Oncologie
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Dymorphisme sexuel associé à la maladie des petits vaisseaux et à l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection preservée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
2 650 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. En surpoids ou diabétiques, elles subissent des injections intrapéritonéales répétées, une à deux chirurgies pour les castrer ou leur implanter une pompe, un test d'effort et une échocardiographie sous anesthésie. Le projet étudie le rôle des hormones sexuelles dans une insuffisance cardiaque touchant surtout les femmes ménopausées, avec des cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur affirme que cette pathologie complexe ne peut s'étudier in vitro et requiert "un organisme vivant proche de l'homme".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque dite « à fraction d’éjection préservée » représente la moitié des insuffisances cardiaques et sa prévalence est en constante augmentation compte tenu du vieillissement de la population et de l’explosion des facteurs de risques cardiovasculaires. Il s’agit d’une pathologie associée à une mortalité élevée et pour laquelle il n’existe pas de traitement efficace. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie ce qui est primordial pour identifier des cibles thérapeutiques. Plus précisément nous nous attacherons à mieux comprendre, d’une part le rôle de la maladie des petits vaisseaux qui est souvent associée à cette maladie et d’autre part le dimorphisme sexuel associé à cette maladie. En effet cette maladie touche surtout les femmes ménopausées suggérant un rôle des hormones sexuelles.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment les hormones sexuelles interagissent avec les facteurs de risque cardiovasculaire pour protéger ou altérer le phénotype des petits vaisseaux et la fonction cardiaque. A plus long terme, il devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques personnalisées pour les patients atteints d’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. En effet, l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée est une maladie hétérogène possiblement induite par des mécanismes multiples.
Procédures
Les souris subiront 1 à 2 séries de 4 à 5 injections intrapéritonéales (chaque injection incluant la contention ne dure que quelques secondes), une à deux chirurgies de 10 minutes visant à les castrer ou à implanter une micro-pompe en sous cutané et un prélèvement sanguin inférieur à 50 µL dans la veine caudale. Finalement ces souris seront soumises à un test d'effort (12 minutes par jours pendant 3 jours habituation) puis 5 à 30 minutes pour le test à proprepemnt dit) et une anesthésie de 15 minutes pour subir une échocardiographie.
Impact sur les animaux
Ce projet utilisera des souris en surpoids ou diabétiques dont les nuisances sont comme chez l'homme, un surpoids, une polyurie et une polydipsie. D'autre part les animaux ressentiront des douleurs post-chirurgicales et un stress occasionné par des administrations intrapéritonéales répétées.
Devenir
Toutes les souris seront sacrifiées pour pouvoir faire des prélévements d'organes. Les géniteurs seront sacrifiés lorsque le nombre d'animaux nécessaires aux expérimentations aura été produit.
Remplacement
L‘insuffisance cardiaque est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions de divers mécanismes, dont beaucoup restent inconnus, entre de nombreux types cellulaires locaux (cardiomyocytes, cellules endothéliales, péricytes notamment) et circulants (cellules hématopoïétiques diverses). Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’homme est donc necessaire.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un logiciel informatique: Pour avoir 90% de chance de mettre en évidence des différences significatives entre 2 groupes (concernant, la pression télédiastolique du ventricule gauche notamment), le nombre de souris par groupe et par analyse doit être 10. Il faut noter cependant que nous ne pourrons pas faire toutes les analyses sur une seule souris, il nous faudra donc 2 souris. Le nombre de souris par groupe sera donc 20. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et à celle de la communauté scientifique s'intéressant aux pathologies cardiovasculaires, 10 animaux par lot sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de la fonction cardiaque et les analyses histologiques. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux des groupes "contrôles", traités de façon identiques, mais inclus dans différentes procédures seront dès que possible utilisé dans plusieurs "expériences ou procédure". Le nombre de souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera ainsi réduit.
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux et la mise en place de points limites. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche de suivi « bien-être » sera créée. Le bien-être des animaux sera alors gradé ce qui permettra d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de forte ressemblance avec celui de l'homme. Par ailleurs, il existe dans cette espèce des individus présentant des mutations spontanées prédisposant au diabète de type 2 (facteur de risque cardiovasculaire). Des souris adultes âgées d'au moins 6 semaines seront utilisées, En effet, notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques.
Effet de la consommation de farines produites à partir de graines de protéagineux et d’oléoprotéagineux enrichies en acides gras polyinsaturés sur le métabolisme lipidique et protéique musculaire du rat jeune
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
90 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Hébergés seuls pour contrôler leur alimentation, ce qui leur impose un stress chronique, ils sont nourris de farines d'oléoprotéagineux enrichies en oméga 3, pesés trois fois par semaine et placés quatre jours en cage métabolique, avant mise à mort pour prélever muscles et sang. L'objectif est nutritionnel et commercial, évaluer la digestibilité de protéines végétales pour développer des "ingrédients" destinés à l'alimentation humaine. Le porteur affirme que ces mesures ne peuvent être obtenues ni in vitro ni directement chez l'homme.
Objectifs
La croissance démographique mondiale pose la question de la disponibilité des ressources alimentaires et notamment des protéines. Une des solutions est d’augmenter les protéines végétales et de réduire les protéines animales dans la ration alimentaire. Toutefois, l'essor des protéines végétales nécessite une meilleure connaissance de leur valeur nutritionnelle, de leur cinétique de digestion et de leur biodisponibilité (capacité des protéines à fournir réellement tous les acides aminés nécessaires pour les synthèses protéiques corporelles). En effet, il est important d’étudier les qualités nutritionnelles des protéines végétales avant de pouvoir recommander leur consommation comme source protéique de substitution aux protéines animales. Et cela s’applique particulièrement aux protéines issues des oléo-protéagineux car elles sont encore peu étudiées pour l’alimentation humaine, malgré leur grand intérêt nutritionnel. En effet, ces sources alimentaires végétales, qui sont à la fois riches en acides gras indispensables (oméga 3) et en protéines (15 à 35 % de protéines dans le Colza et tournesol), pourraient être une option intéressante pour la définition de nouveaux aliments végétaux. Les farines, concentrats et isolats d’oléoprotéagineux disponibles commercialement proviennent des coproduits obtenus après extraction de l’huile (touteaux). Pour tester l’effet combiné de leurs protéines et de leurs acides gras oméga 3, il faudra rajouter des acides gras polyinsaturés aux matières protéiques végétales issues de tourteaux. Dans ce contexte, le projet vise à étudier la digestibilité de régimes riches en protéines végétales d’oléo-protéagineux enrichies avec des acides gras oméga 3, en comparaison avec un régime riche en protéines et étudier leur impact sur la digestibilité et la fonction et le métabolisme lipidiques et protéiques musculaires dans un modèle de rats jeunes.
Bénéfices attendus
L’une des solutions pour répondre au besoin accru en ressources alimentaires et notamment en protéines, est d’augmenter les protéines végétales et de réduire les protéines animales dans la ration alimentaire. Pourtant, il manque encore des preuves scientifiques qui permettent de considérer les protéines végétales comme source protéique de substitution aux protéines animales. Les études décrites dans la littérature portent majoritairement sur les protéines issues de graines de légumineuses (pois, lentilles), ou issues du soja mais peu s'intéressent à la valeur nutritionnelle des protéines provenant d’oléoprotéagineux tels que le colza ou le tournesol. De plus, aucune d'entre elles n’envisage un éventuel effet synergique des lipides et des protéines issues des oléoprotéagineux tant sur leur digestibilité que sur leurs effets santé. Les plantes oléoprotéagineuses offrent un double intérêt nutritionnel car elles apportent des protéines mais également des lipides, notamment des acides gras polyinsaturés qualifiés d'acides gras indispensables car le métabolisme de l'Homme et des animaux est inapte à les synthétiser. Seule l'alimentation est capable de fournir à l'organisme, ces acides gras indispensables à un certain nombre de fonctions physiologiques. Du fait de leur forte teneur en lipides, les plantes oléoprotéagineuses sont principalement cultivées pour la production d’huiles végétales. Les procédés d'obtention de l'huile conduisent à un coproduit appelé tourteau. A partir de ces tourteaux, des produits de transformations appelés farines, concentrats et isolats, sont disponibles lorsque certains procédés de transformation sont appliqués. Ces derniers contiennent des teneurs en matières grasses résiduelles et sont concentrés en d'autres nutriments, notamment en protéines. Le présent projet fournira des données scientifiques nouvelles qui permettront d'apprécier l'intérêt de sources végétales comme les oléoprotéagineux qui combinent les protéines et les lipides tant sur la valeur nutritionnelle des protéines que sur leur éventuels bénéfices santé, résultant d'une synergie entre le métabolisme des lipides et des protéines. Ce projet pourrait donc à terme permettre de développer à partir de ces matrices protéiques végétales issues d’oléo-protéagineux, des "ingrédients" riches en protéines végétales et enrichis ou non avec des acides gras polyinsaturés oméga 3, qui pourraient présenter un intérêt pour la santé et la nutrition humaine.
Procédures
L'ensemble des interventions décrites ci-après concernent l'ensemble des 90 rats. Les rats seront hébergés en cage individuelle pour contrôler précisément leur consommation alimentaire pendant toute la durée du protocole depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à leur mise à mort soit 4 semaines plus 10 jours d'acclimation. Les 90 rats subiront peu d’interventions durant le protocole. La première consiste à les peser, 3 fois par semaine pendant toute la durée du protocole. Les pesées des pesées est de quelques secondes. La deuxième consiste à récupérer la totalité des fèces et de l’urine produits par les animaux afin de mesurer la digestibilité des protéines (=azote ingéré – azote excrété/azote ingéré). Les rats seront alors hébergés dans une cage métabolique conçue pour permettre cette récupération. La durée du passage sera réduite à son maximum (4 jours au total) sans compromettre les résultats du projet.
Impact sur les animaux
A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront âgés de 4 semaines. A la fin du protocole expérimental, ils seront mis à mort à l’âge de 2 mois. Aucun effet indésirable particulier n’est attendu en lien avec les différents régimes et la mesure du poids réalisée de façon non invasive. Afin de mesurer précisément leur consommation alimentaire pendant toute la durée du protocole expérimental, les rats seront hébergés en cage individuelle. Cet hébergement individuel affectera le bien-être de ces animaux sociaux en induisant un stress chronique que nous chercherons à réduire en favorisant les contacts acoustiques, olfactifs et optiques avec leurs congénères et en fournissant un enrichissement adapté dans la cage. De plus, l’ensemble des rats sera soumis à un stress supplémentaire avec leur hébergement dans une cage métabolique au cours des 4 derniers jours du protocole.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet. En effet, le prélèvement des muscles squelettiques est nécessaire pour mesurer le niveau de synthèse protéique au sein de ce tissu. De même, l'ensemble du sang des animaux doit être prélevé pour pouvoir mesurer le statut inflammatoire des rats et réaliser leur bilan sanguin.
Remplacement
L'utilisation d'animaux dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 ou 3 dimensions car ils ne présentent pas à ce jour les mêmes caractéristiques que celles observées chez le rat et l’homme. En effet, les cellules intestinales disponibles ne présentent pas les caractéristiques indispensables dans les phénomènes d’absorption des lipides par la muqueuse intestinale. De plus, ces systèmes ne permettent pas de mesurer simultanément la digestibilité des différentes sources de protéines (protéagineux ou oléoprotéagineux) enrichies avec des acides gras polyinsaturés oméga 3, le métabolisme protéique, lipidique et musculaire et le statut inflammatoire circulant. En l’état, ce projet ne peut pas non plus être mené directement chez l’Homme. En effet, actuellement, les tourteaux et farines issues de tourteaux de colza ou de tournesol disponibles commercialement ne sont destinés qu’à l’alimentation animale et ne peuvent pas être utilisés pour la consommation humaine. Il est à noter qu’avant de réaliser les régimes fournis ensuite aux rats les farines, concentrats ou isolats protéiques seront analysés d’un point de vue nutritionnel et microbiologique garantissant leur innocuité.
Réduction
Les résultats d’études antérieures menées sur des rats nourris avec des farines produites à partir d'autres végétaux (céréales) ont permis de réduire le nombre d’animaux utilisés à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est 90. Pour comparer les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons des tests statistiques.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages adaptée à l'espèce. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 2 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.
Choix des espèces
Le modèle rat est le modèle le plus utilisé dans les études de digestion et d’absorption et de métabolisme des lipides et des protéines, en vue d’une extrapolation chez l’homme. Ce modèle a l'avantage de posséder les mêmes systèmes digestif et enzymatiques que ceux observés chez l'Homme. D'autre part depuis près de 30 ans nous avons cumulés des données obtenues à partir de ce modèle, ce qui nous permet de poursuivre nos investigations sur la base de précédentes études mais aussi de mettre en regard nos données à celles d'autres travaux de recherche à l'international.
Evaluation de l’efficacité d’un traitement anticancéreux sur un modèle de tumeur mammaire humaine développée chez la souris immunodéprimée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dont 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Immunodéprimées, elles reçoivent par chirurgie une greffe de tumeur mammaire humaine, puis jusqu'à dix-huit injections d'une molécule inhibitrice sur six semaines, avec suivi de la tumeur et prélèvements sanguins. L'objectif est de confirmer l'efficacité de ces molécules contre le cancer du sein triple négatif, avec un bénéfice pour les patientes annoncé à long terme. Le porteur affirme qu'après des tests sur cellules, la validation sur "organisme entier" est nécessaire.
Objectifs
Ce projet concerne l'inhibition d'une enzyme qui intervient dans le mécanisme de détoxification des cellules. Cette voie de détoxification est particulièrement utilisée par les cellules des tumeurs. L’augmentation de l’expression de cet enzyme a été reportée dans de nombreux cancers et est associée à la résistance aux traitements habituelles lors de rechutes. Le pourcentage du cancer du sein représente 33.5% de l’ensemble des nouveaux cas de cancer chez la femme. La grande diversité retrouvée dans le cancer du sein rend les traitements plus difficiles que sur d’autres formes de cancer du sein. Il constitue un problème clinique en raison de son pronostic relativement mauvais, de son comportement agressif, de sa capacité à métastaser et de l'absence de thérapies ciblées. Un nouveau traitement anticancéreux contre les cancers a été développé. Une première molécule a montré son efficacité sur la leucémie , le mélanome, le cancer du poumon ainsi que le cancer du sein. L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité des molécules sur des souris greffées avec des cellules tumorales humaines au niveau des glandes mammaires afin de reproduire un modèle de cancer du sein in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet à court terme sont de confirmer l’efficacité de nos molécules inhibitrices sur la progression d’une tumeur de cancer du sein implantée chez la souris. Les bénéfices attendus, à long terme, sur la santé humaine sont d’améliorer la prise en charge des patientes et d’améliorer le pronostic lors de rechutes. Ce traitement, permettra d’envisager une thérapie ciblée plus efficace que les thérapies conventionnelles actuellement utilisées contre le cancer du sein triple négatif.
Procédures
injection de cellules tumorales dans la glande mammaire de la souris par chirurgie courte sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes) Traitement des souris des molécules inhibitrices (3 fois par semaine pendant 6 semaines maximum / 18 injections maximum / 5 secondes par injection) Contention des souris lors de la mesure des tumeurs (2 fois par semaine). Un prélèvement de sang en cours d'étude dans la veine mandibulaire de la souris (1 fois). Un prélèvement final de sang réalisé sous anesthésie (1 fois).
Impact sur les animaux
Douleur liée à la chirurgie. Développement de la tumeurs. Gène liée à la tumeur .Douleur légère liée à l'injection. Douleur liée à la prise de sang (piqure d'aiguille). Stress lors de la contention. Douleur liée à l'apparition de métastase.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements dans le but de la analyser.
Remplacement
Avant de réaliser des études sur la souris, l’efficacité des molécules a été démontrée sur les cultures cellulaire de tumeur séléctionnées pour ce projet. Il est dorénavant nécessaire de confirmer ces résultats sur une tumeur développée dans un mammifère. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement de son environnement. Par ailleurs, plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du traitement dans la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons, nous devons effectuer les études d’efficacité chez la souris.
Réduction
La prise tumorale ayant un taux de réussite de 80%, nous avons réduit le nombre d'animaux à implanter en prenant en compte ce paramètre. L’étude pilote sera réalisée avec le minimum nous permettant d’apprécier la croissance tumorale. Pour les procédure où le traitement sera administré aux souris, la comparaison entre les différents groupes sera réalisée par un test statistique. le nombre d'animaux par groupe a été déterminé car il nous permet un compromis entre une puissance statistique suffisante et l’éthique animale. Une réduction du nombre d’animaux sera possible en fonction des résultats obtenus lors des premières études : - Suppression des doses non tolérées dans les études suivantes pour chacune des souches de souris. - Suppression des témoins négatif s’ils ne démontrent pas d’activité dans les premières études.
Raffinement
Après leur réception, les souris disposeront d’une période d’acclimatation de 7 jours. Lors de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés maximum 70 jours (10 semaines) après leur réception si aucun point limite n’a été atteint. Ce délai correspond à la durée maximale possible des études (1 semaine d’acclimatation + 3 semaines de prise de greffe + 6 semaines de traitement). Lors de la chirurgie, des antidouleurs sont donnés avant l'opération. l'animal a une anesthésie générale et locales. Un antidouleur est apporté dans l'eau de boisson pendant les 3 jours qui suivent l'opération. Les animaux étant identifiés, toute anomalie observée permettra de faire un suivi individuel. Ils seront pesés le jour de la première intervention (J7) puis au moins une fois par semaine (3 fois lors des traitements). En cas de perte de poids >10%, de la nourriture humide sera ajouté dans la cage. En cas de tumeur invalidante, de l'eau gélifiée et des croquettes seront ajoutées dans la cage pour faciliter l'accès à l'eau et à la nourriture. Les animaux seront répartis à raison de 5 ou 6 par cage (dépendant de la prise de la tumeur) afin de maintenir la sociabilité de l’animal. Une observation, 3 fois par semaine lors des traitements, permettra de détecter une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.
Choix des espèces
La souris est l'un des seuls modèles d'animaux adaptés pour la réalisation de greffe de tumeur d'origine humaine. C'est un modèle reconnu dans la recherche contre le cancer. Les animaux seront utilisés à partir de 6 à 10 semaines jusqu’à 15-20 semaines. Ce choix est basé sur la bibliographie afin de favoriser la prise tumorale.
SIGNAL: INFECTION AU SARS-COV-2 DES NEURONES A GNRH, NEUROINFLAMMATION,VEILLISSEMENT ET CONSEQUENCES A LONG-TERME
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
348 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur humain, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale, avec implantation de mini-pompes et prélèvements sanguins répétés, certaines lignées n'ayant qu'une espérance de vie de sept à douze jours après infection. Le projet étudie l'infection des neurones à GnRH et ses effets à long terme sur la reproduction et la cognition, y compris chez des femelles gestantes et leur descendance. Le porteur affirme que cette étude requiert "l'organisme entier" et juge ces souris "indispensables".
Objectifs
Depuis le début de la pandémie de COVID-19, les efforts collaboratifs des 5 équipes de recherche ont montré que le SARS-CoV-2 infecte et tue les neurones produisant l'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) dans le cerveau des patients adultes atteints de COVID-19. Ce phénomène entraîne une réduction spectaculaire de l'expression de la GnRH dans l'hypothalamus chez une proportion significative de patients. Ces neurones, connus pour être les maîtres régulateurs de la fonction de reproduction, pourraient également jouer des rôles clés dans le développement des fonctions cognitives et sensorielles, du métabolisme et du vieillissement cérébral et systémique. En outre, les neurones à GnRH foetaux, qui proviennent du nez, expriment plusieurs protéines qui leur confèrent une sensibilité à l'infection par le SARS-CoV-2. Ceci suggère qu'ils pourraient être vulnérables en cas de transmission materno-foetale/néonatale, et fait planer le risque d'une double pandémie d'infertilité et de déclin cognitif prématuré. Nous émettons l'hypothèse que l'infection des neurones à GnRH et d'autres populations de cellules cérébrales par le SARS-CoV-2 module l'expression des gènes de l'hôte, perturbe le neurodéveloppement et aggrave les changements liés à l'âge par des altérations inflammatoires et épigénétiques persistantes dans les cellules survivantes. Le projet utilise des tissus humains de patients COVID-19 et de sujets non-infectés, ainsi que des modèles cellulaires, et nécessite également l’utilisation de modèles animaux transgéniques afin de déterminer si et comment l'infection et la perte des neurones à GnRH conduit à des altérations pathologiques à long terme. Nous poursuivrons trois objectifs: 1) Déterminer si et comment l'infection par le SARS-CoV-2 module de manière différentielle le paysage de l'expression génétique des neurones à GnRH et d'autres cellules cérébrales infectées pour accélérer l'inflammation hypothalamique, le dysfonctionnement cognitif ou métabolique et la sénescence cérébrale 2) Explorer si l'infection des neurones à GnRH ou la perte d'expression de la GnRH dans le cerveau adulte ou foetal/néonatal a des effets à long terme sur l'axe reproducteur dans des modèles animaux 3) Vérifier si le remplacement de la GnRH de façon physiologique ou l'inversion des voies pathologiques compensera l'expression génique à long terme et les altérations fonctionnelles induites par l'infection du cerveau par le SARS-CoV-2.
Bénéfices attendus
Le projet apportera une meilleure compréhension des répercussions à long terme, jusqu'ici sous-estimées, de la neuroinvasion par le SARS-CoV-2 en termes d'intégrité et de fonction des cellules cérébrales. Il pourrait permettre d’identifier les mécanismes cérébraux qui sous-tendent les symptômes neurologiques de la COVID longue, et proposer des stratégies thérapeutiques viables et fondées sur les preuves pour inverser ou compenser ces mécanismes pathologiques. Les résultats du projet devraient contribuer à réduire le fardeau social, financier et sanitaire imposé par la COVID-19.
Procédures
LES INTERVENTIONS SERONT EFFECTUEES SUR ANIMAL ANESTHESIE ET CHAQUE INTERVENTION EST REALISEE 1 FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL: - IMPLANTATION DE MINIPOMPE SOUS-CUTANEES AU NIVEAU DE LA PARTIE SUPERIEURE DU DOS, - INFECTION DES SOURIS PAR VOIE NASALE (SOURIS ADULTES GESTANTES OU NON). SEULS LES PRELEVEMENTS SANGUINS SERONT EFFECTUES SUR ANIMAL VIGILE. LES PRELEVEMENTS UNIQUES SERONT EFFECTUES AU NIVEAU DE LA VEINE MANDIBULAIRE 1 FOIS PAR MOIS PENDANT 6 MOIS (SUR L'ANIMAL ADULTE) OU A P12, P23 ET P30 (SUR SOURIS POST-NATALES); LES PRELEVEMENTS FREQUENTS SERONT EFFECTUES DANS LA VEINE LATERALE DE LA QUEUE 1 SEULE FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL (3µL DE SANG TOUTES LES 6 MINUTES PENDANT 2H).
Impact sur les animaux
TOUTE MANIPULATION DES ANIMAUX PEUT PROVOQUER DU STRESS, DE LA FATIGUE ET DE L'INCONFORT ET DES MESURES DE RAFFINEMENT SERONT MISES EN PLACE POUR LES LIMITER AU MAXIMUM. EN PARTICULIER LES EXPERIENCES DE CHIRURGIE OU DE PRELEVEMENTS DE SANG PEUVENT PROVOQUER DES DOULEURS A COURT-TERME QUI SERONT LIMITEES PAR L'UTILISATION D'UN ANALGESIQUE (GEL DE CHLORHYDRATE DE PRAMOCAÏNE OU TRONOTHANE 1%). SEULS LES ANIMAUX INFECTES PAR LE VIRUS SARS-COV-2 DANS LA PROCEDURE 2 SUBIRONT UNE PERTE DE POIDS CONSEQUENTES ET SERONT SUIVIS DE TRES PRES; ILS SERONT SACRIFIES A 4 JOURS POST-INFECTION POUR LIMITER LA DUREE DE CET ETAT.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés pour chaque procédure sera EUTHANASIE à terme même ceux qui servent de contrôles afin de récupérer le sang et les organes.
Remplacement
Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3 R. L’étude des effets physiopathologiques de l’infection par SARS-CoV-2 et de l’efficacité des médicaments nécessitent l’utilisation d’organisme entier, et ne laissent pas la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des systèmes cellulaires. En effet, suite à l’infection respiratoire, le système immunitaire s’active et conduit à une inflammation. Celle-ci se traduit par le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et par la production de facteurs solubles (cytokines, chimiokines etc). Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de cellules et de facteurs solubles qui ne peut pas être reproduite in vitro. Par ailleurs, les effets potentiellement bénéfiques du donneur de NO au cours de l’infection ne peuvent être réellement évalués qu’in vivo. Le modèle souris est pertinent pour ce type d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe sera utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. LE NOMBRE D’ANIMAUX EST BASE SUR UN CALCUL STATISTIQUE QUI PREND EN COMPTE LE PARAMETRE ETUDIE ET DES EXPERIENCES PILOTES. POUR CELA, LA TAILLE MINIMALE DES GROUPES EXPERIMENTAUX A UTILISER A ETE DEFINI ; PUIS LA POSSIBILITE DE COLLECTER PLUSIEURS ECHANTILLONS/TISSUS CHEZ LES MEMES ANIMAUX CHAQUE FOIS QUE POSSIBLE A ETE PRISE EN COMPTE. CETTE UTILISATION MAXIMISE LES DONNEES OBTENUES A PARTIR DE CHAQUE ANIMAL, AFIN DE LIMITER OU D'EVITER L'UTILISATION SUBSEQUENTE D'ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES, ET CE, SANS POUR AUTANT COMPROMETTRE LE BIEN-ETRE ANIMAL.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Les personnes impliquées bénéficient d’une autorisation pour travailler sur des agents pathogènes de groupe 3. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. EN PARTICULIER, LES ANIMAUX SONT MANIPULES INDIVIDUELLEMENT, ET DANS LE CALME, AFIN DE LIMITER TOUT STRESS DES ANIMAUX NON MANIPULES. LES MANIPULATIONS S'EFFECTUENT A DISTANCE DES AUTRES ANIMAUX. UNE SURVEILLANCE QUOTIDIENNE EST EFFECTUEE AFIN DE S’ASSURER DE L’ETAT DES ANIMAUX.
Choix des espèces
La souris exprimant l’ACE2 humain génétiquement modifiée représente un modèle pertinent pour l’étude des réponses immunes et inflammatoires liées à l’infection par le SARS-CoV-2. AFIN D’ETUDIER LES CONSEQUENCES PATHOPHYSIOLOGIQUES DE LA PERTE DE CES NEURONES LORS DE LA COVID-19, NOUS UTILISERONS UN MODELE DE SOURIS TRANSGENIQUES DANS LESQUELLES L’ACE2 HUMAIN S’EXPRIMERA UNIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH. L’ETUDE DU ROLE SPECIFIQUE DU CO-RECEPTEUR A LA NEUROPILIN-1 (NRP1) SPECIFIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH REQUIERT L’UTILISATION DE SOURIS TRANSGENIQUES INFECTEES DE MANIERE GLOBALE PAR LE SARS-COV-2 ET QUI N’ONT PAS LE RECEPTEUR NRP1 DANS LES NEURONES A GNRH. CES SOURIS ONT UNE ESPERANCE DE VIE COURTE (7 A 12 JOURS POST-INFECTION) MAIS SONT INDISPENSABLES POUR DETERMINER LE ROLE DU CO-RECEPTEUR NRP1 DANS LA PERTE DE L’EXPRESSION DE LA GNRH. NOTRE TROISIEME OBJECTIF ETANT D’ETABLIR L’IMPACT DE L’INFECTION IN UTERO OU NEONATALE SUR LA MINIPUBERTE ET A LONG TERME SUR L’AXE REPRODUCTEUR, IL NECESSITE L’UTILISATION DE SOURIS FEMELLES GESTANTES INFECTEES PAR LE SARS-COV-2 ET D’ETUDIER LES EFFETS SUR LA DESCENDANCE A PLUS OU MOINS LONG-TERME.
Développement pharmaceutique d’une nouvelle thérapeutique de la maladie de Menkès (EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
85 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 39 en gravité sévère. Les souriceaux mâles porteurs de la maladie de Menkès, dont l'espérance de vie ne dépasse pas trois à cinq semaines, reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept et subissent sept tests neurocomportementaux jusqu'à J38. L'objectif est de développer un transporteur synthétique de cuivre contre cette maladie génétique mortelle de l'enfant. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro n'est possible puisque l'étude porte sur la survie et le comportement de l'animal malade.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie rare causée par un déficit d’un transporteur cellulaire du cuivre (ATP7A) au niveau des barrières intestinales, placentaires et hémato-méningées. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir de ces enfants reste extrêmement pauvre causant alors des déficits multi systémiques et un décès dans les premières années de vie. Dans le contexte de cette maladie, l’obstacle du passage au niveau des barrières intestinales et hémato-méningées est responsable de la pathologie. Le développement et l’étude des nanoparticules ont montré qu’elles avaient une capacité de diffusion inter et intracellulaire augmentée grâce à leur faible taille (
Bénéfices attendus
Chez les animaux malades traités avec le Transporteur synthétique de cuivre : 1) Restauration des fonctions altérées 2) Restaurations des fonctions cognitives principales 3) Amélioration de la survie L'objectif de ce projet est de développer un médicament capable de soigner des enfants porteurs de la mutation et qui ont une espérance de vie très réduite.
Procédures
1/ Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie. 2/ Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J38 pour les souris mâles malades.
Impact sur les animaux
Chez les animaux malades non traités avec le TSC : défauts de croissance et difficultés d'alimentation, risque de mort des animaux non traités par rupture/anévrismes aortiques. Chez les animaux malades traités avec le TSC, une toxicité liée au produit peut apparaitre mais cela n'a encore jamais été observé dans les études que nous menons depuis juillet 2020. Des études de recherche de toxicité in vitro sur cellules hépatocytaires ainsi que des études anatomopathologiques sur reins ont été effectués et n’ont montré aucune toxicité.
Devenir
L’ensemble des animaux du protocole (85 animaux) seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (fixé à J56 d’âge) afin de suivre l’évolution des animaux malades en réponse au traitement médicamenteux. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traités avec un placebo est compris entre 3 et 5 semaines d’âge. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et tous les organes d'intérêt seront rapidement prélevés et conditionnés afin de réaliser des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie et l’amélioration du comportement de l’animal porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L’étude complète prévoit la génération de 13 animaux mâles par groupe pour tenir compte du taux de mortalité élevé liée à la pathologie touchant seulement les mâles, mais s’arrêtera dès que les tests comportementaux seront réalisés sur 10 souris par groupe : donc un minimum de 70 (maximum 85) souris de laboratoire, réparties en 7 groupes de 10 mâles dont 2 groupes de 10 souris saines (sauvages) et 5 groupes de 10 souris mutantes (hémizygotes) seront utilisés jusqu’à l’âge de 2 mois. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales (2 procédures seront appliquées : la gestion de la lignée mutante qui présente un phénotype dommageable pour l’animal, l’injection du TSC en sous-cutanée répétée 5 fois par semaine avec 8 tests pour l’étude comportementale) auront lieu dans l’animalerie, dans un environnement sécurisant pour l’animal. Une démarche d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments cliniques sont évalués chez l’animal afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Choix des espèces
La souris ATP7AMoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. D’autre part, ce choix se justifie par la possibilité de faire le lien avec d’autres modèles transgéniques murins d’autres maladies métaboliques liées à des troubles du métabolisme des oligo-éléments. Nous focaliserons l’étude sur les souriceaux durant la lactation des souris mères et jusqu’au-delà du sevrage, à J56, correspondant à la fin du dernier test comportemental. En effet, durant cette période nous pourrons évaluer l’efficacité du traitement sur l’évolution de l’activité neurocomportementale des animaux en réponse au traitement médicamenteux.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 260 souris vont être utilisé·es, dont 2 960 réutilisées dans d'autres procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des cellules souches humaines après irradiation, puis des injections, gavages et prélèvements sanguins répétés jusqu'à huit fois, avec un suivi par imagerie. Il s'agit d'une plateforme produisant à la demande des souris "humanisées" pour le système immunitaire, fournies à des laboratoires pour tester vaccins et traitements. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non-humain et affirme qu'il est le "seul modèle d'hématopoïèse humaine expérimentale".
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité et/ou leur impact sur le système immunitaire humain.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) ) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) -administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie IVIS (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois)
Impact sur les animaux
Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.
Devenir
Les animaux portant un système immunitaire humain générés dans une procédure pourront être inclus d'autres procédures du même projet (par exemple pour booster certaines cellules humaines, augmenter le nombre de cellules myeloides humaines, valider l’activité d’immuno-modulateurs) ou d'autres projets à la demande des utilisateurs de la plateforme). Les autres souris utilisées pour valider l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort pour analyse des différents organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris humanisée présentant un système immunitaire humain (HIS) est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches isolées dans des souriceaux nouveau-nés de moins de 9 jours car les nouveaux nés sont plus permissifs à la greffe dans les premiers jours de vie. Le contrôle qualité par vérification du niveau d’humanisation dans le sang sera réalisé à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines. Ce nombre de semaines correspond au temps minimum nécessaire au développement du système immunitaire humain dans une souris à partir de cellules souches hématopoïétiques. Les souris HIS seront ensuite utilisées entre 12 et 25 semaines de vie. Cet intervalle d’âge correspond à la période pendant laquelle le système immunitaire humain est le plus stable chez la souris.
Effet des endozépines sur l’anxiété et l’homéostasie glucidique et énergétique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
658 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 208 en gravité sévère. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique, des instillations intranasales une à deux fois par jour pendant quinze jours, des prélèvements sanguins répétés six fois en une heure, deux tests d'anxiété et un séjour en cage métabolique. Le porteur teste un peptide coupe-faim contre l'obésité, en vérifiant d'abord qu'il ne provoque pas d'effet anxiogène, avant un "éventuel transfert en clinique humaine". Il affirme qu'aucun modèle ne peut se substituer à l'animal pour cette étude.
Objectifs
L’obésité est un problème majeur de santé publique à forte prévalence dans les pays industrialisés. Les dernières données recueillies en France montrent en effet que 32% des adultes sont en surpoids et que 15% sont obèses. En marge des traitements diététiques et d’accompagnement de première intention et des solutions instrumentales ultimes comme la chirurgie bariatrique, l’arsenal thérapeutique actuel est d’autant plus réduit que des médicaments sont retirés du marché en raison de leurs effets secondaires marqués. Il est maintenant bien établi que certains neuropeptides jouent un rôle clé dans le contrôle de la prise de nourriture. Dans ce contexte, il a été démontré que l’administration intracérébroventriculaire d’une faible dose de l’octadécaneuropeptide ODN et intranasale d’un de ses analogues entraînent une forte diminution de la prise alimentaire, sans aucune autre manifestation comportementale, et qu’ils jouent donc un rôle clé dans la régulation centrale de l’homéostasie énergétique. Notre travail s’oriente vers la validation des effets d’une instillation intranasale unique ou répétée de peptide sur le comportement alimentaire chez la souris vigile normalement alimentées ou en régime hypercalorique, avant un éventuel transfert en clinique humaine. Au préalable, nous devons vérifier que l’administration d’une faible dose de peptide chez la souris n’entraine pas d’effet anxiogène comme attendu et rapporté dans la littérature. Aucun modèle ne peut se substituer à l’utilisation d’un animal dans cette étude. Le projet est constitué de 3 procédures et les données expérimentales seront recueillies chez les animaux vigiles à différents temps post-administration et une fois euthanasiés pour une quantification de gènes cibles.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude devraient permettre l’obtention d’avancées significatives dans la recherche fondamentale et translationnelle du système endozépinergique. Tout d’abord, cette étude clarifiera le rôle joué par le récepteur de l’ODN dans les effets anorexigènes du peptide. Elle délimitera aussi la fenêtre thérapeutique en termes de dose à administrée pour s’affranchir d’un effet anxiogène indésirable éventuel et enfin, elle confirmera que la voie intranasale est particulièrement bien adaptée pour traiter nos animaux.
Procédures
Au cours du projet, certains animaux seront soumis à : -une chirurgie stéréotaxique qui constitue l’acte de chirurgie expérimentale majeur (30 min). -une instillation intranasale sous contention 1 fois ou 2 fois par jour pendant 15 jours (2 min/instillation). -une injection intrapéritonéale unique (2 min). -un prélèvement sanguin caudale (3 min) répété 6 fois en 1 heure. -deux tests d’anxiété de 5 et 10 min espacés d’une semaine. -un hébergement en cage métabolique de vie normale (21 jours).
Impact sur les animaux
A priori, nous n’attendons pas de manifestations indésirables majeures chez les animaux utilisés dans l’ensemble de cette étude. Nous porterons néanmoins une attention particulière (surveillance accrue) à la douleur des animaux canulés ou prélevés (sang), et aux stress des groupes contrôle positif du contingent engagé dans les tests d’anxiété et ceux qui perdront du poids. Les traitements n’induiront ni douleur, ni inflammation, ni changement du comportement autre ceux anticipés, considérés et maitrisés qui pourraient nuire au bien-être des animaux. Les effets mesurés chez les animaux sont transitoires et les traitements aigus suffisamment espacés (1 semaine) pour permettre une récupération totale des animaux et s’affranchir d’effets indésirables cumulatifs.
Devenir
Tous les animaux reçoivent un traitement pharmacologique aigu ou chronique et peuvent difficilement être réaffectés à d’autres protocoles. De plus, les expérimentions se déroulant dans une zone dédiée, les animaux ne peuvent pas retourner dans la zone d’élevage et être utilisés comme animaux reproducteurs. Pour l’ensemble de ces raisons tous les animaux sont euthanasiés rapidement après la fin des procédures.
Remplacement
Le projet scientifique vise à étendre la compréhension de la régulation de l’homéostasie énergétique pour envisager de nouveaux traitements contre l'obésité et le diabète. Dans la mesure où aucun modèle de substitution permettant de mener à bien ces différents objectifs physiologiques et pharmacologiques n’est actuellement disponible et devant la complexité des mécanismes mis en jeu et leur interconnexion, l’ensemble de l’étude sera réalisé in vivo chez la souris. De plus, de nombreux modèles de souris ont déjà été développés afin de mieux appréhender l’origine des dérèglements centraux de l’homéostasie énergétique et proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les études sont conduites sur des lots de 10 souris par condition de traitement. Le dispositif de cages métaboliques étant paramétré autour de 8 cages de vie normale, l’effectif sera à ce titre diminué d’autant. Ces effectifs nous assurent d’obtenir des données statistiquement comparables. Les deux tests d’anxiété sont réalisés sur les mêmes animaux à une semaine d’intervalle et après randomisation des animaux. De même, le test de tolérance au glucose est mené sur les mêmes animaux randomisés que ceux ayant subis le test de sensibilité à l’insuline, une semaine plus tard afin de garantir la normalisation de la glycémie basale. Un certain nombre de groupes expérimentaux ont été prévus mais ne seront inclus dans l’étude qu’en cas de besoin.
Raffinement
Les souris sont élevées et maintenues en cage standard conformément à la réglementation avec un enrichissement du milieu de vie constitué de nids en copeau de peuplier. Les expériences sont menées dans une pièce adjacente de la zone d’hébergement. Par ailleurs, les animaux sont surveillés pendant et après toute la durée du protocole et leur score quotidien confronté à la grille de score préalablement détaillée incluant des points limites adaptés.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré (in vivo sur animal entier) peut nous permettre de comprendre, de façon globale, la contribution du système endozépinergique dans l’homéostasie énergétique et comment il peut être instrumentalisé pour rééquilibrer les dysfonctions liées aux pathologies associées. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie (taille et coûts d’entretien réduits, bonne performances reproductives). De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques de l’altération du comportement alimentaire car elle est relativement sensible à une modification de son régime alimentaire. Afin de mener à bien nos objectifs, nous effectuerons nos expériences sur des souris adultes âgées de 6 à 10 semaines. En effet, à cet âge les souris ont terminé leur croissance longitudinale et la prise de poids est minimale après cette période.
Rôle et mécanisme d’action de la chromogranine A dans la régulation de la sécrétion de neuropeptides hypothalamiques impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
306 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 234 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections intrapéritonéales, des prélèvements sanguins caudaux répétés six à dix fois, des mises à jeun de seize heures et des tests de tolérance au glucose, à l'insuline et au pyruvate, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur étudie le rôle de la chromogranine A dans la sécrétion de neuropeptides hypothalamiques réglant la glycémie. Les retombées contre l'obésité et le diabète, présentés comme la pandémie de "diabesity", restent lointaines, et il affirme qu'une telle approche "très intégrée" n'est possible que sur "l'animal entier".
Objectifs
Les systèmes neuropeptidergiques hypothalamiques sont récemment apparus comme des liens couplant l’équilibre énergétique et l'homéostasie du glucose. Un dysfonctionnement de l'un de ces systèmes pourrait ainsi jouer un rôle majeur dans le développement de pathologies telles que l'obésité et le diabète. En effet, l'obésité est fréquemment associée au diabète de type II, et leur progression significative et synchrone depuis 30 ans fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un véritable enjeu de santé publique. Au sein de notre Unité, le système peptidergique 26RFa/GPR103 a été identifié et démontré comme étant impliqué dans le contrôle du comportement alimentaire de par son important effet orexigène. De plus l’expression du 26RFa est augmentée chez les animaux obèses, suggérant qu’il pourrait jouer un rôle dans le développement et le maintien de l'obésité. Le 26RFa possède par ailleurs un robuste effet anti-hyperglycémiant central, conséquence de sa capacité à relayer l’action centrale de l’insuline. Au sein de notre équipe, nous avons rapporté le rôle essentiel de la protéine chromogranine A (CgA) dans la formation des granules de sécrétion, organites permettant le stockage et la sécrétion des neuropeptides. De manière intéressante, les souris dont le gène exprimant la CgA a été invalidé de manière globale sont hypertendues et obèses. Par ailleurs, nous avons observé récemment que les neurones 26RFa expriment d'autres neuropeptides ainsi que la CgA. Sur la base de ces données, nous proposons dans le présent projet d’étudier le rôle de la CgA dans les mécanismes moléculaires de la sécrétion des neurones 26RFa en analysant l’impact de la modulation de l'expression de la CgA dans les neurones 26RFa sur la sécrétion du système peptidergique 26RFa, la régulation centrale de l’homéostasie du glucose et le déclenchement de l’obésité et du diabète.
Bénéfices attendus
L’administration centrale de 26RFa a permis une première évaluation de l’effet du 26RFa central dans la régulation de l’homéostasie glucidique par le cerveau. Il a notamment été observé que le 26RFa exerce un puissant effet anti-hyperglycémiant lorsqu’il est administré en intra-cérébro-ventriculaire. Néanmoins, le rôle précis des différentes sous-population de neurones à 26RFa dans la régulation de la glycémie et les mécanismes d’action mis en jeu restent inconnus. De plus, l’interaction du système neuropeptidergique 26RFa/GPR103 avec d’autres systèmes neuropeptidergiques hypothalamiques reste également à l’étude. Nos données récentes montrant la colocalisation du 26RFa et des orexines dans les mêmes neurones de l’aire hypothalamique latérale suggèrent néanmoins que ces deux systèmes pourraient être impliqués ensemble et interagir au sein de l’hypothalamus latéral, pour réguler la glycémie. Ainsi, la caractérisation des différentes populations de granules de sécrétion, en terme de contenu en neuropeptides et granines, au sein des neurones 26RFa devrait permettre une meilleure compréhension de la capacité sécrétoire de ces neurones. Ces données, associées à l'invalidation de l'expression de la CgA au sein de cette population neuronale permettront de caractériser les rôles respectifs de ces neuropeptides dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique et des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant leur action.
Procédures
Les animaux seront soumis à divers types d'expérimentations et de prélèvements soit en condition vigile, soit sous anesthésie. Les injections intra-péritonéales durent 3sec, avec procédure globale : contention+injection ip 15-20 sec. La perfusion intra-cardiaque dure moins de 7 min ; l'anesthésie induite : 5 min, renouvelée si nécessaire. Les animaux subiront des prélèvements sanguins caudaux d'un volume total de l'ordre de 40 μL par expérimentation. Les expérimentations sont répétées 6 à 10 fois avec une semaine de repos minimum entre chacune d'entre elles. - mesure de glycémie : mise à jeun de 16h, puis prélèvements sanguins caudaux (2 prélèvements de 1 sec chacun et de 2µl, toutes les 15 min, 9 fois entre T0 et T120 min). - test de tolérance au glucose : prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 200µl de glucose à T0 (2g/kg poids corporel) - tolérance à l’insuline : mise à jeun de 6h, puis prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 225µl d’insuline à T0 (0,75UI/kg poids corporel). - test de tolérance au pyruvate : mise à jeun pendant 16h, puis prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 200µl de pyruvate à T0 (2g/kg poids corporel). - test de sécrétion d’insuline : mise à jeun pendant 16h, puis prélèvements sanguins caudaux de 10-15µl à T0, T15, T30 et T60 min après injection intra-péritonéale de 200µl de glucose à T0 (2g/kg poids corporel). L'hébergement en cage de calorimétrie indirecte permettra d'évaluer les paramètres métaboliques des animaux : 7 jours d’habituation en cage mimant la cage de calorimétrie indirecte, puis séjour de 7j en cage de calorimétrie indirecte avec 96h de mesures contrôles (prise alimentaire, hydrique, consommation d’O2, production de CO2, déplacements), puis 24h en condition de jeune puis 48h en condition de renutrition.
Impact sur les animaux
Les tests physiologiques auxquels seront soumis les animaux peuvent avoir un impact léger à modéré selon les procédures. Des signes de souffrance peuvent être observés : dégradation de l'état général de l’animal avec modifications de l’apparence physique externe (plaies, mauvais aspect du pelage, poil hérissé, dos voûté), et/ou changements du comportement (prostration, léthargie, agressivité inhabituelle lors des manipulations, vocalises), perte de poids importante.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux ne peuvent être réutilisés dans de nouvelles expérimentations sans compromettre les résultats et sont mis à mort.
Remplacement
Cette étude a l’avantage d’aborder, en parallèle, l’étude neuroanatomique de la chromogranine A (CgA) et de sa fonction régulatrice du système peptidergique 26RFa. Elle permettra la compréhension du rôle de la CgA dans la sécrétion de 26RFa, plus particulièrement par les neurones hypothalamiques, et ainsi la compréhension de la régulation centrale de l'homéostasie glucidique, en condition physiologique. Une telle approche, très intégrée, n’est rendue possible que par les études in vivo.
Réduction
Compte tenu de la variabilité inter-individuelle des processus physiologiques étudiés, nous utiliserons des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, une partie des tests physiologiques prévus pour évaluer l’homéostasie glucidique sera réalisée successivement sur une même souris et chaque souris sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel. Pour les groupes dédiés au prélèvement des explants hypothalamiques ou cérébraux, les groupes de souris pourront être réduits à 10 animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux reproducteurs seront maintenus à trois par cage pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de matériel pour construire un nid + dôme en plastique rouge pour s'y réfugier). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par injection intra-péritonéale d'analgésiques, répétée après 4 heures si nécessaire.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre de façon globale, le rôle de la CgA dans la sécrétion des neuropeptides par les neurones 26RFa et la régulation hypothalamique de l’homéostasie glucidique. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coût d’entretien réduits, fortes performances reproductives. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.
Exploration de la dysfonction endothéliale et de ses complications vasculaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
5 274 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie opérée sans réveil. Sur les unes, les expérimentateurs prélèvent des vaisseaux sous anesthésie profonde, sur d'autres ils pratiquent des chirurgies de la patte avec pose de cathéter pour perfuser des composés et mesurer la réponse des vaisseaux. Le porteur signale peur, stress, hypothermie et douleur liés aux manipulations et aux actes chirurgicaux. Il reconnaît qu'aucun modèle in vitro ne remplace complètement un organisme vivant et annonce des études sur cellules humaines pour limiter le nombre d'animaux.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer l'impact de l'activité de certains récepteurs situés sur l'endothélium des vaisseaux qui pourraient être une cible thérapeutique pour la prise en charge des pathologies cardiovasculaires. Nous resoumettons le projet au regard des résultats obtenus. La mise à jour porte sur l'ajout des nouvelles lignées de souris ainsi que le besoin de réaliser de nouvelles procédures expérimentales. Ces ajouts tiennent compte de la règle des 3R. Le projet scientifique avait été antérieurement évalué positivement par l'ANR (Agence Nationale de la Recherche). Ce projet permettra de nouvelles avancées dans la compréhension des mécanismes de la dysfonction endothéliale qui contribuent au développement des anomalies de l'arbre vasculaire et en particulier de l'athérome. Il fournira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de la recherche fondamentale, ce projet permet de caractériser au niveau de l'endothélium des vaisseaux, le rôle de certains récepteurs ou cibles dans le bon fonctionnement du vaisseau (état contractile nécessaire au déplacement du sang). Il permet aussi d'évaluer la contribution de ces cibles dans les modifications observées de la paroi des vaisseaux (remodelage vasculaire) au cours des variations de débit sanguin et de pression de perfusion. Sur ce terrain, il sera aussi étudié leur contribution dans le développement des lésions d'athérome au cours d'un régime gras déséquilibré. Des travaux publiés sur des cellules endothéliales en culture, montrent que l'activation de ces récepteurs favorise la production de composés/médiateurs par la cellule jouant un rôle protecteur contre les mécanismes pro-inflammatoires et pro-athérogènes. Sur ces avancées, il est attendu d'observer une amélioration des paramètres vasculaires (amélioration de la réponse vasodilatatrice, diminution des lesions sur les parois) et métaboliques (diminution de l'inflammation, amélioration du diabète,et de la lipidémie) chez les animaux recevant des composés à l'étude capables d'activer ces récepteurs. Il est aussi attendu l'absence d'amélioration voire une aggravation de la maladie (développement de lésions d'athérome, diminution de la lumière du vaisseau par développement de la paroi) chez les animaux transgéniques invalidés pour les récepteurs ou cibles moléculaires d'intérêt. Ce projet permet aussi dans le cadre de la recherche translationnelle de pré-établir des données expérimentales de sécurité et aussi d'étude des effets potentiels dans l'organisme pour la mise au point de futurs médicaments.
Procédures
Nous avons estimé un besoin de 5274 animaux dans le projet de recherche. Afin d’étudier les propriétés vasodilatatrices de nouvelles molécules synthétisées ainsi que, leurs effets sur les cellules constitutives de la paroi du vaisseau, des vaisseaux seront prélevés sur les animaux au cours d’une anesthésie profonde induite par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée : quelques secondes). La durée du prélèvement est estimée à 10 minutes (1664 animaux sont concernés). D’autres animaux subiront des actes de chirurgie (décrits ci-dessous) sous anesthésie profonde réalisés par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée: quelques secondes). Ils recevront aussi un analgésique puissant par voie sous – cutané (une piqûre) afin de réduire la douleur en pré-ou post-opératoire. Parmi, les chirurgies, des animaux subiront une chirurgie sur la patte arrière de durée estimée à 45 minutes, afin d’étudier, par la suite, chez l’animal vigile, la réponse vasodilatatrice du vaisseau au cours de la perfusion de composés administrés par le biais du cathéter préimplanté dans la patte arrière (640 animaux). D’autres subiront un acte chirurgical au niveau du cou d’une durée estimée de 10 minutes, au cours duquel une lésion vasculaire (brûlure) sera opérée en surface du vaisseau (1408 animaux) afin d’étudier par la suite chez l’animal vigile, la cicatrisation/régénération du vaisseau. D’autres animaux subiront une chirurgie du cou afin de réaliser une ligature sur des vaisseaux du cou pour d’étudier sur ces modèles vigiles, les effets protecteurs des composés sur la paroi du vaisseau. Le temps mis pour effectuer une ligature sur des vaisseaux du cou est estimé à 15 minutes sous anesthésie profonde (1472 animaux). Enfin, un étude de pharmacocinétique sera effectuée sur les composés à l’étude afin de connaître l’évolution des concentrations circulantes dans le temps. Les composés seront administrés à l’animal vigile à la suite d’une injection dans l’abdomen (une piqûre, durée de l’administration, de quelques secondes) et le devenir ou la concentration circulante de ces composés, sera établie au cours du temps dans le sang de l’animal. Le sang sera prélevé 5 fois à la queue et la durée du prélèvement à chaque fois (ou temps) est estimée à 1minute (90 souris vigiles).
Impact sur les animaux
Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. Une nuisance de l'anesthésie est d'induire une hypothermie, une sensation de fatigue en période de réveil, une petite douleur au point d'injection. D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées au cours des actes chirurgicaux où l'expérimentateur pose à demeurre une cathéter intraveineux ou une sonde à ultrasons de mesure du débit sanguin. Les actes chirurgicaux portés sur les vaisseaux du cou (carotides) peuvent induire au réveil, une douleur locale gênant les mouvements de la tête en particulier pour la prise alimentaire. L'animal peut aussi ressentir au réveil, de la fatigue et développer une fièvre.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Bien qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant, des études in vitro sur des lignées de cellules endothéliales humaines sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter dans la mesure du possible l'utilisation des animaux à cette fin (réduire). Les animaux sont prévus dans ce projet, pour explorer dans le temps, et dans un organisme vivant, les effets biologiques des molécules administrées sur les paramètres cardiovasculaires et métaboliques. C'est pourquoi, ils ne peuvent être substitués par d'autres modèles d'étude.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : tests de tolérance au glucose, prélèvements de tissus, prélèvement de plasma pour étude des lipoprotéines (profils) prélèvement de foie ,... 2/ Une réflexion biostatique est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. Cette réflexion implique la recherche bibliographique et l'examen de travaux similaires avec le nombre d'animaux nécessaires pour démontrer une différence statistiquement significative. Elle implique aussi l'utilisation d'un logiciel de statistique pour estimer sur la base de précédents travaux effectués ou en cours de réalisation, le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérimentation à venir. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ Les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser l'expérimentation, la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire, voire supprimer la douleur, le stress et améliorer le bien-être des animaux seront mises en place : - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agréée - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux invités à coopérer dans les actes non invasifs et non douloureux (exemple: test de tolérance au glucose), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agrée pour transport d'animaux sera réquisitionné - des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pour réduire /supprimer la douleur) - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques) - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons d'utiliser la souris pour plusieurs raisons: Nous disposons d'une grande expertise de l'utilisation de cet animal (manipulation, procédures chirugicales, expérimentations spécifiques). Nous disposons aussi d'outils d'exploration des effets vasculaires des molécules étudiées appliqués aux vaisseaux de souris. Dans la littérature, les effets vasculaires de l'apoA-I sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques) ce qui constitue une base pour notre recherche. Des souris transgéniques, porteuses de mutations sur des gènes qui nous interessent, sont disponibles, et, nous permettent de réaliser le projet.Les souris sont utilisées à partir de 8 semaine de vie. A cet âge, elles pourront débuter le régime gras, ce qui est classique dans les études explorant la mise en place de l'athérome au cours du développement de l'animal. Le régime gras sera maintenu sur 30 à 40 semaines maximum. Les différentes explorations sont prévues sur des animaux âgés de 8 semaines à 50 semaines maximum.
Repenser la nutrition protéique pour la santé, le bien-être et la robustesse du poussin à croissance rapide ou lente – optimisation de l’apport protéique les premiers jours de vie
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
384 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une prise de sang au sinus occipital sur animal vigile, puis est mis à mort à cinq, dix ou vingt jours pour analyser sa composition corporelle selon le taux de protéines de son aliment. Le porteur présente le prélèvement comme rapide et sans risque s'il est réalisé par du personnel habilité. Il affirme qu'aucun test in vitro ou in silico ne représente la complexité de la digestion, l'étude portant sur l'espèce cible elle-même.
Objectifs
La nutrition du jeune poussin est délicate du fait du passage d’une alimentation d’origine maternelle à une alimentation d’origine exogène, alors qu’elle contribue de manière importante à sa robustesse en renforçant sa santé digestive. Les apports protéiques pourraient probablement être réduits dans les premiers jours de vie et l’usage de matières premières protéiques locales souvent riches en fibres pourrait être facilité en période de croissance par une alimentation néonatale adaptée. L’objectif général du projet est de proposer des stratégies nutritionnelles précoces du poussin afin de renforcer sa santé et son bien-être, et d’améliorer l’usage de sources de protéines diversifiées et locales. La première étape, qui fait l’objet de cette demande, vise à optimiser l’apport protéique pendant les premiers jours de vie. Nous chercherons dans une deuxième étape à améliorer l’équilibre en acides aminés et évaluer l’impact de la supplémentation en acides aminés fonctionnels, et dans une troisième étape à raffiner les besoins en protéines et en acides aminés en fonction de certaines caractéristiques du régime.
Bénéfices attendus
L’objectif étant d’affiner la connaissance des besoins protéiques pour ajuster et/ou équilibrer les apports sur la phase de démarrage (premiers jours de vie), l’intérêt scientifique de ce projet réside en premier lieu dans l’approche expérimentale fine d’une période du développement de l’animal qui est relativement peu étudiée. La connaissance des besoins nutritionnels du jeune a été expérimentée mais jamais, à notre connaissance, sous l’angle complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être des animaux. Au niveau opérationnel, les attendus sont de : mieux appréhender les besoins du jeune (incluant la période ≤ 7 jours) pour réduire les apports en protéines et équilibrer les acides aminés de manière à éviter l’excédent protéique pouvant fragiliser la santé digestive, et à terme, proposer des stratégies nutritionnelles précoces permettant de renforcer la santé des animaux tout en favorisant l’usage de matières premières locales protéiques sur toute la période d’élevage.
Procédures
Une prise de sang au sinus occipital sera effectuée sur animaux vigiles. Les animaux prélevés ne seront pas les mêmes à chaque date. Il n’y aura donc qu’une prise de sang par animal qui ne durera que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La technique de prélèvement de sang utilisée est rapide (quelques secondes) et approuvée depuis de nombreuses années. Elle ne présente pas de risques pour l'animal si elle est réalisée par du personnel habilité.
Devenir
Suite à la procédure de prise de sang, les animaux seront mis à mort pour des découpes anatomiques, à J5 et à J10 pour l’essai 1 et à J10 et à J20 pour l’essai 2, ceci afin de caractériser leur composition corporelle en fonction du taux protéique de leur aliment.
Remplacement
La connaissance des besoins nutritionnels du jeune poussin sera expérimentée sous l’angle original et complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être des animaux. Aucun test in vitro ou in silico n'est capable de représenter la complexité des mécanismes physiologiques de digestion et de métabolisme. Les analyses se feront directement sur l’espèce cible (poule domestique)
Réduction
Au total, 384 animaux seront prélevés (sang) sur l’ensemble des 2 essais (essai génotype à croissance rapide et génotype à croissance lente). Le nombre d’animaux expérimentaux choisi pour chacun des 2 essais est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte 1) de nos expériences précédentes en intégrant la variabilité interindividuelle attendue en termes de poids, composition corporelle, statut métabolique et robustesse tout au long de l’expérimentation (cf ci-dessous), et de 2) de la réalisation, à différents jours de la phase de démarrage, de prélèvements (sang) suivis de mise à mort pour découpe anatomique. Nous cherchons à mettre en évidence des variations possibles de la baisse du taux protéique du régime (dose-réponse avec 6 régimes) sur les performances de croissance. L’unité statistique pour les analyser sera le compartiment. Huit compartiments par groupe sont nécessaires et suffisants pour détecter des différences de consommation d’aliment et d’indice de consommation entre régimes d’après des travaux publiés en 2017 sur la baisse de protéines chez les poulets en fin de période d’élevage. Ces paramètres seront analysés statistiquement pour comparer les différents traitements, et utilisés pour modéliser la croissance des animaux. L’unité statistique pour les dosages sanguins sera l’animal. Un effectif de 16 animaux par régime et par âge au prélèvement (2 par compartiment , par régime et par âge au prélèvement), soit 192 animaux par essai, est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte de nos expériences précédentes et de la variabilité interindividuelle attendue des paramètres sanguins mesurés : utilisation des résultats d’un projet précédent et des avancées méthodologiques rapportées dans un article publié en 2021. Un test statistique permettra de comparer les groupes.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard, au sol dans des compartiments où ils resteront en groupe. La taille du compartiment est suffisante pour permettre aux poussins de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire et abreuvement. Les animaux auront à disposition plusieurs enrichissements leur permettant de grimper et de se cacher. Le suivi des performances sera fréquent avec des mesures tous les 2 ou 3 jours sur la période étudiée. Toute manifestation de symptômes persistants tels que « animal prostré » plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver, entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu à part des espaces d’hébergement.
Choix des espèces
Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les œufs embryonnés de souches à croissance rapide (essai 1) ou lente (essai 2) seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur puis les animaux sont élevés jusqu’à 10 jours (essai 1, poulets standards) ou 20 jours (essai 2, poulets à croissance lente).
Rôle des points de contrôle immunologique associés à la sénescence dans la régulation de l’infiltration et l’activation des cellules de l’immunité innée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dépourvues de poils, elles reçoivent des injections sous la peau et dans l'abdomen sous anesthésie gazeuse pour étudier comment le système immunitaire réagit aux cellules vieillissantes dites sénescentes. Le porteur qualifie les nuisances de légères, entre gêne liée à l'absence de poils, douleur d'injection et inconfort de la sédation. Il annonce que bloquer un sucre présent à la surface des cellules sénescentes pourrait relancer leur élimination par l'immunité, piste renvoyée à un stade ultérieur.
Objectifs
Ce projet fait partie d'une étude plus globale visant à comprendre comment le système immunitaire, c’est à dire l’ensemble de nos globules blancs, réagit face à des cellules âgées. Au cours du vieillissement, certaines de nos cellules rentrent dans un état dit de sénescence ou les cellules sont toujours vivantes mais incapables de se dupliquer et présentent un fort pouvoir inflammatoire. Il est proposé que ces cellules sénescentes s’accumulent avec l’âge et soient responsables de nombreuses maladies liées à l’âge et du cancer. Ce projet est basé sur une première étude démontrant un lien entre la surexpression d’un sucre particulier à la surface des cellules sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer si le blocage de ce sucre pourrait favoriser la réactivation des cellules immunitaires et donc l’élimination des cellules âgées. L’interaction et le dialogue entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiés. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surface associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âge incluant le cancer.
Bénéfices attendus
Par cette étude on s’attend à mieux comprendre comment le système immunitaire et les cellules sénescentes interagissent au cours du vieillissement. Plus largement, nous espérons mieux comprendre comment les cellules sénescentes s’accumulent dans nos tissus avec l’âge et comment elles modulent leur immunosurveillance. Notre projet pourra contribuer à terme au développement de solutions thérapeutiques contre les maladies liées à l’âge (maladie d’Alzheimer, fibrose pulmonaire, artériosclérose etc…) et le cancer et à l’augmentation de l’espérance de vie en bonne santé.
Procédures
-Anesthésie gazeuse (2 minute 30 après induction) - 2 injections sous cutanées (en une fois, bilatérale pour tous les animaux, environ 1 min 30 par souris) sous anesthésie gazeuse et simultanément 1 injection intra péritonéale (1 fois pour tous les animaux ; environ 30 sec par souris) -2 administrations par injections intra péritonéales (2 fois par animal, 1 fois à J2 et 1 dois à J4) sur animal vigile (pour tous les animaux) (environ 2 min par souris)
Impact sur les animaux
Nos souris présentent une perte de poils totale provoquant potentiellement une gêne légère et subiront des injections sous-cutanées de produit non-irritant (2 injections/animal pour l’ensemble des animaux prévus) générant une douleur légère. La sédation par anesthésique gazeux (pendant environ 1 min 30 après induction à 2%) pendant quelques minutes est également source d’un léger inconfort.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des procédures car nous devons faire des analyses sur leurs tissus et leurs cellules.
Remplacement
Nous avons déjà observé dans des études précédentes que les cellules âgées dites sénescentes qui s’accumulent avec le vieillissement présentent des capacités inflammatoires très puissantes. Ces cellules sénescentes seraient à l’origine de nombreuses maladies liées à l’âge, y compris le cancer. Ceci serait possible par une capacité à modifier l’activité des cellules immunitaires innées, c’est-à-dire nos globules blancs qui jouent un rôle essentiel dans la surveillance de nos tissus. En exprimant à leur surface un sucre ayant un potentiel immunosuppresseur, les cellules âgées sont capables de bloquer complètement la fonction de nos globules blancs appelé NK ou cellules tueuses naturelles. Cette inhibition favorise l’apparition de fibrose pulmonaire ou de cancer avec l’âge. Nous souhaitons maintenant étudier l’interaction de ces cellules avec le système immunitaire global et plus précisément comment les cellules sénescentes arrivent à recruter localement les globules blancs et les bloquer dans leur fonction. Il n’existe malheureusement pas de bon modèle in vitro pour cela, la sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Dés que les mécanismes seront identifiés, nous remplacerons les expériences chez l’animal par des expériences de co-cultures in vitro.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. Une étude statistique prévisionnelle nous permet également de prédire le nombre minimal d’animaux à inclure dans chaque groupe. Nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif (nombre d’animaux par groupe) nécessaire pour notre étude en fonction de l’estimation des effets biologiques attendus. Ainsi, nous avons pu réduire les groupes d’animaux au minimum possible tout en maintenant une puissance statistique nécessaire à la validation des résultats. Enfin, la maîtrise du protocole expérimental permet d’éviter les problèmes techniques et la perte d’animaux non désirée et donc de réduire au maximum la gêne et le nombre d’animaux nécessaires
Raffinement
Ces expériences ont été raffinées en tenant compte du bien-être animal et ainsi réduire à un niveau minimum le stress, la douleur, la souffrance, l’angoisse ou l’inconfort potentiel. Pour cela, nous utiliserons une série de mesures : -un double enrichissement (des maisons en coton et des bâtons à ronger) -séparation des cages d'expérimentation et d’élevage -suivi quotidien des animaux en expérimentation -injections sous anesthésie - analyses cellulaires sophistiquées après l’euthanasie des souris pour obtenir un maximum de résultats avec le minimum d’échantillons et d’animaux - une grille de score avec un score maximum et une liste de points limites adapté au modèle entrainant l'euthanasie immédiate. L’ensemble de ces mesures de raffinement vise à assurer le bien-être des animaux, éviter toute souffrance inutile et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter tout reproduction expérimentale inutile liée à un défaut de design expérimental.
Choix des espèces
Nous utilisons un type spécial de souris comme modèle pour notre recherche car elle partage des similitudes avec les humains et a une durée de vie relativement courte. Chez la souris, nous pouvons étudier en détail comment les tissus se réparent et comment leur physiologie change. Cela nous aide à comprendre les différentes étapes des événements biologiques. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines. Ceci correspond à des animaux matures, pleinement formés et avec un système immunitaire innée fonctionnel. Ce modèle de souris est le meilleur choix car il nous permet d'étudier tous les processus impliqués dans les maladies liées à l'âge simultanément. Nous pouvons simultanément examiner les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, la progression des maladies et l'expression d'une molécule spécifique appelée ganglioside. En utilisant ce modèle de souris, nous pouvons obtenir des informations précieuses sur les mécanismes des maladies liées à l'âge, ce qui pourrait nous aider à développer de meilleurs traitements et à améliorer la santé humaine
Etude des effets anti-tumoraux de perturbateurs du métabolisme cellulaire dans le cancer de la prostate
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des greffes de cellules cancéreuses sous la peau ou dans la prostate par chirurgie, puis des injections répétées de composés jusqu'à vingt-cinq semaines, développant tumeurs et métastases qui reproduisent la maladie humaine. Le porteur reconnaît des pertes de poids et des atteintes au point d'injection pouvant aller jusqu'à la nécrose. Il affirme avoir mené des essais in vitro sur cellules humaines et conclut à la "nécessité" de la souris pour tenir compte de toutes les interactions de l'organisme.
Objectifs
Selon le dernier rapport de l'Institut National du Cancer, le cancer de la prostate (PCa) est le cancer le plus fréquent chez l'homme et la troisième cause de décès par cancer en France. Le cancer de la prostate représente plus de 50000 nouveaux cas et 8000 morts par an en France. L'ablation de la prostate (prostatectomie) ou la radiothérapie sont les traitements des tumeurs localisées. Lorsque le cancer devient métastatique, des traitements anti-hormonaux (anti-androgènes) et/ou une chimiothérapie (Docetaxel) sont prescrits. Cependant, à très court terme (1 à 2 ans) les patients développent une résistance. Ainsi, la nécessité de trouver de nouveaux traitements est cruciale. Au laboratoire, nous travaillons sur le métabolisme des cellules cancéreuses, en effet, celle-ci ont un métabolisme différent des cellules normales. Notre stratégie est donc de cibler cette particularité est ainsi identifier des approches thérapeutiques nouvelles qui vont contrecarrer les résistances aux thérapies existantes. Grâce à l'expérimentation animale nous pouvons ainsi valider dans un modèle intégré les résultats obtenus dans des cellules en culture.
Bénéfices attendus
100% des options thérapeutiques actuelles pour le cancer de la prostate métastatique conduisent à une résistance aux traitements. Il est donc important de trouver de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail permettra de déterminer si le ciblage du métabolisme des cellules cancéreuses de prostate est une piste thérapeutique intéressante. Nous caractériserons l'action anti-tumorale et anti-métastatique de molécules qui ont un effet anti-prolifératif et diminuent l'agressivité des cellules cancéreuses in vitro. Cela apportera la preuve de concept que dans un système physiologique intégré (étude préclinique) ces molécules ont un effet anti-cancéreux.
Procédures
Nous réalisons différentes expériences qui nous permettent de tester les effets anti-tumoraux de nouveaux composés. Au total, nous réalisons 4 types d'interventions dont une procédure chirurgicale : 1) injections en sous-cutanée de cellules cancéreuses, cette intervention est réalisée une seule fois par souris et pour une procédure, elle dure 10 secondes. Cette nuisance concerne 540 souris. 2) injection intra-veineuse réalisée une seule fois par souris et pour une procédure, elle dure 10 secondes. Cette nuisance concerne 180 souris. 3) injection intra-péritonéale des agents, elle est réalisée 3 fois par semaine pour une durée allant de 6 à 25 semaines en fonction des procédures. Cette nuisance concerne 915 souris. 4) Une procédure chirurgicale ou les souris recevront une injection dans la prostate (greffe orthotopique) après une intervention chirurgicale qui dure 20 minutes. Cette nuisance concerne 185 souris. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les souris subiront des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables peuvent être la perte de poids. Les injections intrapéritonéales et dans une moindre mesure sous-cutanée pourront entraîner des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...). Il y aura également le développement de tumeurs intra-prostatique et de métastases qui reproduisent la pathologie humaine.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des procédures et des traitements, nous étudions les tumeurs générées par xenogreffe sous-cutanée, in situ (dans la prostate) ou bien aux métastases dans différents organes, il est donc nécessaire de mettre à mort l'animal, afin de prélever ces tissus pour les analyser.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, nous avons réalisé des études in vitro sur des cellules cancéreuses humaines (prolifération, capacités migratoires et invasives des cellules) et nous avons montré que nos composés d'intérêt inhibent la prolifération des cellules cancéreuses ou induisent la mort. Il est maintenant nécessaire de l’étudier sur l’animal car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de tenir compte de toute la complexité et de toutes les interactions existantes entre cellules et organes dans un organisme. La formation de métastases est un processus complexe dont l'intégralité des étapes ne peut être étudiée que sur animal vivant.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. De plus, pour satisfaire à la réduction, chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire à des études statistiques pertinentes. Concernant les souris transgéniques, nous ne maintiendrons en élevage que les souris ayant un phénotype non dommageable et nous réaliserons des croisements uniquement pour générer le nombre d'animaux requis pour l'expérience, nous ne conserverons que les mâles qui génèrent un cancer de la prostate.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des conditions stériles permettant de maintenir l’environnement adapté à des animaux immunodéprimés. Nous assurerons un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des souris. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance et ainsi rendre en charge immédiatement tout mal être.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Sa physiologie est adaptée aux expériences que nous désirons réaliser. Dans notre projet, nous utilisons des modèles animaux déjà établis et disponibles auprès de fournisseurs agréés, il n'est donc pas utile de générer de nouveaux modèles. Enfin, nous étudions des composés qui ont déjà été utilisés chez la souris, ils ne sont pas toxiques, mais on ne connait pas leurs effets dans le cancer de la prostate. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour faire des analyses protéiques, génomique et histologique. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Nous travaillons sur la prostate, nous utilisons donc que des souris mâles. Les procédures expérimentales proposées sont réduites dans leur durée au temps suffisant pour établir les effets anticancéreux potentiels des nouveaux composés testés. Nous n'utilisons que des souris mâles adultes à maturité sexuelle qui sécrètent les hormones mâles. La maturité sexuelle est obtenue entre 6-7 semaines chez la souris. Les animaux seront donc utilisés à partir de cet âge.