Oncologie

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées dans la veine de la queue pour former des tumeurs dans les poumons, suivies de traitements, avant une mise à mort à treize ou dix-sept jours pour prélever les poumons. Le porteur indique que chaque poumon porte alors de cent à deux cents foyers tumoraux, qu'il affirme sans conséquence sur la vie des animaux au vu de son expérience. L'objectif est de confirmer in vivo une observation faite in vitro sur le recrutement de globules blancs, qu'il juge non transposable sans passer par l'animal entier.

Objectifs

NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues d’autres globules blancs appelés lymphocytes, isolés de souris montrent que NLRP3 est présent dans ces cellules. En l’absence de NLRP3 ces globules blancs ont une activité anti-tumorale marquée contre différents types de tumeurs. L’absence de NLRP3 dans ces globules blancs semble impacter le recrutement de ces cellules au site tumoral. Grâce à des cellules isolées des tumeurs de souris déficientes pour NLRP3 nous avons pu observer une différence dans l’expression de certains récepteurs membranaires suspecter d’être impliqué dans le recrutement des globules blancs déficients pour NLRP3. Le récepteur appelé CXCR3 interagit avec 3 molécules ayant des effets différents. Différentes lignées tumorales sont capables de les produire. Nous avons validé in vitro la différence de recrutement. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui valider ces observations in vivo. En effet, la complexité de la réponse immunitaire anti-tumorale est telle que les résultats obtenus in vitro ne sont pas suffisants pour affirmer que les mécanismes de recrutement des globules blancs identifiés in vitro sont transposables à un organisme entier et qu’ils pourraient servir de cible thérapeutique. Pour confirmer nos hypothèses in vivo, nous utiliserons des souris contrôles ou déficientes pour NLRP3 comme donneurs de globules blancs. Ces globules blancs seront injectés à des souris ayant de tumeurs au niveau pulmonaire. Ainsi, nous pourrons comparer le recrutement des globules blancs contrôles ou déficients pour NLRP3 dans des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - apporter des connaissances nouvelles concernant NLRP3. - évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie

Procédures

Les injections de cellules seront réalisées en intra veineux sur souris anesthésiées par isoflurane (2 par souris, chaque injection dure quelques secondes). Les traitements par chimiothérapies seront réalisés en intra péritonéal sur souris vigiles (4 par souris, chaque injection dure quelques secondes). La mise à mort sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront induites dans les poumons suite à une injection intra veineuse dans la veine caudale. Cet acte peut engendrer du stress chez l’animal car il doit être maintenu dans un système de contention. L’injection induit une douleur de faible intensité au site de l’injection. Les foyers tumoraux au niveau des poumons permettent d’obtenir des résultats plus clairs et de meilleure qualité. Les animaux seront mis à mort à J13 ou J17 post-injection des cellules tumorales. A ce stade, il y a entre 100 et 200 foyers tumoraux sur les poumons (d’environ 1mm de diamètre) et cela n’impacte pas la vie des animaux (nous avons plus de 10 ans d’expérience sur ces modèles).

Devenir

Les 260 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les poumons

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et des phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires.

Réduction

Dans un souci de réduction et étant donné que nous voulons confirmer des résultats obtenus in vitro, les expériences ne seront réalisées que 2 fois avec 5 souris par groupes et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience sera accompagnée d’une analyse complète de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences (1 lobe pour l’analyse de l’infiltrat et 1 lobe pour les marquages). Enfin, un « go-no go » est appliqué à la fin de chaque phase du projet. En d’autre terme si les résultats de la phase n ne confirment pas l’hypothèse, la phase n+1 ne sera pas réalisée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un cytomégalovirus, reçoivent jusqu'à six injections et deux irradiations aux rayons X, avant prélèvement des organes. Le porteur indique que les effets de l'irradiation, stress, douleur et baisse d'alimentation, ne pourront pas être atténués par un analgésique, celui-ci modifiant les réponses immunitaires étudiées. Il décrit une grille de score de la douleur menant à l'euthanasie au-delà d'un seuil et présente la souris comme le "modèle de référence en immunologie".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier les mécanismes contrôlant la génération et le renouvellement de cellules du système immunitaire au cours d’une infection virale : les cellules innées lymphoïdes de type 1 (ILC1). Les ILC1 jouent un rôle important dans le contrôle précoce d’une infection virale et du développement tumoral. Cette efficacité repose sur le développement de fonctions effectrices adéquates, mais également sur le maintien, l’expansion, et le renouvellement du nombre de cellules effectrices disponibles. Notre laboratoire étudie le développement des cellules du système immunitaire à l’état basal, notamment des ILC1, dans le but d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de moduler l’activité de ces populations cellulaires. Nous souhaitons maintenant étudier les mécanismes contrôlant la taille de la population d’ILC1 en conditions pathologiques. Pour mener cette étude nous utiliserons le modèle classique et couramment utilisé d’infection par le cytomégalovirus murin (MCMV), bien caractérisé sur le plan physiopathologique.

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans le cadre de ce projet vont générer des retombées importantes dans plusieurs domaines. En termes de recherche fondamentale, elles vont permettre d’approfondir nos connaissances sur le développement de ce lignage cellulaire. Elles vont également nous fournir de précieux éléments nécessaires à la compréhension de la réponse immunitaire. En termes de recherche appliquée, ce projet s’inscrit dans le cadre de travaux visant à identifier de nouvelles cibles (cellulaires et/ou moléculaires) dont l’activité pourrait être manipulée à des fins thérapeutiques, tels que le développement de vaccins ou de traitements anticancéreux.

Procédures

Selon la procédure expérimentale, les animaux pourront recevoir une injection intraveineuse, plusieurs injections intra-péritonéales (jusqu'à 6 dans le cas d'un traitement au tamoxifène et d'une infection), être soumises à un prélévment de sang, et à 2 irradiations aux rayons X de 3.5 Gy chacune. Les injections et prélèvements intraveineux sont réalisés sous anesthésie générale. Le temps total de manipulation d’une souris ne dépasse pas 5 minutes. 80 animaux auront 1 injection intraveineuse et 1 prélèvement de sang. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animaux vigiles. Le temps de manipulation d’une souris ne dépasse pas 1 minute. La totalité des animaux (280) recevront entre 1 et 6 injections. Le temps de manipulation nécessaire à une irradiation au rayon X (comprenant l’irradiation elle-même) ne dépasse quelques dizaines de minutes. Les 2 irradiations sont espacées de 6h. 80 animaux suivront ce traitement.

Impact sur les animaux

Stress lié à la manipulation. Douleurs ponctuelles liées aux injections. Stress, douleur et altération de l’alimentation suite à une irradiation (< 2 semaines). Ces effets ne pourront être atténués par un traitement analgésique. Les analgésiques modifient les réponses immunitaires antivirales et peuvent influer sur l’histoire naturelle de la maladie, donc sur la finalité expérimentale. Il est important de noter ici que bien que certaines procédures incluent l’utilisation de produits référencés comme toxiques (tamoxifène et toxine diphtérique (DT)), ou des infections virales (MCMV), mais leur utilisation et/ou mise en œuvre n’ont pas de conséquences attendues sur le bien-être animal dans les conditions utilisées dans ce projet.

Devenir

Toutes les procédures utilisées dans ce projet aboutissent à des prélèvements d'organes, et par conséquent à la mise à mort de la totalité des animaux

Remplacement

La multiplicité des populations cellulaires impliquées, le rôle de multiples tissus et structures tissulaires, ainsi que la complexité des interactions cellulaires et moléculaires dans le temps et l’espace, ne permettent pas le recours à des modèles in vitro pour l’étude du développement de la réponse immunitaire. Le recours à un modèle animal est donc essentiel à la réalisation de notre projet de recherche.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux requis pour ce projet : i) une étude préalable de la littérature a été réalisée pour éviter le recours à des expériences de mise au point, ii) nous utilisons des modèles de souris congéniques réduisant considérablement la variabilité inter-individus. L'utilisation de modèles statistiques applicables à des petits échantillons nous permettra d'évaluer la significativité et la robustesse des résultats sur des groupes d’animaux restreints et un faible nombre de répétitions, iii) nous utiliserons des techniques d’analyses à haut et très haut débits afin de maximiser l’acquisition de données pour chaque expérience.

Raffinement

Les souris seront élevées dans des animaleries conventionnelles et de niveau 3, exemptes d'organismes pathogènes spécifiques (EOPS). Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles (jusqu’à 5 animaux/cage), et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant leur entrée dans les procédures. Ils disposeront d’un environnement enrichi incluant du matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Les doses infectieuses utilisées seront des doses non-létales n’entraînant pas de signes de souffrance chez des souris de type sauvage (contrôles). Toutefois, certains animaux génétiquement modifiés sont plus sensibles aux infections. Pour les procédures où ces animaux seront utilisés, l’accès à la nourriture et à l’eau sera favorisé en positionnant de la nourriture humidifiée au fond de la cage. Il ne sera pas possible de remédier à leur souffrance dans la mesure où les analgésiques modifient également les réponses immunitaires étudiées, et donc, influent sur l’histoire naturelle de la maladie et sur la finalité expérimentale. Cependant, dans toutes les procédures décrites, une grille d’évaluation de la douleur sera appliquée (ci dessous) pour détecter, quantifier et suivre tout signe de souffrance, stress et anxiété relatifs à l’expérimentation en cours. Tout animal dépassant un niveau modéré sera immédiatement euthanasié. Perte de poids : 0 à 10% = +1, 10 à 20% = +2, >20% = +11. Apparence physique : normale = 0, absence de toilettage, signes de barbering et perte de poils = +1, pelage hirsute, lésions de peau minimes peu évolutives, écoulement oculo-nasal = +2, pelage très ébouriffé, lésions de peau évolutives, dos rond, yeux mi-clos = +3. Modification du comportement non provoqué (à distance) : normal = 0, changement mineurs, boiterie, hyperactivité = +1, mobilité réduite, isolement, léthargie = +2, automutilation, prostration, tremblements = +3. Modification du comportement après stimulation (à la manipulation) : normal = 0, prostration transitoire = +1, tremblements ou convulsions intermittents = +2, tremblements ou convulsions persistants = +3. Masses : aucune = 0, petite, non évolutive, sans gêne associée = +1, grosse, modérément ulcérée = +2, nombreuses, évolutives, largement ulcérée, gêne la marche ou l'alimentation = +3. Score total 10 : euthanasie

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence en immunologie. Le choix de ce modèle repose sur la proximité de son système immunitaire avec celui de l’homme, les conditions d’élevage peu coûteuses, un temps de génération court, ainsi qu’un nombre important d’individus par portée. La facilité et la rapidité de génération de souches mutantes, la très large disponibilité de souches mutantes préexistantes, le très grand nombre d’outils et de techniques d’analyses dédiées permettent également de limiter le nombre d’animaux nécessaire à un projet. Notre projet utilisera des souris adultes âgées de 6 à 15 semaines ayant un système immunitaire mature. Pour réaliser des chimères hématopoïétiques à l’aide de cellules souches de foie fœtal nous utiliserons des fœtus dans le dernier tiers de gestation, au stade embryonnaire 18.5 (e18.5). A ce stade, le foie contient des cellules souches spécifiques n’étant pas retrouvées chez des souris adultes.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de mélanome humain leur sont greffées sous anesthésie, chaque souris recevant une greffe sur les deux flancs, puis la tumeur est mesurée deux fois par semaine jusqu'à la mise à mort et le prélèvement. Le porteur reconnaît que les souris développeront une pathologie tumorale potentiellement grave, mais qualifie le suivi de non invasif. Il présente le passage à l'animal comme une "étape indispensable" après des travaux in vitro, seul un organisme entier permettant selon lui de conclure sur la fonction des gènes étudiés.

Objectifs

Le mélanome est le cancer de la peau le moins fréquent mais le plus agressif qui ne cesse d’augmenter depuis ces dernières années. Il est dû à une transformation et à une croissance anormale des cellules de la peau. Malgré l’apparition de nouveaux traitements augmentant de façon significative la survie chez certains patients, en particulier les thérapies ciblées et les immunothérapies, ces cancers demeurent un défi majeur pour la recherche du fait de l’apparition de résistances suite à ces traitements. C’est pour cela qu’un retour aux questions fondamentales concernant la compréhension du développement de la maladie est nécessaire en vue d’envisager d’autres angles d’attaque thérapeutiques. Nos études préalables in vitro sur des modèles simplifiés de cellules en culture montrent que la protéine, que nous étudions dans notre laboratoire, a un rôle de suppresseur de tumeur dans les mélanocytes et que son expression empêche ainsi la transformation tumorale. De plus, nous avons identifié l’interacteur principal de cette protéine, qui est nécessaire à sa fonction suppresseur de tumeur. Cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que la formation d’une tumeur. L’objectif de notre projet est donc de valider l’implication de ces protéines au niveau de la transformation tumorale dans le contexte d’un organisme entier, avec toute la complexité inhérente des interactions cellulaires et moléculaires des organismes. De façon plus globale, cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les processus cellulaires mis en place dans le mélanome. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale.

Bénéfices attendus

La transformation cellulaire est un phénomène complexe. Elle fait appel à des processus cellulaires autonomes et non cellulaires autonomes, c’est-à-dire qui impliquent des interactions avec l’environnement cellulaire proche et distal, ainsi que des interactions complexes avec les cellules immunitaires. Dans ces conditions, seules des expériences réalisées dans un organisme auront une relevance pour conclure sur la fonction in vivo des gènes/protéines étudiées. De façon plus globale, cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les processus cellulaires mis en place dans le mélanome.

Procédures

Une transplantation de cellules cancéreuses nécessitant une anesthésie (15 minutes/souris) sera réalisée une fois au début de l’expérimentation. Les mesures du volume de la tumeur et les pesées (5 minutes/souris) seront effectuées 2 fois par semaine pour suivre l’évolution de la maladie sans geste invasif. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien pour estimer au mieux leur état physiologique global. Ce suivi prendra maximum 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Les souris transplantées avec des cellules cancéreuses développeront une pathologie tumorale potentiellement grave. L'anesthésie constituera une nuisance sur les animaux. L'ensemble des manipulations, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.

Devenir

Tous les animaux à l'issue de la procédure seront euthanasiés. Après la mise à mort des souris, les tumeurs seront prélevées et pesées. Une partie sera analysée pour mieux cerner les acteurs impliqués dans la tumeur grâce à des expériences de biologie moléculaire et de biochimie et une autre partie sera mise en présence d’un fixateur pour faire des coupes dans le tissu tumoral et réaliser des analyses immuno-histochimiques : différents marquages pour étudier la prolifération, la mort cellulaire et la différenciation mélanocytaire.

Remplacement

Notre projet se fera dans la continuité des études que nous avons réalisées in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable pour reproduire d’un point de vue phénoménologique tout ce qu’implique le développement tumoral. Seules des expériences réalisées dans un organisme auront une relevance pour conclure sur la fonction in vivo des gènes/protéines étudiées. Nous choisirons des modèles chez la souris, simples et exhaustivement décrits dans la littérature.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux génétiquement modifiés issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés. Le sexe sera choisi en fonction du nombre d'animaux nécessaires et disponibles par cohorte. De plus, lorsque cela est possible, la mutualisation de groupes contrôles sera réalisé. Pour minimiser le nombre d’animaux et pour diminuer la variabilité inter-individu, chaque souris subira une transplantation bilatérale (sur chacun des flancs) de cellules tumorales, le nombre d’animaux étant limité au minimum nécessaire pour permettre de fournir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). De plus, ils seront hébergés en confinement adapté à la stabulation de lignées murines immunodéprimées (cages individuellement ventilées). La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et coton pour nidification), et maintien des animaux en groupes de 3-5 afin de respecter leur instinct grégaire. De même, les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. Les greffes de cellules seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Le suivi du développement tumoral se fera au cours du temps de manière non invasive à l’aide d’un pied à coulisse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Dès l’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance, nous choisirons l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d’un individu d’une espèce donnée chez un individu hôte d’une espèce différente. Ainsi, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise de greffe de cellules tumorales humaines et éviter la réaction de l’hôte vis-à-vis du greffon. Dans ce contexte, les lignées de souris immunodéprimées sont les modèles les plus couramment utilisés et très bien documentés dans la littérature dans le cadre d’études réalisées à partir de xénogreffes de cellules tumorales humaines. . Concernant les stades de développement, nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules tumorales, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie du cerveau sous anesthésie pour y injecter des virus, d'autres un jeûne de 24 heures, des injections répétées et un régime gras destiné à les rendre obèses, afin d'étudier le rôle d'une protéine dans la prise alimentaire. Le porteur décrit la découverte récente d'un gène jusque-là inconnu et renvoie les applications contre l'obésité et le diabète à un horizon lointain. Il affirme avoir déjà validé son approche in vitro mais conclut au "besoin" de la souris, seule à réunir les organes en jeu dans la régulation énergétique.

Objectifs

Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel autour d'une constante. Une dérégulation du système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont fortement associées comme le diabète. Nous avons récemment mis en évidence une fonction inattendue d’une protéine dans la régulation de l’appétit. Nos données mettent en évidence le rôle d’un variant génétique associé au diabète de type 2. Toutefois le mécanisme moléculaire sous-jacent à cette découverte reste incomplet. Nous avons récemment identifié un nouveau gène jusqu’alors inconnu qui pourrait contribuer à la régulation de l’appétit chez la souris. Nos données préliminaires confirment que cette nouvelle cible pourrait représenter un nouveau mécanisme favorisant l'obésité. Par conséquent, ce projet vise à comprendre comment cette protéine est impliquée dans l’homéostasie énergétique.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'une nouvelle protéine clé dans la régulation neuronale de la prise alimentaire et du comportement alimentaire. Cette étude est pertinente et innovante pour plusieurs raisons. Nous avons déjà montré le rôle spécifique de cette voie de signalisation dans le contrôle de la prise alimentaire, une fonction qui n'avait jamais été mise en avant jusqu’à présent. Comme le contrôle de la prise alimentaire est très complexe, les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage le mécanisme moléculaire impliqué dans la prise alimentaire et le gain de poids. Cette étude nous permettra de déterminer si cette protéine jusqu'alors inconnue est une nouvelle cible thérapeutique dans l’obésité.

Procédures

320 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Les 320 animaux (+160 pas de stéréotaxie) seront soumis à des tests métaboliques (1 test par semaine - 2 tests prévus). Pour chaque test ils subiront 4 injections IP (1inj/jour pendant 4 jours - durée 10 sec/inj). 240 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids.

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou shRNA. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post- chirurgicale. Différents tests métaboliques sont décrits dans ce projet: Le premier est un test de sensibilité à la ghréline (hormone de la faim). Une habituation des animaux sera nécessaire. Pour ce faire, une injection IP de NaCl 0.9% sera réalisée quotidiennement pendant 3 jours. Le jour du test les animaux subiront une injection IP de ghréline qui stimulera leur appétit. Le deuxième est un test de réalimentation après un jeûne de 24H. L'effet de la mise à jeun sera la stimulation de leur appétit et une perte de poids passagère. Une diète riche en gras pour créer un environnement obésogène sera mis en place chez les souris, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

Toutes les validations experimentales in vitro ont été réalisées. Nous avons ainsi apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Pour tester nos hypothèses, nous avons besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 480 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les chirurgies stéréotaxiques potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formée spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

Pour l'étude du métabolisme, la souris est un modèle animal déjà validé. D’autre part, l’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées. Les chirurgies stéréotaxiques pour l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux âgés de 18 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées avec de la moelle osseuse, reçoivent des cellules tumorales ou un agent favorisant les tumeurs suivi d'un irritant de l'intestin dans l'eau de boisson, la croissance des tumeurs étant mesurée jusqu'à la fin. L'objet est de comprendre l'épuisement des défenses immunitaires face au cancer, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques restant au conditionnel. Le porteur affirme que le microenvironnement tumoral ne peut être reproduit in vitro, ce qui l'oblige à recourir aux souris.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires (aussi appelé exhaustion). Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’une exhaustion des globules blancs au cours du vieillissement. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer le rôle de ces protéines sur l'exhaustion des réponses immunitaires dans le cadre du cancer.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de préciser le rôle de ces protéines inflammatoires sur les acteurs de la réponses anti-tumorale, notamment sur leur fonction. In fine, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.

Procédures

Irradiation (4 minutes par souris), une injection intraveineuse rétro-orbitaire de cellules de moelle osseuse sous anesthésie générale (15 sec/souris). Pour certaines souris, une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par échographie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).

Impact sur les animaux

L'irradiation peut occasionner une souffrance en cas de mauvaise reconstitution des cellules de la moelle osseuse. L'injection intraveineuse, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever les organes et la tumeur pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale au niveau du tube digestif en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux. Chaque animal chimère permet d'analyser les cellules de deux génotypes différents au sein d'un même animal.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Tous les gestes invasifs réalisés sur les animaux seront faits sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet (pesée et surveillance deux fois par semaine après l'irradiation, mesure de la croissance tumorale trois fois par semaine après l'injection de cellules tumorales, suivi régulier par échographie pour certains animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certaines voies de signalisation dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.

Procédures

Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

200 poules pondeuses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 80 d'entre elles tuées pour l'étude de leur cerveau et 120 replacées ensuite. Elles sont exposées un mois à une lumière faible et à un remaniement de groupe, le picage étudié pouvant occasionner des blessures entre individus. L'objet est de repérer des traits de comportement liés au picage pour fournir aux éleveurs une grille d'identification des poules prédisposées. Le porteur situe ce travail face à l'épointage du bec, pratique qu'il décrit lui-même comme douloureuse et "de plus en plus controversée", et affirme qu'aucun système alternatif ne permet d'étudier le comportement.

Objectifs

Les poules sont des animaux pour qui l’exploration de l’environnement, à la fois physique et social, consiste en une de leurs activités journalières principales. A l’aide de leur bec, en picorant, les poules peuvent mieux connaître leur environnement et interagir avec leurs congénères. Toutefois, si ce picorage devient répétitif et est fréquemment dirigé vers les plumes ou la peau d’autres individus, ce comportement, alors nommé "picage", peut devenir un problème majeur de bien-être animal et, dans des cas extrêmes, entrainer l’apparition de cannibalisme et une augmentation de la mortalité en élevage. Afin de limiter les dégâts causés par le picage, différentes pratiques et stratégies ont été adoptées et testées en élevage au cours des dernières années. Actuellement, la pratique la plus courante contre ce comportement délétère est l’épointage du bec, une pratique douloureuse, de plus en plus controversée. Les autres stratégies consitent en l’ajout d’enrichissments, de changements de lumière ou nutritionnels qui interviennent tous une fois le picage sévère installé. Malheureusement, au mieux, ces stratégies ne font que limiter modérément les conséquences néfastes du picage, lorsque celui-ci est largement répandu. Le présent projet vise à adopter une nouvelle stratégie, basée sur des études récentes, qui indiquent que le picage serait un trait de comportement stable provenant de quelques individus. Ensuite, il se répandrait au sein des élevages par mimméstisme. L’objectif de ce projet est donc de mieux caractériser ce trait de comportement, pour, à terme, être capable de mieux le prédire voire l’anticiper.

Bénéfices attendus

Identifier des traits de comportement qui sont liés au picage chez la poule domestique. Cette étude s’inscrit dans un projet, permettant l’établissement d’une grille de comportements à destination des éleveurs, pour leur permettre un suivi plus précis en élevage en identifiant des animaux ayant une forte prédisposition à exprimer le picage.

Procédures

Les animaux âgés de 10 mois seront exposés à une intensité lumineuse de 20 lux pendant un mois associée (ou non) à un réallotement.

Impact sur les animaux

Le picage peut engendrer des blessures chez l’animal piqué.

Devenir

20 poules piqueuses et non piqueuses de chaque lignée recevront une dose létale d’un euthanasiant pour des études neurobiologiques (comparaison du cerveau de poules piqueuses vs. non piqueuses), soit 80 au total. Les 120 poules restantes seront replacées.

Remplacement

Les études de comportement ne sont pas réalisables in vitro, ni par modélisation. Les comportements étudiés dans ce projet, comme tout comportement, ne s'expriment et ne peuvent se mesurer que sur animal vigile. Il n'existe pas de système alternatif à ces études.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit à son strict minimum tout en permettant d'observer des liens significatifs entre les comportements observés sur la base de nos expériences précédentes sur la personnalité chez cette espèce.

Raffinement

Nous avons fait le choix d’élever les animaux dans des parquets de 10 individus plutôt qu’en grand groupe. Ce choix facilite le suivi du comportement de chaque animal. Il fournit aussi un environnement d’élevage enrichi et confortable (groupe de petite taille et stable, présence de perchoirs, copeaux au sol, nombre importants de nids par poule). De fait il assure aussi un suivi facilité de l’état de santé des animaux (petit groupe d’individus par parquet). Chaque parquet dispose en plus d’une « infirmerie » permettant d’isoler de façon temporaire (avec eau et nourriture) un animal qui le nécessiterait. En cas de perte de poids supérieure à 15%, de prostration ou d’apathie, le responsable du bien-être animal sera informé directement afin de traiter l'animal (retrait dans l’infirmerie, analgésiques et/ou antiseptiques en cas de plaie, ajout de nourriture appétente). Si le traitement ne fonctionne pas, l'euthanasie de l’animal sera réalisée par électronarcose suivie d’une saignée pour confirmer la mort. Pour les observations comportementales les animaux seront habitués au préalable à l’expérimentateur pour éviter que sa présence ne perturbe leur comportement.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’étudier deux lignées de poules qui sont deux lignées génétiques très répandues en élevage de poules pondeuses. Les animaux seront élevés depuis leur éclosion jusqu’à l’âge de 10-12 mois (âge adulte) soit quelques semaines après le pic de ponte. Cette durée permet de réaliser un suivi longitudinal du comportement, indispensable pour l’établissement du répertoire comportemental des animaux.