Oncologie

20 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrées au troupeau selon leur état en fin d'essai. Pendant quinze semaines, elles reçoivent des additifs à base d'algues destinés à réduire leurs émissions de méthane et subissent huit prises de sang à la veine caudale. Le porteur indique que ces additifs peuvent réduire l'appétence et donc l'ingestion et la production laitière, effets qu'il qualifie de réversibles et sans conséquence sur la santé. Il affirme qu'il "n'est pas possible de remplacer" l'expérimentation in vivo, l'enjeu déclaré étant de diminuer les gaz à effet de serre de l'élevage bovin.

Objectifs

L'objectif de ce projet expérimental est de tester les effets d’additifs alimentaires à base d’algues marines sur les performances zootechniques (ingestion, production et composition du lait) et les émissions de méthane entérique de vaches laitières en lactation. Cette expérimentation in vivo permettra de démontrer l'intérêt éventuel de 3 additifs différents basés sur différentes espéces d'algues (algues rouges, algues vertes et extraits d'algues brunes seuls ou en association) pour la réduction des émissions de méthane entérique, sans effet délétère pour les performances animales.

Bénéfices attendus

L’agriculture représente 17,4% des émissions de gaz à effet de serre (GES) en France. L’élevage bovin émet 60,4% des ces GES agricoles. La réduction de ces émissions polluantes ets donc un enjeu majeur pour la durabilité des élevages. Le méthane entérique (CH4) représente 50-55% émissions de gaz à effet de serre (GES) en élevage bovin. En moyenne, les émissions de CH4 d'une vache laitière se comptabilisent à environ 400 g par VL/jour, soit environ 150 kg/an. L'alimentation est un des leviers majeurs pour réduire les émissions de CH4 entérique chez les bovins. D'après la bibliographie et les essais in vitro (assez peu d'essais in vivo pour l'instant), les attentes pour ce projet sont de diminuer de 10 à 20% les émissions de méthane entérique des vaches laitières, soit 5 à 10% des GES d’un élevage.

Procédures

Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront herbergés et logés selon les normes en vigueur dans les élevages laitiers, durant 15 semaines (3 semaines de mesures de référence, puis 4 périodes de 3 semaines). Les vaches seront nourries à volonté et traitent 2 fois par jour. Des échantillons de lait seront prélevés à la traite (6 traites par semaine). Les seules prélèvements invasifs seront des prises de sang à la veine caudale, à raison de 2 par périodes (soit 8 au total). Les mesures de méthane sont réalisées à l'aide de dispositifs assimilés à des distributeurs d'aliments concentrés, comme ceux rencontrés dans les élevages bovins.

Impact sur les animaux

Les quelques essais in vivo de la littérature font parfois état d'une faible appétence des additifs à base d'algues, selon l'espèce, le mode de présentation et le taux d'incorporation dans la ration. Cela peut entrainer une baisse des quantités d'aliments ingérées et donc une baisse de production laitière. Par ailleurs, certaines algues sont connues pour fortement diminuer les fermentations ruminales (donc pour fortement réduire les émisisons de CH4 associées) ce qui peut avoir pour conséquence de réduire la digestibilité de la ration. L'objectif de cet essai sera justement de quantifier ces potentiels effets négatifs, néanmoins réversibles et sans conséquence sur la santé des animaux.

Devenir

Suite à l’estimation de l’état général des animaux en fin d’essai, la décision pourra être prise par le responsable de l'installation de réintégrer ces vaches dans le troupeau non expérimental. Si une alerte au niveau de l’état général d’un animal le justifiait, la cellule bien-être (SBEA) et le vétérinaire seraient consultés.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux pour étudier l'impact de stratégies d'alimentation sur les performances zootechniques (notamment l'ingestion, la production laitière et la composition du lait) et les émissions de méthane entérique réelles. Les études in vitro ne peuvent que renseigner sur un potentiel antiméthanogène mais doivent être confirmées par des essais in vivo.

Réduction

20 vaches laitières seront utilisées pour ce projet, nombre minimum pour tester 4 traitements selon un carré latin (4 lots, 4 traitements, 4 périodes) et mettre en évidence des différences statistiques. Ainsi, chaque vache recevra chaque traitement dans un ordre différent, permettant de tenir compte des effet rémanents potentiels. Les vaches recevant également la ration témoin (sans additif), chaque vache sera son propre témoin pour réduire le plus possible le nombre d’animaux en gardant une puissance statistique suffisante pour montrer l’effet des traitements expérimentaux. Les tests statistiques utilisés seront des analyses de variance (ANOVA, intégrant l'effet période et l'effet lot) pour comparer les performances des animaux (ingestion, production laitière, composition du lait, poids vif...) et les émissions de méthane entérique entre les 4 traitements. Chacun des traitements expérimentaux sera d'abord comparé au traitement témoin pour attester de l'effet significatif ou non de l'additif offert. Le cas échéant, les traitements expérimentaux seront comparés entre eux (comparaison deux à deux) pour déterminer lequel serait le plus efficace.

Raffinement

La conduite d’élevage sera conforme aux règles d’élevage en vigueur. Un suivi régulier du comportement des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou de douleur. Des points limites adaptés ont été définis afin d’éviter au maximum toute forme de souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les vaches laitières utilisée sont de race Prim’Holstein. Pour diffuser les résultats, la race Prim’Holstein, qui est la race la plus répandue dans le monde en bovin lait, est la race appropriée. Les vaches seront en lactation afin de déterminer les effets des traitements sur les performances zootechniques et la composition du lait.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations du gène c-MET associées à des mutations LPR ou GLD, elles reçoivent des injections censées induire une inflammation articulaire, subissent des ponctions de moelle osseuse sous anesthésie, puis sont tuées et disséquées pour analyse de leurs organes. Le porteur relie ce modèle au cas d'une patiente cumulant cancer du sein, syndrome myéloprolifératif et polyarthrite. Il affirme les modèles in vitro "limités" et juge ses lignées murines les seules à répondre à sa problématique.

Objectifs

A partir de l’observation, chez une jeune femme de 36 ans, d’une association inhabituelle de maladies graves (un cancer du sein, un syndrome myéloprolifératif de type Vaquez, et une polyarthrite rhumatoïde), nous avons fait la preuve du concept d’une approche individuelle en génétique constitutionnelle. Pour notre patiente, nous avions deux échantillons pathologiques: un fragment de son cancer du sein et un prélèvement de moelle osseuse. A l’aide d’une nouvelle technologie d’analyse génomique, nous avons identifié une mutation de l’oncogène cMET. C’est une mutation constitutionnelle, retrouvée dans l’ADN de la patiente et dont la valeur pathologique n’était jusqu’alors pas connue. Nous avons établi un modèle de transgénèse non dommageable pour cette mutation de c-MET chez des souris de fond génétique C57bl/6. La caractérisation phénotypique a mis en évidence des syndromes auto-immuns et myéloprolifératifs semblables à ceux observés chez la patiente. Cependant, les phénotypes restent peu sévères et n’altèrent en rien la survie des animaux. Un premier projet sur ces animaux a permis de montrer l'aspect multifactoriel de l'apparition des syndromes autoimmuns en associant cette mutation c-MET avec l'administration de molécules pro-inflammatoires. Toutefois, ce travail n'a pas permis de mettre en évidence de développement tumoral chez ces animaux. Notre objectif est de poursuivre l'étude de cette mutation c-MET et de démontrer son rôle dans l'apparition des cancers.

Bénéfices attendus

L'apparition des cancers trouvent souvent des origines multifactorielles. Cette mutation dans le gène c-MET peut être qualifiée de moyenne à faible pénétrence, ce qui signifie qu'elle ne peut, à elle seule, induire la survenue tumorale. Toutefois, nous penssons que l'on associe cette fragilité génétique à d'autres facteurs, cela peut aboutir à la formation de cancers. Au delà de l'étude des implications que peuvent avoir cette mutation c-MET dans le dévelopement de pathologies, cela constitue également un outil d'étude des fragilités génétiques aboutissant à l'apparition de tumeurs.

Procédures

2 nouvelles lignées ont été créés portant à la fois la mutation c-MET et une mutation du gène LPR ou GLD. Des modèles de souris mutés LPR ou GLD sont commercialisés et ces mutations sont associés à des syndromes auto-immuns tels que l'arthrite, et des lymphadénopathie aboutissant dans 10% des cas à des tumeurs chez les sujets âgés. Les souris double mutés c-MET et LPR ou GLD ont un phénotype non dommageable comparable à celui des souris seulement mutées pour le gène c-MET. La survenue des pathologies trouvant souvent leur origine dans des processus multifactoriels, nous souhaitons traiter ces souris afin de déterminer l’impact de facteurs additionnels sur l’aggravation du phénotype des animaux. Cette objectif sera atteint par l'injection de 2 composés, l'un permettant d'induire une inflammation, et l'autre se liant spécifiquement à cMET. La sévérité se traduira par l'observation d'un gonflement au niveau des articulations. Ce travail propose d’étudier des pathologies très diverses dont l’élément clé serait la mutation du gène MET pour lequel nous avons des modèles animaux pertinents, qui reproduisent la pathologie humaine et sur lesquels nous pouvons étudier les facteurs d’aggravation des phénotypes.

Impact sur les animaux

Les études précédentes sur les souris c-MET traitées avec du LPS et HGF ont montré l'apparition de syndrome auto-immuns sans pour autant induire de répercutions physiologiques visibles chez l'animal. Ici, l'association avec une mutation dans le gène LPR ou GLD devrait permettre d'amplifier ces phénotypes.

Devenir

A l'issu de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés et disséqués afin d'effectuer des analyses histologiques fines des organes, et ainsi qualifier les atteintes (apparition de tumeurs, syndromes auto-immuns, syndromes myéloprolifératifs).

Remplacement

Les modèles d’étude in-vitro sont limités et peu pertinent dans ce cas de figure exceptionnel. L’objectif de notre projet est d'étudier un modèle porteur d'une mutation du gène Met et de faire le lien génétique entre des maladies graves et très différentes telles que la polyarthrite rhumatoïde, des syndromes myéloprolifératifs de type Vaquez mais aussi des cancers. De ce fait, il est actuellement très difficile d’étudier ces pathologies très diverses in-vitro, et les modèles cellulaires dont nous disposons ont des résultats limités. Par ailleurs il s’agit aussi de proposer un projet qui s’inscrive dans une démarche préclinique a visée thérapeutique pour les patients porteurs de cette mutation et pour les patients atteints de ces pathologies. Aussi, les lignées murines uniques développées sont des modèles de choix puisqu’elles reproduisent fidèlement les atteintes humaines. Les modèles dont nous disposons sont les seuls qui permettent de répondre à notre problématique pour laquelle l’expérimentation animale ne peut pas être substituée.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé au minimum sur la base d’une étude statistique pour nous permettre d’atteindre les objectifs fixés. Ce nombre est porté à 144 souris. Tous les animaux sont disséqués selon un protocole rigoureux pour valoriser les animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les actes de ponctions de moelles seront réalisés sous anesthésie générale. Un suivi quotidien des animaux est assuré par les membres de l’animalerie et le personnel formé de l’unité. Pour assurer le bien-être des animaux, les souris sont placées en groupes sociaux et dans des cages avec enrichissement. Des points limites précoces ont été fixés pour limiter la gêne et la souffrance éventuelle des souris.

Choix des espèces

Ce projet utilisera 144 souris C57bl/6 portant la mutation cMET et la mutation LPR ou GLD mâles et femelles. En raison de ses bonnes performances de reproduction, cette souche a été utilisée pour la mise en place de la lignée transgénique. Le modèle murin est un modèle robuste et parfaitement caractérisé sur lequel il est relativement facile de réaliser des expériences de transgénèse. Souris adultes de 8 semaines. Les souris sont obtenues par croisements. Certaines seront utilisées pour les générations suivantes, les autres pour les injections d’HGF ou de LPS. Les animaux seront utilisés pour nos expériences dès l’âge de 8 semaines. En effet, la patiente chez laquelle la mutation Met a été découverte était agée de 36 ans lors du diagnostic. Nous nous plaçons ici dans les mêmes conditions pour nos souris jeunes adultes.

204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection de vecteurs viraux et implantation de fibres optiques ou de lentilles, un test d'évitement de lieu associé à des chocs électriques, puis une perfusion intracardiaque létale pour fixer le cerveau. Le porteur relie ce travail à l'évitement observé dans le stress post-traumatique et espère y trouver des cibles thérapeutiques. Il affirme qu'un "organisme vivant intègre" est nécessaire, aucun modèle in vitro ou informatique ne pouvant selon lui le remplacer.

Objectifs

Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans la persistance de l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les circuits liant l’hippocampe au noyau accumbens via le septum latéral. L’hippocampe a déjà été impliqué dans la persistance d’évitement de place et le noyau accumbens joue un rôle clef dans la génération du comportement d évitement. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’hippocampe contrôle la persistance de l’évitement de place chez la souris. Pour atteindre l’objectif général, nous réaliserons une caractérisation neuroanatomique et optogénétique des circuits neuronaux activés pendant l’encodage et le reversal de l’évitement de place. Un point clé de cette étude est l’aspect longitudinal indispensable à la caractérisation de ces circuits neuronaux. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ces différents circuits.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.

Procédures

Ce projet implique 4 procédures expérimentales décrites en item 4. Chaque procédure (classe modérée) comprend la chirurgie stéréotaxique pour des injections de vecteurs viraux (30-45 min), le comportement d’évitement de place (10-30 min par jour pendant 3-4 jours) et la perfusion intracardiaque (10 min). La procédure 3 comprend également une chirurgie stéréotaxique pour l’implantation de lentilles à gradient d’indice (30-45 min) et la pose d’une baseplate qui n’implique pas de chirurgie stéréotaxique (30-45 min) pour les études d’imagerie calcique. La procédure 4 comprend également une chirurgie stéréotaxique pour l’implantation de fibres optiques (30-45 min) pour les études d’optogénétique.

Impact sur les animaux

Le comportement d’évitement de place et la perfusion intracardiaque n’engendrent ni douleur ni stress. L'intensité du choc électrique choisie (maximum de 0.2 mA) est largement inferieure aux intensités de chocs classiquement utilisées dans la littérature (0,7 mA). Par ailleurs, ce protocole a été démontré comme n’étant pas plus stressant que l’exploration délibérée d’un environnement familier. Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures douloureuses, l’usage d’anesthésiques et analgésiques est prévu, avant, pendant et après la chirurgie (jusqu’à 8 jours).

Devenir

Notre étude nécessite d’une part de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose létale d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.

Remplacement

L’utilisation d'animaux vivants se justifie par la nécessité d’identifier des phénomènes physiologiques complexes au sein des circuits neuronaux impliqués dans le comportement d’évitement chez la souris, ainsi que leur interaction fonctionnelle. De nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent entre elles. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé à ce jour par des techniques in vitro. De plus, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques contrôlant la persistance de l’évitement actif restent inconnus.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 204 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. De plus, ce chiffre comprend le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires (pilotes), afin de 1) déterminer les conditions optimales lors des tâches comportementales de conditionnement et 2) mettre en place de nouvelles techniques, ce qui permettra de diminuer la quantité d’animaux utilisés à long terme. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.

Raffinement

Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont rapprochées les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri-opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés (la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement) et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical. Toutes les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 11 semaines. Les souris transgéniques seront élevées dans notre animalerie. Les procédures expérimentales débuteront après 1 semaine d’habituation. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris ne seront plus utilisées au delà de 10 mois.

600 rongeurs, 480 souris et 120 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 420 tués à l'issue et 180 réutilisés. Ils reçoivent plusieurs injections d'un immunogène émulsionné avec l'adjuvant de Freund, puis un rappel sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever leur rate et récupérer les anticorps. Le porteur indique que les bons répondeurs sont tués tandis que les mauvais répondeurs sont tués ou versés à un programme de formation. Il affirme le recours aux rongeurs "indispensable" et le prélèvement d'organes possible seulement sur un "organisme entier".

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps monoclonaux ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps monoclonaux soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après immunisation de l’animal, l’objectif est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’ajout d’une drogue immunosuppressive. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Les immunisations seront réalisées par voie intrapéritonéale dans un premier temps et par voie intrapéritonéale chez la souris ou intraveineuse chez le rat (stimulation forte des lymphocytes, qualifié de boost final). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris et le rat. Des prélèvements de sang pourront être réalisés à la veine sub-mandibulaire afin de suivre le niveau d’immunisation des souris ou la veine jugulaire chez le rat. A la fin du protocole, les prélèvements de rate et de ganglions lymphatiques seront réalisés afin de récupérer les cellules B productrices d’anticorps à la vue de la fabrication d’hybridome.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique de l’immunogène injecté à l’animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

Pour la génération d’anticorps monoclonaux chez la souris BALB/c ou le rat Wistar, nous effectuerons deux à trois injections par voie intrapéritonéale (i.p.) à quinze jours d’intervalle puis un rappel par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse, trois jours avant la mise à mort. Les administrations i.p. (5-10 ml/kg) sont réalisées sur animaux vigiles en contention. Lors de la première i.p., le liquide injecté contient l’immunogène émulsionné volume à volume avec (ou sans) de l’adjuvant complet de Freund. Les injections suivantes se déroulent de la même façon mais en présence (ou non selon la nature de l’immunogène) d’adjuvant incomplet de Freund. Quinze jours plus tard, le « boost » final est réalisé par voie intrapéritonéale (ou intraveineuse chez le rat). Ce dernier est réalisé via la veine pénienne sous anesthésie gazeuse. Pour ce rappel, l’immunogène est repris uniquement dans du tampon PBS dans un volume final de 0,1mL/animal. Trois jours plus tard, les animaux seront mis à mort et la rate sera prélevée stérilement. Les ganglions lymphatiques pourront également être récupérés. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’administration d’une drogue immunosuppressive. Deux à quatre injections ip seraient réalisées à 14 jours d'intervalle (soit 4 injections sur 42 jours au maximum), trois jours avant le début du protocole de l'immunisation décrit ci-dessus. Chez la souris, des prélèvements de sang via la veine mandibulaire permettront de tester la présence d’anticorps spécifiques dans le sérum. Le prélèvement sera réalisé sur souris vigiles. Un prélèvement sera réalisé un jour avant l’immunisation (basal) puis 7 jours après la deuxième immunisation et 7 jours après la troisième immunisation s’il y en a une. Le volume maximal prélevé est de 0,5 mL de sang total. Chez le rat, les prélèvements se feront au même timing par ponction de la veine jugulaire au travers du muscle pectoral sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4% pour l’induction puis maintien à 2% avec un mélange 50% air / 50% O2). Le volume maximal prélevé est de 1 ml. Un prélèvement terminal de sang pourrait être demandé par le sponsor. Dans ce cas, l’animal sera anesthésié comme indiqué ci-dessus, et un volume de 1 ml pour la souris et 4ml pour le rat serait prélevé. L’animal serait ensuite mis à mort.

Impact sur les animaux

Les points limites ont été fixés sur la base de l’évaluation de signes caractéristiques de la douleur mais aucune mortalité et souffrance n’est attendue dans ce projet (Raffinement). Une grille d’évaluation clinique avec établissement d’un score sera utilisée et des mesures adaptées seront prises pour réduire ou supprimer la douleur des animaux en fonction de ce score.

Devenir

Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une bonne réponse immunitaire seront sélectionnés. Ces animaux seront mis à mort afin de pélever leur rate pour récupérer les anticorps monoclonaux. Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une mauvaise réponse immunitaire ne seront pas sélectionnés. Ces animaux seront soit mis à mort ou gardés en vie pour être réhabilité dans un programme de formation.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules excrétrices d’anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été déterminé par un calcul de N = 10 animaux par série expérimentale. Ce nombre est suffisant pour générer les anticorps par la technique d’hybridomes.

Raffinement

L'acclimatation des animaux durera au minimum 5 jours. À réception, les souris seront collectivement hébergées (au minimum 3 souris par cage selon le poids) dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. Les rats seront hébergés par deux dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. L'eau et la nourriture (RM1, SDS Dietex, ou équivalent) seront données ad libitum. Les animaux auront accès à différents types d’enrichissements, changés de manière hebdomadaire afin d’éviter une éventuelle lassitude ou habituation (maison, coton, cubes de bois, rouleaux de carton, papier kraft). Les conditions d’hébergement et le bon état de santé́ des animaux seront contrôlés quotidiennement. Bien que aucune douleur ne soit attendue si les animaux venaient à présenter des signes de souffrance, des administrations de buprénophine seront réalisées jusqu'aux prélèvements terminaux. La buprénorphine serait administrée par voie sous cutanée, BID, à 0,01 mg/kg pour le rat et 0,05 mg/kg pour la souris. Pour les injections i.v., une anesthésie gazeuse à l'isoflurane sera utilisée.

Choix des espèces

Pour de nouvelles cibles antigéniques, l’utilisation d’animaux pour l’immunisation et la génération d’hybridomes reste nécessaire car aucun modèle in silico (modèle mathématique, analyse bio-informatique) ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d’un antigène. Les nouveaux modèles de génération d’anticorps monoclonaux (utilisation de souris transgéniques « xenomouse » produisant des anticorps humains ou immunisation in vitro de lymphocytes B de souris) ne permettent pas de s’affranchir également de l’utilisation des animaux. La maturité sexuelle des souris et des rats se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris BALB/c ou les rats Wistar seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation.

50 chiens porteurs de tumeurs naturelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée à l'issue pour autopsie, dix réutilisés dans d'autres procédures et dix proposés à l'adoption. Ils reçoivent pendant environ six semaines des traitements hebdomadaires, jusqu'à sept prises de sang par jour, des biopsies répétées et une résection chirurgicale de la tumeur en fin d'étude. Le porteur reconnaît un risque de syndrome de libération de cytokines, avec fièvre, déshydratation et perte d'appétit. Il indique que ces chiens, issus d'éleveurs et fournisseurs agréés, sont transférés vers l'établissement pour être traités, et présente l'espèce cible comme "requise" pour démontrer l'efficacité d'un médicament vétérinaire.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé mondial important qui possède un taux d’incidence et de mortalité en constante augmentation, aussi bien chez l’Homme que chez les animaux. Le nombre de traitements vétérinaires indiqués contre le cancer canin est très limité. Actuellement la première approche qui peut permettre de réduire la masse tumorale est la chirurgie. Mais elle peut se révéler inutilisable en fonction de la localisation de la tumeur, voire insuffisante en cas de présence de métastases. La chimiothérapie et la radiothérapie sont aussi des solutions utilisées en deuxième intention pour traiter le cancer. Mais ces solutions possèdent, elles aussi, leurs limites. En effet, ces méthodes sont, elles aussi, parfois inefficaces car certaines tumeurs sont dites chimiorésistantes ou radiorésistantes. De plus, ces types de traitements ont des effets secondaires importants. Ils nécessitent également un matériel adapté ainsi qu’une gestion spécifique des effluents et déchets radioactifs et chimiques générés (risque de pollution pour l’environnement). Il est donc important de développer une nouvelle option thérapeutique qui pourra traiter un plus grand nombre de tumeurs avec un mode d’administration et une logistique des déchets plus simple.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’évaluation précoce de l’efficacité et de l’innocuité de nouveaux traitements médicaux à visée anti-tumoral chez le chien. En fonction des résultats obtenus, ce projet pourrait conduire au développement d’un traitement antitumoral chez le chien. Cette nouvelle thérapie permettra à la fois de lutter contre le développement des tumeurs et de réduire les risques de développement de métastases. En raison de l’activité immunomodulatrice de ces traitements, un panel de tumeurs canines sont ciblées : ostéosarcome, sarcome des tissus mous, glioblastome, tumeurs mammaires…

Procédures

Les animaux seront traités régulièrement (environ une fois par semaine) avec un traitement par voie orale, par intraveineuse (IV), intratumorale ou sous-cutanée pendant environ 6 semaines. Les prélèvements prévus dans la procédure sont les suivants : - Prises de sang : jusqu’à 7 fois par jour, 10 fois par semaine pendant 6 semaines consécutives. Le volume prélevé ne pourra en aucun cas dépasser 7.5% du volume total circulant d’un animal sur 24h ou 15% sur 28 jours. Si le volume total prélevé sur 24 heures atteint 7.5%, la prochaine prise de sang ne pourra pas être réalisée dans les 7 jours suivants (pour laisser un temps de récupération). - Prélèvements d’urine par cystocentèse, ou sondage urinaire, jusqu’à une fois toutes les deux semaines. - Biopsies (punch : 2 à 4 mm de diamètre) de la tumeur, jusqu’à 3 fois sur la durée de l’étude. Pendant le temps des prélèvements, les animaux pourront recevoir des analgésiques ou pourront être anesthésiés ou tranquillisés pour une courte durée, afin de réduire la douleur, l’angoisse ou la souffrance de l’animal. La décision de l’analgésie, de l’anesthésie ou de la sédation dépendra de plusieurs facteurs comme : les prélèvements à réaliser, du comportement des chiens, de la facilité de manipulation. - La résection chirurgicale de la/les tumeur(s) mammaire(s) en fin d’étude sera réalisée sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les produits candidats ont pour objectif d’activer le système immunitaire des animaux. Le principal risque associé, pourrait être une suractivation du système immunitaire, qui entrainerait un syndrome de libération de cytokines. Ce syndrome peut entraîner des symptômes d’intensité faible à sévère comme : de la fièvre, une déshydratation, de l’apathie, une perte d’appétit. Afin de pouvoir objectiver les effets secondaires à l’administration du traitement et adapter le suivi clinique de chaque chien, les chiens seront hébergés individuellement pendant 8 heures (avec contact visuel et olfactif) après l’administration du traitement. Afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité de ces nouveaux traitements, des prélèvements devront être réalisés (sang, urine, biopsies de la tumeur…) ainsi qu’une résection chirurgicale de la/des tumeur(s) en fin d’étude. Ils peuvent générer un stress et de l’inconfort : au moment du geste pour ceux réalisés vigile, ou en post-opératoire pour ceux réalisés sous anesthésie générale. Les contentions liées à ces gestes peuvent générer du stress chez les animaux. La réalisation de biopsies et/ou la résection chirurgicale de la/des tumeur(s) pourraient induire des saignements, des gonflements, une infection, des ulcérations, une altération voire une destruction des tissus traversés. L’anesthésie pourrait générer : un stress au moment de l’induction, de l’inconfort, de la nausée et du stress au moment du réveil. Dans le cas où l’efficacité du candidat ne serait pas suffisante, il est possible que la tumeur continue de se développer (augmentation de la taille et développement de métastases).

Devenir

Les animaux pourront être mis à mort en fin de procédure pour autopsie, prélèvements d’organes ou de tissus pour évaluer l’innocuité et/ou l’efficacité des produits testés. Si au cours de la procédure ou à la fin de la procédure, l’animal présente un état de santé dégradé et qu’il atteint des points limites sévères l’animal sera euthanasié. À la fin de la procédure si l’animal recouvre un bon état physique/clinique, il pourra être (sur décision du vétérinaire désigné) mis à l’adoption ou être inclus dans une autre procédure.

Remplacement

Des études précliniques avec des candidats ont déjà été réalisées in vitro et in vivo sur rongeurs, chiens sains, chats, et sur l’Homme. Ces tests ont montré des résultats favorables. Après cette première étape, le recours aux animaux ayant développé une tumeur est requis, afin de pouvoir évaluer l’efficacité et l’innocuité du candidat médicament chez la population cible. En effet, l’efficacité d’un produit vétérinaire anti-tumoral doit être démontrée sur l’espèce cible. Car les études d’efficacité nécessitent de travailler sur un organisme entier, mettant en jeu des interactions entre différents tissus/organes impliqués dans le métabolisme et le/les effets physiologiques et thérapeutiques du futur candidat médicament.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, seul le ou les composé(s) ayant les meilleurs profils pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et la meilleure innocuité, seront testés sur les animaux présentant une tumeur. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum lors des premières études exploratoires (jusqu’à 10 animaux par composé à tester soit 5 composés maximum). Ces études permettront de caractériser plus précisément les variabilités existantes inter-individus ainsi que les variabilités existantes entre les différents types de tumeurs incluses. Grace à ces informations, le nombre minimum d’individus le plus pertinent pourra être inclus dans les études suivantes. Pas d'étude biostatistique pour ce projet. Chaque chien sera son propre contrôle, c'est à dire que l'on comparera la tumeur avant/après ainsi que l'état clinique avant/après. Ceci permettra de réduire le nombre de chien inclus dans la procédure.

Raffinement

Des chiens présentant naturellement des tumeurs issues d’établissement éleveurs ou fournisseurs agréés seront inclus dans les études. Les animaux présentant des tumeurs (tumeurs mammaires dans un premier temps) seront alors transférés au sein de l’établissement utilisateur pour être traités. Afin de permettre un traitement le plus précocement possible, un chien seul peut être inclus dans la procédure. Dans ce cas, il sera mis en hébergement avec au moins un autre compagnon compatible durant cette période. Ce ou ces compagnons seront des chiens déjà présents au sein de l’établissement utilisateur et qui seront en période de repos entre deux études. Ils bénéficieront de zones de jeu avec interaction avec l’Homme. Les jouets présents dans les zones d’hébergement et dans les zones de jeu sont régulièrement changés pour favoriser la curiosité. Une période d’acclimatation systématique est mise en place. Si la durée n’est pas suffisante elle sera rallongée jusqu’à ce que les animaux soient aptes à entrer dans la procédure. Le personnel intervenant dans l’étude sera formé aux examens et prélèvements afin de travailler avec le plus d’expertise possible. Les animaux sont observés quotidiennement, ou plus si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal et/ou toute anomalie clinique non attendue. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le responsable de l’étude, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal et/ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal. En cas de syndrome de libération de cytokines, un traitement avec des corticoïdes, une réhydratation et/ou un traitement symptomatique digestif seront prescrits pour diminuer les effets dus à ce syndrome. Un suivi clinique rapproché de l’animal sera également mis en place. Des points limites seront définis pour apporter des soins adaptés ou une exclusion de l’étude avec d’autres soins ou une euthanasie si nécessaire. Afin de limiter le stress lié aux actes (contention, traitements, prélèvements, …), ces actes seront travaillés sur les chiens en renforcement positif avec friandises et caresses lors de trainings pendant l’acclimatation puis pendant toute la durée de l’étude. La Structure du Bien Être Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

Espèce cible de la pathologie investiguée. Les animaux utilisés seront des animaux ayant naturellement développés une tumeur. Une tumeur chez le chien peut se développer quel que soit l’âge de l’animal, bien que les animaux les plus âgés sont les plus souvent atteints (en particulier pour les tumeurs mammaires).

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun, un gavage, des prélèvements de sang et l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique, avec induction d'un diabète et d'une inflammation intestinale. Le porteur reconnaît une polydipsie, un poil hérissé, une léthargie, un dos courbé, une ataxie et des tremblements possibles. Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais présente le recours à la souris comme nécessaire pour ces dialogues inter-organes.

Objectifs

L’intestin est directement en contact avec le bol alimentaire et les bactéries de la flore intestinale et assure donc un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage concomitant de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2 (DT2), les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit indépendemment de l'obésité et de l'hyperglycémie, à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline contribue, indépendemment de l'obésité, à l'hyperperméabilité intestinal et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales. Notre projet permettra l'identification dans l'épithélium intestinal des cibles cellulaires et des voies de signalisation dérégulées au cours de la résistance à l'insuline, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

-1 lot d’animaux vigiles fera l’objet d’une mise à jeun (14h), de 6 à 7 contentions (45 secondes chacune), d’une administration orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -1 autre lot d’animaux vigiles fera l’objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 7 à 8 contentions (45 secondes chacune), de 2 administrations orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les prélèvements, l’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou encore les douleurs post-opératoire (implantation de la pompe) ou liées à l’inflammation intestinale. De plus, la chirurgie comporte un risque pour l'animal lié à l'anesthésie (réveil, dépression respiratoire, hypothermie). Les souris rendues diabétiques présenteront une polydipsie associée à une glycosurie. L’implantation des pompes osmotiques en sous cutanée peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale, l’infection par des entéropathogènes, ou l’induction d’un diabète, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux issus de souris diabétiques pour démontrer que la résistance à l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend au total 480 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests statistiques adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser la réponse des cellules épithéliales intestinales à l'insuline à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas à l’insuline. Cette technique ne nécessite donc aucun traitement chez la souris. Elle permet également à partir d'une seule souris d'étudier plusieurs parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post-opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Par ailleurs, le choix de cette espèce est motivé par la volonté de comparer les résultats de ce projet obtenus sur des modèles de perte d'action globale globale de l'insuline à ceux d'un autre projet obtenus sur des souris génétiquement modifiées, déficientes pour l’action de l’insuline spécifiquement au niveau intestinal. Les souris utilisées seront âgées de 12 à 14 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun, une biopsie, des administrations orales et injections répétées et jusqu'à quatorze prélèvements de sang à la queue, un test de tolérance à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie prononcée. Le projet vise à décrire le rôle de l'insuline intestinale dans la prise de poids sous régime gras, le porteur affirmant que ce régime "n'entraîne pas de souffrances". Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais présente le recours à la souris comme nécessaire pour ces dialogues inter-organes.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote et assure entre autres, un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. L’hyper- perméabilité intestinale a été proposée comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique de bas grade qui accompagne l'obésité, état inflammatoire qui favoriserait la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, équilibre glycémique). Nos premiers résultats montrent que la perte d'action intestinale de l’insuline conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin chez la souris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action intestinale de l’insuline favorise ou accélère la la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, équilibre glycémique) chez des souris soumises à un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline et l'hyperperméabilité intestinale associée favorise ou accélère la prise de poids et l'altération de l'équilibre glycémique au cours d'un régime obésogène. Notre projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les voies de signalisation permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes) - 1er lot d'animaux : 2 mises à jeun (14h et 6h), 4 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral, 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun) - 2ième lot d'animaux : 2 mises à jeun (14h et 6h), 8 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun) -3ieme lot d'animaux: 2 mises à jeun (14h et 6h), 16 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral, 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun). Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Aucun des modèles murins ne présente de phénotype dommageable à l’état basal et le regime gras n'entraine pas de souffrances. Les deux régimes offerts sont appétents et ne provoqueront pas de stress ou de trouble dans le comportement alimentaire des animaux. Il y a un stress lors de l’anesthésie, de la contention et des injections. L'animal peut avoir une sensation de douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille). Le test de tolérance à l'insuline peut entraîner une hypoglycémie prononcée chez la souris.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but de mimer certaines caractéristiques de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend au total 360 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique in vitro qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée sous régime et les tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les deux régimes offerts sont appétents et ne provoqueront pas de stress ou de trouble dans le comportement alimentaire des animaux. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. L'euthanasie de l'animal se fait sous analgésie et anesthésie profonde. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés et l’application des points limites établis.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 9 semaines à chaque début de procédure. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

156 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du sein leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des injections intraveineuses de nanoparticules d'or et des séances de laser portant la tumeur à 41-43 °C, avec un prélèvement de sang intracardiaque terminal, les nécroses tumorales douloureuses déclenchant la mise à mort. Le porteur annonce espérer une "régression totale" des tumeurs et la "guérison des souris", bénéfices renvoyés à un éventuel passage en clinique. Il affirme qu'"aucune méthode alternative" n'est disponible pour cette étude de biodistribution et de toxicité.

Objectifs

Dans la lutte contre le cancer, une des stratégies thérapeutiques utilisées consiste à induire la mort des cellules cancéreuses, en ciblant notamment des récepteurs de la famille du TNF. Ce « suicide » cellulaire peut être activé à l’aide d’anticorps monoclonaux (Acm), ciblant des récepteurs membranaires. C’est ce qui est proposé dans ce projet où le greffage de ces Acm sur des nanoparticules d’or va permettre, suite à l’induction d’une hyperthermie induite par action d’un laser, d’augmenter leur activité cytotoxique. L’approche thérapeutique développée dans ce projet est basée sur des données expérimentales obtenues dans notre équipe qui démontrent notamment qu’une hyperthermie modérée sensibilise les cellules cancéreuses à la mort et que cette hyperthermie peut-être obtenue par excitation de nanoparticules d’or par un laser. : L'objectif de ce projet consiste donc à démontrer l’effet anti-tumoral de notre médicament dans des modèles de tumeurs mammaires chez la souris. Notre médicament est composé de nanoparticules d’or cylindriques sur lesquelles sont greffées des anticorps ciblant un récepteur membranaire, couplées à une molécule fluorescente. Une fois injecté aux souris, ce médicament présentera donc l’avantage de cibler les tumeurs exprimant le récepteur et de pouvoir être suivi par imagerie. De plus, la présence des nanoparticules d’or va permettre d’induire une hyperthermie modérée (41 à 43°C) grâce à un laser émettant dans le proche infrarouge, ce qui devrait en principe favoriser la mort des cellules tumorales. Afin de pouvoir proposer cette nouvelle thérapie en clinique, il nous faut maintenant déterminer l’effet anti-tumoral de cette thérapie dans des modèles de tumeurs chez la souris. Nous analyserons la toxicité de l’agent, sa bio-distribution et son efficacité thérapeutique dans des souris porteuses de tumeurs exprimant ou non le récepteur d’intérêt.

Bénéfices attendus

De nombreux travaux mettent en évidence l’intérêt de cibler les récepteurs de mort, cette thérapie étant en essai clinique dans certains cancers de l’Homme. D’autres travaux obtenus in vitro montrent que l’induction d’une hyperthermie peut augmenter l’activation du signal de mort, l’activation de nanoparticules d’or par un laser étant un des moyens d’induire cette hyperthermie ciblée. Ce nouvel agent combine toutes ces propriétés puisqu’il est composé de nanoparticules d’or sur lesquelles sont greffées des anticorps (Acm) ciblant un récepteur de mort et une molécule fluorescente nous permettant de détecter cet agent par imagerie. Les résultats obtenus in vitro nous encouragent à tester cet agent dans des modèles de tumeurs chez la souris. Nous nous attendons à visualiser la présence de cet agent, injecté chez la souris, uniquement sur les tumeurs exprimant le récepteur de mort. L’effet anti-tumoral de cet agent devrait être augmenté par l’induction de l’hyperthermie induite par le laser. Nous nous attendons à avoir la régression totale des tumeurs exprimant le récepteur de mort et donc la guérison des souris. A terme, cette thérapie pourra être proposée en clinique aux malades porteuses de cancer du sein résistantes aux différents traitements proposés actuellement.

Procédures

Les animaux recevront 1 injection en sous-cutané de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (en 5-6 secondes). Le traitement aura lieu une fois par semaine sur 4 semaines (4 injections au total), en IV sous anesthésie gazeuse. L’imagerie nécessitera une injection intrapéritonéale préalable (en 3-4 secondes), soit 7 injections. La stimulation laser localisée au niveau des tumeurs sera réalisée sur une durée de 5 à 10 minutes sous anesthésie gazeuse. Le prélèvement de sang en intra-cardiaque nécessitera l’injection intrapéritonéale de l’anesthésiant (injecté en 3-4 secondes) et ce prélèvement sera réalisé en moins de 1 minute. L’irradiation par laser des tumeurs aura lieu pendant 5 à 10 minutes, la durée exacte étant déterminée par mesure de l’hyperthermie modérée (41-43 °C) mesurée par la caméra thermique.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales pour le développement d’une tumeur sous-cutanée au niveau des flancs de la souris n’est pas sensée induire d’inconfort notoire tant que le volume tumoral ne dépasse pas la taille de 2000 mm3 et que la tumeur ne gêne pas la motricité. Une diminution de mobilité des souris. La perte de poids engendrée par la réduction de capacité à se nourrir. Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. Nous ne nous attendons pas à des atteintes pulmonaires. Le traitement localisé au laser (au niveau des tumeurs), qui aura lieu sous anesthésie à l’isoflurane, peut engendrer un peu d’irritation. Une potentielle déshydratation des yeux des souris.

Devenir

La croissance tumorale (point limite), ainsi que le prélèvement de sang final et des organes justifient la mise à mort des animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

Toutes les expériences in vitro portant sur l’effet cytotoxique de l’agent théranostique associé ou non à une activation par laser ont été réalisées et ont montré l’effet désiré (synergie de l’induction d’apoptose spécifiquement dans les cellules exprimant le récepteur de mort). Pour aller plus loin dans la preuve de concept de l’utilisation de cet agent associé à l’induction d’une hyperthermie modérée comme traitement anti-cancéreux, l’utilisation des modèles de souris porteuses de tumeurs est nécessaire. Aucune méthode alternative n’est disponible pour réaliser cette étude. Ce projet nécessite la réalisation d’une étude de biodistribution et de toxicité, ainsi que l’évaluation du ciblage spécifique de la tumeur et de son potentiel antitumoral. Ce type d’étude n’est possible qu’avec des système complexes vivants. De plus, l’étude du rôle du système immunitaire dans l’approche thérapeutique proposée, et notamment sur les cellules tumorales murines exprimant le récepteur de mort humain, permettant de tester notre anticorps ciblant ce récepteur humain, n’est possible que dans des souris immunocompétentes.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum, tout en respectant nos objectifs scientifiques. Pour augmenter cette réduction, nous implantons deux tumeurs à la fois sur les souris, une tumeur n’exprimant par DR4 (tumeur contrôle) et une tumeur exprimant DR4 (tumeur test). Cette double implantation évite de devoir utiliser un groupe supplémentaire afin de tester la spécificité de ciblage de nos anticorps (expérience de compétition en injectant une quantité 100 X plus importante d’Ac non marqué). Le nombre d’animaux est déterminé à priori par une analyse de puissance et représente le nombre minimal d’animaux permettant de produire des résultats statistiquement interprétables. En effet, des analyses de puissance statistique sur le logiciel G*Power ont été réalisées pour déterminer la taille d’échantillons minimum à utiliser. Le test de Wilcoxon est le plus approprié pour l’analyse de nos résultats. L’analyse de variance à un facteur peut être utilisée pour déterminer s'il existe des différences significatives entre les groupes. Des tests post-hoc, tels que le test de Tukey ou la correction de Bonferroni, seront utilisés pour identifier les différences spécifiques entre les groupes.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des locaux appropriés où ils bénéficieront du raffinement de rigueur. Les souris seront habituées aux gestes techniques (contention, injections…) avant l’expérimentation. La croissance tumorale sera mesurée tous les deux jours pour éviter l’apparition de tumeurs de taille excessives. En cas d’apparition de signes anormaux la fréquence de surveillance sera augmentée. Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. En cas de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront euthanasiées. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant (alu spray). Une grille de score d’évaluation des points limites sera mise en place pour réduire la souffrance des souris utilisés. Différents paramètres seront observés pour limiter la douleur tels que : - Apparence physique (poils, oreilles, yeux, posture) - Perte de poids - Comportement / réponse aux stimuli - Volume tumoral - Nécrose tumorale - Déshydratation - Gêne à la mobilité L’addition du score de chaque critère donnera une note sur 21. Un score de 12 ou un critère atteignant 3 points entraînera la mise à mort des souris par dislocation cervicales après anesthésie à l’isoflurane.

Choix des espèces

Dans un premier temps, cette étude sera réalisée avec des souris immunodéficientes BALB/c Nude. Ces souris immunodéficientes nous permettront de réaliser des greffes de cellules humaines de cancer de sein (exprimant ou non le récepteur de mort). Ces dernières seront injectées en sous-cutané afin d’évaluer l’effet antitumoral des traitements que nous allons tester. Des souris BALB/c WT de fond génétique identique à des cellules cancéreuses mammaires de souris seront également utilisées pour montrer le rôle du système immunitaire dans l’efficacité antitumorale Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g). Cela nous permettra la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire bien développé (BALB/c WT) ou du moins mature (BALB/c Nude).