Oncologie

Une ablation des ovaires ou des testicules, puis quinze jours plus tard une injection de cellules cancéreuses au cœur de l'hypophyse: 345 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à trente-cinq jours. S'y ajoutent quatre prises de sang et, pour certains, des implants hormonaux sous la peau. Le projet cherche à comprendre comment le sexe et les hormones stéroïdes influencent le développement des tumeurs de l'hypophyse. Le porteur en attend des traitements plus personnalisés selon le sexe et le statut hormonal des patients, perspective laissée au conditionnel.

Objectifs

Le projet a pour but d'explorer comment le sexe et les hormones stéroïdes sexuelles influencent le développement, la progression, le comportement invasif ; et les caractéristiques cliniques, histopathologiques et moléculaires des tumeurs hypophysaires.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet visant à approfondir les connaissances fondamentales sur les différences liées au sexe et le rôle des hormones stéroïdes sexuelles dans le développement et l'agressivité des tumeurs hypophysaires. Les stéroïdes sexuels pourraient favoriser l'invasivité tumorale par des mécanismes impliquant la prolifération cellulaire et les interactions avec le microenvironnement tumoral. En mettant l'accent sur le sexe comme variable biologique-clé en biologie tumorale, ce projet pourrait améliorer les traitements actuels et mener à des innovations thérapeutiques, offrant ainsi des solutions plus personnalisées aux patients en fonction de leur sexe et de leur statut hormonal. De nouvelles thérapies ciblées pourraient être développées pour moduler la synthèse et l'action des stéroïdes sexuels, notamment pour traiter les adénomes hypophysaires résistants aux traitements conventionnels chez l'homme et la femme.

Procédures

Procédures chirurgicales : Injection stéréotaxique de cellules tumorales hypophysaires dans l'hypophyse sous anesthésie générale gazeuse et sous analgésiques (durée 30 min). Chez certains rats femelles, l’injection de cellules cancéreuses sera précédée 15 jours avant du retrait des ovaires (sous anethésie générale gazeuse et sous analgésiques; durée 20 min). Chez certains rats mâles, l’injection de cellules hypophysaires sera précédée 15 jours avant du retrait des testicules (sous anesthésie générale gazeuse et sous analgésique, durée 15 min). Prélèvements sanguins: 4 prises de sang à J1, J14 , J28 et J35 post-chirurgie pour le suivi hormonal (10 min par prélèvement). Chez certains rats ,traitements pharmacologiques par insertion sous cutanée sous anésthésie d'implants à libération continue d'un anti-aromatase ou d'un antagoniste de srécepteurs des oestrogènes.

Impact sur les animaux

Le nuisances attendues sont : - douleurs modérés et stress liés au retrait des testicules/ovaires - douleurs et stress lié à l'intervention chirurgicale d'implantation tumorale - léger stress lié aux prélèvements sanguins, à la prise régulière de mesures du poids.

Devenir

Les animaux seront gardés vivants après l’ovariectomie des femelles et l’orchidectomie des mâles et seront soumis 15 jours après à une injection stéréotaxique de cellules hypophysaires pour induire une tumeur. Tous les animaux seront euthanasiés à 35 jours post-injection stéréotaxique des cellules hypophysaires ; le cerveau et les tumeurs hypophysaires seront prélevés pour faire des analyses biochimiques et moléculaires.

Remplacement

Les modèles animaux permettant d’étudier la progression tumorale chez l'être humain sont utiles à la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénicité tumorale et l’identification de possibles cibles thérapeutiques et/ou diagnostiques. Seule l’expérimentation utilisant un modèle in vivo mimant le plus fidèlement possible le microenvironnement tumoral permettra de répondre à nos questions. Le modèle in vivo permet notamment d’évaluer les interactions avec le système immunitaire ainsi que les régulations endocrines, ce qui est actuellement impossible avec des modèles in vitro ou in silico. Actuellement, il n’existe pas de modèle alternatif n’utilisant pas d’animaux qui permettrait de mimer fidèlement la pathologie telle qu’elle est observée chez l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés à été réduit au strict minimum afin d'avoir un nombre suffisant d’animaux pour réaliser une analyse statistique fiable. Ce nombre a été calculé à partir de données déjà publiées par notre laboratoire sur ce même modèle.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages que pourraient ressentir les animaux. Ils seront maintenus par trois dans chaque cage avec de l’enrichissement du milieu par copaux de bois et tunnel en carton. Dans le cadre de leur habituation à l’expérimentateur et afin d’améliorer leur bien-être, les rats reçoivent 3 jours d’affilé des chatouillis pour mimer leurs comportements sociaux de jeu. Ces chatouillis seront répétés juste avant d’opérer les animaux. Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaitre tout signe de souffrance. La chirurgie est réalisée sous anesthésie gazeuse. Afin d’éviter toute hypothermie durant la chirurgie, l'animal est placé sur un tapis chauffant afin de maintenir sa température corporelle à 37°C. Pour minimiser les douleurs et stress potentiels de l’animal, des analgésiques sont administrés. Les rats sont pesés avant et quotidiennement après toute procédure pour évaluer la perte de poids. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.

Choix des espèces

Actuellement, le rat est la seule espèce animale chez laquelle a été développé un modèle de tumeur hypophysaire reproduisant le microenvironnement tumoral des tumeurs hypophysaires humaines. Les animaux seront utilisés à 10-12 semaines, âge auquel ils sont sexuellement matures.

1 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, jusqu'à vingt injections directement dans la tumeur, des prélèvements de sang derrière l'œil et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le projet teste des ARN thérapeutiques contre le cancer colorectal, dont l'activité a déjà été observée sur cellules en culture. Le porteur écrit que le recours à l'animal devient "indispensable" pour juger l'effet dans un "organisme entier", avant une utilisation espérée chez l'humain.

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but d'évaluer le potentiel antitumoral d’ARN thérapeutiques sur des modèles précliniques de cancer. Malgré de nombreuses avancées, en particulier avec l’arrivée des thérapies ciblées puis des immunothérapies, les thérapeutiques anticancéreuses actuellement disponibles restent limitées et des résistances émergent le plus souvent, nécessitant un changement de stratégie thérapeutiques. Il est donc essentiel de développer des nouveaux traitements, dont les mécanismes d’actions seraient différents des traitements actuellement utilisés, afin d’élargir le spectre des options thérapeutiques ais également de pouvoir adapter le traitement au patient et aux caractéristiques biologiques et moléculaires tumorales. Les arylsulfonamides sont une classe de drogue dont l’intérêt pour le traitement des cancers a été évalué. Nous avons récemment développé une approche thérapeutique via des ARN thérapeutiques, et avons fait la preuve de concept in vitro de leur activité antitumorale. Nous souhaitons donc avec ce projet valider nos observations in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider l'utilisation d'ARN thérapeutiques pour le traitement des cancers, en particulier le cancer colorectal. A plus long terme, ce projet pourrait aboutir au développement en clinique de ces mêmes ARN thérapeutiques.

Procédures

Greffe de cellules tumorales sous-cutanée dans les flancs : Durée 10 minutes - 1 fois par animal / Injection intrapéritonéale de luciferine pour bioluminescence : Durée 1 minute - 5 à 6 fois par animal - Anesthésie gazeuse durant l'imagerie : Durée 30 minute - 5 à 6 fois par animal / Prélèvements sanguins retroorbitaires - Durée 2 minutes - 3 fois par animal / Injection de traitements par voie IV - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / MODIFICATION - Injection de traitements par voie intratumorale - Durée 2 minutes - 5 A 20 FOIS PAR ANIMAL / Injection de traitements par voie intrapéritonéale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal

Impact sur les animaux

La greffe de lignées cellulaires tumorales, suivi de la croissance des tumeurs, engendreront une altération de l'état général des animaux avec perte de poids, fatigue, et anémie principalement. Le traitement par indisulam pourrait engendrer certaines toxicités, même si la littérature décrit des toxicités systémiques limitées chez l'homme et la souris (rares anémies). Nous n'avons pas encore évalué la toxicité potentielle des ARN thérapeutiques, mais celle-ci sera évaluée grâce aux expériences de mise au point. LES INJECTION REPETEES INTRATUMORALES POURRAIENT ENGENDRER UN SURCROIT DE STRESS ET D'INCONFORT POUR LES ANIMAUX.

Devenir

Des tests sur des cellules tumorales cultivées au laboratoire nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles animaux est indispensable mieux comprendre leur effet dans un organisme entier, nottament concernant la toxicité. Cette étape est primordiale puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme. Afin d'évaluer l'effet de nos traitements sur les tumeurs, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie et mise à mort systématique de l'ensemble des animaux du projet. L'étude biologique des tumeurs au laboratoire, ainsi que celles des tissus des autres organes est indidspensable pour évaluer les effets antitumoraux mais également la toxicité des traitements testés.

Remplacement

Des tests sur des cellules tumorales et des cellules normales en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action du traitement dans un organisme entier proche de l'homme, incluant des paramètres comme le développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques etc. qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux, nous utiliserons les mêmes animaux pour évaluer à la fois la prise et la croissance tumorale, la dose des traitements et leur toxicité. Nous utiliserons également les mêmes souris pour nos contrôles positifs et négatifs dès que ce sera possible. Cette association nous permet de réduire le nombre de souris contrôles utilisées. Le nombre d’animaux par lot sera également réduit au maximum afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Des enrichissements (maisons rouges) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, de la nourriture humidifiée sera accessible directement dans la cage pour éviter la déshydratation des souris. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant les injections, et lors de la phase de réveil. Des injections d'analgésique pré et postopératoire pourront être réalisées en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal. Un suivi attentif quotidien par du personnel compétent et formé, weekend compris, sera également mis en place. L'environnement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

La souris représente l'animal classiquement décrit dans littérature pour ce type d'éxpérimentation. Nous utiliserons des lignées génétiquement modifiée immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale des xénogreffes de cellules humaines. L'utilisation d'un modèle syngénique nous permettra de valdier nos observations dans un système immunocompétent ce qui est essentiel pour envisager un dévellopement chez l'homme par la suite. Comme ce qui est classiquement décrit dans littérature pour ce type d'expérimentation, les animaux utilisés seront de 8 à 12 semaines.

Pour tester si des anticorps ciblant certaines bactéries améliorent la réponse à l'immunothérapie, 3 008 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Greffées d'une tumeur, elles reçoivent des immunothérapies, des injections par plusieurs voies et jusqu'à six gavages, la croissance tumorale pouvant provoquer une douleur locale modérée et une perte de poids. Le porteur affirme que seul un organisme entier au système immunitaire proche de l'humain permet d'étudier ces interactions. Un suivi trois fois par semaine et des points limites encadrent la mise à mort des animaux dont l'état se dégrade.

Objectifs

L’immunothérapie, utilisée seule ou avec d’autres médicaments qui attaquent directement les cellules cancéreuses ou empêchent la tumeur de se développer, est aujourd’hui un traitement clé pour les personnes atteintes de cancer. Même si ces traitements combinés apportent des bénéfices importants, beaucoup de patients ayant un cancer avancé ou ayant déjà fait des métastases ne répondent toujours pas bien au traitement. La plupart des cancers qui réagissent aux traitements d’immunothérapie (comme ceux du poumon, de la tête et du cou, de la vessie, de l’œsophage ou du côlon) se développent dans des zones du corps où vivent naturellement des microbes, comme la peau ou les muqueuses. Ces microbes — bactéries ou champignons — ne causent pas directement le cancer, mais lorsqu’ils se retrouvent à l’intérieur de la tumeur, ils peuvent créer un environnement qui aide le cancer à évoluer ou à se propager. On sait aussi que les patients atteints de cancer présentent souvent un déséquilibre dans leur microbiote intestinal (la population de microbes vivant dans l’intestin). Leur système immunitaire répond moins bien à certains microbes liés au cancer, comparé à celui de personnes en bonne santé. Notre objectif est de montrer que différentes stratégies pourraient aider les patients traités par immunothérapie : • ajouter des anticorps capables de neutraliser ou de détruire les microbes associés aux tumeurs, • ou encore vacciner les patients contre ces microbes. Ces approches pourraient améliorer la réponse aux immunothérapies et donc le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

Nous voulons montrer qu’il est possible d’utiliser des anticorps spécialement conçus pour cibler certaines bactéries afin d’aider les patients à mieux répondre aux immunothérapies contre le cancer. Nous pensons que le fait d’apporter directement au patient des anticorps capables de neutraliser ou détruire ces microbes liés au cancer — que ce soit sous forme d’anticorps seuls, ou même grâce à une vaccination contre ces microbes — pourrait transformer la manière dont on traite les cancers avec l’immunothérapie. Ce projet servira à prouver que ces méthodes peuvent fonctionner et permettra de développer ces nouvelles pistes de traitement.

Procédures

Injection de tumeurs (1 fois par procédure), injections d’immunothérapies (3 fois par procédure à 2 jours d’intervalle), injections en intra-veineuse, en intrapéritonéal ou en sous cutané (1 ou 2 fois par procédure), gavages (jusqu’à 6 par procédure, sur des temps d’intervalles entre deux gavages allant de 20 minutes à plusieurs jours/semaines). Chacune de ces interventions dure moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lié à la manipulation. Les gavages peuvent provoquer une contrainte transitoire et légère lors du geste en lui-même. La croissance d’une tumeur peut entrainer une gêne locale et une douleur locale modérée. Les traitements et la tumeur peuvent entraîner une perte de poids modérée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de pouvoir réaliser nos analyses.

Remplacement

Pour réaliser ce projet, l’usage d’animaux vivants est indispensable. En effet, seul un organisme complet permet d’observer l’ensemble des réactions du corps face au cancer et aux immunothérapies, notamment lorsque le microbiote intestinal est déséquilibré. Ces interactions complexes entre les organes, le système immunitaire, la tumeur et les microbes ne peuvent pas être reproduites en laboratoire. Les organoïdes, par exemple, ne recréent qu’un seul tissu ou un seul organe. Ils ne permettent donc pas d’étudier l’effet d’un traitement donné par voie orale ou injecté dans le sang sur différents organes en même temps. Or, dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment les anticorps influencent : • la composition du microbiote intestinal, • les microbes présents dans la tumeur, • le fonctionnement du système immunitaire, • et la croissance de la tumeur. Toutes ces informations ne peuvent être obtenues qu’en étudiant un organisme entier avec un système immunitaire complet et proche de celui de l’être humain, comme la souris.

Réduction

Dans cette étude, nous ferons tout notre possible pour regrouper les expériences afin de limiter le nombre d’animaux utilisés comme groupes témoins. Ensuite, le projet est organisé en plusieurs étapes successives : si une de ces étapes montre que notre hypothèse est fausse, l’étude sera immédiatement arrêtée, ce qui permettra de réduire encore davantage le nombre de souris utilisées. Le nombre d’animaux est strictement encadré pour respecter la règle des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer). Grâce aux travaux précédents menés dans notre laboratoire, nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant par calcul statistique réalisé pour garantir un nombre minimum d’animaux tout en obtenant des résultats fiables. Les doses d’immunothérapie, d'antibiotiques et de bactéries utilisées dans nos expériences ont déjà été établies et validées par notre laboratoire. Si une procédure doit être arrêtée tôt parce que le microbiote intestinal d’une souris ne correspond pas aux critères nécessaires — et tant qu’aucune manipulation n’a encore été faite pouvant modifier son système immunitaire — la souris pourra être réutilisée dans une autre partie du projet afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière ainsi que la mesure de la surface tumorale et la prise de poids (3x/semaine) permettront le suivi des animaux (prostration, auto-agressions, perte de poids, animal froid) et l’éventuelle mise en place de traitements analgésiques (buprémorphine, NaCl pour réhydratation) ou l’euthanasie si nécessaire.

Choix des espèces

La génétique de la souris est proche de celle de l'Homme et bien décrite au niveau de la littérature scientifique, ce qui rend comparable les voies de signalisation immunologiques des tumeurs entre l'Homme et la souris. Notre centre de recherche utilise principalement des souris, ce qui offre de nombreux avantages en termes d'élevage, d'animalerie, d'expertise en techniques d'expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Aussi, les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l'immunité, l'effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité et l'immunité intestinale. Toutes ces raisons scientifiques, pratiques et éthiques font de la souris un animal indispensable dans la réalisation de ce projet. Nous utiliserons des animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 8 semaines, ce qui nous permettra d'étudier le système immunitaire à un stade de développement optimal et fonctionnel.

Élevées pour développer spontanément une arthrite inflammatoire, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est génotypée par poinçonnage de l'oreille sur animal vigile, sans anesthésie mentionnée. Le porteur décrit une inflammation articulaire apparaissant vers huit à dix semaines, avec un gonflement des pattes pouvant affecter la mobilité. Sur les 1 200 animaux, 900 sont expédiés vers un autre établissement pour y être utilisés, 300 servent à l'élevage et sont tués avant vingt semaines pour limiter l'aggravation de la maladie avec l'âge.

Objectifs

Ce projet décrit une procédure de l'élevage avec la prise en charge des animaux d’une lignée de souris développant progressivement une arthrite inflammatoire. Ces souris sont un modèle d’inflammation articulaire qui est causée par un mélange de facteurs génétiques, environnementaux et liés aux microbes présents dans l’intestin. Normalement, le corps produit une molécule inhibant l’interleukine 1 qui va limiter l’inflammation. Mais chez ces souris, cette molécule est absente, ce qui entraîne une inflammation excessive qui va notamment toucher les articulations. De plus, des éléments comme certains additifs alimentaires ou les antibiotiques ou les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal peuvent aggraver cette inflammation. L’objectif de cet élevage est de produire des animaux reproduisant la maladie observée chez l'homme. Ces animaux seront par la suite utilisés dans des projets de recherche afin d'étudier l’arthrite inflammatoire et, à terme, aider à la recherche sur cette maladie chez l’homme qui représente 1 million de patients en France.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre à l'équipe de recherche et à leurs partenaires d’avoir les souris nécessaires pour mener leurs études sur l’arthrite inflammatoire. A long terme, ces souris aideront les chercheurs à : mieux comprendre l’arthrite, identifier des marqueurs pour mieux la diagnostiquer, trouver de nouvelles façons de traiter cette maladie, tester de nouveaux médicaments anti-inflammatoires et évaluer leur efficacité par rapport aux traitements déjà disponibles pour les patients atteints d’arthrite.

Procédures

Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué après l’âge de 14 jours. Cette méthode consiste à prélever sur animaux vigiles un petit échantillon de tissu (environ 2 mm de diamètre) sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement certains animaux utilisés pour les croisements seront génotypés.

Impact sur les animaux

Les souris qui n’expriment pas le récepteur inhibant la molécule de l’inflammation interleukine 1 peuvent, pour certaines, développer spontanément une inflammation articulaire à partir de l'âge de 5 semaines. Cependant, les observations récentes de l’équipe de recherche démontrent un âge plus tardif pour l’apparition de l’arthrite, vers 8-10 semaines. Il s’agit de symptômes comme une rougeur ou un gonflement des articulations. Lorsque l’atteinte est sévère, elle peut se manifester par un gonflement des pattes qui peut affecter la mobilité de la souris. Selon les observations antérieures, ces souris ne développent que très peu de signes généraux et leur mobilité est peu affectée. Les souris reproductrices pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage (douleur légère de courte durée).

Devenir

Une partie des animaux sera expédiée en début ou avant l’expression du phénotype dommageable et utilisée dans des projets de l’équipe de recherche dans un autre établissement utilisateur (900 animaux pour l’expérimentation en 5 ans). Une autre partie des animaux sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement (300 animaux pour l’élevage en 5 ans). Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 20 semaines, pour limiter l’évolution du phénotype dommageable avec l’âge. Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.

Remplacement

L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie l’arthrite, qui est une maladie complexe multifactorielle faisant intervenir différents facteurs (le système immunitaire, les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal, le patrimoine génétique et l’environnement), différents organes et la présence d’une inflammation à la fois chronique locale (articulation) et systémique. Par ailleurs, l’utilisation d’un modèle mammifère vertébré est nécessaire, car les organes impliqués dans la physiopathologie de l’arthrite (notamment le système immunitaire, l’intestin, les articulations et les tissus lymphoïdes associés) présentent des différences anatomiques, physiologiques et immunologiques importantes chez les espèces non mammifères, limitant leur pertinence translationnelle pour l’étude de cette pathologie humaine. Afin d'étudier l'interaction entre l’environnement, le microbiote intestinal et le génome de l'hôte, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (par exemple, modèles cellulaires).

Réduction

Un nombre total de 1200 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour l’élevage et les animaux nécessaires pour l’expérimentation pour les projets scientifiques associés. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, le modèle pourra être cryoarchivé dans notre établissement.

Raffinement

Tous les animaux mutés de manière homozygote pour la modification génétique et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 5 semaines seront suivis à partir de 4 semaines et ce jusqu'à leur envoi avant 8 semaines vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation (ou leur mise à mort) : une évaluation du bien-être animal sera réalisée en prenant en compte l'arthrite, la sensibilité articulaire, l'aspect général, le comportement et la mobilité de l’animal. En fonction de l’état de l’animal, des mesures de raffinement seront mises en place selon les conseils de la vétérinaire et/ou la SBEA (disponibilité de la nourriture directement dans la cage, mise à disposition d’une solution de réhydratation gélifiée, augmentation de la fréquence du suivi, application d'un antiseptique). Les points limites précoces et spécifiques pour les signes cliniques de l’arthrite ont été définis. Si, malgré le raffinement mis en place, un point limite est atteint, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour l’élevage et mis à mort avant 20 semaines (pour limiter les nuisances liées à la progression de l’arthrite avec l’âge).

Choix des espèces

Les souris sont souvent utilisées pour étudier l’arthrite, car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l’alimentation, l’environnement, les microbes intestinaux et l’articulation elle-même. Dans ce projet, nous utilisons une lignée de souris qui ne produit pas une protéine clé entraînant ainsi une inflammation articulaire ressemblant à une arthrite chez l’humain. Ce modèle génétique de la maladie n’existe que chez la souris. Les souris seront utilisées pour les croisements dès l’âge de 7-8 semaines (maturité sexuelle) et ce jusqu’à 20 semaines, pour limiter l’expression du phénotype dommageable qui progresse avec l’âge. Le phénotype dommageable d’arthrite est susceptible d'apparaître à partir de l'âge de 5 semaines, mais dans l’élevage de l’EU du chercheur ne se manifeste pas avant 8-10 semaines. Les animaux envoyés pour expérimentation auront ainsi un âge de 5-8 semaines pour limiter et potentiellement éviter l’expression du phénotype dommageable avant l’envoi.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour étudier leurs poumons, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des inhalations intranasales sous anesthésie, des particules virales et des injections abdominales répétées destinées à supprimer certaines cellules immunitaires. Le projet cherche à lever un frein immunitaire empêchant les cellules du poumon de se reprogrammer. Les applications en médecine régénérative, jusqu'au cœur ou au foie, sont annoncées à terme, quand les inhalations et les injections répétées, elles, sont immédiates.

Objectifs

Durant le développement, une cellule souche est capable de se spécialiser en n’importe quelle autre cellule différenciée et mature ayant une fonction définie. Cet état de différenciation est réversible et cela a été montré récemment notamment grâce à des travaux démontrant la possibilité de reprogrammer une cellule différenciée en une cellule souche en utilisant des gènes particuliers. Diverses études ont montré que cette reprogrammation cellulaire ne fonctionnait pas systématiquement dans tous les tissus à cause de la présence de certains freins. Parmi ces tissus, le poumon semble contenir un frein qui empêche ses cellules de se reprogrammer, même s’il est connu comme ayant la capacité de se régénérer. De ce fait, le but est d’identifier ce frein puis de le lever afin de comprendre le processus de reprogrammation cellulaire dans le poumon. Des études préliminaires nous ont permis d’identifier le système immunitaire comme frein potentiel à cette reprogrammation cellulaire dans le poumon. Dans ce contexte, nous souhaiterions étudier l’interaction entre la reprogrammation cellulaire du tissu pulmonaire avec le système immunitaire.

Bénéfices attendus

La reprogrammation cellulaire d’un tissu peut avoir lieu sous certaines conditions en levant certaines barrières responsables du blocage de la reprogrammation. Nous souhaiterions donc approfondir notre étude dans un modèle de souris où nous allons supprimer certaines cellules du système immunitaire et étudier le chemin des cellules en cours de reprogrammation dans le poumon. Les connaissances issues de ce travail pourraient, à terme, contribuer au développement de nouvelles approches en médecine régénérative, visant à favoriser la réparation des tissus endommagés. Ces avancées pourraient avoir des retombées plus larges, au-delà du poumon, pour améliorer les stratégies de régénération d’autres organes et soutenir la recherche de traitements innovants pour des maladies aujourd’hui difficiles à soigner telles que les insuffisances cardiaques ou hépatiques.

Procédures

Les animaux seront tout d’abord, au jour 0, soumis à une anesthésie et à une inhalation par voie intra-nasale d’un composé qui va permettre la déplétion de cellules immunitaires dans le poumon. Pour l’anesthésie et l’inhalation, la procédure totale dure environ 4 minutes (2 minutes d’anesthésie, 2 minutes d’administration par inhalation et réveil). Au jour 3, les animaux sous anesthésie inhalent des particules virales, et recevront une injection au niveau de l'abdomen d’un composé déplétant les cellules immunitaires qui se trouvent dans la circulation sanguine. Le geste dure environ 4 minutes (2 minutes d’anesthésie, 2 minutes inhalation). L’injection au niveau de l'abdomen se fera en 15 secondes en maintenant la souris, déjà anesthésiée, en contention sur le dos (geste maitrisé dans notre laboratoire). Pour la totalité de la procédure, l’inhalation intra-nasale sera réalisée 2 fois, au jour 0 et au jour 3. L’injection dans l'abdomen sera, quant à elle, réalisée trois fois : au jour 3 sur souris anesthésiées, au jour 6 et 9 sur souris vigiles.

Impact sur les animaux

Un saignement, une irritation et ou un grattage excessif de la région nasale peuvent apparaitre à la suite de l’administration intra-nasale. Pour effectuer l’injection intrapéritonéale, la souris sera maintenue sur le dos grâce à une contention. Ce geste causera un stress temporaire chez l’animal. Les effets indésirables liés à l’injection au niveau de l'abdomen sont limités au site d’injection. En effet, l’apparition de rougeur, d’une nécrose ou d’un saignement est possible.

Devenir

Les animaux seront mis à mort puisqu'il est nécessaire d'étudier leurs poumons.

Remplacement

Afin d’étudier l’impact du système immunitaire dans la reprogrammation des cellules du poumon, nous sommes dans l’obligation de recourir à un modèle animal. Des études in vitro faites dans notre laboratoire n’ont pas permis de valider notre hypothèse car il ne nous est pas possible de récapituler le système immunitaire in vitro. Dans un but de mener des études plus approfondies et pour se rapprocher de la médecine régénérative (discipline permettant de réparer ou remplacer les tissus abimés grâce à des cellules souches) il nous est indispensable de passer à des modèles in vivo.

Réduction

Les effectifs définis dans ce protocole ont été déterminés grâce à un logiciel tenant compte des exigences statistiques nécessaires à l’exploitation des résultats. Afin de limiter le nombre nécessaire de souris, nous avons réduit au maximum le nombre de souris utilisées (26 par lot et nous aurons 4 lots de souris) dans notre procédure sans en compromettre l’interprétation et la puissance statistique des analyses.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement sur les 4 jours suivant l’administration par voie intra-nasale et intrapéritonéale afin d’identifier toute complication liée au mode d’inoculation (gonflement de la trachée/région du cou). Les animaux seront par la suite observés 2 fois dans la semaine afin d’identifier tout signe potentiel de mal-être ou de souffrance. Nous avons défini une série de points limites (Grille de score) conduisant à l’arrêt de nos protocoles et à la mise à mort immédiate des souris concernées. Notre procédure implique l’ingestion d’un médicament dans de l’eau de boisson. Au vu du goût amer de ce médicament, du glucose est rajouté dans l’eau afin d’en augmenter l’appétence.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente du fait de l’existence de modèles génétiquement modifiés bien caractérisés qui permettent d’étudier la reprogrammation cellulaire à l’échelle de l’organisme. Nous utiliserons des souris entre l’âge de 6 et 8 semaines car c’est à cet âge que le geste de l’administration par voie intra-nasale fonctionne le mieux. Technique ayant été validée lors d’un projet antérieur.

Greffées d'une tumeur sous anesthésie, mesurées au pied à coulisse une à deux fois par semaine, gavées jusqu'à quarante fois, suivies par imagerie: 730 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des fragments de tumeurs humaines, ce qui suppose des animaux immunodéficients, et subit une chirurgie supplémentaire. Le projet teste des inhibiteurs du métabolisme des cellules cancéreuses de la peau, seuls ou combinés, pour freiner la croissance tumorale. Les traitements plus efficaces sont espérés à moyen et long terme, quand la greffe et les gavages répétés, eux, sont immédiats.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment se développent certains cancers de la peau appelés carcinomes épidermoïdes cutanés, afin d’identifier de nouvelles possibilités de traitement. Les cellules cancéreuses ont besoin de beaucoup d’énergie et de nutriments pour se multiplier rapidement. Pour y parvenir, elles modifient leur fonctionnement interne et utilisent différemment les ressources disponibles dans l’organisme. Cette capacité d’adaptation leur permet de continuer à croître et parfois de résister aux traitements existants. Notre travail vise à identifier ces mécanismes d’adaptation et à déterminer s’il est possible de les bloquer à l’aide de médicaments ciblant spécifiquement le métabolisme des cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains cancers de la peau se développent et progressent. En particulier, il vise à étudier la manière dont les cellules cancéreuses produisent et recyclent les éléments indispensables à leur multiplication. Nous testerons différentes stratégies thérapeutiques, administrées seules ou en association, afin d’évaluer leur capacité à freiner la croissance tumorale. Ces essais seront réalisés dans des modèles reproduisant au mieux les conditions réelles d’une tumeur dans l’organisme, incluant son environnement, sa vascularisation et ses interactions avec les tissus voisins. Les résultats attendus permettront d’identifier des approches thérapeutiques potentiellement plus efficaces, en ciblant spécifiquement les mécanismes essentiels à la survie des cellules tumorales. À moyen et long terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour les cancers de la peau, avec l’objectif d’améliorer la prise en charge des patients tout en limitant les risques de résistance aux thérapies

Procédures

Les animaux anesthésiés subiront une greffe de cellules tumorales (1 fois, 5 min,sur 360 animaux), ou de fragments tumoraux humains (1 fois, 15 minutes, sur 370 animaux) . Croissance tumorale sur animaux vigiles par mesure au pied à coulisse , à raison de 1 à 2 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. 1 minute, 8 à 10 fois par animal, 730 animaux. Toutefois, le nombre de mesure ne peut être déterminée avec précision a priori, car elle dépend de variables tels que la prise de greffe, la cinétique de croissance tumorale, l’atteinte d’un volume tumoral suffisant pour la poursuite des expérimentations ou l’atteinte des critères d’arrêt. Suivie de la croissance par imagerie sous anesthesie ,20 minutes par animal, 3 fois sur 240 animaux, et 7 fois sur 120 animaux. Administration des traitements par gavage oral sur animaux vigiles, 40 fois par animal, 1 minute, sur 660 animaux. Avant chaque imagerie, une injection intrapéritonéale sur animal vigile (1 min, 3 fois sur 240 animaux, 7 fois sur 120 animaux. Intervention Chirurgical sur animaux anesthesiés (15 min, 1 fois, 120 animaux).

Impact sur les animaux

L’induction et la manipulation peuvent entraîner un stress léger transitoire. La croissance tumorale peut provoquer une gêne locale en fin d'experimentation. Les traitements administrés quotidiennement par voie oral peuvent induire un stress et comporte dans de trés rares cas un risque d’irritation œsophagienne, de fausse route ou de perte de poids en cas de complication. Les inhibiteurs métaboliques utilisés peuvent entraîner des effets généraux modérés tels qu’une perte de poids, une altération transitoire de l’état général ou des troubles digestifs. À l’issue du traitement, la chirurgie peut entraîner une douleur post-opératoire transitoire ainsi qu’un risque limité d’infection ou de retard de cicatrisation. Les injections peuvent induire une gêne transitoire.Dans de rares cas, la présence de micrométastases non détectées au moment du suivi tumoral ne peut être totalement exclue et pourrait conduire à l’apparition secondaire de foyers tumoraux

Devenir

Mise à mort pour analyse post mortem des tumeurs.

Remplacement

Des approches in vitro ont été utilisées en amont du projet afin d’identifier et de caractériser les cibles métaboliques étudiées, ainsi que pour évaluer l’efficacité des inhibiteurs seuls ou en combinaison sur la prolifération et la viabilité cellulaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral, la vascularisation, la biodistribution des molécules, la pharmacocinétique. À ce jour, aucun modèle alternatif in vitro ou ex vivo ne permet d’évaluer de manière intégrée l’efficacité antitumorale, la tolérance et la dynamique de progression tumorale ou métastatique. Le recours aux modèles de xénogreffes constitue donc une étape indispensable pour valider in vivo les stratégies thérapeutiques proposées.

Réduction

Le nombre d’animaux à été determiné en utilisant un test de puissance et des tests statistiques seront utilisés post expérimentation pour évaluer la significativité des résultats.L’approche expérimentale est séquentielle. Les premières études seront réalisées sur les lignées cellulaires avec un ou deux inhibiteurs. Le recours aux xénogreffes dérivées de patients et à l’ajout d’un troisième inhibiteur ne sera envisagé qu’en cas de résultats antitumoraux significatifs. Cette approche permet de limiter l’utilisation d’animaux supplémentaires si les premières combinaisons s’avèrent inefficaces. Le suivi longitudinal par mesures répétées et par imagerie bioluminescente permet de diminuer le nombre d 'animaux par groupe.

Raffinement

Toutes les manipulations invasives seront réalisées sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les animaux seront installés sur tapis chauffant thermostatable pendant toute la durée des procédures et jusqu’au réveil complet afin de prévenir l’hypothermie. Une analgésie préventive sera administrée avant toute intervention chirurgicale. L'imagerie par bioluminescence seront réalisées sous anesthésie et espacées dans le temps afin de limiter le stress lié aux manipulations répétées. Des points limites prédéfinis seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures conservatoires seront immédiatement mises en place. Un arbre décisionnel interne sera appliqué par le personnel formé, permettant de décider de la poursuite, de l’adaptation du traitement ou de l’euthanasie en fonction de l’évaluation clinique quotidienne. L’ensemble des procédures est conçu conformément aux principes de raffinement et aux bonnes pratiques de bien-être animal, afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle le plus approprié pour ce projet pour plusieurs raisons : La souris permet de recréer un environnement physiologique proche de celui des mammifères, notamment en termes d’absorption digestive, de métabolisme des médicaments, ainsi que de la manière dont les médicaments sont absorbés, circulent dans l’organisme, sont transformés puis éliminés. Elle permet également de reproduire le microenvironnement tumoral. De plus, la greffe de cellules tumorales humaines nécessite l'utilisation d'animaux immunodéficients. Les souris seront incluses dans les protocoles expérimentaux à l’âge de 8 à 10 semaines, soit l’équivalent de l’âge adulte chez la souris, afin que l’étude reflète au mieux le développement et le traitement du cancer chez l’adulte

2 366 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à quatre tests de mémoire, à des injections et parfois à l'ablation des glandes génitales. Nourries douze à quinze semaines d'un régime obésogène dès le sevrage, une partie subit une ou deux chirurgies sous anesthésie, puis une imagerie de la masse grasse en fin d'expérience. Le projet vise à comprendre le rôle des hormones sexuelles dans les troubles de mémoire liés à l'obésité, chez les mâles comme chez les femelles. Les stratégies thérapeutiques évoquées restent lointaines, quand la stérilisation et la mise à mort des 2 366 individus sont, elles, programmées.

Objectifs

L'obésité, en tant que défi de santé publique, réduit l'espérance de vie en raison des pathologies qu'elle favorise (hypertension, cancers, diabètes, etc.). Elle est également associée à des troubles de la mémoire, ce qui est particulièrement préoccupant durant l’enfance et l’adolescence, des périodes clés pour la maturation de structures cérébrales essentielles à la mémoire. Chez la souris, la consommation d'une nourriture riche en lipides pendant l'adolescence, en plus d'entrainer une prise de poids excessive, altère les capacités de mémoire en impliquant des mécanismes spécifiques dans certaines régions du cerveau. La majorité des travaux scientifiques ont été réalisés chez des mâles, alors que, chez l’humain, l’obésité touche de manière comparable les deux sexes. Afin de mieux transposer ces résultats, des études ont également été menées chez des femelles. Comme chez les mâles, la nourriture riche en lipides, à l’adolescence, a des effets négatifs sur la mémoire. Toutefois, les mécanismes impliqués semblent différer selon le sexe. L’objectif de ce projet est donc d’identifier le rôle des hormones sexuelles dans les altérations de la mémoire induites par un régime riche en lipides, chez les mâles comme chez les femelles.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet devrait produire des données expérimentales sur l'évaluation de la mémoire dans différentes conditions expérimentales (régime, age, sexe, traitement) chez la souris. Les résultats issus de ce projet devraient être accessibles à moyen terme, à l’issue de l’analyse complète des données et de leur diffusion via des publications scientifiques et des communications dans des congrès spécialisés. Et à plus long terme, ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des mécanismes à la base des effets délétères d'une nourriture hyperlipidique sur le cerveau et la mémoire en fonction du sexe et le rôle des hormones sexuelles, afin d'envisager potentiellement des stratégies thérapeutiques, puisque le surpoids concerne 47 % des français adultes et 17% des français souffrent d'obésité.

Procédures

Tous les animaux subiront, à au moins 48h d’intervalle, quatre tests comportementaux afin d'évaluer leur mémoire. Chaque étape de ces tests dure 10 minutes. Une partie des animaux subira lors de ces tests comportemantaux des injections périphériques ou locales. Une partie des animaux subira une fois un jeune de 5h préalablement aux mesures métaboliques (7 prélèvements sanguins sur une durée de 2 h). Une partie des animaux subira une ou deux interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire. Ces interventions durent entre 20 et 45 minutes avec une phase de réveil entre 5 et 20 minutes. Tous les animaux subiront en fin d’expérimentation, une seule analyse en imagerie d’une durée de 2 min afin d’évaluer la répartition de leur masse grasse/masse maigre et un seul prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

L’alimentation obésogène donnée pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes comme ceux utilisés dans notre étude. Outre la sterilité induite par le retrait des glandes génitales, il n'y a que peu d’effets secondaires notables. Les tests de comportement, ainsi que les injections peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation et limitée par la maitrise des expérimentateurs. Les prélèvements durant le test de tolérance au glucose pourront engendrer une légère douleur aux animaux. Les chirurgies pourraient entraîner dans les 48h suivant l’opération une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de récupérer leurs cerveaux pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et du fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène et il n’est pas possible de le remplacer par des approches cellulaires sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. De plus, le nombre d’animaux sera réduit au mieux pour obtenir des résultats concluants lors de nos comparaisons statistiques. Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques produits, les besoins expérimentaux seront planifiés et les stratégies de croisement optimisées par l'utilisation de reproducteurs génotypés. Cela représente un total de 2366 animaux (1183 males et 1183 femelles) sur 5 ans.

Raffinement

Des critères objectifs d’arrêt des souffrances des animaux sont définis afin d’encadrer de manière objective et graduée les décisions visant à prévenir toute souffrance excessive. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré-, péri et post-opératoire pour limiter la douleur. Toutes les précautions d'asepsie et de confort seront prises pour limiter l'inconfort des animaux. Les jours suivant la chirurgie, les animaux sont surveillés attentivement une fois par jour pour s’assurer de leur bon rétablissement. Avec la mise en place de points limites, si un animal présente une anomalie il sera immédiatement isolé, surveillé et soigné pendant 3 jours jusqu’à amélioration. Si il n'y a pas d'amélioration et après avis de la cellule bien être et de l'avis du vétérinaire désigné, les animaux seront mis à mort. Si il y amélioration et durant les mois suivant la chirurgie, les animaux seront pesés 1 fois par semaine et un suivi avec des critères objectifs est mis en place. S’il n’y a aucun signe de mal-être chez l’animal, il passera en phase comportementale, qui sera optimisée pour durer le moins de temps possible. Une période d’habituation des souris à l'expérimentateur sera mise en place avant les taches comportementales afin de réduire le stress lié aux manipulations et aux procédures, contribuant ainsi à améliorer leur bien-être et la fiabilité des données recueillies. Les souris seront remises avec leurs congénères entre chaque phase de test. Les injections pharmacologiques seront réalisées de sorte à limiter les interventions sur l’animal.

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée dans ce projet est la souris. Ce choix s’explique par la possibilité de modifier de façon précise le fonctionnement de certains éléments du cerveau chez cet animal. Ce sont des animaux sur lesquels les traitements nutritionnels et l'induction de l'obésité sont faciles à conduire et notre équipe dispose d’une expérience de longue date pour conduire des approches nutritionnelles chez cette espèce. Le modèle de rongeurs soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Les chirurgies et les tests comportementaux, maîtrisés sur cette espèce dans notre laboratoire, sont facilement mis en œuvre et permettent d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives et émotionnelles, qui sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les souris seront exposées au régime hyperlipidique ou contrôle dès le sevrage (3 semaines) et pendant 12 semaines. Cette exposition commence dès le sevrage (jusqu’à l'âge adulte) afin de couvrir la période de l'adolescence. Certains animaux subiront une chirugie, une partie à l’âge de 4 semaines (pré adolescence) et une autre partie à l’âge adulte (8 semaines). Les taches comportementales seront réalisées à l'age adulte entre 15 et 18 semaines.