Oncologie

Ayant reçu sous anesthésie gazeuse une prodrogue de vinblastine sous la peau du dos, ou de la vinblastine dans la veine de la queue, des souris BALB/c sont ensuite tuées pour l'analyse de leurs organes ou de leur sang, certaines après une ponction cardiaque sous dose létale de pentobarbital. 108 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Il s'agit de fixer la dose maximale tolérée de la prodrogue, en testant jusqu'à quatre doses croissantes sur des groupes de quatre souris, soit la dose "la plus élevée qui produira l'effet souhaité sans entrainer d'effets indésirables inacceptables". Parmi les nuisances attendues, le porteur ne cite que le stress de l'anesthésie et des pesées et une gêne ou une inflammation au point d'injection, sans rien dire des effets des doses les plus fortes.

Objectifs

L’administration de médicaments anticancéreux par voie sous-cutanée est actuellement limitée par leur faible solubilité, leur viscosité et leur toxicité au niveau du site d’injection (irritations voire nécroses cutanées). Nous proposons dans ce projet une nouvelle approche permettant d’administrer efficacement par voie sous-cutanée des chimiothérapies anticancéreuses déjà présentes sur le marché. Nous avons en effet développé une technologie innovante qui consiste à coupler un agent de chimiothérapie existant, la Vinblastine, à une succession de molécules pour le rendre soluble et injectable par voie sous-cutané. L’objectif de cette étude est d’étudier la toxicité et la distribution dans l'organisme de cette prodrogue de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC), comparativement à la Vinblastine seule, administrée en intraveineuse (IV). L’étude de toxicité a pour objectif de déterminer la dose maximale tolérée (DMT, dose la plus élevée qui produira l’effet souhaité sans entrainer d’effets indésirables inacceptables) par voie SC de la prodrogue de Vinblastine, et de vérifier qu’elle n’induit pas de toxicité au niveau du site d’injection. L’étude de pharmacocinétique permettra de vérifier qu’il est possible d’avoir une exposition au principe actif comparable à la voie intraveineuse, et donc une efficacité thérapeutique similaire.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est de démontrer l’innocuité de la prodrogue polymère de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC) et de comparer son profil pharmacocinétique à celui de la Vinblastine libre administrée en intraveineuse (IV). De tels résultats permettraient d’envisager la délivrance des principes actifs anticancéreux par voie sous-cutanée, qui seraient à la fois efficace, confortable pour le patient et bien moins couteuse dans son utilisation que les chimiothérapies actuelles.

Procédures

Chaque souris recevra une seule injection de la prodrogue polymère par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%) dans la région dorsale préalablement rasée ou de la Vinblastine libre en intraveineuse sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%). Cette intervention durera environ 10 minutes, anesthésie comprise. Certaines souris subiront également un prélèvement sanguin terminal effectué par ponction cardiaque après injection d’une dose léthale d'anesthésique de pentobarbital, un anesthésique puissant, et la mise à mort de l'animak sera confirmée par élongation cervicale. Cette intervention durera environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances suivantes sont attendues : - L'anesthésie par cage à induction qui pourrait entrainer un stress de l'animal avant endormissement. - Les injections de la vinblastine en intraveineuse dans la veine de la queue et de la prodrogue en sous-cutané, qui pourraient causer une gène ou une inflammation au niveau du site d'injection - Les pesées qui peuvent entrainer un stress chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de prélever les organes et la zone d'injection pour des études histologiques afin de vérifier l’absence de toxicité systémique et de toxicité locale aigue (procédire 1) ou pour effectuer des prélèvements sanguins terminaux (procédure 2).

Remplacement

Les médicaments, durant leur transport dans l’organisme, vont interagir avec les éléments du système immunitaire et être soumis à une métabolisation (hépatique, rénale, …) qui peut provoquer l’apparition de métabolites pouvant être plus ou moins actifs voire toxiques. Cette chaine de phénomènes complexes ne peut pas être modélisée ou mimée in vitro. Il est donc nécessaire de mener ces études sur des animaux vivants pour reproduire tous ces processus et évaluer la toxicité et la fraction de substance active qui arrive dans le sang.

Réduction

Les études préliminaires in vitro ont permis le criblage de différentes formulations dont une seule sera testée in vivo, permettant ainsi une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans cette étude. Une planification statistique minutieuse permet aussi de réduire le nombre d’animaux tout en préservant la validité statistique de l’étude. La DMT de la prodrogue sera déterminée en testant des doses croissantes de prodrogue à partir de la dose équivalente à la DMT par voie IV de la molécule libre (connu dans la littérature) car la prodrogue polymère est censée avoir une DMT supérieure à celle de la molécule libre. Quatre doses seront testées au maximum, nous nous arrêterons avant si la DMT de la prodrogue est atteinte. Le dimensionnement des groupes a été déterminé par un test de puissance (erreur de 5% et puissance de 80%) qui permet de mettre en évidence une perte de poids de 10% avec une variabilité de 10% avec 4 animaux par groupe. La DMT du principe actif libre, bien décrite dans la littérature, ne sera testée qu’à deux doses maximum pour tenir compte de la variabilité inter-souche. Pour la pharmacocinétique de libération du principe actif, une seule dose sera testée pour déterminer quelle est la prodrogue qui permet une libération optimale du principe actif dans le sang. La prodrogue polymère et la molécule libre seront administrées à une dose équivalente permettant leur détection pendant 48 à 72 heures, afin de pouvoir comparer la cinétique de la molécule libre et de la prodrogue. Nous cherchons à mettre en évidence une augmentation du temps de présence de la molécule dans l'organisme. Le nombre d’animaux nécessaire (erreur 5%, puissance 90%) a été évalué à 4 animaux par groupe. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test non-paramétrique.

Raffinement

Dans notre laboratoire, les animaux en provenance des centres d'élevage sont pris en charge dès leur arrivée (environ 8 jours avant le début de l'expérimentation), jusqu'à l'euthanasie. Le bien-être animal sera respecté : -Conditions d’hébergement adaptées : nourriture et eau à volonté, température constante de 20°C et mise en place d’un cycle jour/nuit inversé par période de 12 heures. -Temps d’acclimatation de 8 jours avant toute procédure -Souris hébergées en groupes (6 par cage) -Enrichissement des cages : dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques (Cell Nest) -Définition des points limites et évaluation quotidienne des signes de douleurs (difficultés respiratoires, prostration, atonie, défaut d’alimentation, isolement, ou tout autre signe physique tel que la position des oreilles ou des vibrisses). La définition exacte des points limites se trouve dans une grille des scores de la douleur, qui évalue le bien-être animal sur chacun de ces points et décrit la conduite à tenir en fonction de l’état de l’animal (par exemple augmentation de la fréquence du suivi, utilisation d’analgésique…). De plus, toutes les procédures se feront sous anesthésie pour éviter toute forme de douleur.

Choix des espèces

Pour la réalisation de nos études, nous utiliserons des souris BALB/c. Les souris BALB/c sont un bon modèle car elles sont blanches et permettent de suivre plus facilement les apparitions de nécroses ou d’irritations au niveau cutané. Les premières études ayant été réalisées sur cette souche, cela nous permettra aussi de comparer les résultats. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 7-10 semaines qui ont un système immunitaire mature et des fonctions physiologiques bien établies.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des périodes d'hypergravité en centrifugeuse, qui provoquent stress, baisse d'activité et perte de poids les premiers jours, puis soumises à une série de tests comportementaux, boîte noir et blanc, reconnaissance d'objet, labyrinthe en Y et piscine de nage. Elles sont ensuite mises à mort pour prélever le cerveau. Le porteur relie le projet aux troubles cognitifs des astronautes et affirme que l'effet de la gravité sur un organisme entier ne peut être modélisé in vitro ou in silico.

Objectifs

Lors des voyages spatiaux, les astronautes sont soumis à des modifications de gravité qui compromettent leurs performances cognitives, et qui représentent encore l’un des principaux écueils concernant les vols de longue durée. Ce projet consiste à comprendre les mécanismes cérébraux, en particulier hippocampiques, induisant ces perturbations provoquées par des changements de gravité. En effet, si le système vestibulaire est le système sensoriel initialement impliqué dans le mal de l’espace, l’hippocampe, structure centrale auquel il est étroitement connecté, représente une cible potentielle de choix. Notre hypothèse est qu’une partie des troubles cognitifs des astronautes seraient liés à des modifications de la plasticité fonctionnelle des réseaux neuronaux hippocampiques, propriété reconnue comme support biologique des processus mnésiques.

Bénéfices attendus

Les données qui seront recueillies grâce à ce projet apporteront des informations essentielles sur le rôle de la gravité dans le fonctionnement de l’hippocampe et des structures associées. En effet, on sait que le système vestibulaire, qui est l’organe sensoriel sensible à la gravité est indirectement connecté à l’hippocampe et participe ainsi non seulement à l’orientation dans l’espace mais aussi à la mémoire spatiale et aux autres fonctions contrôlées par l’hippocampe. Comprendre comment la gravité modifie le fonctionnement et la plasticité de l’hippocampe, et indirectement comment elle affecte les fonctions cognitives servira de base pour trouver des contre-mesures pour aider les astronautes à éviter la désorientation et l’altération des fonctions cognitives qu’ils subissent lors de changements de gravité au cours des vols spatiaux. En utilisant différentes durées d’exposition à l’hypergravité, nous cherchons à évaluer à la fois les adaptations qui s’opèrent dans les premiers jours mais aussi sur le plus long terme et comment s’effectue la réadaptation à 1G post-exposition à l’hypergravité.

Procédures

Les animaux seront exposés à une période d’hypergravité . Ensuite, 96 animaux seront mis à mort dès la sortie de la centrifugeuse pour permettre des prélèvements de tissus (expositions de 24h, 48h, 15j). Les autres seront soumis à des tests comportementaux. Les animaux effectuant des tests comportementaux seront divisés en 2 lots avec des protocoles de comportement différents (exposition à 24h, 15 j ou 30 j d’hypergravité). Pour le premier lot, le premier jour après la sortie de la centrifugeuse, les souris feront un test de la boite noire et blanche (10 min par souris). Ce test vise à évaluer l’anxiété des souris. Le deuxième jours le test de reconnaissance de place d’objet sera utilisé (test qui permet d’évaluer la mémoire spatiale et de reconnaissance à long terme) (2 sessions de 10 min à 4h d’intervalle par souris). Le 3ème jour la sociabilité et la reconnaissance sociale des souris sera évaluée grâce à un dispositif comportemental (2 sessions de 10 min par souris). Le 4ème jour les souris effectueront la première session d’un test d’évitement passif, la seconde partie du test sera effectuée une semaine plus tard (entre 1 et 5 min par souris)(mémoire émotionnelle). Après ces différents tests, soit 2 semaines après la sortie de la centrifugeuse les souris seront mises à mort pour permettre des prélèvements de structures et des enregistrements électrophysiologiques. Pour le lot 2, le jour de la sortie de la centrifugeuse les animaux effectueront le test d’enfouissement de billes (évaluation de l’anxiété,20 min par souris). Le jour 2, les souris effectueront un test d’alternance spontanée dans un labyrinthe en Y (mémoire de travail, 5min par souris). Le 3ème jour les souris commenceront un protocole en piscine de Morris. Ce test, réparti sur 5 jours donnera des indications sur la mémoire spatiale et l’apprentissage (4x4 essais de 1min max par jour). Une semaine après la sortie de la centrifugeuse les souris seront mises à mort pour permettre des prélèvements de structure et des enregistrements électrophysiologiques. Ces études vont nous permettre d’évaluer si les modifications sont concomitantes au niveau comportemental (mémoire) et au niveau cérébral (propriétés électrophysiologiques de l’hippocampe).

Impact sur les animaux

La mise en hypergravité des animaux induit une sensation d’alourdissement qui provoque une augmentation du niveau du stress chez le rongeur, lié à la perturbation de perception de la gravité, et à la difficulté initiale à se déplacer. Par conséquent, et comme cela a été montré dans la littérature, les animaux vont présenter une faible activité motrice pendant une période de quelques heures avant de s’habituer au nouveau référentiel gravitataire et reprendre une activité normale. Une baisse de la température corporelle due à l’inactivité des animaux se produira lors des 3 premiers jours d’exposition. De nombreuses études ont aussi montré une diminution de la masse corporelle les premiers jours de centrifugation. Cette perte de poids est due à une hypophagie médiée par une réaction au stress vestibulaire induit par la centrifugation, au bout de 3 à 4 jours les animaux recommenceront à s’alimenter normalement et reprendront du poids.

Devenir

Les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure (soit 300 souris) pour la réalisation d'analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de l’hypergravité sur un organisme entier. En effet, la gravité exerce des effets sur l’intégralité de l’organisme (systèmes sensoriels, système musculosquelettique, viscères etc.), et les effets de ses modifications et de leurs interactions ne peuvent, à l’heure actuelle, pas être modélisés autrement que sur un organisme dans son intégralité. Par ailleurs, étant donné que nous effectuons des tests comportementaux, nous avons besoin des animaux vivants. Pour les enregistrements électrophysiologiques nous avons besoin de tranches de cerveaux d’organismes ayant été exposés à une hypergravité, qui ne sont pas encore modélisables in vitro ou in silico. Nous avons choisi le modèle souris afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur ce même modèle, car il est de petite taille et peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse. De plus, le modèle souris est un mammifère suffisamment proche de l’homme pour pouvoir transférer les données obtenues entre ces deux espèces.

Réduction

Tous les animaux utilisés pour les études comportementales seront utilisés pour les études post-mortem ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. Nous avons défini le nombre d’animaux dans chaque groupe à n=12 en nous basant sur la littérature disponible sur le sujet et sur les travaux du laboratoire utilisant les mêmes méthodes. En effet, un calcul d’effectif sur le site biostatgv.sentiweb.fr nous a permis d’aboutir à ce nombre sur la base de données précédentes acquises au laboratoire. Dans une optique de réduire le nombre d’animaux nous avons décidé de n’utiliser qu’un seul groupe d’animaux témoins et non pas un groupe témoins pour chaque temps d’exposition à l’hypergravité. Aussi, les animaux serviront en plus de la récupération de leur cerveau à des prélèvements sanguins afin d’en réduire leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Une semaine de manipulation des animaux sera réalisée avant les expérimentations afin de réduire le stress lié à la manipulation. Pendant cette semaine les animaux des groupes utilisés pour l’étude comportementale seront aussi habitués à être transportés dans un tunnel en polycarbonate rouge. Le tunnel sera placé à demeure dans la cage puis la souris sera encouragée à entrer dans le tunnel qui sera soulevé afin de faire ensuite délicatement glisser la souris dans la main. Cette méthode permet de ne pas soulever les souris par la queue et enlève par conséquent un facteur important d’anxiété. Lors des tests comportementaux les souris seront placées dans la pièce expérimentale 30 minutes avant le début des tests afin de leur permettre de s’habituer à ce nouvel environnement. De la nourriture humidifiée sur le sol ainsi que de la gélatine seront mis dans les cages pour permettre aux animaux de se nourrir et de s’hydrater facilement au début de l’exposition à l’hypergravité (il en sera de même pour les animaux témoins). Leur environnement est enrichi par des frisures de carton et un igloo en papier mâché. Les animaux seront surveillés par un système vidéo dans la centrifugeuse. De plus, à chaque arrêt de la centrifugeuse un responsable des animaux vérifiera quotidiennement leur état de santé et particulièrement d’éventuelles variations de poids, leur apparence physique externe (poils hérissés, blessures…) ou des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement ou réagissant de manière inhabituelle à l’expérimentateur, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et une discussion sera entreprise avec des membres de la SBEA concernant son éventuelle euthanasie (cf grille de points limites).

Choix des espèces

Les données bibliographiques les plus récentes sur ce sujet ont portés sur le modèle souris, il parait donc judicieux de poursuivre avec cette espèce pour pouvoir confronter nos résultats et apporter de nouvelles données. Nous avons également choisi le modèle souris car il est de petite taille, peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse et supporte bien une modification de la gravité jusqu’à 2G. Nous avons également choisi d’utiliser des souris C57BL6 car leur génome est connu et que des modifications de leur génome est possible et pourrait nous être utile par la suite (OGM sans otoconies par exemple). C’est aussi une souche qui est beaucoup étudiée au laboratoire et sur laquelle nous avons donc une importante base de données. Nous utilisons des souris adultes entre 3 et 5 mois car pour étudier la plasticité synaptique hippocampique, nous souhaitons que la croissance et le développement cérébral soient atteints. De plus, les astronautes sont toujours adultes, nos données seront donc plus facilement transposables à l’humain.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intra-trachéale de particules virales sous anesthésie pour induire des tumeurs pulmonaires, sont transférées entre deux établissements, puis suivies pour la détérioration liée au développement tumoral avant la mise à mort et le prélèvement des poumons. Cette version du projet ajoute un groupe de souris témoins pour renforcer les données. Le porteur étudie le rôle d'une protéine à bromodomaine dans le cancer du poumon et juge le modèle animal nécessaire, les cultures cellulaires restant selon lui trop éloignées de la physiologie.

Objectifs

La transformation maligne des cellules pourrait être considérée comme une série d'événements de reprogrammation cellulaire conduite par des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation en amont. La plasticité et la dynamique de la chromatine sont des déterminants critiques dans le contrôle de la reprogrammation cellulaire. Une augmentation de la dynamique de la chromatine pourrait donc constituer une étape essentielle dans la conduite de l'oncogenèse et dans la génération de l'hétérogénéité des cellules tumorales, ce qui est indispensable pour la sélection des propriétés agressives, y compris la capacité des cellules à se disséminer et à acquérir une résistance aux traitements. L'apport et le dosage d'histones sont les régulateurs les plus connus de la dynamique de la chromatine. En facilitant la reprogrammation cellulaire, le sous-dosage des histones devrait également être crucial dans la transformation cellulaire et les métastases tumorales. L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle d'un facteur à bromodomaine, dans la transformation tumorale et plus particulièrement dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Cette modifcation du projet concerne l'addition d'un groupe de souris contrôles pour renforcer nos données.

Bénéfices attendus

Le gène étudié au cours des 15 dernières années a été largement décrit comme étant surexprimé dans tous les tissus cancéreux humains étudiés et présentant un facteur de mauvais pronostic. Après analyse des articles scientifiques sur ce gènee et le cancer, il s'avère que toutes les études ont été réalisées in vitro avec des modèles de lignées cellulaires de différents cancers ou in vivo en utilisant des modèles de xénogreffes. Ceci rend difficile de conclure sur le degré d’implication de ce gène dans l’initiation et la progression tumorales in vivo d’où la nécessité de développer des modèle (s) animaux de cancer impliquant directement cette protéine. Les expériences entreprises dans ce projet devraient nous permettre de démontrer si l’activité de la protéine d'intérêt est nécessaire pour la réponse du génome à des facteurs oncogéniques. Ce travail devrait permettre non seulement de découvrir un mécanisme moléculaire de base essentiel mais encore inconnu, mais constitue aussi une étape commune critique dans la transformation maligne.

Procédures

Les animaux recevront par voie intra-trachéale une injection unique et sous anesthésie de particules virales induisant la mutation désirée dans les poumons. Aucun prélèvement ni procédure chirurgicale n'est prévu durant cette période. La préparation des particules virales dure 30 minutes environ. La durée de l'anesthésie est de 5 minutes par souris. Une fois anesthéssiées, les souris recevront par voie intratrachéale une dose de particules virales. Cette étape dure 1 à 5 minutes par souris. À la fin de cette étape, les animaux seront placés pendant 10 à 15 minutes sur une plaquante chauffante dans un environnement calme afin de leur permettre de se réveiller.

Impact sur les animaux

Dans cette partie du projet, les souris recevront une injection unique de particules virales sous anesthésie générale. Elles seront hébergées dans un premier établissement utilisateur avant d'être transférées dans un second établissement où elles seront suivies et observées pour le développement tumoral. Une détérioration de l'état général des animaux lié au développement tumoral sera étudié.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort et les poumons prélevés pour analyse histologique et biochimique.

Remplacement

Bien que les propriétés fonctionnelles du facteur que nous investigons dans cette étude aient été initialement abordées par des tests in vitro et dans des modèles de cultures cellulaires, ces derniers présentent néanmoins des limites considérables. Il n’est pas possible d’appréhender l’ensemble des mécanismes que nous étudions sans l’apport du modèle animal. A ce jour et à notre connaissance il n’existe pas de modèle animal qui permet de déterminer le rôle de notre protéine dans l’initiation et la progression tumorales. Nous avons développé des modèles alternatifs en invalidant des gènes d’intérêt dans des cellules souches de souris ou dans des lignées humaines ou encore l’utilisation de modèles de xénogreffes, mais ces systèmes basés sur la culture cellulaire in vitro présente plusieurs limites. Ce modèle de culture cellulaires est en effet très loin de la physiologie animale et ne reflète pas les évènements de dynamique de la chromatine qui ont lieu in vivo.

Réduction

Après avoir discuté avec nos biostatisticiens nous nous étions fixés un nombre minimal de 4 animaux par groupe nécessaire afin de réaliser une cinétique d'infection pour suivre l'évolution des tumeurs (sur le plan histologique mais aussi et surtout au niveau moléculaire) et pouvoir l'analyser statistiquement, car les tumeurs pulmonaires sont très hétérogènes. D'autre part, d'après notre expérience, il arrive que des animaux décèdent lors de l'expérimentation. Une réduction de nos groupes expérimentaux initiaux rendrait caduque l’interprétation et l'analyse de nos données, c'est pourquoi nous comptons faire un individu supplémentaire si besoin. Enfin, contrairement à la version précédemment autorisée nous ne réaliserons des prélèvements qu’aux 2 temps les plus pertinents par rapport aux données déjà obtenues (6 et 12 semaines) et plus à 5 temps (4, 6, 8, 10 et12 semaines), ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. C’est pourquoi nous avons n=5 animaux par groupe x 2 lignées 2 temps d’analyse différents.

Raffinement

Les injections de particules virales sont faites sous anasthésie générale pour limiter la douleur et le stress. Les souris seront maintenues sous tapis chauffant pour éviter une perte de tempréature. Du gel occulaire sera appliqué pour éviter la déshydratation. Des points limites seront mis en place pour maintenir un état de douleur léger.

Choix des espèces

Afin de mieux comprendre les mécanismes de développement et d'aggessivité tumorales et pour découvrir de nouveaux moyens plus efficaces pour diagnostiquer et traiter le cancer, il est nécessaire de mener des recherches sur les animaux vivants. Les études sur les souris sont essentielles pour comprendre la complexité des processus fondamentaux qui sous-tendent le cancer dans les organismes vivants. Les souris utilisées dans cette étude viennent d'un laboratoire de recherche américain. Le modèle a été validé sur des souris agées de 6 à12 semaines afin d'induire les tumeurs. Les souris de cet âge sont suffisement adultes pour se rétablir assez rapidement des effets de l'anesthésie, du volume des particules virales utilisé anisi que des effets de l'intubation intratrachéale.

872 amphibiens vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les grenouilles vertes relâchées et les xénopes tués. Des adultes capturés dans la nature reçoivent une injection d'hormone sous anesthésie pour obtenir des pontes, puis les têtards sont soumis à des tests de comportement face à un prédateur, en cages flottantes ou en mésocosmes. Les 436 grenouilles vertes et leurs têtards sont relâchés, tandis que les 436 xénopes et leurs têtards reçoivent une surdose d'anesthésique, cette espèce classée envahissante ne pouvant être remise dans le milieu. Le porteur présente l'étude comme utile à la conservation de la grenouille verte, quasi menacée, et affirme qu'aucun modèle ne peut remplacer l'observation directe des interactions.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’apporter des éléments de connaissance sur la sensibilité des populations d’amphibiens autochtones comme la grenouille verte à des changements environnementaux majeurs auxquels l’espèce est confrontée. Si les études scientifiques sur l’écologie de la grenouille verte sont nombreuses, l’impact de la présence de potentiels compétiteurs et/ou prédateurs invasifs sur la dynamique des populations de grenouille verte restent très mal documentés. L’étude se propose ici de tester l’impact de la présence des têtards de xénopes lisses Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis une vingtaine d’années dans les mares, cours d’eau et rivières. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet visera à étudier l’impact de la présence du xénope sur la croissance (durée de la période larvaire), la survie, la taille à la métamorphose et le comportement de la grenouille verte. Pour ce faire, il est nécessaire d’obtenir des pontes de grenouilles vertes et de xénopes à partir d’adultes capturés en milieu naturel puis injectés à l’aide d’une hormone. Une fois les pontes obtenues les adultes de grenouilles vertes seront relâchés et les adultes de xénopes seront mis à mort (dû à son statut d’espèce exotique envahissante) puis les têtards seront soit placés en cages flottantes dans une mare, soit en mésocosmes placés en laboratoire. Dans les deux situations, les têtards seront placés sous des conditions de compétition différentes (intra- et interspécifique) et sous une ou deux densités différentes (1 et 3 têtards.L-1). Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé.

Bénéfices attendus

Ce projet s’insère dans les problématiques de conservation et gestion de la biodiversité. Il s’inscrit dans le défi scientifique actuel visant à comprendre les mécanismes en lien avec la sensibilité des organismes à l’altération spatio-temporelle de leur habitat dont la présence des espèces exotiques envahissantes est annoncée comme l’une des principales causes de l’érosion de la biodiversité. Ce projet nous permettra de tester pour la première fois l’impact de la présence du xénope sur la croissance, la survie, la taille à la métamorphose et le comportement des grenouilles vertes. Nous émettons l’hypothèse que la présence de têtards de xénope dans le milieu de vie des grenouilles vertes pourrait induire une diminution de leur croissance et survie en affectant des fonctions écologiques vitales chez la grenouille verte. D’un point de vue comportemental, nous émettons l’hypothèse que la présence de xénope induirait des comportements anti-prédateurs. Ces résultats permettraient une meilleure compréhension de la biologie et de l’écologie de ces deux espèces et plus encore sur leur interaction. De manière plus globale, cette étude permettra d’apporter des éléments scientifiques qui viendront enrichir les discussions sur les stratégies de gestion/conservation de ces espèces à l’échelle du territoire notamment depuis que le xénope a colonisé beaucoup de zones humides du Maine-et-Loire.

Procédures

Le transport durant 30 minutes sera assuré dans une double boite réduisant les risques de chocs. Femelles et mâles seront injectés d’hormones pour induire l’ovulation et stimuler l’accouplement. Avant l’injection, les amphibiens seront anesthésiés dans un bain de sédatif (endormissement en 15 minutes, réveil en 10 minutes). Après l’accouplement et l’ovulation, les œufs seront laissés dans les bacs et les adultes seront déplacés dans un autre mésocosme avec les mêmes conditions environnementales. Une partie des têtards obtenus (n=250 têtards de grenouilles vertes et n=250 têtards de xénopes) seront répartie dans les cages flottantes dans la mare et une autre partie des têtards obtenus (n=180 têtards de grenouilles vertes et n=180 têtards de xénopes) seront répartis en mésocosmes sous conditions contrôlées. Ces têtards élevés en milieu contrôlé seront au bout de trois jours (stade 25) passés en tests de comportement. Ces tests seront au nombre de trois (avec 48h entre chaque test), deux face à un prédateur (xénope adulte et grenouille verte adulte) et un face à un contrôle (grenouille en plastique). Les tests seront filmés et dureront 30 minutes (15 minutes d’acclimatation puis 15 minutes de test). Chaque groupe expérimental passera une fois le test dans chacune des trois conditions. Une fois les tests passés, les adultes et les têtards seront replacés dans le milieu naturel pour les grenouilles vertes après avoir été pêchés de leur bac d’élevage, placés dans une double boite de transport puis rapportés sur leur site d’origine après 30 minutes de transport. Les xénopes ne pouvant pas être libérés dans la nature seront en revanche placés dans un bain de sédatif pour être anesthésiés puis une surdose d’anesthésiant sera ajoutée pour la mise à mort des xénopes adultes.

Impact sur les animaux

Il est envisageable qu’un individu soit blessé lors de la capture ou de la manipulation et par conséquent développe une maladie. L’effet indésirable le plus probable est le stress lié au transport et aux conditions d’hébergements. De plus, à leur arrivée dans le laboratoire, certains animaux pourraient ne pas s’acclimater à leur environnement.

Devenir

Les six grenouilles vertes adultes et les 180 têtards seront remis en liberté avec une acclimatation à leur milieu naturel en ouvrant les boites de transports à côté de leur mare d’origine. Les animaux seront observés le temps qu’ils sont visibles après l’ouverture des boites afin de s’assurer de leur bonne acclimatation à leur milieu. Les six xénopes adultes et les 180 têtards seront mis à mort avec une surdose d’anesthésiant après une anesthésie en balnéation car il est impossible de relâcher dans le milieu naturel cette espèce classée comme espèce exotique envahissante. Les 250 têtards de xénope placés dans les cages seront après métamorphose mis à mort avec une surdose d’anesthésiant et les 250 têtards de grenouille verte après métamorphose seront libérés dans la mare.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant d’étudier la survie, la croissance et le comportement des premiers stades de vie de la grenouille verte face à la présence d’un compétiteur et d’un prédateur, il n’est pas possible de remplacer les animaux prévus pour cette expérimentation. Il est donc nécessaire de recourir à des animaux. De plus, il est impossible de modéliser les réponses des têtards face à la compétition et face à la prédation car c’est la première fois que cette question sera posée pour ces deux espèces dans un contexte semi-contrôlé et en testant la compétition indirecte. Par conséquent, aucun modèle ne pourra permettre de prédire ce qu’il va se passer.

Réduction

Les trois couples de grenouilles vertes et les trois couples de xénopes soit trois femelles et trois mâles Pelophylax spp. et trois femelles et trois mâles Xenopus laevis seront amenés au laboratoire et injectés d’hormones permettant d’induire la ponte et de stimuler l’accouplement. Les trois couples de chaque espèce sont le minimum pour assurer la quantité d’œufs et donc la quantité de têtards nécessaire pour l’expérimentation en cages flottantes et en mésocosmes. Pour l’étude sur les têtards en mésocosmes, les trois réplicats par modalité (grenouilles vertes ; xénopes ; grenouilles vertes – xénopes) sont le minimum pour obtenir des résultats statistiques viables (modèle linéaire permettant d’étudier les interactions statistiques sur le comportement des individus testés). Par ailleurs, la densité de têtards (3 têtards.L-1), nous semble appropriée pour pouvoir observer des interactions entre les individus. Les triplicats permettent de rendre compte de la variabilité interindividuelle existante au sein des groupes tout en obtenant une moyenne au plus proche de la réalité.

Raffinement

Le transport de la zone de prélèvement en milieu naturel vers le laboratoire sera effectué dans des bacs fermés à l’abri de la lumière pour limiter le stress des animaux. Les amphibiens étant des espèces proies, il est important de leur fournir un abri. Des tuyaux en plastiques et des objets flottants seront disposés dans les bacs permettant aux amphibiens de se cacher. De plus, afin d’apporter un environnement plus complexe aux amphibiens, des pierres seront disposées dans les bacs. Avant, l’expérimentation, la qualité de l’eau (dureté et chlore) sera testée. Chaque jour, une personne habilitée et formée sera en charge de vérifier le comportement des amphibiens avant et après l’injection d’hormones (en dehors des périodes de nourrissage). La qualité d’eau, c’est-à-dire les paramètres physico-chimiques sera mesurée une fois par semaine. En cas de mauvaise qualité d’eau (au-delà des seuils précités), un changement d’eau sera effectué puis une mesure deux jours après sera reprise pour s’assurer que les amphibiens sont dans un environnement stable. Enfin, l’anesthésie en balnéation avant l’injection d’hormone permettra de limiter tout stress. Les différentes phases de réveil seront surveillées ainsi qu’un retour à l’alimentation 24h après l’injection. Pour la phase expérimentale en mésocosme, le transport de la zone d’élevage à la zone expérimentale sera effectué dans des bacs couverts permettant de placer les individus dans le noir limitant le stress des amphibiens lors du transport. Une mauvaise qualité d’eau reportera le test prévu jusqu’à ce que la qualité d’eau revienne aux seuils exigés ci-dessus. Enfin, les tests de comportement seront toujours précédés d’un temps d’acclimatation (15 minutes) au dispositif afin que les individus puissent revenir à un taux d’activité normal après le transfert des mésocosmes vers le dispositif de test. Il est prévu également un repos de 48h entre chaque test. Le bien-être sera évalué par une grilles déterminant les points limites à la continuité du projet. Infections, blessures, comportement, dépigmentation et prise alimentaire seront évalués grâce à une échelle de score donnant un score global compris entre 0 (normal – aucune action) à supérieur à 7 (mise à mort de l’amphibien avec une surdose d’anesthésique).

Choix des espèces

Les deux espèces choisies sont : la grenouille verte Pelophylax spp. et le xénope Xenopus laevis. L’objectif de cette étude est de comprendre l’impact de la présence des têtards de xénopes lisses Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis quelques années dans les mares, cours d’eau et rivières de Maine-et-Loire. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé. Aujourd’hui, il apparaît donc nécessaire de comprendre l’impact de la colonisation du xénope dans sa globalité dès les plus jeunes stades de vie.

300 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein triple-négatif humain leur sont injectées dans les tissus mammaires sous anesthésie, pour étudier le rôle du gène HLF dans l'infiltration des tumeurs par les cellules immunitaires. Le porteur annonce une douleur légère au réveil et une gêne liée à la croissance tumorale qu'il dit limitée, puis une mise à mort pour analyses post-mortem. Il affirme que seul 'un animal vivant, entier' permet d'étudier ces interactions et juge le recours à la souris 'indispensable', les applications thérapeutiques restant hypothétiques.

Objectifs

Le cancer du sein est devenu en 2020 le type de cancer le plus fréquent à l’échelle mondiale, avec plus de 2 millions de nouveaux cas diagnostiqués chez les femmes. Le cancer triple négatif (TNBC pour Triple-negative breast cancer) est l’une des formes les plus agressives et est associé à des rechutes plus précoces, plus fréquentes et à un mauvais pronostic vital. Il a été montré qu’un niveau élevé d’infiltrats lymphocytaires intra tumoraux après chimiothérapie chez les patients TNBC est corrélé à un excellent pronostic, suggérant que la surveillance immunitaire anti-tumorale joue un rôle crucial dans l’évolution des cancers TNBC. Grâce à des analyses bioinformatiques, nous avons identifié un gène dont l’expression pourrait inhiber l’attraction des cellules immunitaires dans les tumeurs et donc, potentiellement être utilisé comme cible thérapeutique dans le traitement de ce type de cancer. Nous avons supprimé ou diminué son expression et donc ses fonctions dans des lignées tumorales humaines TNBC. Des travaux réalisés in vitro nous ont confortés dans le rôle joué par notre gène d’intérêt dans l’infiltration des tumeurs par les cellules immunitaires et souhaitons maintenant déterminer son influence dans l'organisme. Pour se rapprocher du modèle humain, nous injecterons des cellules tumorales humaines TNBC parentales ou inactivées pour le gène étudié dans les lignées de souris immunodéficientes.

Bénéfices attendus

Ce projet transversal est issu d’observations cliniques indiquant que lorsque le gène HLF est surexprimé dans les cellules tumorales de patientes souffrant de cancer de type TNBC, une inhibition de la réponse immunitaire, en particulier de l’activation d'un sous-type de globules blancs est observée et corrélée à un mauvais pronostic. Des études in vitro en cours nous suggèrent que ce gène est bien impliqué dans la régulation de mécanismes moléculaires et cellulaires associés à l’attraction et la fonction de ces cellules blanches. L’étude dans l'organisme de l’infiltration des tumeurs TNBC exprimant ou non HLF est indispensable afin de confirmer le rôle joué par ce gène dans la réponse immunitaire anti-tumorale au sein du microenvironnement et en particulier dans la régulation des fonctions des cellules impliquées dans la lutte anti-tumorale. Ces connaissances fondamentales sont également essentielles pour passer à la phase suivante de recherche plus translationnelle et de déterminer si le gène HLF pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ce type de cancer très agressif de mauvais pronostic. Des inhibiteurs de ce gène identifiés par criblage à haut débit sont actuellement en cours de caractérisation in vitro au laboratoire.

Procédures

Injection de cellules tumorales au niveau des tissus mammaires après anesthésie générale: une fois par animal, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances seront liées aux injections: légère douleur au réveil après injection des cellules tumorales et à la gêne physique induite par la croissance des tumeurs: limitées car la taille des tumeurs sera très limitées. Ces tumeurs n'entraînent pas d'autres nuisances.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des tumeurs et leurs extensions éventuelles. Nous avons de solides résultats préliminaires in vitro qui suggèrent que notre gène d’intérêt joue un rôle important dans le recrutement et l’activation de certaines cellules blanches dans la lutte anti-tumorale dans les cancers du sein de type triple négatif. Il est indispensable pour notre projet de tester nos hypothèses in vivo dans un modèle de souris immunodéficientes greffées par des tumeurs humaines ayant conservé sa population de cellules blanches, ou dans un modèle murin humanisé pouvant être reconstitué avec des cellules humaines, et recevant des greffes de tumeurs humaines.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance. Pour certaines expériences, une étape de sélection de lignées triple-négatif sauavges et déplétées pour le gène d'intérêt à étudier seront réalisées in vitro afin de réduire au maximum le nombre de souris. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un triatement. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. L'eau et la nourriture leurs sont proposés à volonté et lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire adapté leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

Nous avons développé des lignées de cancer triple-négatif humaines inactivées ou non pour le gène d'intérêt qui seront injectées chez des souris immunodéficientes. Nous avons choisi l'espèce souris car ces souris immunodéficientes permettent d'étudier les tumeurs humaines sans rejet. Ces souris présentent également l’avantage d’avoir conservé la production des globules blancs sur lesquels nous avons centré notre projet. Le cancer étudié apparaissant chez les adultes, les animaux auront entre 7-15 semaines au début des procédures.

2 766 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des gavages, des injections sous anesthésie, jusqu'à une trentaine de prélèvements sanguins et une irradiation, pour étudier le rôle d'une protéine, TET2, dans le développement de lymphomes B. Le porteur indique qu'un tiers des souris dont ce gène est inactivé développe une maladie proche d'une leucémie, qu'il décrit comme asymptomatique. Il reconnaît mener des approches in vitro en parallèle mais conclut que le recours à l'animal reste "indispensable" pour tenir compte du micro-environnement et du système immunitaire.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de déterminer le rôle de la déficience en une protéine impliquée dans les hémopathies malignes chez l'Homme (TET2) dans la production de lymphocytes à l'origine des anticoprs et en particulier dans les lymphomes de type B. Nous avons montré, avec d'autres, que la déficience en Tet2 murine affecte la maturation terminale des lymphocytes B, en altérant leur différenciation . Ce blocage de la différenciation est associé à plusieurs caractéristiques des lymphomes B, en particulier ceux présentant des mutations inactivatrices de TET2. Le but de ce projet est donc de mieux comprendre le rôle de TET2 dans la maturation lymphoïde B, lors de la réponse immunitaire adaptative, ainsi que les mécanismes à l'origine du développemment des lymphomes B chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mieux comprendre le rôle de TET2 dans la maturation lymphoïde B lors de la réponse immunitaire adaptative ainsi que les mécanismes à l'origine du développement des lymphomes B chez l'Homme. Il pourra y avoir des applications sur la prise en charge des patients porteurs de ces tumeurs, par une meilleure compréhension de la maladie et l'identification éventuelle de cibles thérapeutiques

Procédures

Gavages : nombre= 3, durée = 30 secondes. Injections (une à trois) :durée 5 minutes sous anesthésie générale. Prélèvements de sang :1 à 30 : durée 5 minute sous anesthésie générale. Irradiation (non léthale) à dose moyenne: durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les interventions sur les animaux (gavages, injections, irradiations et prélèvements de sang) induiront des nuisances temporaires et transitoires de type douleur légère. L’inactivation de Tet2 n’entraîne pas de conséquence notable avant 6-9 mois. Lorsque Tet2 est absent dans les cellules souches, une fraction (1/3) des souris développe alors une maladie de type leucémie myélomonocytaire chronique asymptomatique. Quand Tet2 est inactivé spécifiquement au cours de la différenciation lymphoïde B, la même fraction des souris montre une accumulation de lymphocytes B1a, sans aucun symptôme associé.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédure pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Nous utilisons en parallèle des approches in vitro, qui permettent de reproduire une partie de la maturation lymphoïde B. il s'agit de stimulation des lymphocytes B naïfs triés à partir de suspension cellulaires de rate, par diverses molécules pour mimer la maturation T-indépendante, CD40L + IL4 pour mimer la maturation T-dépendante des lymphocytes B. nous avons aussi développé une approche plus complexe, qui s'approche un peu plus des conditions in vivo, sur des cellules certains gènes en présence d'une cytokine. ces approches permettent d'obtenir beaucoup de cellules pour certaines analyses biochimiques, donc de réduire les analyses in vivo, qui restent néanmoins indispensables. L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est en effet indispensable car il est important de pouvoir prendre en compte l’ensemble des interaction des cellules mutées (et tumorales) avec l’organisme, du micro-environnement au système immunitaire complet. Ces aspects ne peuvent pas être reproduit in vitro.

Réduction

Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés et nous privilégierons toute étude in vitro sur modèles cellulaires établis, ou sur cellules primaires de patients, nous permettant de valider nos hypothèses de travail. Le nombre d'aimaux nécessaire et suffisant a été déterminé par calcul de puissance. Les résultats seront analysées par des méthodes statistiques.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour examen clinique, et dès l'apparition d'un signe de contrainte ou de douleur, les animaux recevront un traitement ou des mesures palliatives. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. L'eau et la nourriture leurs sont proposés à volonté et lorsque les animaux présentent une faiblesse, un aliment adapté leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’animal vertébré le plus adapté et utilisé dans la recherche translationnelle sur les cancers et les tests de toxicité, aussi bien qu'en recherche fondamentale. Cela se traduit par un accès à une quantité importante de publications scientifiques et de techniques détaillées essentielles à nos études. Des animaux adultes seront utilisés au vu des pathologies concernées.