elles se dérouleront sous anesthésie générale sur 15 minutes. Nous nous attendons pas de nuisances supplémentaires.

Devenir

Les souris seront toutes mises à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir réaliser des examens post-mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui même est une deuxième étude sur la base d’études in vitro réalisées fin 2O25 pour valider la biodistribution de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers grâce aux effets thérapeutiques associés à l'hyperthermie.

Réduction

Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre l’évolution de la tumeur pour l’utilisation thérapeutique des nanoparticules. Une permière partie de validation est prévue et une deuxième partie suivra avec ces groupes minimaux. Des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la littérature. Ces simulations ont été faites à l’aide de l’outil en ligne.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de 4 individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite trois fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Cette surveillance inclut également un scoring avec des paramètres d’interaction sociale, associés à la perte de poids et motricité autour de l’évaluation du point limite. La procédure a été pensée de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés.

Choix des espèces

Concernant le choix des souris, nous nous intéressons aux souris qui sont immunodéficientes et fréquemment utilisées dans les modèles précliniques de cancérologie, en particulier pour greffes de cellules humaines. L'immunité de la souche choisie est spécifique pour une réponse immunitaire très réduite et une très bonne tolérance, ce que améliore la prise tumorale, indispensable à ce projet. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 7-8 semaines à l'arrivée à l'animalerie. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.

Le virus respiratoire syncytial et le SARS-CoV-2 sont instillés dans le nez des souris, une à deux fois, au cours d'expériences de cinq à dix jours. 176 souris génétiquement modifiées pour porter le récepteur humain ACE2 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées au dioxyde de carbone pour le prélèvement de leurs poumons, de leur liquide broncho-alvéolaire et de leur sang. L'objet est de savoir si une enzyme pulmonaire, la MMP-7, freine l'entrée de ces virus dans les cellules, question déjà abordée en culture cellulaire. Le porteur affirme que les animaux "ne ressentent aucune gêne" et qu'aucune manipulation n'a lieu sur animal conscient, tout en listant une gêne respiratoire pendant un à cinq jours, un isolement et une posture recroquevillée pendant vingt-quatre à soixante-douze heures, et une hypothermie possible après anesthésie.

Objectifs

Ce projet part de l’idée que certaines molécules produites par les cellules des poumons lors d’une infection en particulier une enzyme qui décompose certaines protéines et qui pourraient aider le corps à se défendre contre des virus respiratoires. La molécule est naturellement présente en grande quantité dans les cellules qui tapissent nos voies respiratoires, et elle semble jouer un rôle important dans plusieurs maladies pulmonaires. Nos premières expériences en laboratoire montrent que cette enzyme pourrait empêcher ces virus d’infecter les cellules. Mais il reste à vérifier si elle joue le même rôle dans un organisme vivant. L’objectif du projet est donc de comprendre comment la molécule contribue à la défense immunitaire : -influence-t-elle l’entrée des virus dans les cellules ? -participe-t-elle à activer ou réguler la réponse immunitaire ? -permet-t-elle de réduire la gravité ou la progression de l’infection, y compris lors d’une co-infection par les deux virus ? En bref, ce projet cherche à déterminer si l’enzyme en question est un acteur clé de la protection naturelle des poumons contre ces infections virales.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’améliorer notre compréhension du rôle d’une molécule dans l’inflammation des voies respiratoires et dans les problèmes pulmonaires provoqués par les infections virales. En étudiant comment cette molécule influence l’infection et la réaction du corps, nous espérons identifier des mécanismes importants qui pourraient aider, à terme, à mieux prévenir, diagnostiquer ou traiter ces infections chez l’homme. Les observations recueillies permettront de comprendre : -comment les virus se développent dans les poumons, -comment l’organisme réagit (inflammation, substances libérées par le système immunitaire, production de mucus), -et dans quelle mesure la molécule aide à éliminer les virus. Les résultats attendus pourraient ouvrir de nouvelles pistes pour le développement de traitements ou d’outils médicaux destinés aux infections respiratoires. Le modèle utilisé dans ce projet deviendra également un outil précieux pour la recherche future, notamment pour étudier d’autres virus respiratoires ou pour tester de potentielles stratégies vaccinales.

Procédures

Aucune manipulation n’est réalisée sur des animaux conscients. Les virus sont administrés par voie intranasale uniquement lorsque les animaux sont complètement anesthésiés, ce qui évite toute douleur ou stress. L’administration des virus sera réalisée une à deux fois au cours des expérimentations, dont la durée totale est de 5 à 10 jours. Tous les prélèvements nécessaires à l’étude (sang, liquide pulmonaire, poumons) sont effectués uniquement après l’euthanasie, afin que les animaux ne ressentent aucune gêne. Par ailleurs, les animaux ne sont manipulés qu’une seule fois par jour, pour une durée courte de 2 à 3 minutes, afin d’assurer le suivi de leur bien-être. Ainsi, toutes les manipulations pouvant provoquer de l’inconfort sont réalisées sous anesthésie ou après l’euthanasie, et les animaux ne sont jamais vigiles pendant ces procédures.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ce projet pourraient présenter certains effets liés à l’infection expérimentale ou aux procédures nécessaires à l’étude. Ces effets resteront en général modérés et temporaires, et feront l’objet d’une surveillance étroite. Les nuisances possibles sont les suivantes : 1.Gêne respiratoire légère à modérée : Les animaux pourraient respirer plus rapidement ou avec un certain inconfort durant les premiers jours après l’infection (environ 1 à 5 jours). Les signes respiratoires très marqués seront considérés comme un critère d’arrêt immédiat pour protéger l’animal. 2.Changements de comportement : Une baisse d’activité, un isolement ou une posture recroquevillée peuvent apparaître temporairement (24 à 72 heures). Ces réactions sont courantes lors d’infections ou après des interventions légères. 3.Baisse temporaire de la température après anesthésie : Une légère hypothermie peut survenir dans les heures suivant l’anesthésie, mais elle est corrigée rapidement grâce au maintien au chaud. Une hypothermie prolongée serait un critère d’arrêt. 4.Léger inconfort lié aux instillations intranasales : Des éternuements, toux légères ou irritations du nez peuvent apparaître juste après la procédure, mais ces signes sont brefs et disparaissent en quelques minutes ou heures. 5.Diminution transitoire de l’appétit ou de l’hydratation : Certains animaux pourraient manger ou boire un peu moins pendant 1 à 3 jours, entraînant parfois une légère perte de poids. Une perte trop importante ou persistante entraînera l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal concerné. 6.Sensibilité accrue des lignées génétiquement modifiées : Les souris utilisées, dont certaines présentent des modifications génétiques, peuvent être plus sensibles aux infections. Elles pourront donc montrer des signes un peu plus marqués, ce qui justifie une surveillance renforcée et des mesures de prise en charge adaptées. Toutes ces nuisances prévues seront limitées au maximum grâce aux pratiques de raffinement, à un suivi rigoureux et à l’application stricte de critères d’arrêt pour garantir le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux ne pourront pas être réutilisés, car le protocole prévoit un prélèvement terminal des poumons, du liquide broncho-alvéolaire et du sang. Ces échantillons ne peuvent être obtenus que post-mortem et justifient que l’euthanasie soit réalisée en fin de procédure, garantissant la qualité et la validité des analyses prévues. Cette approche assure également que la procédure est uniforme et compatible avec le respect du bien-être animal. Les animaux seront euthanasiés à l’aide de dioxyde de carbone (CO₂), conformément aux recommandations réglementaires et éthiques en vigueur. Le gaz est introduit de manière progressive dans une chambre adaptée, ce qui entraîne une perte de conscience rapide. Les animaux sont observés en continu afin de garantir que la procédure se déroule correctement, et le décès est confirmé par l’absence de respiration et de réflexes. Cette méthode est réalisée uniquement par du personnel formé et autorisé. Une méthode secondaire validée peut être utilisée si nécessaire. L’utilisation du CO₂ permet de limiter les manipulations individuelles et d’assurer une procédure uniforme, réalisée dans des conditions contrôlées et compatibles avec le respect du bien-être animal.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, nous avons d’abord réalisé toutes les études possibles sans modèle animal. Nous avons notamment travaillé sur des cellules cultivées en laboratoire et utilisé des outils informatiques permettant de faire des prédictions. Ces méthodes nous ont permis d’obtenir de nombreuses informations et de réduire autant que possible le recours aux animaux. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des réactions d’un organisme vivant, en particulier pour comprendre l’inflammation des poumons et la manière dont le corps réagit à une infection ou une coinfection. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux reste nécessaire pour certaines étapes du projet.

Réduction

Le projet est conçu pour utiliser le minimum d’animaux nécessaire afin d’obtenir des résultats fiables. Le nombre de souris est défini en tenant compte de la quantité de données nécessaires pour répondre aux questions scientifiques, tout en évitant les groupes trop nombreux. Chaque animal sera étudié de manière optimale : plusieurs mesures et analyses seront effectuées sur le même animal (ex. analyse des poumons, du sang, observation de l’infection), ce qui permet de réduire le nombre total de souris. Nous utiliserons également des plans expérimentaux optimisés, qui combinent différentes analyses et exploitent au maximum les informations de chaque animal, sans compromettre la qualité des résultats. Cette approche respecte le principe des 3R : réduire le nombre d’animaux tout en obtenant des données fiables et significatives, et limiter les nuisances pour chaque animal.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux sont conçues pour réduire au maximum toute douleur, stress ou inconfort. Elles sont réalisées par du personnel spécialement formé et expérimenté. Des mesures spécifiques seront appliquées pour le bien-être des souris : Les anesthésies seront faites de manière sûre avec un gaz adapté, et la température corporelle sera maintenue pour éviter toute hypothermie. Les yeux seront protégés pendant l’anesthésie, et les animaux seront surveillés de près jusqu’au réveil pour détecter tout signe de malaise. La douleur sera gérée avec des médicaments si nécessaire, et les signes de détresse ou de changement de comportement déclencheront une intervention immédiate. Les animaux disposeront d’un environnement enrichi, avec matériaux de nidification, objets pour explorer et cachettes, pour favoriser leur comportement naturel. Toutes les manipulations seront limitées au strict nécessaire, la durée des expériences sera réduite au maximum, et des critères d’arrêt sont prévus pour interrompre immédiatement toute procédure si un animal montre des signes de souffrance. Ces mesures permettent de garantir le bien-être des animaux tout en recueillant des données scientifiques fiables et pertinentes

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont le modèle le plus approprié pour étudier, dans un organisme vivant, les infections respiratoires virales. Elles permettent de mieux comprendre les mécanismes immunitaires et les réactions des voies respiratoires, ce qui n’est pas possible uniquement avec des cellules en laboratoire. Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour étudier le rôle de la molécule MMP-7 lors d’infections simples ou de co-infections. Ces modèles animaux sont nécessaires pour observer l’ensemble des réponses immunitaires et les interactions complexes entre les différents types de cellules impliquées dans l’infection. Les souris auront entre 5 et 12 semaines, correspondant à de jeunes adultes avec un système immunitaire mature. Cette tranche d’âge permet d’obtenir des résultats fiables tout en limitant la gravité des symptômes et le stress pour les animaux. Elle représente donc un bon compromis entre pertinence scientifique et bien-être animal, conformément aux principes de raffinement.

Une partie des souris utilisées a un système immunitaire volontairement affaibli, ce qui les expose davantage aux infections et impose un hébergement en cages ventilées avec eau et nourriture stériles. 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes seront tuées pour que leurs tissus soient collectés. Chacune reçoit une injection de cellules de mélanome sous la peau après épilation de la zone, et certaines reçoivent en plus une injection deux fois par semaine pendant quatre semaines, sans anesthésie. Le projet vérifie dans un organisme vivant ce que des cultures cellulaires ont déjà montré sur le rôle de GATA6, et le porteur situe les retombées pour le traitement du mélanome "à terme".

Objectifs

Le mélanome est une forme de cancer de la peau particulièrement agressive. Même s’il est moins fréquent que d’autres cancers cutanés, il est responsable de la majorité des décès liés à ces cancers, car il peut se propager rapidement et s’adapter aux traitements. Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines cellules de mélanome changent de comportement et deviennent plus agressives et résistantes aux traitements. Nous étudions en particulier une molécule appelée GATA6, capable de modifier l’activité de nombreux gènes dans les cellules. Des résultats obtenus en laboratoire ont montré qu’un signal du système immunitaire, appelé interféron gamma, peut augmenter la quantité de GATA6 dans les cellules de mélanome. Dans ce cas, les cellules deviennent plus résistantes à certains traitements. À l’inverse, lorsque GATA6 est réduit, les cellules redeviennent sensibles aux traitements. Cela suggère que ce signal immunitaire et GATA6 agissent ensemble pour favoriser la résistance du cancer. Pour vérifier si ces phénomènes existent aussi dans un organisme vivant, nous étudierons la croissance de tumeurs de mélanome de souris. Nous comparerons des tumeurs avec ou sans GATA6 dans des souris ayant un système immunitaire fonctionnel ou affaibli, afin de comprendre comment ces facteurs influencent la progression du cancer. Dans un second temps, si GATA6 joue un rôle important, nous testerons son impact sur l’efficacité d’un traitement d’immunothérapie, qui aide le système immunitaire à combattre le cancer et qui est déjà utilisé chez des patients. L’objectif global de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes qui rendent certains mélanomes plus agressifs ou résistants aux traitements, afin de contribuer à terme à l’amélioration des traitements.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre le rôle d’une molécule appelée GATA6 dans la progression du mélanome. Nous cherchons à savoir comment elle influence la croissance des tumeurs et leurs interactions avec le système immunitaire. Les expériences réalisées chez l’animal permettront de compléter les résultats déjà obtenus en laboratoire, en observant ces phénomènes dans un organisme vivant. Nous étudierons notamment si GATA6 joue un rôle dans la vitesse de croissance des tumeurs, dans leur agressivité et dans la présence de cellules immunitaires à l’intérieur des tumeurs. Si cette molécule influence la réponse du système immunitaire, nous analyserons aussi son impact sur l’efficacité de certains traitements récents contre le cancer, appelés immunothérapies, qui visent à aider le système immunitaire à mieux combattre les cellules cancéreuses. À terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer les traitements du mélanome.

Procédures

Tous les animaux recevront une injection unique de cellules tumorales sous la peau. Avant cette injection, la zone sera épilée et désinfectée. L’intervention dure moins de deux minutes et est réalisée sous anesthésie. Certaines souris utilisées dans ce projet possèdent un système immunitaire affaibli et peuvent être plus sensibles aux infections. Afin de limiter ce risque, elles seront hébergées dans des conditions sanitaires renforcées (cages ventilées, manipulation sous hotte, nourriture et eau stériles). Certains animaux recevront également un traitement deux fois par semaine pendant quatre semaines, sous forme d’injections rapides (moins d’une minute), réalisées sans anesthésie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés à l’implantation de cellules tumorales sous la peau, à la croissance de la tumeur et aux injections répétées. La croissance de la tumeur peut entraîner l’apparition de lésions cutanées au niveau du site d’implantation. Les injections peuvent provoquer un stress temporaire lors des manipulations, ainsi que, plus rarement, une irritation ou une lésion au niveau du site d’injection. Certaines souris utilisées dans ce projet possèdent un système immunitaire affaibli afin de permettre la comparaison entre des animaux avec ou sans réponse immunitaire fonctionnelle. Ces animaux peuvent être plus sensibles aux infections. Afin de limiter ce risque, ils seront hébergés dans des conditions sanitaires renforcées. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance. Des critères d’arrêt stricts seront appliqués pour limiter au maximum les effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L’étude des interactions entre les cellules cancéreuses et le système immunitaire, ainsi que l’évaluation des traitements par immunothérapie, nécessitent de prendre en compte de nombreux types de cellules qui interagissent entre elles dans la tumeur. Les expériences réalisées en laboratoire, en cultivant des cellules entre elles, ne permettent de reproduire qu’une partie de cette complexité, notamment la capacité des cellules cancéreuses à échapper aux défenses de l’organisme. L’utilisation d’animaux avec un système immunitaire fonctionnel est donc nécessaire pour répondre aux objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été soigneusement déterminé pour en utiliser le moins possible tout en obtenant des résultats fiables. Il repose sur des résultats déjà obtenus en laboratoire ainsi que sur l’expérience de l’équipe avec ce type de modèle. Dans une première étape, nous comparerons plusieurs groupes de souris afin d’étudier le rôle de la molécule GATA6 et celui du système immunitaire dans la croissance des tumeurs. Chaque groupe comprendra 15 souris, ce qui permet d’obtenir des résultats solides malgré la variabilité entre individu, tout en limitant le nombre total d’animaux. Dans une seconde étape, nous étudierons l’effet d’un traitement d’immunothérapie sur ces tumeurs, également avec 15 souris par groupe. Cette deuxième phase ne sera réalisée que si les résultats de la première étape le justifient, afin d’éviter toute utilisation inutile d’animaux. Enfin, un maximum d’analyses sera réalisé à partir de chaque animal (analyses des tissus, des cellules, etc.), ce qui permet d’obtenir le plus d’informations possible tout en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux, le protocole est soigneusement planifié et optimisé à chaque étape. Des critères d’arrêt ont été définis pour interrompre les expériences si nécessaire et éviter toute souffrance excessive. Une anesthésie est utilisée lors des procédures qui le nécessitent afin de réduire le stress et l’inconfort. Les animaux sont observés quotidiennement, et leur état de santé est évalué régulièrement à l’aide d’une grille de suivi. Les souris sont hébergées en groupe de quatre par cage afin de respecter leur comportement social. Afin de limiter le risque d’infection, les souris possédant système immunitaire affaibli auront des conditions sanitaires renforcées (nourriture et eau stériles en plus des cages ventilées et de la manipulation sous hotte). Avant le début des expériences, elles bénéficient d’une période d’adaptation de deux semaines, incluant quelques jours sans manipulation puis une habituation progressive aux manipulations, afin de limiter le stress.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères dont le système immunitaire fonctionne de manière similaire à celui de l’être humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour étudier le cancer. L’injection de cellules murines de mélanome chez des souris avec un système immunitaire fonctionnel permet d’observer comment l’organisme réagit face aux cellules tumorales, comment celles-ci parviennent parfois à échapper aux défenses naturelles et comment l’immunothérapie peut contrer ces mécanismes. Un groupe de comparaison sera composé de souris dont le système immunitaire est défaillant, afin de mieux comprendre l’implication de ce dernier dans la progression des tumeurs. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines. Avant cela, elles seront maintenues pendant deux semaines pour s’adapter à leur nouvel environnement. À cet âge, leur système immunitaire est mature pleinement fonctionnel, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et comparables entre les animaux.

Injectées avec des cellules tumorales puis avec des bactéries jusqu'à quatre fois, 3 598 souris passent ensuite sous imagerie une à deux fois par semaine pendant trois à cinq mois, chaque séance sous anesthésie. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et seront toutes tuées, soit à l'atteinte d'un point limite, soit à date fixe pour le prélèvement de leurs organes. L'objet est de vérifier si des bactéries provoquent la formation d'amas de cellules immunitaires dans les tumeurs pulmonaires et si cela améliore l'effet des immunothérapies, qui ne fonctionnent aujourd'hui que chez environ 40 % des patients. Le RNT annonce aussi "une injection d'une substance qui agit sur le système nerveux", administrée deux fois, sans nommer cette substance ni décrire l'effet attendu.

Objectifs

Les immunothérapies, notamment les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ou ICI), ont révolutionné le traitement de plusieurs cancers solides, dont le cancer du poumon. Cependant, seuls jusqu'à 40 pour cent des patients atteints d'un cancer du poumon obtiennent une réponse après traitement par ces immunothérapies. Des recherches récentes ont montré que la présence, dans les tumeurs, de petits groupements de cellules immunitaires appelés "structures lymphoïdes tertiaires" (ou TLS) est liée à une meilleure réponse à ces traitements. Ces structures se forment en cas d’inflammation et disparaissent une fois l’inflammation résolue. Il a été récemment montré qu’une molécule, issue de certaines bactéries, pouvait provoquer l’induction de TLS dans les poumons de souris. Ce projet vise donc à tester si certaines bactéries peuvent, elles aussi, induire la formation de ces structures, et si cela améliore l’efficacité des immunothérapies dans des modèles murins de cancer. Nous chercherons aussi à comprendre les mécanismes impliqués dans la formation et la maturation des TLS, dans l’objectif, à long terme, de développer de nouvelles stratégies pour renforcer l’efficacité des traitements chez les patients atteints de cancer. (MODIFICATION) Une modification de projet est nécessaire afin de modifier la méthode réglementaire d'euthanasie pour obtenir des analyses plus fiables.

Bénéfices attendus

En France, le cancer du poumon touche plus de 50 000 personnes chaque année et est responsable de près de 33 000 décès. Il représente également un coût économique majeur estimé à plus d’un milliard d’euros par an pour le système de santé. Malgré les avancées en immunothérapie, notamment avec les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ICI), seulement environ 40 pour cent des patients atteints d’un cancer du poumon répondent favorablement à ces traitements. Ce projet vise à renforcer l’efficacité des immunothérapies. Il reposera sur un modèle de cancer du poumon chez la souris, dans lequel des bactéries seront administrées soit à titre préventif (comme une vaccination), soit à titre curatif (après l’apparition de la tumeur). L’objectif est d’évaluer leur capacité à induire des structures immunitaires dans les tumeurs, appelées structures lymphoïdes tertiaires (TLS), et à améliorer la survie des souris. Le projet permettra de déterminer : 1) si ces bactéries améliorent la survie des souris et induisent la formation de TLS ; 2) si l’effet thérapeutique de ces bactéries est dû à la formation des TLS ; 3) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’effet thérapeutique de ces bactéries 4) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’induction et de la maturation de TLS. Les résultats de ce projet pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteints de cancer, soit en utilisant directement ces bactéries comme traitement, soit en développant de nouvelles molécules capables de stimuler la formation de TLS dans les tumeurs. Cette approche pourrait s’appliquer non seulement au cancer du poumon, mais aussi à d’autres types de cancers dans lesquels la présence de TLS est associée à un meilleur pronostic

Procédures

Les animaux seront soumis à : des injections pour administrer les cellules tumorales (animal vigil ou anesthésié, 1 à 2 fois, 1 minute), des injections pour administrer les bactéries (animal vigil, 1 à 4 fois, 1 minute), un suivi par imagerie (animal anesthésié, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois, 15 minutes) avec injection au préalable de produit de contraste (animal vigil, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois maximum, 1 minute) pour les animaux avec tumeurs, une injection d'une substance qui agit sur le système nerveux (animal vigil, 2 fois, 1 minute), une injection d’anticorps dans certains cas (animal vigile, jusqu’à 6 fois au maximum, à raison de 2 fois par semaine pendant 3 semaines au maximum, 1 minute) (MODIFICATION) ainsi qu’une euthanasie par une méthode réglementaire (animal sous anesthésie générale et analgésie, 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les manipulations des animaux pourront induire un stress. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les injections répétées peuvent induire un risque de péritonite. L’injection de bactéries pourra engendrer une réponse inflammatoire générant une douleur modérée à l’animal associée à une difficulté de se mouvoir et s’alimenter. L’injection de cellules tumorales pourrait engendrer une gêne à se mouvoir. L'imagerie in vivo sera effectuée sous anesthésie et pourra engendrer une baisse de la thermorégulation. Ces administrations et anesthésies pourront également engendrer une gêne respiratoire transitoire. L'induction de tumeur pourra induire une douleur modérée, une perte de poids ainsi qu'une réduction de la mobilité.

Devenir

Les souris injectées avec des cellules tumorales développeront des tumeurs pulmonaires. Dès l’apparition de signes cliniques indiquant l’atteinte d’un point limite défini, elles seront euthanasiées afin de prévenir toute souffrance inutile. Les autres animaux seront euthanasiés à des temps définis expérimentalement pour permettre le prélèvement d’organes. Ces échantillons seront utilisés pour analyser la réponse immunitaire induite, notamment l’organisation locale du système immunitaire suite à l’injection de bactéries ou en réponse à la présence de cellules tumorales.

Remplacement

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du BCG (Bacillus Calmette-Guérin), une souche atténuée de Mycobactérium Bovis, et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo.

Réduction

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du traitement et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé par un calcul de puissance statistique et réduit au strict nécessaire pour atteindre les objectifs sans compromettre la validité des résultats. En raison de la variabilité de la croissance tumorale entre les souris, 7 souris par groupe seront utilisées dans les expériences suivant l’effet des traitements sur la survie et la progression tumorale (jusqu’à atteinte d'un point limite ou au maximum 3 mois après la dernière injection de cellules tumorales). Pour étudier la présence et le stade de maturation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS), 3 souris par groupe seront utilisées à chaque point temporel. Afin d’établir les cinétiques d’induction et de maturation des TLS, 5 souris par time point seront nécessaires. Les analyses par cytométrie nécessiteront quant à elles 7 souris par groupe et par point temporel. Les écarts attendus entre les groupes devraient garantir une puissance statistique suffisante malgré la taille restreinte des groupes. Pour les expériences nécessitant des souris survivantes, 20 animaux seront inclus initialement pour assurer un nombre suffisant de survivantes, qui seront ensuite soit réinjectées avec des cellules tumorales, soit euthanasiées pour récupérer les cellules immunitaires. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie, permettant des mesures répétées sur un même animal. Chaque expérience sera répétée au moins 2 fois afin d’assurer la reproductibilité des résultats, conformément aux bonnes pratiques expérimentales. Au total, 3 598 animaux seront utilisés dans ce projet

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des portoirs ventilés dans un environnement A2 et ne seront expérimentés qu'après une semaine minimum de stabulation. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (hébergement individuel limité à la fin des expériences s’il ne reste qu’une seule souris survivante dans la cage) en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec 2 des enrichissements ci-après : 6 à 10 bâtonnets de coton, 1 à 2 rouleau en carton ou 1 à 2 maisonnette. La taille des cages est variable, permettant d’héberger jusqu’à 12 souris, tout en respectant la densité réglementaire. Dans les situations nécessitant un hébergement individuel de l’animal (dernier animal dans la cage), il bénéficiera d’un enrichissement en plus et il sera vérifié par le responsable du Bien-Être Animal de l'animalerie pour valider son hébergement individuel. Les conditions de températures et d'hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Dans la réalisation de ce projet, l'ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie). Tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum les nuisances. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. L'évolution tumorale sera suivie et mesurée. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les animaux seront vérifiés quotidiennement. Ils seront également pesés au minimum deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de la procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie). (MODIFICATION) L’utilisation d’une analgésie avant l’anesthésie et la perfusion intracardiaque constitue une mesure de raffinement visant à limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux. L’administration préventive d’un antalgique permet d’assurer une meilleure prise en charge de la douleur potentielle liée à l’acte chirurgical.

Choix des espèces

L’utilisation de souris comme modèle est un outil précieux pour étudier les structures lymphoïdes tertiaires (TLS), car leur système immunitaire fonctionne de manière similaire à celui des humains, en particulier pour les réponses immunitaires innée et adaptative. Malgré quelques différences, la souris reste un modèle pertinent pour comprendre comment se forment les TLS et comment les cellules immunitaires interagissent avec les cellules cancéreuses dans le microenvironnement tumoral. Le modèle de cancer que nous utiliserons a déjà permis d’observer des TLS chez la souris. De plus, il existe de nombreux outils expérimentaux adaptés à ce modèle, comme des anticorps spécifiques ou des cellules tumorales modifiées permettant le suivie de la croissance tumorale par imagerie, ce qui facilite les analyses. Enfin, plusieurs protocoles déjà validés chez les souris commerciales femelles non génétiquement modifiées permettent de mener les expériences efficacement, sans augmenter le nombre d’animaux, ce qui est essentiel dans une démarche préclinique responsable. Les animaux seront reçus à l'âge de 7 ou 11 semaines puis mis en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire mature. Les animaux seront identifiés par un code couleur et le nombre de points fait aux feutres sur la base de la queue de l'animal.