Oncologie
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Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes BRGS dans le but d’étudier le développement des lymphocytes B
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes immunitaires, dont la rate et les ganglions, la déclaration en comptant 340 en souffrance modérée et 200 en souffrance sévère. Les souris immunocompétentes sont irradiées sur tout le corps, parfois à dose létale, avant une greffe de cellules souches du sang, les souris immunodéficientes BRGS reçoivent des cellules souches humaines, et toutes subissent une prise de sang toutes les quatre semaines. Après une irradiation létale, le porteur cite comme signes possibles un affaiblissement, une perte de poids, une léthargie et un dos courbé, et prévoit la mise à mort au-delà d'un score de grimace de 1,5 ou d'une perte de 20 % du poids. Le but est de repérer des gènes impliqués dans la prolifération des lymphocytes B et de tester l'insertion de gènes d'anticorps dans ces cellules. Pour limiter le nombre de souris, le porteur annonce des groupes de cinq, et prévoit de répéter une expérience quand une différence apparaît sans être significative, "afin d'obtenir une significativité".
Objectifs
Le but de ce projet est double. Tout d'abord un objectif fondamental qui sera d'évaluer le rôle de différents gènes dans le développement et la maturation des lymphocytes B. Cette partie sera réalisée grâce à des cellules souches hématopoïétiques (CSH) murines qui seront immortalisées in vitro. Ainsi, ces CSH murines pourront recevoir à façon des mutations génétiques avant d'être injectées aux souris. Ces dernières auront reçu une forte irradiation afin d'éliminer le système hématopoïétique de la souris. Les CSH ayant la capacité de reconstituer tous les composants du système hématopoïétique, nous pourrons alors suivre dans les souris l'effet des mutations sur le comportement des lymphocytes B. L'objectif étant de repérer les gènes impliqués dans l'hyperprolifération des lymphocytes B, afin de mieux comprendre les mécanismes ayant lieu dans les lymphomes. Ensuite un objectif plus translationnel avec l'évaluation de l'efficacité de l'insertion de gènes d'immunoglobuline dans les lymphocytes B. Les lymphocytes B sont capables de produire des anticorps (appelés aussi immunoglobulines) qui seront spécifiques d'un pathogène ou d'un antigène tumoral donné. Nous voulons donc modifier génétiquement les lymphocytes B ou les CSH humaines afin d'obtenir des lymphocytes B (après reconstitution hématopoïétique dans des souris dans les cas des CSH) qui produiront un anticorps spécifique donné. Pour cela, un gène codant pour une immunoglobuline définie sera inséré soit directement dans des CSH humaines soit dans des lymphocytes B purifiés à partir de souris reconstituées à partir de CSH humaines. Les cellules seront alors reinjectées dans des souris et la production de l'immunoglobuline sera alors monitorée. Les souris utilisées dans ce projet sur les CSH ou lymphocytes B humain sont des souris immunodéficientes (BRGS) qui ne peuvent pas détruire les cellules humaines injectées. Une fois que les CSH sont injectées dans ces souris, elles reconstituent un nouveau système immunitaire humain dans la souris.
Bénéfices attendus
Concernant le projet CSH souris, de nombreux résultats seront attendus sur le rôle de différents gènes dans la survenue de syndromes lymphoprolifératifs (prolifération excessive des lymphocytes) et ainsi une évolution dans la compréhension des leucémies et lymphomes. Pour le projet CSH humain, nous testons la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B une immunoglobuline (anticorps) thérapeutique.
Procédures
Notre modèle de greffe de CSH murines dans des souris immunocompétentes implique une irradiation (parfois à dose léthale) préalable à l'injection des cellules afin d'obtenir une hypoplasie complète. La greffe des cellules se fera ensuite par injection intraveineuse dans la veine caudale. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 4 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution au cours du temps. Enfin des immunisations pourront être appliquées sur les animaux en post-greffe si la reconstitution a été jugé optimale.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection de cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire afin de repérer tout signe indiquant un inconfort ou une douleur. Des nuisances plus importantes viendront de l'irradiation corps entier léthale. Le développement d'une immunodépression complète induite par l'irradiation léthale peut engendrer un affaiblissement notable de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter une potentielle absence de reprise de l'hématopoïèse (qui devrait être obtenues suite à la greffe des cellules souches hématopoïétiques murines) avec l'apparition de signes de l'immunodépression (perte de poids, léthargie, dos courbé...).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution hématopoïètique et sur développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Ces dernières sont en effet capables de se différencier en de nombreux précurseurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse. Ces précurseurs vont ensuite continuer de se différencier soit dans la moelle osseuse soit dans d’autre organes du système immunitaire et ainsi reconstituer un système immunitaire entier et compétent. Il est actuellement possible de différencier des CSH in vitro mais uniquement vers une voie donnée, ce qui permet d’obtenir qu’un type de cellules immunitaires. Aucun modèle ne permet une différenciation complète des CSH. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes ou de souris immunocompétentes irradiées léthalement reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes des CSH, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations après CRISPR-Cas9). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Lorsque deux groupes de souris seront comparés, un test de Student (two-tailed) sera utilisé alors qu'un test One-Way ANOVA sera utilisé pour comparer plusieurs groupes ensemble. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux (posture et comportement) par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon les mêmes critères généraux cités précédemment en plus de critères spécifiques: suivi du poids et mesure du score grimace permettant d’évaluer l’état de santé des animaux. Le « score de grimace » (MGS) (Langford et al. 2010, Nature Methods) correspond a une échelle permettant d’évaluer la douleur chez l’animal, en particulier chez la souris. Cinq paramètres sont évalués et un score allant de 0 (normal) à 2 (modification sévère) est attribué pour chaque paramètre : ouverture des yeux, gonflement du museau, gonflement des joues, position des oreilles, position des moustaches. Si le MGS excède 1.5, les animaux seront alors euthanasiés. Également si la perte de poids excède 20% du poids de référence alors les animaux seront alors euthanasiés. Si des effets secondaires ou signes d'inconfort non soulagés par l’administration de buprénorphine (buprénorphine 0.1 mg/kg en sc, aiguille 30G) ainsi que des changements perceptibles (aspect, comportement, poids, isolement dans la cage, déplacements limités) sont observés, les animaux seront alors euthanasiés.
Choix des espèces
Les souris BRGS (BALB/c_RAG2-/- IL2GammaC-/-_SIRPA.NOD) choisies pour ce projet sont complètement dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK, ce qui permet donc d'éviter le rejet de la xénogreffe de cellules humaines. Ces souris permettent la croissance de nombreuse lignées lymphoïdes humaines et l'utilisation d'effecteurs d'origine humaine. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé́ de prise de xénogreffes. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de l’expression d’un phénotype dommageable car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Le maintien de ces souris en hébergement protégé de type A2 permettra de prévenir tout risque d’infection. Les utilisateurs se muniront d'une combinaison recouvrant tout le corps ainsi que d'un masque chirurgical et d'une 2eme pair de gant. Enfin, les souris seront manipulées sous hotte à flux laminaire. L’expérimentation sera commencée chez des animaux de 5 semaines à 3 mois. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 6 mois.
Exploration chez la souris des mécanismes cellulaires impliqués dans le déconditionnement musculaire, le vieillissement et les mécanismes de protection induits par l’activité physique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'un anti-inflammatoire et d'un inducteur de mutation, sont soumises à des tests d'effort sur tapis roulant jusqu'à l'épuisement et à des périodes d'isolement en cage métabolique pouvant provoquer perte de poids et détresse, pour étudier la fonte musculaire liée aux traitements anti-inflammatoires et au vieillissement. Le porteur reconnaît que l'isolement est stressant mais le juge obligatoire pour mesurer l'activité de chaque souris. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut créer des fibres musculaires adultes et conclut que l'étude ne peut être conduite qu'in vivo.
Objectifs
Le projet se propose de mettre en évidence les mécanismes cellulaires impliqués dans les pertes de masse et de fonctions musculaires induites par les traitements aux antiinflammatoires et le vieillissement ainsi que les mécanismes de protection induit par l’activité physique (endurance et résistance). Le muscle squelettique est composé de fibres à contraction lente, peu fortes et résistantes à la fatigue et des fibres de types rapide, très forte et très fatigables. Basés sur la littérature nous faisons l’hypothèse que : i) les fibres rapides sont plus sensibles à l’atrophie et résistantes à l’hypertrophie , ii) que la sédentarité est un facteur aggravant la perte de masse musculaire, iii) inversement, l’entraînement d’endurance protégerait le muscle de la perte de masse musculairet et favoriserait l’hypertrophie , iiii) une souris génétiquement modifiée qui possède des caractéristiques de souris entraînées va être moins vulnérable face à la perte de masse musculaire et plus sensible à l’hypertrophie induite par les efforts de force et de résistance. Nous proposons ensuite de décrire les mécanismes moléculaires . Nous étudierons également l’effet de l’activité et de la sédentarité exacerbée sur l’atrophie des fibres rapides et la mort des neurones moteurs au cours de la perte de masse musculaire liée à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet aura pour but de mettre en évidence les mécanismes mis en jeu dans la prévention du déconditionnement musculaire induit par un traitement anti-inflammatoire très utilisé chez l’homme. En effet il est connu que le déconditionnement musculaire peut être un facteur d’aggravation de certaines pathologies, ainsi la compréhension des mécanismes de déconditionnement musculaire est de nos jours d’un intérêt socio-économique très important. C'est la raison pour laquelle ce projet est financé en partie par L'Assication Française contre les myopathies. D’autres parts ce projet permettra de mettre en évidence des mécanismes expliquant la mort spécifique des fibres musculaire de type II (permettant les contractions rapides) lors du vieillissement.
Procédures
Les souris subiront les injections de l'inducteur de la mutation génétique et de l'antiinflammatoire. Une contention courte sera effectuée lors de la mise en évidence du rapport de masse maigre/masse grasse par IRM. Les animaux seront soumis à un isolement durant leur entraînement et lors de l’analyse métabolique. L'analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne nécessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Les animaux seront monitorés et pesés: 3 fois/ semaine (2 minutes/animal) lors de l'individualisation, puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition corporelle analysée (3 minutes/animal) de manière non invasive 1 fois au début de l'individualisation puis à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances vont être : le test de capacités fonctionnelles sur les tapis et l’isolement dans les cages métaboliques qui pourraient engendrer du stress chez les animaux, l’injection intra-péritonéale de l'anti-inflammatoire. Les effets indésirables pour le test d’activité sur tapis roulant peuvent être: l’épuisement de l’animal, une blessure à la patte. Les effets indésirables de l’isolement peuvent être: la perte de poids et la détresse. Les effets indésirables du traitement avec l'anti-inflammatoire sont les modifications de poids et de comportement, ces derniers seront vérifiés tous les jours lors du traitement à l'antiinflammatoire qui sera arrèté si un changement important de comportement est observé. Les animaux seront soumis à un isolement. L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne nécessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Aucun prélèvement n'auront lieu sur animal vigile.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Nous avons besoin de réaliser des expériences dans un modèle de souris où un gène d’intérêt pour le contrôle génétique de l'expression des différents types de fibres musculaires a été invalidé. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude des effets dépendant du type de fibre musculaire. En effet aucun modèle in vitro à ce jour peut créer des fibres musculaires adultes compte tenu que la formations fibres sont dépendantes des autres cellules de l'organiqme.
Réduction
Les tests statistiques utilisés dans ce projet seront choisis afin de mettre en évidence les effets de l'activité par rapport à la sédentarité ou bien les effets de la modification génétique du type de fibres afin de contrer les effets des anti-inflammatoires. Ensuite chacun des sous groupes seront comparés deux à deux. Les différences seront considérées comme significatives pour une valeur de p
Raffinement
Les animaux isolés en cages métaboliques ou durant la période de 8 semaines d'entraînement auront pour enrichissement la présence de roues dans les cages. L'isolement est obligatoire pour notre expérience car nous devons être sûrs de mesurer l'activité de chaque souris. La période de familiarisation au tapis de course permettra réduire le stress des animaux lors des tests. Lors de l'exercice les souris seront en permanence sous la surveillance de l'expérimentateur qui arrêtera le tapis lorsque la souris se laisse emporter par le tapis trois fois de suite et ne peut plus le remonter. Le tapis sera arrêter si la souris semble gênée dans sa course et qu'elle semble s'être blessée à la patte. Par expérience avec ce tapis de course nous n'avons jamais vu de blessure, cependant dans le cas où cela arriverait elle sera soignée avec de la bétadine et recommencera le test une fois la blessure cicatrisée ou bien retirée du protocole. La déxaméthasone induit une perte de masse musculaire et donc une perte de poids qui est l'effet escompté. Les souris seront réunies par cages de 4 après l'activité pour le traitement à l'anti-inflammatoire afin de ne plus subir l'isolement car il n'est plus nécessaire pour ces expériences. L’enrichissement consistera à placer des nids végétaux, des maisonnettes et bâtonnets à ronger dans les cages. Le comportement général des animaux sera suivi.
Choix des espèces
L’atrophie musculaire induite par les antiinflammatoires et l'adaptation à l'exercice d'endurance (présentes chez l’homme) sont bien démontrées dans le modèle souris. La souris modifiée génétiquement , choisie pour cette étude, est connue pour mimer naturellement en partie les caractéristiques musculaires liées à un entraînement d'endurance. Leur utilisation nous permettra de mieux comprendre les effets de l'activité physique sur la réponse aux traitements aux antiinflammatoires. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. En effet, il a été démontré que chez la souris la structure musculaire adulte est observée dans les 7 à 8 semaines après la naissance. D'autre part, des souris âgées (24 mois) seront utilisées dans un deuxième temps. Il a été montré qu’à cet âge les mécanismes induisant le dysfonctionnement musculaire.
Modélisation de comportements complexes de type autistique chez la souris et impact de l’obésité induite pendant la grossesse en utilisant la vision par ordinateur et des approches d’apprentissage en profondeur
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
676 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Certaines subissent un tatouage, une amputation de la queue et l'implantation d'une puce radiofréquence, et un groupe de femelles reproductrices est soumis à un régime riche en graisses, avant enregistrement des comportements sociaux dans un dispositif de suivi vidéo. Le projet, de recherche fondamentale, modélise des comportements de type autistique et l'effet de l'obésité gestationnelle. Le porteur classe l'amputation de la queue parmi les gestes légers tout en reconnaissant qu'elle provoque stress et douleur, et affirme que le comportement ne peut s'étudier qu'in vivo.
Objectifs
Le trouble du spectre de l’autisme (TSA) désigne un ensemble de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par : 1) des déficits de la communication sociale et 2) la présence de comportements répétitifs et des intérêts restreints. L'étiologie des TSA serait déterminée par la combinaison de plusieurs facteurs : génétiques et environnementaux. Parmi ces facteurs environnementaux, l’obésité maternelle représente un facteur de risque important. Le diagnostic des TSA repose essentiellement sur l’observation d’un comportement « anormal » durant les deux premières années de vie et notamment le comportement social. Ce dernier est un comportement très complexe dont l’étude requiert un niveau de détails élevé et l’accès à l’observation de plus de 2 animaux interagissant de manière libre pendant une longue période de temps. Pour étudier ce comportement et répondre à ces critères, nous proposons d’utiliser un système qui permet d’enregistrer de manière non-invasive des comportements sociaux complexes de 4 souris pendant plusieurs jours. Dans ce projet, nous souhaiterions modéliser des comportements complexes de type autistique sur 5 modèles de souris portant chacun l’inactivation d’un gène impliqué dans des pathologies avec TSA. Ce projet s’articule autour de 4 objectifs : Objectif 1 : Modélisation de comportements complexes de type autistique chez 2 modèles murins de TSA à différents stades du développement. Objectif 2 : Etudier l’effet de l’inactivation du gène associé au TSA dans certains types de neurones sur les interactions sociales et les comportements répétitifs respectivement. Objectif 3 : Etudier l’effet de la réexpression du gène cité précédemment sur les comportements complexes de type autistique. Objectif 4 : Etudier l’impact d’un surpoids gestationnel sur des comportements complexes de type autistique chez la descendance du modèle murin de TSA. En effet, la variabilité des symptômes autistiques pour une même mutation peut être expliquée par la contribution de facteurs environnementaux. Dans ce projet, nous proposons de tester l'hypothèse que le surpoids gestationnel pourrait être un facteur aggravant.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet seront, d'une part, l'identification de nouveaux comportements complexes associés aux troubles du spectre de l'autisme observés chez des souris en « semi-liberté » sur des modèles génétiques de l’autisme, sur un modèle avec obésité gestationnelle (connue pour être un facteur de risque), et sur des modèles combinant les facteurs génétiques et obésité gestationnelle. L'obésité représente un enjeu majeur de santé publique dont l'incidence est en nette augmentation en France depuis 1997 avec des conséquences graves sur la santé cardiovasculaire, métabolique et neurologique. Plus précisément, le taux de surpoids et d'obésité atteint 32% chez les femmes en âge de procréer ou enceintes. Par conséquent, la mesure de l'impact d'un surpoids/obésité gestationnel, est importante car elle peut démasquer ou aggraver l’effet des mutations génétiques. Il est nécessaire de mettre en évidence ces conséquences sur les symptômes de type autistique qui sont de plus en plus fréquents chez les enfants.
Procédures
Dans ce projet, certains animaux subiront différentes interventions légère unique pour les identifier (tatouage, caudectomie, implantation d'une puce radiofréquence en sous-cutanée) permettant de les identifier et un lot de femelles reproductrices sera soumis à un régime riche en graisses sur une période 6 semaines. Dans tous les cas, des mesures adaptées ont été prévues pour pallier aux nuisances éventuelles occasionnées par ces procédures.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, certaines expérimentations sont susceptibles d'induire du stress (tatouage, anesthésie, implantation de la puce radio fréquence) ou du stress et de la douleur (caudectomie). Les enregistrements vidéo dans le système Live Mouse Tracker (LMT) qui permet d’enregistrer de manière non-invasive des comportements sociaux complexes de plusieurs souris pourrait induire un stress lié au changement d’environnement. Le régime riche en graisses pourrait produire de l'anxiété mais ce n'est pas évident sur une période courte de 6 semaines.
Devenir
Les animaux enregistrés dans le système Live Mouse Tracker (LMT) et les animaux soumis au régime riche en graisses seront sacrifiés pour réaliser des prélèvements pour des analyses immunohistochimiques et histologiques.
Remplacement
Dans ce projet, nous nous intéresserons essentiellement à l'étude du comportement social. Le comportement est un ensemble d'actions réalisés par un être vivant, les modèles in vitro (culture cellulaire par exemple) ne permettant pas d'étudier le comportement, le modèle animal reste donc notre seule alternative. De plus, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques nécessite une validation sur des modèles précliniques (modèles animaux). Par conséquent, l'utilisation d'un modèle murin est indispensable pour répondre aux objectifs de notre étude. Il est à noter que l'utilisation de souches murines fixées génétiquement permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisé.
Réduction
Ce projet sera réalisé sur plusieurs étapes successives. Le nombre de souris générées pour cette étude (20 souris par groupe, par sexe et par génotype) a été établi à partir d'études comportementales réalisées précédemment se basant sur des tests de puissance statistiques (http://powerandsamplesize.com/Calculators/) ainsi que sur les données de la littérature utilisant ce système. Etant donné que l’utilisation du Live Mouse Tracker (LMT) est une procédure non-invasive, les mêmes souris seront utilisées aux différents âges pour l’étude comportementale. Ces mêmes animaux seront utilisés pour les études immunohistochimiques. De plus, l'utilisation d'animaux dans certaines expérimentations sera conditionnée par les résultats obtenus dans d'autres expérimentations. En effet, si les résultats de cette dernière sont positifs (altérations comportementales), alors nous réaliserons les expérimentations suivantes et le nombre de souris utilisé sera alors établi grâce à l'utilisation de tests de puissance statistiques.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages enrichies avec du matériel de nidification, un accès illimité à l'eau et la nourriture, la présence d'objets (tunnel) et un nombre limité de souris par cage (4 souris par cage). Pour notre étude, il est nécessaire de constituer des groupes de 4 souris de même sexe et de même âge par cage pour l'étude comportementale. Les animaux seront habitués à la manipulation par l'expérimentateur. Les expérimentations induisant une douleur seront toutes réalisées sous anesthésie (locale et générale). Les animaux seront surveillés quotidiennement (poils, posture, activité dans la cage ...) et le poids pris régulièrement. Une grille de score (jointe en annexe) sera mise en place pour la surveillance des animaux. Si un animal montre un score classé comme bénin à modéré, il sera surveillé plusieurs fois par jour et l'administration d’un AINS (anti-inflammatoire non stéroidien) en sous-cutanée et/ou d’un morphinique en sous-cutanée sera envisagée. L'arrêt de la nourriture riche en graisse sera également considéré pour les animaux avec surpoids gestationnel. Si aucune amélioration n'est observée et que l'état de l'animal se détériore, une mise à mort sera alors réalisée.
Choix des espèces
Les souris représentent des modèles robustes pour étudier différentes pathologies dont les TSA. Tout d'abord, les souris sont des animaux très prolifiques avec des temps de génération courts et des portées assez conséquentes facilitant l'étude de cohortes de plusieurs animaux. De plus, l'espérance de vie des souris est courte permettant d'étudier différents stades de développement en moins d'un an. Et enfin, les outils génétiques utilisés chez la souris permettent de générer les mêmes mutations génétiques retrouvées chez l'Homme mimant ainsi un certain nombre de symptômes et motivant la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, les animaux seront utilisés à 3 stades de développement différents : 1) Stade juvénile (entre le 35ème jour de vie postnatale (P35) et le 40ème jour de vie postnatale (P40)) : Pour identifier des altérations précoces du comportement (de type autistique). En effet, les TSA apparaissent durant les 2 premières années de vie chez l'Homme. 2) Stade adulte (3 à 4 mois) : Pour évaluer la progression des altérations comportementales présentes au stade juvénile et/ou l'apparition de nouvelles altérations comportementales. 3) Stade de vieillissement (>18 mois) : Pour identifier des altérations comportementales similaires à celles observées dans certaines maladies neurodégénératives telle que la maladie d'Alzheimer. En effet, les patients atteints de certains syndromes autistiques (syndrome de Down ou le syndrome de Prader-Willi) développent une démence ou un déclin cognitif après 40 ans.
Alternative d’immunisation avec pistolet à gène (gene gun) chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 400
800 animaux non-humains, 400 souris et 400 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des immunisations par pistolet à gènes deux fois par semaine pendant jusqu'à 25 semaines, avec des prélèvements sanguins réguliers, les souris prélevées vigiles à la veine maxillaire et les rats sous anesthésie. Le porteur indique que le pistolet à gènes provoque une rétraction de la peau, une irritation et une douleur locale, et qu'aucun animal ne sera gardé en vie. Il affirme qu'un modèle in vitro ne reproduirait pas la complexité de la réponse immunitaire.
Objectifs
La préparation aux pandémies est un bien public mondial. Les menaces de maladies infectieuses ne connaissent pas de frontières. De même, des maladies telles que le cancer, les maladies auto-immunes et la résistance aux antibiotiques constituent un risque mondial. Des efforts sont donc en cours pour développer des vaccins plus efficaces et plus spécifiques. L'enjeu est de taille car les progrès scientifiques et la maîtrise des procédés de génie génétique ont permis de concevoir des molécules de plus en plus efficaces à des coûts avantageux. Les anticorps monoclonaux produits in vitro étaient coûteux et échouaient lors des essais cliniques. Ainsi, le développement des vaccins plus efficaces et plus spécifiques, tels que les vaccins à ADN sont donc mis en avant. Ces vaccins produisent, in vivo, une immunité spécifique à l'antigène et font l'objet d'intenses recherches. Alors que les vaccins traditionnels reposent sur la production d'anticorps par l'injection de virus atténués, de particules virales mortes ou de protéines recombinantes, les vaccins à ADN peuvent être construits pour fonctionner de manière fiable tout en conservant la spécificité du vaccin. Les vaccins à ADN sont non vivants, non réplicatifs et présentent un faible risque de réversion pour provoquer une forme de la maladie en question ou une infection secondaire. En outre, les vaccins à ADN sont très flexibles et peuvent coder de multiples gènes (virus, bactéries et protéines). L'objectif de cette étude est de comparer l'efficacité de différentes méthodologies d'immunisation chez le rat et la souris par la production d'anticorps neutralisants.
Bénéfices attendus
Le principal avantage de ce projet est le développement de vaccins plus efficaces et plus sûrs grâce à la validation de la méthode d'immunisation par le "gene gun".
Procédures
Les animaux seront soumis aux protocoles d’immunisation avec l’utilisation du pistoler à gènes sous pression qui envoie des molécules d'ADN à travers la barrière épidermique et/ou muqueuse. Ce type d’immunisation est réalisé sous anesthésie. Lors de ce protocole, les animaux contrôles recevront les injections des éléments d’essais par une des voies dites classique, à savoir : sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou orale. Afin que les résultats puissent être comparables, les animaux contrôles seront également anesthésiés. Les immunisations seront réalisées 2 fois/semaine. La durée maximale du protocole d’immunisation et des injections est 25 semaines. Des prélèvements sanguins sont prévus avant immunisation et toutes les 2 semaines pendant le protocole d’immunisation dont la durée maximale est de 25 semaines. Les rats seront prélevés en veine sublinguale sous l’anesthésie générale. Les souris seront prélevées en veine maxillaire en vigile. Les prélèvements de sang effectués en cours d'étude se feront en respectant les volumes circulants et à ne pas dépasser 15% du volume circulant. A la fin du protocole les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie pour le prélèvement d’organes.
Impact sur les animaux
L'anesthésie induit une baisse de la température corporelle. Le traitement par pistolet à gènes induit une rétraction temporaire du pis, une irritation temporaire de la peau et une douleur locale (légère et temporaire). Les voies d'immunisation conventionnelles, telles que les voies sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, orale et intraveineuse, peuvent induire une irritation et une douleur cutanées (locales et temporaires). La prise de sang chez la souris par la veine mandibulaire est effectuée avec l'animal éveillé. La contention peut générer un stress momentané, contrôlé par les opérateurs. La douleur locale est minime et temporaire, et les animaux ne montrent généralement pas de signes de souffrance (ils recommencent rapidement à explorer la cage, à manger et à boire). La prise de sang chez le rat est réalisée sous anesthésie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude, des organes tels que la rate, la moelle osseuse et les lymphonodes peuvent être prélevés après sacrifice par dislocation cervicale sous anesthésie. Aucun animal ne sera gardé en vie à la fin du projet.
Remplacement
La vaccination permet de développer une réponse immunitaire de mémoire qui est à ce fin protectrice. La réponse immunitaire est complexe, mettant en jeux plusieurs types cellulaires : les cellules présentatrices d’antigènes, les cellules T, les cellules B, entre autres avec des activités biologiques différentes. Un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire ces mécanismes complexes, et ne permettrait pas de montrer le potentiel et la puissance du vaccin ainsi que les effets indésirables.
Réduction
Le nombre total d'animaux (800) utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre ses objectifs, c'est à dire avoir une production de anticorps neutralisants et protecteurs après le protocole d'immunisation. Le nombre d'animaux par groupe, un échantillon minimum de 10 animaux/groupe, a été choisi pour cet essai préclinique de vaccin sur la base d'études antérieures, en raison de l'efficacité accrue des vaccins ADN avec le protocole d'immunisation par pistolet à gènes.
Raffinement
Nous réalisons le protocole sur des animaux anesthésiés. Afin d'éviter tout impact négatif de l'anesthésie sur l'animal, la durée de la procédure n'excède pas 10 minutes, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les concentrations anesthésiques sont adaptées à chaque espèce. Le personnel est formé à l'utilisation du pistolet à gènes, afin d'assurer un contrôle adéquat de la technique et de la procédure. Pour les voies d'immunisation conventionnelles, les volumes d'administration et le type d'aiguille ou de canule sont adaptés à l'espèce et au site d'injection ou d'administration. Toutes les voies d'administration conventionnelles chez les rats et les souris seront effectuées sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux et de garantir des conditions égales entre les groupes. Les mesures de raffinement pour les prélèvements répétés concernent le respect du volume circulant total et une période de récupération de 2 semaines. Les prélèvements dans les veines sublinguales des rats sont réalisés sous anesthésie, avec une pression sur le site de prélèvement en fin de procédure pour prévenir le risque de saignement. Chez la souris, la veine maxillaire est choisie et les prélèvements sont effectués tous les quinze jours, de manière à ne pas anesthésier les animaux et à prélever un volume suffisant, en alternant les deux côtés pour permettre un temps de récupération. La surveillance quotidienne des animaux, le contrôle de leur poids et l'observation clinique permettront d'identifier le plus tôt possible tout signe de douleur, de souffrance ou de stress. Les animaux seront hébergés en groupes et des enrichissements spécifiques à l'espèce seront systématiquement fournis et/ou ajoutés si nécessaire (par exemple, en cas de comportement agressif). La nourriture sera placée au fond de la cage pour faciliter l'alimentation.
Choix des espèces
Les rats et les souris peuvent bénéficier d'un protocole de vaccination destiné à stimuler largement le système immunitaire humoral. Une étude a montré que les anticorps naturels issus des sérums de rats immunisés ont produit une grande variété de production et une liaison totale supérieure à celle des anticorps naturels provenant des sérums de rats non immunisés. Cela indique que chez les rats de laboratoire, l'immunisation est associée à un plus grand répertoire d'anticorps naturels et à une liaison plus forte des anticorps. D'autres études plus récentes montrent chez la souris et le hamster et même chez l'humain le grand répertoire d'anticorps neutralisants produits par immunisation. Les animaux arrivent dans nos locaux à partir de 8 semaines d'âge. Après 1 ou 2 semaines d’acclimatation, en fonction de leur origine ils seront donc au stade adulte, et leur système immunitaire aura atteint sa pleine maturité.
Réalisation d’une preuve de concept d’un pansement hémostatique tissé pour la prise en charge de plaies chirurgicales et mesure de la résorption du produit chez le modèle lagomorphe (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
11 lapins vont être utilisé·es, gardés en vie en vue d'une adoption, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale pour accéder au foie, puis une seconde intervention de prélèvement, l'ensemble pouvant durer jusqu'à une heure et demie, pour tester un pansement hémostatique à base d'alginate. Le porteur décrit l'accès au foie comme une "chirurgie lourde pour le lapin" et prévoit une euthanasie sous anesthésie en cas de complications, les autres animaux étant maintenus en vie. Il présente ce dispositif comme un futur pansement résorbable pour la chirurgie.
Objectifs
Le pansement idéal n’existe pas. Cependant, il doit présenter quelques caractéristiques, parmi lesquelles : 1/maintenir la plaie en milieu humide et chaud, 2/être modifié selon les stades de cicatrisation, 3/ être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, 4/absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, 5/ ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, 6/ ne pas être toxique et être hypoallergénique, 7/ protéger des chocs, 8/ être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, 9/ être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanées mais très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies capillaires dites « en nappe », des hémostatiques chirurgicaux résorbables non naturels sont utilisés comme traitement adjuvant. L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate d’un pansement tissé, et de suivre sa résorption et son impact au niveau du tissu lésé et des zones proches à différents temps post-opératoire. Il y aura 3 groupes de 3 lapins qui seront opérés (chirurgie d’implantation). Et à J+2 semaines, J+1 mois et J+3mois post-opératoire, nous opérons les lapins pour faire un prélèvement histologique de la zone d’intérêt (chirurgie d’exérèse). Si les conditions le permettent, les animaux ne seront pas systématiquement mis à mort au moment de la chirurgie d’exérèse afin de pouvoir être mis à l’adoption. Nous prévoyons 2 lapins supplémentaires en cas d’un décès lors de la chirurgie ou à cause d’une mise à mort liée à un point limite. Ce projet portera sur 11 lapins au total. Pour ce faire, il sera réalisé une série de lésions calibrées sur le foie du lapin, suivie de l'application d'une quantité prédéfinie de produit. L'évaluation de l'arrêt du saignement est faite selon la grille de score d'ADAM. En cas de reprise de saignement, le chirurgien fera une cautérisation avec le bistouri électrique (pince bipolaire) ou posera des points de suture. La biocompatibilité du pansement tissé a été testé en in vitro.
Bénéfices attendus
Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit sur le saignement d’un organe intra-abdominal comme le foie mais aussi de suivre la résorption du produit dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) pour le traitement des plaies chirurgicales et qui ne nécessite pas son retrait avant fermeture de l’incision chirurgicale comme les pansements actuels commercialisés.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie d’implantation pour permettre l’accès au foie tout en préservant les autres organes digestifs dans la cavité abdominale et une seconde chirurgie d’exérèse pour faire un prélèvement de tissu. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès au foie, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutanée). L’animal aura une à deux interventions chirurgicales. La chirurgie d’exérèse ne sera faite que si la zone d’implantation ne présente pas trop d’adhérences qui compromettraient l’état de récupération de l’animal. L’animal sera injecté avec un analgésique pour anticiper la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un anesthésique couplé à un analgésique (anti-douleur) pour réduire toutes sensations à la douleur. L’animal est placé sous masque avec un anesthésie gazeux pour le maintien de l’anesthésie et sur une table chauffante afin de maintenir la température corporelle.
Impact sur les animaux
L’accès au foie est une chirurgie lourde pour le lapin. Afin de limiter l’impact et de ne pas risquer un incident de chirurgie, nous avons opté pour un abord chirurgical restreint dans la région sous costal plutôt qu’un abord abdominal plus vulnérant pour l’animal. L’abord abdominal nécessite une incision de grande longueur pour pouvoir placer les écarteurs et accéder au foie. De plus, lors de cette approche, le risque de faire une incision sur le coecum est important étant donné sa grande taille et la mise en évidence des viscères aurait accélérée la perte de chaleur et le desséchement de ces derniers, ce qui auraient entrainé plus de complications à gérer en post-opératoire. L’abord sous costal limite la taille de l’incision et nous ne touchons pas les viscères et ni le coecum. Cette approche permet de garder au chaud les organes et limite leur desséchement.
Devenir
La mise à mort des animaux sera décidée lors de la chirurgie d’exérèse pour faire un prélèvement histologique. Si nous observons trop de complications qui met l’animal dans une balance bénéfice/dommage en sa défaveur, alors l’animal sera euthanasié encore sous anesthésie générale. Dans le cas contraire, il sera maintenu en vie pour une adoption.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance et de suivre sa résorption sur un tissu lésé. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique tissé permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements intra-cavitaire en cours de chirurgie. Il nous est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduit en in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.
Réduction
Nous utiliserons 11 animaux au total dont 9 animaux répartis en 3 groupes (3 lapins/groupe = 3*3 =9), et il est prévu 2 animaux supplémentaires pour compléter l’un des groupes si nécessaires. Le nombre/groupe a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. En tant donné que c’est une preuve de concept, nous avons besoin de 3 animaux maximum par groupe pour obtenir la réponse à notre questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et amène à faire une intervention chirurgicale pour l’arrêter nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur des animaux décédés, issus de procédures antérieures. Il s’agit d’une preuve de concept, ce faible nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats suffisants pour cette étape du projet.
Raffinement
L’animal sera placé 3 semaines en acclimatation et reparti en lot homogène avec d’autres congénères. Le lapin est un animal qui stresse très facilement et qui a besoin de temps pour s’habituer à son nouvel environnement et aux personnes. La veille de la chirurgie, l’animal sera injecté avec un analgésique (anti-douleur) pour anticiper la sensation de la douleur. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un anesthésique couplé à un analgésique. Un cathéter sera mis en place sur la veine de l’oreille pour permettre l’hydratation de l’animal tout au long de la chirurgie. L’animal est placé sous masque avec un anesthésie gazeux pour le maintien de l’anesthésie. L’animal est placé sur une table chauffante afin de maintenir la température corporelle. Une anesthésie locale sera mise en place. En fin de chirurgie, après nettoyage de la peau avec du sérum physiologique et une application d’un gel anesthésique sur les berges permettra d’apporter une anesthésie locale. L’animal sera habillé d’un pyjama pour protéger la cicatrice. Un renfort de protection (une compresse et coton cardé) réduira les frottements des fils des points sur le pyjama et donnera une protection supplémentaire à un grignotage du pyjama par l’animal. L’animal sera placé dans des couvertures polaires et sous-surveillance jusqu’à son réveil. L’animal avec les couvertures polaires seront remis dans la cage. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans la cage des légumes frais, plus appétent, pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. Les légumes frais seront maintenus pendant 72 h post-opératoire. Le poids de l’animal est suivi quotidiennement jusqu’à la reprise de poids. La cicatrice sera surveillée toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. La présence quotidienne du vétérinaire et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet evite toute souffrance, douleur ou stress inutiles. Le transfert des animaux vers la structure d’hébergement sera fait dans les boites de transport propres à chaque animal dans un véhicule adapté.
Choix des espèces
Le lapin est un animal de taille intermédiaire, plus gros qu’un rat et moins gros qu’un cochon, mais assez gros pour avoir accès à un foie dont la taille peut supporter les biopsie punch de 5 mm de diamètre (3 à 4) prévues et l’implantation du produit hémostatique pour obtenir un effet pharmacologique (hémostatique). Les animaux seront réceptionnés à 2.5-3 kg environ pour atteindre 3.5-4 kg (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de de bénéficier d’une taille permettant la chirurgie sur le foie.
Impact du développement d’une tumeur du pancréas sur le système musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
648 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent jusqu'à cinq injections intrapéritonéales et jusqu'à six mesures de force musculaire sous anesthésie, tandis qu'une tumeur du pancréas se développe et peut entraîner une perte de poids. Le projet, de recherche fondamentale, vise à comprendre comment la tumeur affaiblit le muscle. Le porteur indique avoir déjà mené des cultures cellulaires et affirme que l'analyse des tissus rend le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
Le développement d’une tumeur au sein du corps humain a des répercussions sur l’organisme entier. Plus particulièrement, il a été démontré que la croissance d’une tumeur réduit la force et la masse musculaire mais les mécanismes biologiques sont encore mal connus. L’objectif du projet est d’évaluer l’impact du développement d’une tumeur du pancréas sur le système musculaire chez un modèle de souris.
Bénéfices attendus
Le développement d’une tumeur dans l’organisme a pour conséquence d’induire une fonte et une faiblesse du tissu musculaire qui réduit la qualité et la durée de vie des patients et diminue l’efficacité des traitements. Le projet vise à améliorer les connaissances sur les mécanismes impliqués dans ces dysfonctionnements musculaires, et éventuellement, d’identifier de nouveaux processus biologiques comme cibles thérapeutiques potentielles
Procédures
Les souris sont soumises à des injections intrapéritonéales (5 maximum) et à un protocole de mesure de force musculaire (6 au maximum, anesthésie générale de 5-10 minutes)
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables légers à modérés sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections, anesthésies, mesure de force musculaire), qui induisent du stress. Le développement de la tumeur peut induire une perte de poids de corps et diminuer les défenses immunitaires
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant
Remplacement
Des analyses in vitro, utilisant des cultures cellulaires ont déjà été réalisées afin d’établir une évidence des processus biologiques. Afin de démontrer la pertinence des résultats, l'analyse des tissus ou des cellules de l’animal est indispensable
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des mesures de la force musculaire sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de la mesure de la force musculaire. Des fibres de peuplier, du coton et un igloo seront placés dans les cages d’hébergement pour favoriser la nidification des souris et leur bien-être. De la nourriture et un hydrogel seront déposés à même la litière afin de prendre en compte la réduction de la mobilité de l’animal et le risque de ne plus pouvoir accéder facilement à la nourriture avec le développement de la tumeur. Une grille de score est utilisée pour déterminer les points limites. Notre expérience montre que cette stratégie est suffisamment prédictive pour que l’ensemble des animaux soit inclus dans l’étude
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.
Traitement de souris gestantes avec un activateur d’une voie de regulation de la production d’energie cellulaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
120 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Les femelles gestantes reçoivent une injection quotidienne pendant 28 jours, puis sont tuées à mi-gestation, leurs embryons et souriceaux étant tués pour étudier des malformations de la face et de l'intestin. Le projet, de recherche fondamentale, teste si un activateur d'une voie énergétique cellulaire limite ces malformations dans une lignée génétiquement modifiée. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de remplacer un modèle de gestation par un modèle in vitro et ne prévoit ni analgésie ni anesthésie.
Objectifs
Il existe dans la cellule des processus de régulation de la production d'energie. Nous avons montré que l'inactivation de l'une de ces voies dans les cellules à l'origine de la formation des os de la face et du système nerveux de l'intestin aboutissait à la naissance de souriceaux présentants de graves malformations de la face et de motrcité digestive. Dans notre modèle génétiquement modifié dans lequel une voie de production d'ernergie est inactivée, nous allons donner un traitement aux mères gestantes pour compenser cette voie et voir si nous parvenons à limiter les malformations à la naissance..
Bénéfices attendus
Les malformations associées aux defauts de développement que nous étudions sont à l'origine de maladies congénitales chez l'enfant qui se traduisent comme dans notre modèle par des malformations de la face et du système nerveux de l'intestin. Ce groupe de maladies s'appelle des neurocristopathies. Parmi les plus connues il y a le syndrome de Hirschsprung et celui de Waardenburg. D'autres malformations sont aussi concernées comme celles qui surviennent suite à la consommation d'alcool pendant la grossesse ou la prise de médicaments dit tératogènes, c'est à dire qui peuvent induire des malformations du foetus lorsqu'ils sont pris en période de grossesse. Ce sont des maladies orphelines, pour lesquelles presque aucun traitement n'est disponible à ce jour. Les bénéfices attendus sont notamment une amélioration de nos connaissances sur le rôle des processus cellulaires de production d'ernergie et du métabolisme en général dans l'apparation de ces syndromes.
Procédures
Les femelles gestantes recevront une injection rapide (2 secondes) pendant 28 jours sur l'ensemble de la procedure.
Impact sur les animaux
Les seuls effets indésirables attendus sont liés à la manipulation et à l'injection quotidienne des femelles gestantes. Le produit est injecté à des souris dans de nombreux articles de la littérature sans qu'il soit mention d'effet indésirable de la molécule à la dose envisagée.
Devenir
Les femelles seront euthanasiées après la campagne de production d'embryon à E15.5, les sourceaux et les embryons seront euthanasiés pour étudier les malformations de leur tête et de leur inestin.
Remplacement
Il est impossible de remplacer un modèle de gestation par un modèle in vitro à notre connaissance. Les études in vivo sur le comportement des cellules en l'absence de notre gène régulateur d'intérêt et en présence du traitement, nous permettent de poser une hypothèse forte quant au résultat attendu :"Le traitement améliore nettemment les malformations de nos animaux malades "
Réduction
Nous organisons nos croisements d'animaux afin de maximiser les chances (1/4) d'obtenir des souriceaux au génotype d'interêt dans nos portées afin de limiter le nombre de femelles gestantes necessaires. En outre l'ordre des expérimentations est choisi pour minimiser le nombre de femelle ( les souriceaux sont produits avant la cohorte d'embryon)
Raffinement
Les femelles seront hébergées en groupe avec de l'enrichissement. Aucune analgésie ou anesthésie n'est necessaire et donc prévu pour ce projet. cependant, les gestations sont surveillées Bien que au regard de la litterature scientifique disponible et de notre expertise, nous n'attendons aucun problème spécifique sur le déroulement de la gestation, l'opérateur pourra interrompre la mise bas en cas de souffrance anormale pour une mise bas.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré dont de developpement de l'embryon est très proche de celui de l'Homme, En outre, nous avons déjà beaucoup de donnée dans nos modèles animaux. Les femelles et les mâles seront adultes et en age de ce reproduire.
Analyse des effets de monocytes modifiés sur la croissance de tumeurs chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 496 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales et de monocytes génétiquement modifiés, des séances d'imagerie sous anesthésie deux fois par semaine et développent des tumeurs sous-cutanées mesurées régulièrement. Le porteur indique qu'une partie des protocoles provoque une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et perte de poils, et que tous les animaux sont tués pour analyse des organes. Il revendique des résultats in vitro "très encourageants" en coculture 3D mais conclut au "besoin" de passer par la souris, et renvoie les retombées cliniques au conditionnel.
Objectifs
Le développement constant des immunothérapies contribue fortement à l’amélioration et au progrès liés au traitement des cancers. Nous développons des approches cherchant à mobiliser les cellules myéloïdes (la lignée des cellules myéloïdes est produite dans la moelle osseuse et donne naissance à plusieurs types de cellules sanguines dont les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques) pour stimuler la réponse immunitaire anti-tumorale et ainsi contrôler le développement de la tumeur. Nous souhaitons modifier génétiquement les monocytes pour augmenter leur capacité à stimuler la réponse immunitaire et évaluer leur efficacité antitumorale dans des modèles de souris portant des tumeurs. Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous avons pour but 1) d’optimiser ce type de traitement en cherchant à déterminer quel est le devenir des monocytes modifiés in vivo (localisation, survie, état), 2) déterminer leur mode d’action contre les tumeurs et 3) leur capacité à modifier le microenvironnement tumoral qui est par nature inhibiteur du système immunitaire. Par la mise en place de différents modèles d’injection des cellules tumorales et des CAR monocytes, nous étudierons à la fois la capacité des CAR monocytes à contrôler directement la croissance tumorale en favorisant l’interaction entre les deux types de cellules mais aussi le recrutement des CAR monocytes au sein de la tumeur et leur action sur la progression tumorale en injectant les CAR monocytes de manière systémique. Nous pourrons distinguer donc si les CAR myéloides sont capables de passer d’un compartiment/organe à la tumeur via le système sanguin. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous voulons avant tout acquérir des connaissances importantes qui pourront ensuite être utilisées en clinique pour le traitement du cancer. Les possibilités de traitement d'une tumeur solide sont jusqu'à présent plutôt limitées et parfois moins efficaces. L'approche thérapeutique avec les CAR monocytes et autres monocytes génétiquement modifiés promet d'être plus efficace tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires et surtout de permettre le traitement de cancers qui étaient jusqu'à présent difficiles ou impossibles à traiter. En effet, nos approches pourraient permettre de réduire certaines toxicités liées à l’utilisation d’autres approches de l’immunothérapie comme des cellules CAR T (lymphocytes T modifiés génétiquement), telles que l’apparition d’une suractivation du système immunitaire appelée orage cytokinique. L'avantage des CAR monocytes est avant tout qu'ils seront recrutés plus facilement au sein de la tumeur et qu'ils peuvent ainsi interagir directement avec les cellules tumorales mais aussi avec les cellules immunitaires alentour. Les monocytes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer « du système immunitaire. Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.
Procédures
Pour évaluer la capacité des CAR myeloides à contrôler la croissance tumorale et en se basant sur des recherches publiées (Klichinsky et al, 2020), nous injecterons les cellules tumorales et les CAR monocytes directement dans l’abdomen des souris (voie intrapéritonéale) permettant de suivre via un système d’imagerie le contrôle de la croissance tumorale. Les cellules tumorales injectées exprimant la luciferase, de la luciferin sera injectée par voie intra-péritonéale (1,5mg par souris de 20g). Les souris seront anesthésiées avec de l’Isofluorane (entre 2,5 et 3%) puis imagées via IVIS. L’anesthésie aura une durée de 10 minutes. Les souris seront imagées 2 fois par semaine. Pour évaluer la localisation, la persistance et le recrutement des cellules utilisées comme traitement, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale, intraperitoneale ou intraveineuse. (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec). Pour évaluer l’effet du traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie intraveineuse aux animaux vigiles (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis les animaux seront traités 1 fois avec des CAR myeloides injectées par voie intraveineuse. Pour évaluer le traitement dans d’autres modèles de tumeurs, les cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inf à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale ou intraveineuse. Dans certaines expériences, nous utiliserons une chirurgie courte (20min) sous anesthésie (1h) pour implanter de manière orthotopique des cellules tumorales pancréatiques afin de mettre en place un modèle plus fidèle afin de valider notre thérapie cellulaire. Nous administrerons le traitement cellulaire par voie intraveineuse (durée du geste inf à 10 sec). Pour comprendre comment fonctionne notre traitement, les animaux seront injectés 1 fois avec les cellules tumorales par voie sous cutanée. Le traitement sera injectée 1 fois par voie intratumorale ou intraveineuse et les cellules effectrices 1 fois par voie intraveineuse (durée de chaque geste inf à 10 sec).
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à un stress et à une douleur minimale au moment des injections, mais nous nous efforçons de les maintenir à un niveau aussi bas que possible grâce à une manipulation professionnelle. L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires transplantées attaquent le corps du receveur, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Comme nous avons déjà réalisé ce type d’expérience dans notre laboratoire, nous pouvons bien nous préparer et nous connaissons les signes pour éviter la douleur et la souffrance. Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules par voie intraveineuse ou sous cutanée seront celles liées à l’injection.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo
Remplacement
Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet avec des monocytes modifiés ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroides qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet car il est important de considérer l'interaction des monocytes CAR avec les cellules tumorales dans un organisme entier et d’évaluer les éventuelles toxicités.
Réduction
En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les tumeurs sous-cutanées seront mesurées minimum 2 fois par semaine afin de s’assurer qu’elles ne dépassent pas la taille maximale entrainant le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. L'intervention chirurgicale est réalisée dans des conditions aussi stériles que possible et par un personnel spécialement formé à cet effet. Un traitement anti-douleur standardisé et un contrôle régulier des animaux après l'intervention sont effectués. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score définie pour le projet. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des analgésiques ou des compléments alimentaires.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 6 semaines afin que les souris aient atteint la maturité sexuelle, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Seconde administration de vecteur AAV pour pallier à une perte d’efficacité suite à une thérapie génique de la myopathie myotubulaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
1 224 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des injections intraveineuses d'un vecteur AAV et des prélèvements sanguins répétés à la veine mandibulaire ou caudale toutes les trois semaines jusqu'à l'euthanasie, pour tester une seconde administration de thérapie génique contre la myopathie myotubulaire. Le porteur indique que les mâles malades développent une faiblesse musculaire généralisée qui gêne leur déplacement et leur accès à la nourriture, et que tous les animaux sont euthanasiés pour prélever leurs tissus. Il affirme que le recours aux animaux est "indispensable" car les modèles cellulaires ne reproduisent pas la perte de force musculaire, et retient le rat pour sa réponse immunitaire jugée proche de celle de l'humain.
Objectifs
Il n’existe aucun traitement disponible pour la myopathie myotubulaire lié au chromosome X, une maladie congénitale sévère affectant les garçons et entrainant la mort prématurée avant un an. Cette maladie est due à des mutations dans le gène MTM1, codant pour la myotubularine. Sa déficience implique une diminution de la taille des muscles et une faiblesse musculaire généralisées entrainant une faiblesse respiratoire. Dans un essai clinique en cours, un vecteur AAV (dérivé d’un virus associé à un adénovirus), utilisé comme transporteur pour introduire le gène MTM1 dans les muscles des patients, est injecté par voie intraveineuse. L’espérance de vie étant faible, les patients doivent être traités dans les premiers mois voire premières années de vie. Leurs muscles vont alors se développer avec de nouvelles cellules qui n’auront pas été traitées par l’AAV. Il y a un risque de dilution de la protéine MTM1 et donc de diminution de l’efficacité de la thérapie dans le temps. Pour des raisons immunitaires, il n’est pas possible actuellement de réinjecter le même vecteur de thérapie génique. Récemment, nous avons identifié un nouveau vecteur AAV qui ne génère pas la même réponse immune que les AAV couramment utilisés pour traiter les maladies neuromusculaires en préclinique et clinique. Ce vecteur pourrait donc être utilisé pour une réinjection. Dans ce projet, nous testerons cette réinjection dans un modèle de rat de la myopathie myotubulaire qui reproduit avec fidélité les caractéristiques pathologiques que l’on retrouve chez l’Homme. Plusieurs associations de vecteurs AAV seront testées avec une première injection d’un vecteur dès l’apparition des premiers symptômes, puis une deuxième injection avec un autre vecteur à un stade plus tardif. Nous étudierons la réponse des anticorps et des cellules immunitaires suite à la première et à la deuxième injection. Nous évaluerons également la plus-value d’une ré-administration du gène MTM1 par rapport à une seule injection, dans le contexte d’une perte d’efficacité d’un premier traitement chez des rats malades de la myopathie myotubulaire.
Bénéfices attendus
Cette étude permettrait de proposer une solution à la perte d’efficacité d’un traitement dans le temps. En effet, la meilleure combinaison de deux vecteurs AAV permettrait de traiter les patients à un âge précoce avec un premier vecteur, et de réadministrer ce traitement avec un autre vecteur à un âge plus tardif si nécessaire, à l’adolescence par exemple. De plus, les bénéfices attendues dans ce projet pourraient s’étendre à d’autres pathologies neuromusculaires telles que la myopathie de Duchenne ou toute autre myopathie ou dystrophie touchant les muscles dans les premières années de vie. Si toutefois cette étude ne permettait pas de mettre en avant les bénéfices d’une ré-administration, ce travail permettrait de mieux comprendre les réponses immunes (production d’anticorps) générées par le vecteur nouvellement identifié, et proposer peut-être des alternatives pour réduire l’activation de ces anticorps qui empêchent l’efficacité d’une ré-injection d’AAV.
Procédures
Analyse sur animaux vivants anesthésiés avec injection intraveineuse: environ 20min par rats, 1 fois. Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés: environ 5 min par rats, 4 fois. Injections intraveineuses du traitement : environ 1 min par rat, 2 fois. Injection d’anesthésiques : environ 1min, 2 fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine myotubularine. Les mâles malades développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Les vecteurs AAVs seront appliqués par injection intraveineuse (qui provoquent une douleur légère). Le sang, environ 500µL, sera prélevé à partir de la veine mandibulaire ou caudale en fonction du poids, à partir de 6 semaines, toutes les 3 semaines jusqu’à l’euthanasie. L’analyse de l’efficacité de la deuxième injection se fera en partie après injections de deux anesthésiques et les rats recevront une injection intra-péritonéale d’un produit nécessaire à l’analyse. Les animaux seront euthanasiés par surdosage de deux anesthésiques en intra-péritonéale.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever des tissus qui nous permettront de démontrer l’efficacité des traitements (état du muscle, présence de la protéine dans le muscle, non toxicité sur certains organes…).
Remplacement
L’utilisation d’animaux est indispensable pour faire des preuves de concepts thérapeutiques, car les modèles cellulaires de la maladie ne permettent pas d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle (perte de force non mesurable sur des modèles cellulaires, pas de remplacement possible), et ne permettent pas non plus d’étudier la répartition d’un vecteur dans les différents organes et la réponse immunitaire générée par celui-ci. A l’opposé, le modèle de rat qui sera utilisé dans ce projet reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’Homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des tissus, la distribution du vecteur dans les différents organes et muscles, et la réponse immunitaire. A noter que la réponse des cellules immunitaires et la production d’anticorps suite au traitement avec un vecteur AAV est plus similaire à l’Homme chez le rat que chez la souris d’où l’utilisation de ce modèle plutôt que le modèle souris.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de tests statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux pour observer des différences entre les animaux traités à deux reprises et ceux traités une seule fois. Pour l’ensemble du projet, des groupes d’animaux servant de contrôles sont nécessaires (animal non traité, animal traité une seule fois); les actes exercés sur ces groupes ont été déterminés de façon à ce que certains groupes contrôles puissent servir de contrôle à différentes étapes du projet, ce qui réduit le nombre d’animaux total. De plus, si au cours de l’étude, certaines associations de vecteurs ne permettent pas d’obtenir un bénéfice suite à la deuxième injection, certains contrôles ou certaines étapes ne seront pas réalisés avec ces vecteurs. De même, si aucune association de vecteurs ne permet une ré-administration efficace à la première étape, le projet ne poursuivra pas.
Raffinement
Des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 3 fois par semaine en plus de l’observation quotidienne des animaux. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis. En cas de dégradation de l’état général de l’animal, des soins seront administrés : désinfection locale, pansement de plaies cutanées, soins dentaires (la coupe des dents peut s’avérer nécessaire s’ils ne peuvent pas ronger) et oculaires ou euthanasie sont parfois nécessaires. Des conditions d'hébergement particulières leur seront appliquées afin de garantir leur survie dans de bonnes conditions. Les animaux malades recevront un aliment spécifique, plus riche en nutriments, hydratant et posé au sol pour pallier aux éventuels problèmes moteurs. Les rats étant des animaux sociaux, un rat ne sera jamais seul dans sa cage. En cours de protocole, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie mandibulaire, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésiant gazeux.
Choix des espèces
Les rats ont été choisis comme animaux modèles pour trois raisons : 1) La réponse immune cellulaire que l’on souhaite observer est plus similaire à l’Homme chez le rat que chez la souris d’où l’utilisation de cette espèce plutôt que l’espèce murine. Par exemple, les lymphocytes T ne vont pas interagir de la même façon avec l’antigène (antigène de l’AAV par exemple) entre le rat et la souris, alors qu’il y a peu de différence entre l’Homme et le rat. 2) Ces animaux peuvent être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène d’intérêt. Un modèle de rat de la myopathie myotubulaire a été caractérisé et reproduit avec fidélité les signes cliniques caractéristiques de la maladie humaine, ce qui permet d’évaluer l’efficacité thérapeutique des traitements. 3) La gestation étant de 3 semaines, les animaux nécessaires peuvent être obtenus rapidement. Les rats mâles seront utilisés entre 3 et 4 semaines pour qu’ils soient sevrés et euthanasiés à 15 semaines. Les symptômes de la maladie apparaissent dès la troisième semaine de vie chez les rats Mtm1-KO, la première injection d’AAV vise à corriger en partie les symptômes de la myopathie myotubulaire : les animaux mâles porteurs de la mutation seront donc utilisés après l’apparition des premiers symptômes, en s’assurant que les points limites ne soient pas atteints.
Analyse des conséquences de mutations dans des gènes impliqués dans la stabilité du génome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
404 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour des défauts de réparation de l'ADN, elles reçoivent des injections d'un agent myéloablatif, le 5-fluoro-uracile, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le projet étudie les conséquences de ces mutations sur l'instabilité du génome et le développement de cancers, avec des pistes annoncées pour les téloméropathies. Le porteur indique réaliser une partie des analyses sur fibroblastes prélevés, et affirme que le reste ne peut s'étudier qu'in vivo sur "le mammifère in toto".
Objectifs
L’information génétique nécessaire au bon fonctionnement des organismes vivants est contenue dans les molécules d’ADN qui forment les chromosomes. Les télomères représentent des structures particulières situées aux extrémités des chromosomes qui protègent ces derniers de la dégradation et de la fusion, source d'instabilité génomique. De nombreux facteurs participent à la protection des télomères. Par ailleurs l’ADN fait constamment l’objet de dommages introduits soit secondairement à des fonctions physiologiques telles que la réplication, soit à la suite d’exposition à des agents génotoxiques de l’environnement tels que les rayonnements. Ces dommages sont très efficacement réparés pour éviter l’altération de l’intégrité du génome. Les défauts de réparation de l’ADN et de protection des télomères, notamment dans certaines maladies génétiques, conduisent à diverses pathologies telles que les déficits immunitaires, les téloméropathies ou les cancers. Nous générons des modèles murins d’altération des processus de protection des télomères et de réparation de l’ADN afin d’apprécier les conséquences du défaut de ces processus dans certaines maladies génétiques et dans le développement des cancers afin d’entrevoir de nouvelles solutions thérapeutiques pour ces maladies.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de certaines de ces mutations dans la stabilité des télomères, l'intégrité du génome, et leurs implications dans les téloméropathies. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients atteints de téloméropathies causées par ces mutations.
Procédures
Des injections intrapéritonéales contenant du 5 fluoro-uracile (5FU), un produit myéolablatif, seront effectuées. A la dose utilisée de 5FU, il n'y a pas d'effet indésirable globale de cette drogue. Une létalité embryonnaire peut exister lors de la gestation des animaux homozygotes.
Impact sur les animaux
Les animaux, du fait d'un défaut potentiel de la stabilité du génome peuvent présenter un défaut immunohématologique. Cependant leur maintien dans une zone EOPS devrait les préserver d'infections opportunistes. Par ailleurs l'injection de l'agent myéloablatif génère une légère douleur lors de l'injection intrapéritonéale et provoque un stress et réduit le nombre de cellules souches hématopoiétiques.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques
Remplacement
Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des organes prélevés sur des souris. Il s’agit ici d’études sur le développement du système hématopoïétique qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du système hématopoiétique des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. Les organoïdes permettant d'étudier l'hématopoïèse et en particulier la lymphopoïèse ne sont pas actuellement disponibles. De même les approches in silico ne permettent pas d'étudier m'impact de mutations sur l'hématopoïèse et la lymphopoïèse. En revanche l'analyse de la réparation de l'ADN et de la stabilité des télomères sera en grande partie réalisée dans des fibroblastes embryonnaires des différentes lignées murines ce qui permettra d'utiliser un nombre limité d'animaux.
Réduction
En se basant sur des test statistiques, nous réduiront au maximum le nombre d'animaux utilisés pour obtenir les résultats escomptés. Les tests statistiques faits a priori utiliserons le calcul de puissance. Les tests statistiques faits a posterori seront réalisés à l'aide d'un test non-paramétrique . Par ailleurs, de nombreux tests seront réalisés sur des fibroblastes obtenus de souris, permettant une étude in vitro de nombreux paramètres et ainsi réduisant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront observés de façon hebdomadaire par le personnel compétent de l'animalerie. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés). Le maintien des animaux dans une zone EOPS devrait les préserver d'infections opportunistes. La mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites. Le scoring hebdomadaire est réalisé en plus de l'observatin quotitidenne règlementaire des animaux. Les injections intrapéritonélaes sont peu douloureuses et ne nécessitent pas d'analgésie.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement du système immunohématopoiëtique, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Le phénotype dommageable affectant la survie (embryonnaire et postnatale) sera réalisé au moment du sevrage (3 semaines), le phénotype du système immunitaires sera réalisé à 8-10 semaines (période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel), l'apparition de tumeur sera évaluée à 3 mois (les tumeurs surviennent généralement vers 6 mois, puisque nous voulons savoir s'il y a une accélération de l'apparition des tumeurs dans les modèles de souris double mutantes par un effet de synergie nous analyserons ces souris à 3 mois).
Entretien d’une lignée de souris dont le gène de la chromogranine A est floxé (ChgA-loxP); Génération et entretien d’une lignée de souris dont le gène ChgA est éliminé sous le contrôle du promoteur du gène du 26Rfa (26RFa-iCre/+)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce projet se limite à produire et entretenir des lignées génétiquement modifiées, avec biopsie de la queue sous anesthésie pour génotypage et pose d'une puce sous-cutanée. Les souris de génotype "inadéquat" sont tuées après génotypage, et les couples reproducteurs le sont quand ils cessent de donner des portées. Le porteur relie cet élevage à l'étude d'une protéine liée à l'obésité et au diabète, présentés comme la pandémie de "diabesity".
Objectifs
L'obésité et le diabète de type II connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans qui fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que des neuropeptides connus pour jouer un rôle crucial dans le contrôle hypothalamique du comportement alimentaire sont aussi exprimés dans les îlots pancréatiques, suggérant que les neuropeptides hypothalamiques pourraient servir de lien entre l’homéostasie énergétique et glucidique. C’est le cas du 26RFa, neuropeptide hypothalamique identifié au sein de l'Unité comme le ligand endogène d’un récepteur humain orphelin, le GPR103. Des études récentes menées au sein du laboratoire révèlent que le 26RFa est un nouvel acteur de la régulation de la glycémie. Au sein de notre équipe, nous avons rapporté le rôle essentiel d'une protéine de la famille des chromogranines, la chromogranine A (CgA), dans la formation des granules de sécrétion, organites permettant le stockage et la sécrétion des neuropeptides. De manière intéressante, les souris dont le gène exprimant la CgA a été invalidé de manière globale sont hypertendues et obèses. Or la CgA est exprimée par de nombreuses populations de cellules nerveuses, et de récentes études préliminaires nous ont permis d'observer que les neurones 26RFa expriment également la CgA. Ainsi, la compréhension du rôle de cette chromogranine dans les mécanismes moléculaires de la sécrétion des neuropeptides tels que le 26RFa pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du diabète de type II. Dans ce contexte, nous souhaitons héberger et reproduire des souris CgA-loxP obtenues de "GemPharmatech". L'entretien de cette lignée nous permettra d'invalider de manière ciblée le gène exprimant la CgA en la croisant avec la lignée 26RFa-iCRE/+ pour invalider la CgA dans les cellules exprimant le 26RFa. Ce croisement devrait nous permettre de caractériser l'impact de l'altération de la sécrétion de neuropeptides sur la régulation de l'homéostasie du glucose dans l'organisme.
Bénéfices attendus
L'expression de la CgA étant ubiquiste, l'invalidation globale du gène exprimant la CgA ne nous permet pas de discriminer le rôle central des rôles périphériques de la CgA quant au contrôle de l'homéostasie glucidique. Par ailleurs, la caractérisation du phénotype des souris issues des croisements (prise alimentaire, poids, glycémie, morphologie et capacité sécrétoire des neurones hypothalamiques) concourra à la compréhension du rôle de la CgA dans la sécrétion du 26RFa et son rôle dans l’homéostasie glucidique.
Procédures
Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm destiné au génotypage des animaux) sous anesthésie : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie. L’induction de l'anesthésie profonde se fait par voie aérienne dans une cage dite "à induction". Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide de puces stériles dédiées. La puce est placée en sous-cutané entre les omoplates de façon tangentielle à la courbe du dos et à l'aide de l'injecteur stérile à usage unique fourni avec la puce.
Impact sur les animaux
Les modèles de souris dont le gène ChgA a été invalidé de manière globale sont viables, mais présentent une hypertension et une obésité. L'invalidation ciblée du gène ChgA ne devrait pas induire de nuisance ou d’effet indésirable accentués chez les animaux. Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale sous anesthésie par voie aérienne dans une cage dite "à induction" (isoflurane). Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide d'une puce placée en sous-cutané. L’élevage et la reproduction devraient induire peu de stress et de souffrance.
Devenir
Une partie des animaux générés dans ce projet sera destinée à la reproduction et à l'entretien de la lignée CgA-loxP, et une autre partie des animaux sera destinée à la génération et à l'entretien d'une lignée dont le gène ChgA est éliminé sous le contrôle du promoteur du gène du 26RFa. Les animaux de génotype adéquat seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissance à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ne produisant plus de portées seront mis à mort selon les procédures précedemment décrites. Les animaux de génotype inadéquat donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.
Remplacement
L’étude de l'impact de l'invalidation ciblée du gène ChgA sur l'homéostasie glucidique n’est possible que dans un système intégré et nécessite donc l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à réduire le nombre d'animaux générés en choisissant de travailler sur les animaux homozygotes pour la construction CgA-loxP, plutôt qu'hétérozygotes. En effet, les règles de la génétique mendélienne indiquent que la probabilité d'obtenir des animaux de génotype adéquat est de 1/4 dans le cas de croisements d'animaux double hétérozygotes CgA-loxP. Le nombre d'animaux de génotype non adéquat, générés dans la descendance des croisements est ainsi divisé par deux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à cinq par cage (deux femelles et un mâle par cage pour les accouplements) pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de boules de coton pour construire un nid + dôme en plastique rouge sous lequel se réfugier). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux. Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Pour réduire une éventuelle souffrance liée à la mise bas, les femelles seront suivies quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. La mise-bas en elle-même sera étroitement surveillée afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal (le processus de mise-bas dure en moyenne 2 heures chez la souris) et l’aide nécessaire sera apportée aux femelles en cas de difficultés au cours de la mise bas (temps de mise bas allongé au-delà de 4h, mise-bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…).
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes, ce qui n'est pas le cas d’autres modèles mammifères. Ainsi, des souris de la lignée C57Bl/6J ont été utilisées afin de générer les animaux portant la construction transgénique CgA-floxP provenant de GemPharmatech (B6/JGpt-Chgaem1Cflox/Gpt). Cette dernière lignée (utilisation de souris à partir de 8 semaines de vie, âge de maturité sexuelle) sera alors croisée avec une lignée transgénique 26RFa-iCRE (même stade de développement et également obtenue à partir de souris de la lignée C57Bl/6J), détenue au sein de l'animalerie, soumise à un « Material Transfert Agreement » convenu entre le laboratoire d’origine et l’Inserm U1239.
Etude de l’efficacité d’un probiotique sur l’anxiété chez le chien
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
20 chiens vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dix-neuf étant ensuite réutilisés dans d'autres études et un seul proposé à l'adoption. Pendant six semaines, ils reçoivent un aliment additionné d'un probiotique, subissent quatre prises de sang et deux "défis comportementaux" consistant en un trajet en voiture en caisse de transport. L'objectif est commercial, faire autoriser ce probiotique comme additif alimentaire pour chiens sur le marché européen, une troisième étude étant exigée par les autorités. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'effet d'un aliment sur l'anxiété du chien.
Objectifs
Le projet a pour but d'évaluer le bénéfice d'un probiotique inclus dans un aliment complet sur l'anxiété chez le chien.
Bénéfices attendus
Il est attendu du projet que le probiotique évalué puisse faire l'objet d'une autorisation en tant qu'additif entrant dans la composition d'aliment pour chien sur le marché Européen. Le probiotique utilisé dans l’étude a un effet calmant pour les animaux anxieux et ainsi améliorer la qualité de vie des chiens.
Procédures
Pendant l'étude, les chiens recevront un aliment complet avec ajout d'un probiotique sous forme de poudre chaque jour pendant 6 semaines, soit 42 jours. Chaque chien subira 4 prises de sang (volume de 1mL / prise) par voie veineuse et 2 défis comportementaux réalisés à J43 et J106 de l'étude. Le défi comportemental prendra la forme d'un court trajet en voiture d'une durée de 10 minutes, en caisse de transport.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles seraient: défécation ou miction incontrôlée, comportements d’échappement intenses et persistants pouvant nuire à l’animal, et vomissements durant le trajet en voiture. Les nuisances possibles au moment des prélèvements sanguins sont: hématome, infection.
Devenir
Parmi les 20 chiens, 19 seront ré-utilisés dans d'autres études, et 1 chien ayant atteint l'âge requis sera proposé pour un placement via le programme d'adoption de l'animalerie.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative prouvée permettant d'évaluer l'impact de la consommation d'un aliment sur l'anxiété chez le chien. Par conséquent, il n'est pas possible de remplacer le recours à l'espèce animale étudiée dans ce projet.
Réduction
Sur la base de la variation constatée sur des études similaires réalisées précédemment, il a été déterminé qu'avec 20 chiens, nous serons en mesure de détecter une différence statistiquement significative de 10% dans les paramètres physiologiques étudiés.
Raffinement
Les chiens suivent un programme de socialisation individuelle régulière se composant d'activités d'éducation canine, de promenade en laisse et de sortie en parc. Ceci pour favoriser des interactions positives avec le personnel soignant et ceux appliquant les procédures expérimentales. Les animaux bénéficient quotidiennement d'accès à de larges enclos gazonnés où ils peuvent s'ébattre plusieurs heures par jour sous la supervision d'animaliers. Ils sont logés en box individuel par couple dont les dimensions sont très supérieures aux minima réglementaires. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel soignant composé de vétérinaires, assistants vétérinaires et soigneurs animaliers, ainsi que de comportementalistes.
Choix des espèces
Le probiotique étudiée est destiné à l'espèce Canine, qui a déjà été évalué dans deux études précédentes. Les autorités sanitaires Européennes requierent qu'une troisièmé étude soit réalisée sur l'espèce animale concernée pour valider l'effet du probiotique étudié en tant qu'additif alimentaire. Les animaux seront au stade adulte considérant que l'ingrédient actif sera intégré en premier lieu dans des aliments pour chien adulte.