Oncologie
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Etude du rôle des Neutrophil Extracellular Traps (NETs) dans l’initiation et la progression tumorale du carcinome associé à la colite (CAC)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
6192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un cancer colorectal leur est induit par un carcinogène et un promoteur d'inflammation, avec une centaine d'injections intrapéritonéales en dix semaines et sans anti-inflammatoire, puisque le projet étudie précisément le rôle de l'inflammation. Le porteur reconnaît des douleurs et une perte de poids, et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever côlon et rectum. Il indique disposer de cultures in vitro qui "ne récapitulent pas" la complexité de l'organe et conclut au recours aux souris.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier le rôle des cellules immunitaires appelées neutrophiles dans l'initiation et la progression tumorale du cancer colorectal. Plus précisemment nous souhaitons étudier une des fonctions des neutrophiles : la formation de « Pièges Extracellulaires», appelés "NETs", dans le developpement cancéreux. Les NETs sont composés d’ADN recouverts de protéines et sont libérés à l'exterieur des neutrophiles, afin de piéger et tuer les pathogènes lors d'une infection. Cependant des études ont montré que ces NETs ont également des propriétés pro-tumorales. Notre hypothèse est que les neutrophiles et NETs entrainent la progression du cancer colorectal via i) l’activation de cellules saines de soutien des tissus ; ii) l’inhibition de la réponse immunintaire anticancéreuse. En effet, ces évènements sont indispensables au développement des tumeurs et à la progression du cancer. Plus spécifiquement, nos résultats montrent que les NETs activent les cellules de soutien des tissus qui sont capables de modifié l'environnement des cellules permettant ainsi l'apparition et le developpement du cancer. De plus, nous avons identifié 2 protéines clés présentent dans les NETs connues inhiber la réponse immunitaire anti-tumraole. Il en résulte un environnement propice au développement des cellules cancéreuses. Nous souhaitons confirmer nos résultats chez la souris en utilisant le modèle AOM/DSS (Azoxymethane : carcinogne / Dextran Sodium Sulfate : promoteur) de cancer colorectal. En effet nous nous attendons à un retardement de l’initiation du cancer et une diminution de la progression du cancer lorsqu'on empeche l'action des neutrophiles et la formation de leur NETs. Le but est d'utiliser ce modèle pour confirmer le rôle des voies de signalisation impliquées dans l'activation des neutrophiles, la formation des NETs, et dans leur capacité à empecher la réponse immunitaire anticancéreuse et à modifier l'environnement des cellules.
Bénéfices attendus
Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux mais permettra de comprendre précisemment le(s) lien(s) entre inflammation et cancer et pourrait déboucher sur la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints d'un cancer colorectal.
Procédures
Les animaux seront manipulés par contention classique quotidiennement pour inspecter leur état général et leur administrer par injection intrapéritonéales les différents traitements (piqures en bas de l'abdomen, quotidiennement pour les inhibiteurs et 3 fois par semaine pour les anticorps) pendant 10 semaines. La contention de chaque animal durera en moyenne 20 – 25 secondes et sera réduit autant que possible dès que les conditions le permettront afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Par ailleurs, chaque animal sera pesé 3 fois par semaine, ce qui nécessitera une manipulation supplémentaire de l’animal courte (environ 5 secondes) pour le déposer sur la balance et le remettre dans sa cage. Les animaux recevrons 100 injections en 10 semaines et ces injections ne dureront que quelques secondes chacune.
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus des animaux développant des tumeurs sont des signes de douleurs et une perte de poids (entre 5% et 10% du poids de l’animal après chaque cycle de DSS). Cette perte de poids est normale et elle est récupérée et généralement augmentée quelques jours après la fin d’un cycle de DSS (pendant la periode de récupération). La perte de poids ne devrait donc jamais excéder les 15% du poids initial à jour 0 des souris. Des signes de stress induits par l'injection répétée en intra-péritonéale des traitements peuvent aussi apparaitre.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience car nous aurons besoin de prélèver ensuite la le colon et le rectum des animaux pour analyser les tumeurs qui se seront développées en réponse au traitement cancérigène AOM/DSS.
Remplacement
Nos recherches ont décrit les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude de l’invasion cancéreuse. Nous avons déjà développé des modèles in vitro permettant de vérifier le rôle des NETs sur les capacités tumorales des cellules de cancer colorectal (CCR). Cependant ces cultures ne récapitulent pas en totalité les caractéristiques du carcinome colorectal (contrairement au modèle AOM/DSS de carcinome associé à la colite) et la complexité de l’organe, nous avons donc recours aux animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est choisi pour détecter toute différence significative sur le volume tumoral avec un nombre de souris minimum. Le nombre de souris se justifie par la fréquence des lésions tumorales observées après 10 semaines de traitement et l’hétérogénéité possible des différents stades cancéreux auxquels seront les tumeurs après le traitement par l'AOM/DSS. Pour l’étude des lésions cancéreuses très avancées et invasives, il nous faudra suffisamment d’animaux par groupes ayant développé spontanément ces lésions avancées pour avoir des analyses statistiques fiables. Les résultats obtenus au laboratoire in vitro permettent de réduire le nombre d’animaux. En effet, le fait que ce modèle soit largement utilisé et décrit par la communauté scientifique nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie. Ainsi nous avons générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans le respect de la réglementation européenne, les animaux seront manipulés dans le calme, 4 souris par cages, avec un cycle jour/nuit de 12h, eau/nourriture à volonté. Chaque cage est enrichie (mouse house, carrés de coton, bâtons à ronger). Les cages sont séparées des élevages pour un suivi adapté. La période d’acclimatation sera de 5 jours. Le suivi se fera 3 fois par semaine et la santé des animaux sera évalué via une liste de critères, de symptomes et de points limites. Aucun anti-inflammatoire ne sera donné puisque nous souhaitons caractériser le rôle de l’inflammation dans le développement du carcinome associé à la colite.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des NETs dans l'inititation et le développement du carcinome associé à la colite (CAC) . Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. De plus, le modèle AOM/DSS reproduit fidèlement les caractéristiques de carcinogenése inflammatoire que nous souhaitons étudier et il a été bien caractérisé et est largement utilisé pour sa reproductibilité dans la communauté scientifique pour ce type d’étude. L’administration d’agents chimiques induisant la carcinogénèse sera réalisée sur des souris âgées de 8 à 12 semaines. Les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront à 10 semaines après initiation au AOM/DSS, ce qui correspond à la formation de carcinome colorectal.
Induction de tumeurs pulmonaires dans un modèle de souris mutantes K-rasG12D et implication de la protéine Atad2 (2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent sous anesthésie une injection intra-trachéale unique de particules virales déclenchant une mutation cancéreuse dans les poumons, avant d'être tuées pour analyse pulmonaire. Ce volet ajoute un groupe de souris témoins pour renforcer des données sur le rôle d'un facteur à bromodomaine dans le cancer du poumon. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reflète la dynamique observée in vivo et conclut à la nécessité du modèle animal.
Objectifs
La transformation maligne des cellules pourrait être considérée comme une série d'événements de reprogrammation cellulaire conduite par des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation en amont. La plasticité et la dynamique de la chromatine sont des déterminants critiques dans le contrôle de la reprogrammation cellulaire. Une augmentation de la dynamique de la chromatine pourrait donc constituer une étape essentielle dans la conduite de l'oncogenèse et dans la génération de l'hétérogénéité des cellules tumorales, ce qui est indispensable pour la sélection des propriétés agressives, y compris la capacité des cellules à se disséminer et à acquérir une résistance aux traitements. L'apport et le dosage d'histones sont les régulateurs les plus connus de la dynamique de la chromatine. En facilitant la reprogrammation cellulaire, le sous-dosage des histones devrait également être crucial dans la transformation cellulaire et les métastases tumorales. L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle d'un facteur à bromodomaine, dans la transformation tumorale et plus particulièrement dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Cette modifcation du projet concerne l'addition d'un groupe de souris contrôles pour renforcer nos données.
Bénéfices attendus
Le gène étudié au cours des 15 dernières années a été largement décrit comme étant surexprimé dans tous les tissus cancéreux humains étudiés et présentant un facteur de mauvais pronostic. Après analyse des articles scientifiques sur ce gènee et le cancer, il s'avère que toutes les études ont été réalisées in vitro avec des modèles de lignées cellulaires de différents cancers ou in vivo en utilisant des modèles de xénogreffes. Ceci rend difficile de conclure sur le degré d’implication de ce gène dans l’initiation et la progression tumorales in vivo d’où la nécessité de développer des modèle (s) animaux de cancer impliquant directement cette protéine. Les expériences entreprises dans ce projet devraient nous permettre de démontrer si l’activité de la protéine d'intérêt est nécessaire pour la réponse du génome à des facteurs oncogéniques. Ce travail devrait permettre non seulement de découvrir un mécanisme moléculaire de base essentiel mais encore inconnu, mais constitue aussi une étape commune critique dans la transformation maligne.
Procédures
Les animaux recevront par voie intra-trachéale une injection unique et sous anesthésie de particules virales induisant la mutation désirée dans les poumons. Aucun prélèvement ni procédure chirurgicale n'est prévu durant cette période. La préparation des particules virales dure 30 minutes environ. La durée de l'anesthésie est de 5 minutes par souris. Une fois anesthéssiées, les souris recevront par voie intratrachéale une dose de particules virales. Cette étape dure 1 à 5 minutes par souris. À la fin de cette étape, les animaux seront placés pendant 10 à 15 minutes sur une plaquante chauffante dans un environnement calme afin de leur permettre de se réveiller.
Impact sur les animaux
Dans cette partie du projet, les souris recevront les particules virales.
Devenir
A l'issue de cette procédure, toutes les souris seront sacrifées et les poumons prélevés pour analyse histologique et biochimique.
Remplacement
Bien que les propriétés fonctionnelles du facteur que nous investigons dans cette étude aient été initialement abordées par des tests in vitro et dans des modèles de cultures cellulaires, ces derniers présentent néanmoins des limites considérables. Il n’est pas possible d’appréhender l’ensemble des mécanismes que nous étudions sans l’apport du modèle animal. A ce jour et à notre connaissance il n’existe pas de modèle animal qui permet de déterminer le rôle de notre protéine dans l’initiation et la progression tumorales. Nous avons développé des modèles alternatifs en invalidant des gènes d’intérêt dans des cellules souches de souris ou dans des lignées humaines ou encore l’utilisation de modèles de xénogreffes, mais ces systèmes basés sur la culture cellulaire in vitro présente plusieurs limites. Ce modèle de culture cellulaires est en effet très loin de la physiologie animale et ne reflète pas les évènements de dynamique de la chromatine qui ont lieu in vivo.
Réduction
Après avoir discuté avec nos biostatisticiens nous nous étions fixés un nombre minimal de 4 animaux par groupe nécessaire afin de réaliser une cinétique d'infection pour suivre l'évolution des tumeurs (sur le plan histologique mais aussi et surtout au niveau moléculaire) et pouvoir l'analyser statistiquement, car les tumeurs pulmonaires sont très hétérogènes. D'autre part, d'après notre expérience, il arrive que des animaux décèdent lors de l'expérimentation. Une réduction de nos groupes expérimentaux initiaux rendrait caduque l’interprétation et l'analyse de nos données, c'est pourquoi nous comptons faire un individu supplémentaire si besoin. Enfin, contrairement à la version précédemment autorisée nous ne réaliserons des prélèvements qu’aux 2 temps les plus pertinents par rapport aux données déjà obtenues (6 et 12 semaines) et plus à 5 temps (4, 6, 8, 10 et12 semaines), ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. C’est pourquoi nous avons n=5 animaux par groupe x 2 lignées 2 temps d’analyse différents.
Raffinement
Les injections de particules virales sont faites sous anasthésie générale pour limiter la douleur et le stress. Les souris seront maintenues sous tapis chauffant pour éviter une perte de tempréature. Du gel occulaire sera appliqué pour éviter la déshydratation. Des points limites seront mis en place pour maintenir un état de douleur léger.
Choix des espèces
Afin de mieux comprendre les mécanismes de développement et d'aggessivité tumorales et pour découvrir de nouveaux moyens plus efficaces pour diagnostiquer et traiter le cancer, il est nécessaire de mener des recherches sur les animaux vivants. Les études sur les souris sont essentielles pour comprendre la complexité des processus fondamentaux qui sous-tendent le cancer dans les organismes vivants. Le modèle a été validé sur des souris agées de 6 à12 semaines afin d'induire les tumeurs. Les souris de cet âge sont suffisement adultes pour se rétablir assez rapidement des effets de l'anesthésie, du volume des particules virales utilisé anisi que des effets de l'intubation intratrachéale.
Evaluation de l’état de santé de la population de baleines à bosse de La Réunion en lien avec le réchauffement climatique
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
160 baleines à bosse (30 adultes et 10 baleineaux par an sur quatre ans) vont être biopsiées dans leur milieu naturel puis laissées sur place, dans des procédures classées en souffrance légère. Le prélèvement de peau, réalisé par tir d'un emporte-pièce à courte distance sur animal vigile, provoque une réaction de surprise, un spasme et une accélération de la nage, que le porteur présente comme sans conséquence importante d'après la littérature. Le projet vise à évaluer l'état de santé de la population face au réchauffement climatique et au dérangement lié au whale-watching. Le porteur affirme qu'aucun autre modèle ne peut se substituer au prélèvement sur ces baleines sauvages.
Objectifs
Les baleines à bosse de l’Hémisphère sud sont des espèces sentinelles de l’écosystème antarctique, dont les caractéristiques biochimiques tels que les indices d’adiposité, de fécondité et du régime alimentaire (isotopes stables et acides gras) sont intimement corrélés aux conditions environnementales. Dans le contexte du réchauffement climatique, ce programme se propose d’échantillonner 40 individus (30 adultes et 10 baleineaux) par an sur une période de 4 ans (2023-2026), dans le but de contribuer à une vision d’ensemble sur l’état de santé des populations de baleines à bosse de l’Hémisphère sud et d’évaluer leur vulnérabilité face au changement climatique. Au niveau local, ces données apporteront des connaissances importantes pour évaluer le niveau de vulnérabilité des individus venant se reproduire dans la zone d'étude, face aux dérangements répétés et aux perturbations liés à l’activité croissante du « whale-watching ». Ces données permettront également de mieux interpréter les modèles visant à expliquer l’influence de facteurs environnementaux sur le niveau de fréquentation de la zone d'étude par les baleines.
Bénéfices attendus
Ce programme se propose d’échantillonner au maximum 40 baleines à bosse (30 adultes et 10 baleineaux) par an sur une période de 4 ans (2023-2026) en vue d’analyser divers paramètres biochimiques (indices d’adiposité, de fécondité et marqueurs de régime alimentaire-isotopes stables et acides gras). Les baleines à bosse de l’Hémisphère sud sont des espèces sentinelles de l’écosystème antarctique, dont les paramètres biochimiques pré-cités sont intimement corrélés aux conditions environnementales. L’évaluation de ces paramètres biochimiques pour cette population permettra de disposer d’un état de référence pour ce stock, tout en suivant son évolution temporelle. De plus, la comparaison de ces paramètres biochimiques avec ceux des autres stocks permettra de disposer d’une vision globale de l’état de santé des populations de baleines à bosse à l’échelle de l’Hémisphère sud. Ces données seront également pertinentes pour la mise en place de mesures de gestion à l’échelle locale afin de préserver la quiétude des animaux venant se reproduire dans la zone d'étude.
Procédures
Les biopsies cutanées seront effectuées sur animaux vigiles. Un animal sera prélevé une seule fois. La biopsie cutanée dure généralement quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les biopsies cutanées sont réalisées sur de nombreuses espèces de cétacés, des plus petits delphinidés aux plus grands mysticètes. De nombreuses publications scientifiques sont disponibles sur l’impact de la pratique des biopsies sur les individus et les populations. Sur les grands cétacés, il a été montré que la pratique de biopsies n’a pas de conséquences importantes. De plus, bien qu’il y ait généralement une réaction de surprise lors de l’impact (spasme du corps, accélération de la nage), les animaux reviennent rapidement à leur activité initiale.
Devenir
Les objectifs du projet impliquent le prélévement de biopsie cutané sur des animaux vivants dans leur milieu naturel. Les individus prélevés seront laissés dans leur habitat naturel
Remplacement
Les objectifs du programme imposent le prélèvement de biopsie cutanée sur des baleines à bosse dans le but d’évaluer l’état de santé la population par l’analyse de divers paramètres biochimiques (indices d’adiposité, de fécondité et marqueurs de régime alimentaire) en vue notamment de leur conservation. Aucun autre modèle ne peut être substitué.
Réduction
Dans un souci de comparaison des paramètres biochimiques analysés avec les autres stocks de baleines à bosse de l’Hémisphère sud, ce programme se propose d’échantillonner, via une biopsie cutanée un maximum de 40 baleines à bosse (30 adultes et 10 baleineaux) par an, sur une période de 4 ans (2023-2026) dans la zone d'étude. Le nombre choisi permet de disposer d’un nombre suffisant de biopsies pour des analyses statistiques fiables, tout en permettant d’échantillonner une portion restreinte de la population. Le nombre d’échantillons prélevés sera adapté en fonction de la fréquentation annuelle des baleines à bosse (rabaissé en cas de faible fréquentation). La photo-identification des individus biopsiés permettra d’éviter de prélever le même individu à deux reprises.
Raffinement
Les groupes de baleines à bosse seront approchés lentement et progressivement par les ¾ arrière, non seulement pour éviter l’effet de surprise et minimiser l’angoisse, mais aussi pour permettre à l’équipe d’attribuer un indice comportemental à chaque individu. Le point limite le plus précoce correspond à un indice de 2. Si le groupe est difficile à approcher (individus farouches ou score >2, état de la mer mauvais), ou que plus de 3 tentatives d’équipement auront été infructueuses, un autre groupe sera recherché. Seuls les individus en bonne condition physique seront prélevés. De même, les mères accompagnées de très jeunes baleineaux ne seront pas prélevées. Le prélèvement de biopsie sera réalisé : •après la désinfection préalable de l’emporte-pièce, afin de minimiser l’infection de la plaie et d’éviter la contamination de l’échantillon de biopsie, •perpendiculairement au corps de l’animal, à une distance courte (4 à 10 m), afin de disposer d’une puissance de tir optimale permettant le prélèvement d’une quantité suffisante de peau et de lard sous-cutané, et évitant toute rétention de la flèche de prélèvement sur l’animal, responsable d’angoisse et de réactions fortes. •Au niveau de la zone située sous la nageoire dorsale, zone connue pour induire le moins de réaction physique et physiologique •par des personnes formées et expérimentées, afin de limiter les tentatives en autorisant un taux de réussite optimal. La réaction de l’individu cible, ainsi que du groupe auquel il appartient, sera suivie pendant 15 minutes et les comportements seront consignés. La présence d’un vétérinaire et de membres de la structure chargée du bien être au sein de l’équipe permettra le contrôle du respect du principe des 3 R et des points limites. L’identification des individus prélevés par la méthode de photo-identification permettra d’éviter de prélever deux fois le même animal et autorisera le suivi de sa cicatrisation à plus ou moins long terme, lors des diverses prospections ultérieures
Choix des espèces
Les baleines à bosse de l’Hémisphère sud sont des espèces sentinelles de l’écosystème antarctique, dont les marqueurs biochimiques tels que les indices d’adiposité, de fécondité et les marqueurs de régime alimentaire sont intimement corrélés aux conditions environnementales. L’analyse de ces paramètres biochimiques des différents stocks de l’Hémisphère sud et leur suivi temporel permet non seulement de dresser l’état de santé de ces populations, de disposer d’un état de référence et de suivre l’évolution temporelle de ces indices dans un contexte global de réchauffement climatique. L’évaluation de leur état de santé et de leur condition physique permettra de mieux comprendre les mécanismes qui influence leur migration et leur niveau de vulnérabilité face aux interactions avec les activités anthropiques. Au niveau mondial, le statut de conservation de cette espèce est identifié comme « préoccupation mineure » sur la liste rouge UICN. Nous souhaitons prélever 30 baleines adultes et 10 baleineaux. Une partie des analyses consistent en l’estimation de la concentration en Polluants Organiques Persistants (POPs) chez les mâles adultes. Le prélèvement sur les baleineaux permettra de disposer d’un état initial de concentration en POPs afin d’étudier la bioaccumulation chez les adultes.
Fourniture de souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
250 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le projet consistant à leur greffer une tumeur puis à les livrer à un chercheur extérieur. Une lignée de cellules de glioblastome humain leur est implantée sous la peau du flanc sous anesthésie, puis elles sont expédiées au demandeur dans les quinze jours, avant l'apparition annoncée de nuisances. Ce laboratoire se limite donc à greffer une tumeur et à fournir les animaux à un tiers, qui les utilisera pour tester des sondes d'imagerie. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" pour étudier la biodistribution d'un composé.
Objectifs
Ce projet a pour but de fournir, à la demande d'un chercheur extérieur à notre laboratoire, des souris modèles de cancer cérébral. Ces souris modèles seront ensuite utilisées chez le chercheur afin d'évaluer la spécificité de nouvelles sondes d'imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons) ciblant en particulier le métabolisme du tryptophane. La lignée cellulaire tumorale d'origine humaine U87 MG Luc correspond aux besoins du chercheur. L’objectif du financement ANR du chercheur est le transfert en clinique de radiopharmaceutiques innovants pour l’imagerie TEP en oncologie et neurologie et la radiothérapie moléculaire. Il est donc nécessaire des réaliser ce projet sur une lignée cellulaire humaine. Les souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée seront envoyées au chercheur 15 jours maximum après leur induction.
Bénéfices attendus
Le métabolisme du tryptophane via la voie de la kynurénine médiée par l'indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO) joue un rôle dans l'immunomodulation et est devenu une cible plausible pour l'immunothérapie contre le cancer. Ce projet permettra au chercheur d'évaluer la spécificité de nouvelles sondes d'imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons) ciblant le métabolisme du tryptophane. L'imagerie TEP est un outil diagnostique de choix en cancérologie chez l'homme.
Procédures
Souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée : 1 seule injection par animal, cellules injectées sous anesthésie gazeuse en sous cutanée au niveau du flanc des souris. Cette procédure dure moins de 5 minutes. Pesée des animaux vigiles , dure 30 secondes, 1 fois par semaine minimum. Mesure de la tumeur au pied à coulisse, se fait sous anesthésie gazeuse, dure moins de 1 minute, 1 fois / semaine maximum. Si l'envoie des souris se fait 15 jours après l'induction: pour chaque souris 3 pesées minimum et 2 mesures de tumeur au pied à coulisse).
Impact sur les animaux
Les dommages attendus sont liés au développement d'une tumeur sous cutanée. Dans ce modèle, il n'y aura pas de métastases. Les souris seront envoyées au chercheur avant l'apparition de nuisances ou d'effets indésirables soit 2 semaines maximum après l'induction des tumeurs. La douleur infligée par l’injection des cellules correspond à celle d’une piqûre d’aiguille et se fait sur souris anesthésiée (Isoflurane 2% dans l'air) tout comme la mesure de la tumeur au pied à coulisse qui est indolore. Les souris immonodéficientes utilisées présentent un phénotype dommageable dû à leur immunodéficiences qui n'apparait pas puisqu'elles sont hébergées en portoir ventilé.
Devenir
Tous les animaux du projet (50 souris x 5 envois= 250 souris) seront uniquement induits puis hébergés dans nos locaux pendant 2 semaines maximum. Ils pourront ensuite être fournis au chercheur demandeur de ce modèle pour des projets expérimentaux autorisés réalisés dans son UE. Nous lui fournirons la grille de scoring et le suivi pondéral des animaux dans nos locaux.
Remplacement
Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro nous permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution/ciblage de nouvelles sondes d'imagerie.
Réduction
Ce modèle de cancer chez la souris a pour finalité d'être utilisé par un chercheur pour l'étude de nouvelles sondes d'imagerie. D'une part, nous avons déterminé avec lui le nombre minimal de souris nécessaire pour mener à bien son projet et d'autre part le chercheur mettra en œuvre une technique d'imagerie (Tomographie d'émission de positon) qui permettra de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Pour chaque série expérimentale, il analysera les images ce qui permettra de comparer l’accumulation du traceur dans différentes zones (« zones d’intérêt ») entre les temps d’imagerie pour chaque groupe, et entre les groupes. Les différences d’accumulation du traceur dans chaque zone d’intérêt seront analysées statistiquement.
Raffinement
Les cages sont enrichies avec des petits cylindres de coton pour la fabrication d’un nid. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement et afin d’éviter toute souffrance avant leur départ chez le chercheur, nous mettrons en place une grille de score et utiliserons des points limites adaptés et un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Etude du rôle de la voie IL-1/IL-1R1 sur la réponse à la chimio-immunothérapie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont greffées sous la peau du flanc, puis elles reçoivent des chimiothérapies et immunothérapies par voie intrapéritonéale, la masse tumorale pouvant gêner leurs mouvements avant leur mise à mort lorsque la tumeur devient trop volumineuse ou pour en prélever le tissu. Le projet vise à comprendre le rôle de la cytokine IL-1 dans la résistance aux traitements de trois cancers parmi les plus mortels. Le porteur affirme que l'évaluation de ces combinaisons "doit être réalisée sur les organismes vivants" et conclut au recours à des souris immunocompétentes greffées.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer le rôle de l’ IL-1sur l’efficacité des traitements de chimiothérapies et d’immunothérapies utilisés en clinique. Nous étudierons également la présence de cellules immunitaires dans les tumeurs. Ainsi, nous pourrons évaluer l’efficacité des traitements et déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiée. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.
Bénéfices attendus
Les cancers du côlon du pancréas et du poumon font partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Leur traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies qui malheureusement ne conduisent pas systématiquement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie, visant à activer le système immunitaire, a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas et pour certains cancers colorectaux et pulmonaires. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. L’IL-1 est une cytokine inflammatoire pouvant être produite à la suite d’un traitement par chimiothérapie. Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de l’ IL-1, sur l’efficacité anti-tumorale des chimio-immunothérapies, utilisées en clinique dans différents modèles de cancers murins. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par chimio-immunothérapie. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.
Procédures
- Injection sc des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Nombre de souris : 1600 souris C57BL/6, 800 souris C57BL/6 Il1b-/- et 800 souris C57BL/6 Il1r1-/-. - Traitements par chimiothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 800 souris C57BL/6, 400 souris C57BL/6 Il1b-/- et 400 souris C57BL/6 Il1r1-/-. - Traitements par immunothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 800 souris C57BL/6, 400 souris C57BL/6 Il1b-/- et 400 souris C57BL/6 Il1r1-/-.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies, immunothérapies et thérapies spécifiques utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important..
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Les souris utilisées pour les expériences de croissances tumorales seront mises à mort lorsque la taille des tumeurs sera trop importante. Les souris utilisées pour les expériences d’analyse du système immunitaire seront mises à mort afin de prélever la tumeur.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Les différents modèles (cancers du pancréas, du poumon et du colon) utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon l’organe d’origine, les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements. De plus, selon le type de cancers, les régimes de chimiothérapies seront différents afin de se rapprocher de la clinique. Ces traitements affecteront également de manière différentielle les cellules du microenvironnement. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour un ou plusieurs modèles, les expériences d’immunomonitoring ne seront pas réalisées sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe. Certains points limites peuvent survenir, ce qui conduira dans un premier temps à un arrêt des traitements, puis si persistance à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence des souris C57BL/6 génétiquement modifiées pour ne plus exprimer l’IL-1R1 ou l’IL-1β renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.
Etude des effets thérapeutiques lors du traitement par radiothérapie interne via l’utilisation de nanoparticules chargées au Rhénium-188 et d’un bio-implant dans le cas du glioblastome chez le rat (1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de glioblastome leur est implantée dans le cerveau, suivie de la pose d'implants biodégradables et de séances de radiothérapie interne au rhénium-188 et externe, cette dernière imposant un transport aller-retour d'environ 95 kilomètres, avec un suivi IRM hebdomadaire. Le porteur reconnaît une fatigue, du stress, une mauvaise cicatrisation, une perte de poids et une prostration possibles, et prévoit la mise à mort de tous les rats pour éviter la souffrance liée à la croissance tumorale. Il indique avoir mené des essais préalables sur cellules et sphéroïdes mais présente le recours à deux modèles de rats comme "indispensable" pour obtenir des données transférables à la clinique.
Objectifs
Le développement de ce projet chez le rat permettra d'évaluer si l'attraction de cellules cancéreuses résiduelles dans un implant biodégradable en zone confinée (la cavité d'ablation de la tumeur dans le cerveau) apporte un bénéfice préclinique en synergie d'une radiothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements du fait de l'inclusion d'un acte de radiothérapie externe à distance du site principal.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavité d'éxérèse dans le glioblastome en synergie d'irradiation pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) - la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h) - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h30) - l'association ou non à des radiothérapies (durée d'environ 30 minutes fractionnée en 2 ou 3 fois selon le type de radiothérapie). En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 3. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire. L'un des actes (radiothérapie externe) inclue un transport aller-retour d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.
Remplacement
La thématique de recherche de notre équipe concerne le développement d’approches thérapeutiques pour le traitement du glioblastome et l’étude des modalités de mise en place posant à la fois des questions fondamentales et des questions de biotechnologies pour la santé. Le projet ici proposé a pour but l’étude du piégeage tumoral au travers de bio-implants polymères pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes de piégeage (au travers d’un leurre environnemental) et celle d’élimination (au travers de l’application d’une procédure de radiothérapie interne vectorisée). L’utilisation de deux modèles pour valider ces procédures et obtenir des données interprétables par la suite valorisables par la publication et transférables à la clinique est indispensable pour répondre aux questions et livrables scientifiques indiqués dans le résumé non technique.
Réduction
En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur des cellules dissociées ainsi que des sphéroïdes ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Un groupe référence incluant la radiothérapie externe est introduit, toutefois sans modifier le nombre initial d'animaux prévus pour l'étude, tout en devant générer des données statistiquement interprétables.
Raffinement
Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Ce projet sera développé chez le rat, permettant des gradients d’infusion de chimio-attractant et des migrations cellulaires sur des volumes et distances plus importants que chez la souris. La possibilité d’utiliser deux types cellulaires dans deux types de rats est envisagée afin d’investiguer les réponses dans un cadre de xénogreffe d’une part et dans un cadre syngénique d’autre part (permettant d’étudier le rôle de l’immunité). En effet, nous avons validé des cellules humaines modifiées (de niveau sécuritaire 1) sur-exprimant le récepteur CXCR4, jouant un rôle dans les réponses aux radiations, et une protéine de fluorescence ; ce modèle sera utilisé chez le rat nude. Par ailleurs la lignée cellulaire F98 (modèle de GB de rat) sera utilisée chez le rat Fischer pour les études syngéniques. Les rats seront utilisés à 8 semaines car ils seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.
Analyse longitudinale des effets de la stimulation tactile périnatale sur le comportement au cours du développement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
64 souris vont être utilisées, 29 tuées à l'issue pour analyse du cerveau et 35 réutilisées dans d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des souriceaux sont séparés de leur mère de façon répétée, caressés brièvement puis soumis à des tests de développement, avant l'implantation d'une puce sous anesthésie, pour calibrer une batterie de tests comportementaux sur des animaux sains. Le porteur indique que la séparation mère-petit peut faire chuter la température des souriceaux jusqu'à 20 %, seuil qu'il fixe comme maximum tolérable, et prévoit de les réchauffer après chaque test. Il présente ce calibrage comme un moyen de réduire le nombre d'animaux dans de futures études sur les cancers pédiatriques.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans la continuité des études menées par l’équipe sur l’impact comportemental et neurobiologique des cancers et de leurs traitements. Sa finalité est de déterminer l’impact comportemental à court et long termes de gènes de prédisposition à certains cancers pédiatriques associés ou non à la présence d’une tumeur durant la phase de développement post natale. Il permettra également de différencier cet (ces) impact(s) de ceux liés aux traitements proposés actuellement (chirurgie, chimiothérapies, thérapies ciblées) dans le cadre des tumeurs pédiatriques cérébrales. Le recours au modèle animal permet de mesurer, sur un lapse de temps réduit et grâce à une étude longitudinale l’impact des facteurs de risques potentiels et de proposer des méthodes alternatives aux traitements actuels. Il s’agit donc ici de développer de nouvelles compétences en matière d’analyses comportementales animales traitant du développement périnatal. Il s’agit, en outre, d’enrichir la batterie de tests d’analyse comportementale chez l'animal pré adulte et l’adulte afin d’affiner les données recueillies jusqu’alors. La présente demande concerne exclusivement la mise en place et le calibrage de ces tests comportementaux chez des animaux de souche sauvage, non porteurs de gène de prédisposition, non porteurs de tumeurs et non traités avec des substances.
Bénéfices attendus
La présente demande a pour objectif de permettre la mise en place de tests comportementaux évaluant le neurodéveloppement de souriceaux et de tests effectués à l'âge adulte et pré-adulte pour évaluer l'activité exploratoire, l'équilibre et la coordination motrice, la force, l'anxiété, les interactions sociales. Les manipulations permettront de poursuivre prochainement des études portant sur la modélisation de l’impact des cancers pédiatriques et leurs traitements sur le développement, chez la souris. En incluant ces manipulations dans un projet translationnel : de l’Homme à l’animal et de l’animal à l’homme, nous pourrons appréhender les effets d’interventions complémentaires, précoces, non médicamenteuses sur le développement pour contrer les désordres neuro-cognitivo-affectifs induits par les cancers et /ou leurs traitements.
Procédures
Les animaux seront identifiés à partir de leur 3ème jour post-natal (J3) à l’aide de marques au feutre sur la peau, quotidiennement jusqu’à J6, puis quand ils auront grandi, une puce électronique d’identification sera implantée sous la peau, à l’aide d’une aiguille, après anesthésie générale gazeuse. Il n'y a pas de prélèvements effectués sur les animaux vigiles ni de procédures chirurgicales. Une stimulation tactile douce sera réalisée à J3, 5, 7, 9 et 11 sur une partie des animaux (10 mâles et 10 femelles pour le lot de souris stimulées et 10 mâles et 10 femelles pour le groupe « contrôle »), au moment de la pesée : chaque animal du groupe "stimulé" est déposé dans le creux de la main gantée de l’expérimentateur et délicatement caressé sur le dos avec l'autre main gantée pendant 15s. Les animaux du groupes contrôles sont simplement déposés dans la main de l’expérimentateur durant une période identique. L’évaluation du développement et de l’effet de la stimulation précoce seront d’abord analysés au cours d’une phase précoce. Les souriceaux seront observés quotidiennement pendant deux semaines afin de mesurer leur développement physique (ouverture des yeux, décollement des oreilles, soutien de la tête, acquisition de la marche…). Tous les deux jours, des tests comportementaux permettront d'évaluer l'évolution de leur motricité, de leur réactivité et de leur système de communication : chaque test ou manipulation durera 5 minutes maximum. Une phase d’analyse tardive sera entreprise à partir de J30 : mesure de l’anxiété pendant 5 min (J30), de l’exploration pendant 5 min (J32), évaluation de la coordination motrice et apprentissage moteur (2 séries de 3 essais de 60s maximum, tous les 2 jours, pendant 3 jours maximum), évaluation de la mémoire (J38-40 : un test de 5 min par jour pendant 3 jours successifs), test d’interactions sociales avec des animaux naïfs (7 mâles et 7 femelles) (J42-43)pendant 5 min. Puis les animaux seront mis à mort par décapitation après anesthésie gazeuse profonde.
Impact sur les animaux
Les tests périnatals nécessitent une séparation mère-petit qu’il convient de limiter. Le temps maximum cumulé de séparation mère-petit estimé avant sevrage (entre J1 et J16) est de 62 min par petit, s’il échoue à tous les tests. Il n'est pas possible d'estimer précisément et a priori l'amplitude de la baisse de température. Ce projet permettra d'obtenir ces précisions pour les manipulations futures. En fonction des résultats nous pourrons ajuster la durée des séparations mère- petit. La température corporelle des animaux sera vérifiée pendant les manipulations et à distance grâce à un thermomètre infrarouge avant et pendant la séparation. Nous ne disposons pas, à l’animalerie de l’information concernant les variations de température chez les souriceaux, en fonction des conditions d’élevage et de manipulation. C’est notamment l’objet de ce projet de quantifier de telles perturbations. D’après la littérature, dans le nid, les petits souriceaux, bien qu’incapables de thermoréguler, peuvent maintenir leur température corporelle entre 33° et 37°C. Ces oscillations sont sous la dépendance de nombreux facteurs, comme le nombre de congénères, la qualité du nid et le comportement maternel. La littérature indique également une baisse de température de l’ordre de 15 à 20 % lors d’une séparation mère/petit de 7 minutes. Nous considèrerons que 20% sera la variation maximale, tolérable dans cette expérience. Cette amplitude a déjà été observée sans provoquer de séquelle. Dans tous les cas, après chaque séparation, même de moins d’une minute, les animaux seront réchauffés avant le retour au nid, pour atteindre les 33°C. Une nuisance potentielle à prendre en compte concerne le puçage des animaux au jour 6 post-natal. Pour restreindre cette l’impact de nuisance, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale gazeuse avant l'implantation de leur puce d'identification. La séparation avec les petits peut être une source de stress pour la mère, c'est pour cela que les petits seront enlevés un par un du nid pour être testés avant d'être remis à la mère de manière à ce qu'elle en ait toujours plusieurs avec elle.
Devenir
Les cerveaux des animaux impliqués dans l'étude développementale individuelle (20 males et 20 femelles maximum) seront analysés afin de déterminer les effets des stimulations périnatales sur les structures nerveuses. Afin de limiter dans son ensemble le nombre d'animaux utilisés en expérimentation animale, les 14 souris naïves ayant été utilisées pour les tests d'interactions sociales ainsi que les 10 femelles utilisées pour produire les souriceaux seront utilisées dans d'autres projets autorisés. Les souris réutilisées incluent donc les 10 femelles gestantes, les 14 souris naïves utilisées pour le test d’interaction sociale et les 11 souris surnuméraires (selon un calcul effectué en se basant sur une moyenne de 6,5 souris par portée). Ainsi, 29 animaux seront euthanasiés pour prélèvement et 35 animaux seront réutilisés.
Remplacement
L’approche comportementale renseigne sur le fonctionnement cérébral et vient donc répondre à une problématique qui ne peut pas être abordée avec la plupart des modèles in sillico ou in vitro actuels.
Réduction
L’utilisation de mâles et de femelles et d’une batterie de test suffisamment complète, fine et calibrée permet de réduire le nombre d’animaux utilisés par la suite dans les expérimentations. Elle nécessite une mise au point rigoureuse afin d’anticiper de futures erreurs potentielles de protocole. Ce faisant, le travail en amont de calibrage du matériel, des durées d’expérimentations et de planification des manipulations permet, in fine, de limiter le nombre d’animaux qui seront intégrés dans les futures expérimentations. De plus, une bonne maitrise du protocole permet de limiter les durées de séparation mère-petits dans les futures manipulations et, de fait, l’éventuel stress associé à cette séparation. Contrairement aux projets transversaux, l’avantage des projets longitudinaux est de permettre un suivi individualisé des animaux. Il permet, en outre de réduire considérablement le nombre des animaux utilisés dans les protocoles. L’effectif par groupe expérimental a été estimé à partir d’un test de puissance et à partir de données sur le développement de la littérature pour mettre en évidence une différence significative. Le nombre 10 par groupe est la valeur limite basse pour observer des différences significatives. L’étude des comportements sociaux chez les animaux adultes nécessite d’exposer un animal expérimental à un animal naïf, n’ayant pas été manipulé au préalable. Ces animaux naïfs seront au maximum au nombre de 7 mâles et 7 femelles et pourront être utilisés dans un autre projet. Les stimulations périnatales ont un effet qui est la plupart du temps bénéfique sur le développement de souris porteuses de lésions cérébrales précoces. Il demeure néanmoins important de déterminer l’intensité de cet effet chez des animaux sains, ceci afin de limiter, là encore, le nombre d’animaux dans les futures études.
Raffinement
Les analyses comportementales entreprises visent notamment à isoler l’impact de différents facteurs sur la réactivité émotionnelle. Le but ultime du projet est de définir une méthode de remédiation des désordres neuro-cognitivo- affectifs induits par le cancer ou les traitements actuels des tumeurs pédiatriques. Le projet nécessite par essence de réduire au maximum tout facteur induisant un stress chez les animaux. Les périodes de séparation mère-petit bien que nécessaires pour les manipulations et pour reproduire au mieux les périodes périnatales humaines, seront limitées à leur maximum. Cette réduction du temps de manipulation nécessite une bonne maitrise du protocole et des manipulations. Les animaux ne seront pas soumis à des à des environnements sonores ou olfactifs identifiés comme stressants (odeurs de prédateur par exemple). Les tests comportementaux décrits plus loin ne font pas usage de contraintes importantes (i.e. pas de contention, de privation alimentaire, de chocs électrique ou manipulation de longue durée). Ils sont, pour la plupart, basés sur de l’exploration spontanée et/ou des comportements naturellement exprimés par les animaux (retournement, orientation olfactive, marche rythmée, évitement d’obstacles lors de la déambulation, exploration libre d’un environnement…). Une surveillance du comportement de la mère envers ses petits après toute séparation sera appliquée. Les gants seront plongés dans la litière du nid avant toute manipulation des petits et seront changés entre chaque portée. Un suivi de la température des animaux sera fait à plusieurs reprises avec un thermomètre infrarouge afin de détecter l’apparition d’une éventuelle hypothermie (voir 3.3.2.4). De plus, des tapis chauffants seront utilisés lors des séparations et les animaux seront réchauffés au creux des mains de l'expérimentateur après chaque test effectué jusqu'à ce qu'ils aient acquis une fourrure suffisante. A partir du 3ème jour post-natal (J3), les souriceaux seront identifiés à l’aide de marquages cutanés avec des feutres permanents non toxiques. A partir de J6, les souris seront identifiées grâce à une injection sous-cutanée d'une puce d’identification faite sous anesthésie gazeuse afin de réduire le stress des animaux. Un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement, et permettra ainsi de déceler d’éventuels signes de souffrance (perte de poids de plus de 15%, exclusion du nid, hypothermie non résolue non alimentation), considérés comme point limite.
Choix des espèces
Le travail entrepris a pour but de développer une batterie de test chez la souris car les gènes de prédisposition aux cancers pédiatriques qui seront étudiés dans les prochains travaux sont proposés avec ce modèle animal. La demande d'autorisation de projet a pour objectif de mettre en place une batterie de tests pour analyser le développement chez la souris : nous mesurerons plusieurs items de développement au cours des 16 jours postanatals, avant le sevrage des animaux. Cette période est par ailleurs critique pour la mise en place des structures d’intérêt qui seront étudiées dans les futurs protocoles. les animaux seront ensuite retestés lors d'une période correspondant à la période d'adolescence chez l'humain (entre le jour 30 et le jour 45) car les futurs projets cibleront cette période critique de développement.
Réponse antidépressive et modèles pharmaco-résistants chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont isolées en cage individuelle jusqu'à la fin de l'expérience, soumises à des stress répétés, injection d'ACTH et nage forcée, puis reçoivent des substances et des prises de sang, pour créer un modèle de dépression résistante aux traitements et tester l'effet de la lumière. Le porteur justifie l'effectif de dix animaux par groupe autant par la puissance statistique que pour "éviter tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication". Il affirme que l'usage d'animaux vivants est "incontournable" pour analyser une dépression pharmaco-résistante, malgré des approches in vitro déjà menées.
Objectifs
La dépression majeure concerne environ 17 % de la population française, ce qui en fait le trouble psychiatrique le plus fréquent. La classe d’antidépresseur prescrite en première intention sont les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, mais 50% des patients déprimés ne répondent pas correctement à ce type de traitement, d'où l'importance de chercher de nouvelles stratégies capables de potentialiser leur effet.
Bénéfices attendus
Nous prévoyons que ces deux modèles induisent des comportements pseudo-dépressifs stables et résistants à des traitements classiques mais également en développements. De même, le traitement par la lumière seule ne devrait pas avoir d’effet antidépresseur. En revanche, le traitement par la lumière permettrait de potentialiser la réponse antidépressive des antidépresseurs résistants.
Procédures
Les interventions prévues sont : 1) Les animaux seront isolés dans des cages individuelles jusqu’à la fin de l’expérimentation. Cependant, les animaux pourront voir leurs congénères et auront aussi accès à leurs odeurs et bruits. 2) Les animaux subiront des administrations de substances actives et de prélèvements sanguins sur animal vigile, 3 fois moins de 7 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) dès réception et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages munies d’un capteur infrarouge permettant de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. Cependant, les cages sont placées dans une armoire, et les animaux ont donc accès aux odeurs et bruits de leurs congénères. 2) les animaux subiront un changement de cycle pendant 14 jours pour pouvoir effectuer les tests comportementaux à l’obscurité. 3) Les animaux subiront des stress (injection ACTH, nage répétée) afin de valider le modèle de dépression pharmaco résistant. 4) Les animaux subiront des administrations de substances actives et des prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expérimentations. Ayant subi un protocole pharmacologique et/ou de stress chronique, les animaux ne peuvent pas être réutilisés dans une autre étude pour éviter tous biais.
Remplacement
Des approches in vitro sont déjà réalisées au laboratoire (évaluation de la neurogène et de la synaptogenèse, électrophysiologie in vitro). Cependant, l'utilisation de modèles complexes, i.e. d'animaux vivants, est incontournable afin d'analyser les réponses antidépressives dans des modèles de dépression pharmaco-résistants.
Réduction
Les groupes sont formés de 10 animaux. Le nombre d'animaux utilisés est fonction de la réponse physiologique mesurée et est basé sur nos travaux précédents. Il correspond également au nombre classiquement utilisé dans la littérature pour la validation de cette réponse. Le nombre d'animaux est réduit à une valeur minimale (10 animaux par groupe) permettant d'une part d'atteindre une significativité statistique pour la validation et l'évaluation des réponses mesurées et d'autre part d'éviter tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication. Pour réduire le nombre total d'animaux, nous réalisons plusieurs tests chez le même animal et certaines mises au point techniques seront réalisées en réutilisant le même animal.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. Pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton). Pendant une dizaine de jours, ils feront l’objet d’une attention particulière afin de vérifier le bon développement du model. En cas de problème d’alimentation, les animaux auront accès à de la blédine directement dans une coupe dans la cage. L’observation des animaux sera effectuée tous les 2 jours et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Les points limites sont basés sur l'apparition de signes généraux évocateurs de souffrance : dyspnée, chute de température. En cas de signe de douleur (grille de score de la douleur >5), une injection analgésique de buprenorphine sera prodiguée. En cas de dépassement du point limite, les animaux seront mis à mort par anesthésie systémique avec de la kétamine et une injection létale d’euthasol. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié.
Choix des espèces
Les rongeurs sont choisis car il s'agit des plus petits mammifères ayant un cerveau encore suffisamment homologue à celui de l'homme pour mener des études expérimentales en neuropsychiatrie. Des animaux adultes seront utilisés car chez l'homme, les antidépresseurs sont majoritairement prescrits chez l'adulte.
Effet d’une infusion centrale chronique d’hormones thyroïdiennes sur l’expression de l’hibernation chez le hamster syrien mâle
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
219 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque hamster est hébergé seul seize semaines en conditions hivernales, exposé au froid à 8 °C pour entrer en hibernation, et subit deux chirurgies, la pose d'un capteur de température puis d'une pompe diffusant des hormones, la moitié des animaux étant en plus castrés. Le porteur indique que des injections pratiquées pendant la torpeur peuvent provoquer une douleur aiguë et le réveil de l'animal, et que la castration peut entraîner une hémorragie et des douleurs supplémentaires. Il affirme que l'hibernation met en jeu l'organisme entier et qu'aucun moyen de substitution ne permet de la modéliser, justifiant le recours au hamster syrien.
Objectifs
L’hibernation est une adaptation physiologique et comportementale qui permet la survie de l’espèce pendant les périodes saisonnières défavorables (en hiver : température extérieure basse et pénurie des ressources alimentaires). Tout au long de l’hibernation, afin d’économiser de l’énergie, l’animal va réaliser des cycles d’éveil/sommeil, alternant entre des phases actives avec une température corporelle à 37°C et des épisodes de torpeur, caractérisés par un endormissement profond associé à une hypothermie corporelle sévère. La température corporelle s’ajustant sur les températures extérieures froides de l’hiver peut descendre à 5°C. Des travaux antérieurs suggèrent que les hormones thyroïdiennes du cerveau seraient impliquées dans ces processus d’hibernation. Nous allons vérifier cela chez une espèce hibernante : le hamster syrien.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet concernent les connaissances obtenues en recherches fondamentales sur le système nerveux central, le métabolisme ainsi que sur la biologie d'un animal hibernant.
Procédures
Les hamsters syriens seront hébergés seul pendant 16 semaines dans des conditions où les jours sont courts comme en hiver mais également exposés au froid afin d'obserser les comportements hibernatoires des animaux. Les animaux subiront deux actes chirurgicaux à 2 semaines d'intervalle. Le premier acte durera moins d'une heure 1 h pour l'insertion d'un capteur télémétrique de température corporelle, permettant le suivi à distance de l'hibernation des animaux. Le deuxième acte, d'une durée de 2h30 maximum pour la mise en place d'une mini-pompe diffusant des hormones. Ils seront exposés au froid (8°C) pour entrer en hibernation. Lors d'utilisation de pompe rechargeable, des injections transcutanées sont réalisées en phase de torpeur (animaux profondément endormis). Une castration est ajoutée à la première chirurgie pour la moitié des animaux. L'évolution de l'hibernation des animaux est surveillée pendant 6 semaines environ.
Impact sur les animaux
Lors des chirurgies, l’anesthésie générale peut induire une hypothermie, de la sécheresse occulaire et une légère déshydratation. Au niveau du site d’incision, il y a des risques de douleur, d’inflammation et d’infection de la plaie. Une perte de poids légère (inférieure à 5%) sur 24h est attendue, mais devrait être transitoire. Elle pourrait se maintenir en cas de complications post-chirurgicales (inflammation, infection, douleur). L’insertion de la pompe sous la peau du dos pourrait éventuellement gêner la motricité de l’animal (encombrement, frottements) si celle-ci est trop proche du cou ou des membres antérieurs. Dans le cas d'utilisation de la pompe rechargeable, lors d'un épisode de torpeur, des injections transcutanées sont réalisées et peuvent induire une douleur aigüe légère et son réveil. La castration peut induire une hémorragie et de douleurs supplémentaires.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements en fin d'expérience.
Remplacement
L’expérience doit être réalisée sur l’animal entier. Les processus impliqués dans l’hibernation font intervenir l’ensemble de l’organisme, aussi est-il impossible, en l’état actuel de nos connaissances, de réaliser une telle étude sur des organes isolés. Aucun moyen de substitution ne permet de modéliser les différentes étapes de l’hibernation et les processus liés à chaque étape ni les relations entre les organes périphériques et le cerveau.
Réduction
Le nombre d'animaux (8 par groupe) a été calculé pour obtenir des résultats statistiquement robustes et de faible variance pour comparaisons inter-groupe.
Raffinement
Pour éviter les agressions dans les jours courts comme en hiver, les animaux seront hébergés en cages individuelles enrichies avec de la frisure de nidation et un bâton à ronger. Lors des chirurgies, les animaux bénéficieront d'une anesthésie générale et d'analgésiques locaux. La température corporelle sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Un anti-inflammatoire non stéroïdien sera administré en post-chirurgie. La longueur du cathéter entre la canule et la pompe est tout particulièrement ajustée afin de pas gêner le hamster syrien dans ses mouvements. Des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le hamster syrien (Mesocricetus auratus) car c’est un animal hibernant. Les animaux sont des adultes mâles (entre 3 et 9 mois ; poids corporel moyen 120 g) car notre expérience requiert qu’ils soient sexuellement matures et ce sexe nous permet de voir facilement si le système reproducteur de l'animal est activé ou inhibé grâce à la taille des testicules.
Développement d’un nouveau biomatériau naturel poreux pour une médecine régénérative en vue de traiter les communications bucco-sinusiennes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une perte de substance du palais leur est infligée sous anesthésie pour créer une communication entre la bouche et les sinus, comblée par un biomatériau à base de collagène et de lysat plaquettaire, avec un suivi de trois semaines par scanner avant mise à mort au 21e jour. Le porteur reconnaît des douleurs postopératoires, des difficultés à s'alimenter, des risques d'infection, de nécrose et une mortalité pouvant atteindre 5 %. Il affirme qu'il n'est pas possible de se passer d'animaux et présente ce modèle comme un préalable à des essais chez l'humain.
Objectifs
Les communications buco-naso-sinusiennes (CBS) sont fréquentes en cancérologie, d'origine iatrogène de la tête et du cou et peuvent être causées par la chirurgie et/ou la chimiothérapie. Elles se manifestent sous forme de fistules entre la cavité orale et les sinus maxillaires ainsi que les fosses nasales.Ces communications peuvent entraîner des symptômes tels que des infections récurrentes des sinus, une obstruction nasale, des douleurs faciales et des écoulements nasaux persistants. Les traitements actuels sont souvent invasifs et présentent un risque élevé d'échec. Pour résoudre ce problème, nous proposons un nouveau biomatériau sec, poreux et bioactif fabriqué à partir de collagène de types I et de lysat plaquettaire. Ce biomatériau a pour objectif de fermer complètement les CBS tout en libérant des molécules bioactives qui favorise la réparation tissulaire (facteurs de croissance, des cytokines...) Le but se ces travaux d'évaluer l'efficacité de ce biomatériau sur des animaux dans le cadre du traitement des CBS. Il vise à offrir une solution thérapeutique supplémentaire aux CBS de petite ou moyenne taille, en particulier celles qui sont récidivantes et réfractaires au traitement par lambeaux. L'utilisation de ce biomatériau plutôt que d'un lambeau permettrait d'éviter la morbidité associée (séquelles du site donneur) et de raccourcir la durée de l'opération. Cela améliorerait la qualité de vie des patients, en particulier ceux qui doivent porter des plaques palatines obturatrices à vie en raison de CBS persistantes. Les approches utilisant des biomatériaux bioactifs d'origine naturelle, comme celle que nous proposons, représentent une alternative de choix pour combler ce vide thérapeutique.
Bénéfices attendus
- Prouver l’efficacité des biomatériaux pour la régénération tissulaire in-vivo - Perfectionner le modèle animal de CBS chez le rangeur (rats)
Procédures
L'induction de la communication bucco-sinusienne et la mise en place des biomatériaux seront réalisées sur l'ensemble des rats (60) sous anesthésie générale, avec une durée estimée de 60 minutes. Chaque rat sera placé allongé sur le dos sur un tapis chauffant, avec la bouche maintenue ouverte à l'aide d'un élastique placé sur les incisives maxillaires. La procédure consistera en la création d'une perte de substance palatine, conformément à la méthode décrite dans la littérature. Cette perte de substance sera ensuite comblée avec nos biomatériaux sélectionnés, soit l'aérogel de collagène et de lysat plaquettaire, soit l'aérogel de collagène seul, à l'exception du groupe contrôle. Lors de l'application des aérogels, une pression douce sera exercée avec une compresse jusqu'à obtention de l'hémostase. Un suivi de 3 semaines sera effectué, avec une observation hebdomadaire par scanner (micro-TDM) sous anesthésie générale, pour une durée estimée inférieure à 15 minutes. Ceci permettra d'évaluer la régénération tissulaire induite par nos biomatériaux dans les groupes traités et de la comparer à la régénération spontanée du groupe contrôle. Enfin, après une anesthésie générale, tous les rats seront euthanasiés au 21e jour ce qui prendra quelques secondes. Les cadavres des rats seront ensuite transférés au service de zootechnie expérimentale pour la dissection, et des analyses histologiques seront réalisées sur les échantillons.
Impact sur les animaux
Douleurs : Il est possible que des signes de douleur postopératoire apparaissent en raison des incisions chirurgicales, de la manipulation tissulaire et des lésions tissulaires pendant la chirurgie. Ces douleurs peuvent avoir des effets négatifs sur le bien-être général des animaux, tels que des problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité. /Difficultés alimentaires : Des difficultés à s'alimenter peuvent survenir en raison de douleurs ou d'inconfort buccal, des modifications anatomiques de la cavité buccale et des sinus qui affectent la fonction de mastication et rendent l'ingestion des aliments moins efficace./Infection : Il est possible que des infections se développent au site de la communication bucco-sinusienne ou de la réparation subséquente avec l'aérogel./ Mauvaise cicatrisation : Il est possible que la réparation avec l'aérogel ne soit pas efficace et que la communication bucco-sinusienne persiste ou se reforme. /Effets secondaires systémiques : L'utilisation de l'aérogel pour la réparation de communications bucco-sinusiennes chez les rats peut entraîner des effets secondaires systémiques, tels que des modifications du poids corporel, du métabolisme ou d'autres paramètres physiologiques. Réaction immunitaire : Il est possible que certains animaux développent une réaction allergique à l'aérogel, ce qui pourrait entraîner des symptômes tels que de l'inflammation, des rougeurs, des démangeaisons ou une nécrose tissulaire. /Mortalité : Il est possible que des animaux décèdent en raison de complications liées à la procédure de réparation avec l'aérogel, telles que des infections, des complications chirurgicales ou des réactions inattendues (risque estimé inférieur à 5%).
Devenir
Mise à mort nécessaire pour examen histologique (évaluation biointégration, biodégradation, formation osseuse, présence d'ostéoradionécrose).
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier l'efficacité du nouveau biomatériau dans une étude préalable sur modèle animal. Une seule formulation de mousse composé de collagène et de lysat plaquettaire parmi 3 formulations de départ sera évaluée, car l’évaluation in-vitro (culture cellulaire 3D) a montré son fort potentiel
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature.Le critère de jugement principal est le taux de rats présentant un succès. Un succès est défini comme une régénération de plus de 50% de la surface. En utilisant un plan de A’Hern sous les hypothèses alpha=5%, puissance=85%, p0=25% et p1=55%, il est nécessaire de randomiser 20 rats dans chaque bras expérimental. Un ratio 1:1:1 sera utilisé pour la randomisation, le bras contrôle étant uniquement présent pour valider les hypothèses. Au total 60 rats (bras contrôle : n=20 / bras expérimental 1: n=20 / bras expérimental 2 : n=20) seront randomisés dans cette étude. Le critère principal est le taux de rats présentant un succès (cf. section critère de jugement principal).Il sera présenté par bras sous la forme de nombre, pourcentage et intervalle de confiance à 95% selon une distribution binomiale exacte.
Raffinement
La totalité des procédures effectuées seront réaliser par un personnel qualifié composé de concepteur de projet et d’applicateur de procédure expérimentale ainsi de chirurgiens ORL Un entrainement sur des cadavres de rats sera effectué afin de permettre aux opérateurs de se familiariser et raffiner la procédure chirurgicale. Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur (buprenorphine). Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages seront de taille adaptée. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.
Choix des espèces
Bien que les modèles animaux ne puissent reproduire précisément la physiologie ou l'anatomie humaine, le rat se distingue en tant que modèle animal particulièrement avantageux pour notre étude. Il présente une combinaison d'atouts significatifs, tels que son coût abordable, sa robustesse et sa facilité d'entretien. Notre sélection s'est orientée vers la race Wistar Han, avec des mâles âgés d'environ 7 à 9 semaines, pesant entre 251 et 275 grammes. Toutes les expérimentations animales seront rigoureusement conduites au sein d'une installation de Zootechnie agréée. Cette décision repose sur des études préalables similaires à notre approche de recherche, qui ont été précédemment publiées.
MOTORHEAD
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après la pose d'un implant sous anesthésie, elles subissent une restriction d'eau à un millilitre par jour et une contention tête fixée trente minutes par jour pendant environ trente jours, avant d'être tuées pour un contrôle du cerveau. Le projet étudie les bases cérébrales du choix entre exploration et exploitation, le porteur mettant surtout en avant la visibilité internationale attendue. Il affirme que ces mécanismes ne s'étudient que chez l'animal vigile en situation de choix, sans modèle in vitro possible.
Objectifs
La prise de décision est un processus crucial qui régit chacun de nos comportements les plus évolués. Tandis que nous apprenons de notre environnement et prenons des décisions sur la base de ces connaissances, nous conservons également la capacité d’adapter notre comportement face aux modifications soudaines de l’environnement. Cette adaptation serait favorisée par l’équilibre entre les comportements d’exploitation (c'est-à-dire l'utilisation des connaissances déjà disponibles pour obtenir un gain connu) et ceux d’exploration (c'est-à-dire la recherche d’options plus favorables). Cette hypothèse résulte des études cognitives menées chez l'homme, les primates non humains et les rongeurs. L’objectif général de ce projet est d’étudier les mécanismes cérébraux responsables de la transition entre comportements d’exploitation et d’exploration chez la souris. De nombreuses structures corticales et sous-corticales pourraient participer à ce phénomène. En particulier, des recherches récentes proposent que le cortex moteur secondaire (M2) des rongeurs constitue un nœud critique permettant le contrôle flexible des actions volontaires. Ce constat est étayé par la spécificité de cette structure ayant un rôle démontré dans les comportements flexibles. Ce projet vise donc à éclairer le rôle du M2 pour décider quand explorer ou quand exploiter l'environnement. Pour cela, nous utiliserons l’imagerie cérébrale des structures d’intérêts lorsque la souris est soumise à un test comportemental permettant de quantifier les comportements d’exploitation et d’exploration. Enfin, nous testerons le rôle causal des connexions neuronales identifiées pendant l'exploration et l'exploitation en effectuant des manipulations sélectives des différentes voies sous-corticales.
Bénéfices attendus
Cette étude est avant tout un projet de science fondamentale visant à comprendre les principes neuronaux permettant l’adaptation de la prise de décision dans des environnements changeants. Ce champ de recherche est en effet devenu un domaine extrêmement compétitif au niveau international, et pourtant n'est que faiblement représenté en France. Ce projet améliorera significativement la visibilité internationale de la recherche académique française et placera le porteur en position de force pour réévaluer les rôles complexes des régions motrices et leur connexions aux régions corticales. Au-delà de cet aspect fondamental, ce projet possède une forte composante translationnelle. En effet, l'accent mis sur l'exploitation-exploration des actions volontaires est central dans les neurosciences cognitives, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre efficacement le compromis exploitation-exploration est une caractéristique frappante de plusieurs troubles mentaux.
Procédures
1) Anesthésie chimique sans chirurgie pour la procédure 1 d'implantation. Elle sera realisée une seule fois par souris, pour une durée maximale d'une heure. 2) Restriction hydrique (1 ml/ jour) et contention « tête-restreinte » (30 min/jour) pendant environ 30 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
1) Anesthésie chimique sans chirurgie pour la procédure 1. 2) Restriction hydrique (1 ml/ jour) et contention « tête-restreinte » (30 min/jour) pendant environ 30 jours consécutifs. Ces nuisances sont indispensables pour l’imagerie biphotonique et motiver les souris à la tâche expérimentale.
Devenir
A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort. Il est nécessaire de réaliser des contrôles histologiques ou des expériences d’immunohistochimie sur les cerveaux fixés afin de valider les coordonnées des sites d’injection des virus et des sites d'enregistrement.
Remplacement
L’étude des mécanismes de la prise de décision est un enjeu sociétal et économique majeur des neurosciences modernes, comme le relèvent de nombreuses situations humaines inadaptées (prise de risque, addiction au jeu, compulsivité, troubles psychiatriques). Par définition, ces mécanismes ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision et permettra de jeter les bases d'études plus appliquées.
Réduction
La nature innovante des méthodes utilisées (imagerie biphotonique chronique, et optogénétique chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l’expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre des animaux. En effet, certains tâches dans les procédures mettent en jeu des techniques non invasives et non douloureuses qui seront réalisées de façon quotidienne pendant le comportement chez le même animal. Ces techniques modernes permettent donc de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient être le résultat d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques pairés sur la base des données préliminaires déjà obtenues (moyenne et ecart-type) afin de satisfaire les conditions statistiques de puissance et de significativité (puissance (beta) de 0.8 et un seuil de significativité (alpha) de 0.05).
Raffinement
Les compétences techniques et expérimentales du porteur du projet sont reconnues internationalement, comme prouvé par la qualité élevée des financements obtenus faisant suite à une évaluation exhaustive du projet par de multiples comités d’expert scientifique du domaine scientifique, et garantissent la qualité des procédures expérimentales et de leur raffinement (habituation des animaux, optimisation du comportement et des techniques d’enregistrement, points limites, …). Le projet ne comprend pas de chirurgies. Cependant, la procédure d’implantation, bien que non invasive et non douloureuse se fera malgré tout sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les animaux ne sont jamais isolés mais maintenus en groupe sociaux (5 par cage avec nourriture adaptée et enrichissement : nid, maison et tunnel) et manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée (2 fois par jour) après la restriction hydrique. Des points limites spécifiques suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux : 1) Déshydratation (persistance au test de pli) et/ou perte de poids supérieur à 25 % du poids mesuré au jour 1 avant restriction ; 2) Infection de l’implant (plaie purulente, rougeur, tuméfaction, abcès) ; 3) Qualité de l'implant (perte ou dégradation) ; 4) Neurologie (tremblements, ataxie marquée, tête penchée, crises convulsives). Ces points sont vérifiés deux fois par jour selon un tableau de suivi simplifié (absence/présence) permettant la mise en place de mesures rapides et ciblées (et d’arrêt si nécessaire) si ces points sont observés, respectivement : 1) arrêt immédiat de la restriction hydrique et sortie du protocole le temps nécessaire pour une prise de poids ; 2) analgésie générale (Buprenorphine) pendant 3 jours ; 3 et 4) euthanasie immédiate.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux qui nous intéressent ici (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine sans avoir recours à des primates non-humains. Les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris seront donc largement transférables à l'homme, et permettront de mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision en général tout en jetant les bases d'études plus appliquées chez les humains. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.
Etude des mécanismes évolutifs des grenouilles aquatiques de la famille des Pipidae
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
Xénopes : 40
40 xénopes et 314 autres amphibiens vont être utilisés, gardés en élevage et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent deux injections sous-cutanées d'hormones pour induire la reproduction, geste pouvant provoquer une blessure ou une réaction cutanée. Le projet étudie les mécanismes évolutifs de grenouilles aquatiques, les femelles étant induites à pondre de nombreuses fois sur une vie longue. Le porteur affirme que la fécondation in vitro est la seule méthode pour obtenir des embryons en nombre, tout en indiquant explorer des lignées cellulaires pour éviter des mises à mort.
Objectifs
L’évolution des espèces met en jeu des mécanismes qui agissent à des niveaux biologiques différents : génétiques, cellulaires, comportementaux etc Notre projet cherche à mieux comprendre certains de ces mécanismes qui sont à l’œuvre chez les amphibiens, un groupe d’animaux vertébré comme l’homme. Un aspect central des recherches pour ce projet porte sur la génétique des amphibiens, la génétique de leur développement embryonnaire et l'écologie moléculaire en particulier au travers de l'étude des microbiomes d'amphibiens. Ces sujets sont développés depuis plusieurs années dans le laboratoire et font l’objet de collaborations scientifiques internationales.
Bénéfices attendus
Les travaux réalisés devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes génétiques de l'évolution des amphibiens anoures, et de comprendre l'impact de l'environnement sur leurs caractéristiques génétiques. Cette étude devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes évolutifs liés aux changements du nombre de chromosomes chez ces amphibiens.
Procédures
L'intervention consistera en deux injections sous-cutanées dans la région dorsale et postérieure du tronc avec contention de l'animal vigile. La durée de chaque procédure d'injection est d'environ une minute. Les deux injections doivent être réalisées à 72h d'intervalle.
Impact sur les animaux
La procédure d'injection sur l'animal vigile en contention peut entraîner une blessure de l'animal avec l'aiguille, avec possibilité de saignement. Une réaction cutanée ou systémique à l'injection de la solution d'hormone peut également appararaître.
Devenir
Les animaux adultes seront maintenus en élevage.
Remplacement
Pour notre projet, l’utilisation d’animaux vivants revêt un caractère de stricte nécessité car la reproduction induite par fécondation in vitro constitue la seule méthode pour élever les espèces étudiées, obtenir des embryons et des têtards à développement synchrone, de stade précis, et en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques, et étudier les éventuelles barrières de reproduction entre ces espèces. Des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne sont donc pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En revanche nous explorerons la possibilité d'obtenir des lignées cellulaires des différentes espèces étudiées afin d'avoir une source de matériel biologique ne nécessitant pas l'euthanasie d'animaux.
Réduction
La réalisation de notre projet implique notamment l'injection d'hormone chez des femelles xénopes adultes pour la production d’ovocytes afin d’obtenir des embryons. Pour réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés, nous prenons en compte que i) Les femelles, ayant une période reproductive longue (15 ans), peuvent être induites à pondre de nombreuses fois; ii) les testicules des mâles euthanasiés disséqués pour la fécondation in vitro sont utilisés pour plusieurs expériences et par plusieurs expérimentateurs minimisant ainsi le nombre de mâles mis à mort; iii) nous réalisons des fécondations naturelles évitant le sacrifice du mâle à chaque fois que c'est possible.
Raffinement
Dans le but de réduire la douleur, souffrance ou angoisse, nous utilisons des conditions d’élevage conformes à la directive 2010/63/UE et à la STE123. Nous appliquons des points limites stricts et spécifiques aux amphibiens. L’utilisation des femelles et des mâles se fera par roulement tous les quatre mois permettant le renforcement positif lors des manipulations. Nos conditions d’élevage sont régulièrement améliorées en fonction de nos connaissances sur l’écologie et la biologie de nos espèces mais aussi en fonction des connaissances sur le bien-être, le comportement et l’éthologie des espèces aquatiques qui se diffusent dans la communauté scientifique.
Choix des espèces
Le xénope est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Il occupe une place phylogénétique clé (vertébré tétrapode non-mammifère). Nous disposons des génomes pour les deux espèces (X.tropicalis et X.laevis) et l’analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain : 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont leurs orthologues chez le xénope. Par ailleurs, ces espèces sont faciles à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. X. tropicalis est diploïde avec un temps de génération plus court que X. laevis. Tout comme le poisson zèbre, le xénope fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont couramment utilisées. Nous utilisons des animaux aux stades adultes car c'est le seul stade de développement permettant leur reproduction sexuée. La reproduction induite par fécondation in vitro constitue la seule méthode pour élever les espèces étudiées, obtenir des embryons et des têtards à développement synchrone, de stade précis, et en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques, et étudier les éventuelles barrières de reproduction entre ces espèces.