Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Évaluation de la biodisponibilité relative orale des phtalates, pyréthrénoïdes et d’organophosphates retardateurs de flamme contaminants les poussières intérieures chez l’Homme estimé via le modèle porcelets
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
114 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces jeunes mâles castrés sont isolés puis exposés pendant sept jours à des poussières contaminées par des phtalates et d'autres perturbateurs endocriniens, avant le prélèvement de leurs organes. Le projet vise à valider un test in vitro censé, à terme, remplacer ce type d'expérience, étape que le porteur qualifie lui-même d'"indispensable". Le choix du porcelet est justifié par une physiologie digestive proche de celle de l'enfant, cible réelle de l'évaluation du risque.
Objectifs
Le but de ce projet est de valider in vivo l’intérêt d’une méthode alternative à l’utilisation d’animaux : utiliser un test in vitro pour prédire la biodisponibilité relative de plastifiants, insecticides et retardateurs de flamme contaminants les poussières intérieures. Cette étape de validation in vivo est indispensable pour intégrer le test in vitro dans les futures démarches d’évaluations d'exposition sur environnement intérieurs pollués par ces perturbateurs endocriniens (poussières représentatives d’environnements intérieurs contaminés en France)
Bénéfices attendus
Cette expérimentation permettra de vérifier la corrélation d’un test in vitro susceptible de remplacer ce type d’expérimentation pour les polluants étudiés. Il permettra ainsi à terme de rendre plus éthique les l’évaluation quantitative de risque sanitaire, et de réduire manière significative le coût de ces dernières, tout en aidant les gestionnaires à hiérarchiser les environnements les plus à risques concernant l’exposition de l’enfant.
Procédures
Les animaux subiront une claustration individuelle temporaire (quotidienne, même en acclimatation
Impact sur les animaux
Le comportement social des animaux sera affecté légèrement par cette procédure. Peu de douleur, de stress et d'angoisse devraient survenir durant cette expérimentation. Les animaux seront toutefois surveillés quotidiennement et un point limite basé sur la perte de poids entre deux pesée a été fixé.
Devenir
Du fait des prélèvements envisagés (prélèvement d'organes comme des muscles, le foie en plus du sang et des urines) et de leur importance pour l'animal la mise à mort est rendue nécessaire
Remplacement
La stratégie de l'expérience consiste à comparer et à corréler les données prédites par un test in vitro avec les données de biodisponibilité in vivo afin de remplacer à terme les essais sur animaux sur cette problématique. Il ne peut y avoir de remplacement à l'heure actuelle pour ces perturbateurs endocriniens objet de la présente étude.
Réduction
Un calcul de puissance a été réalisé en vue de définir le nombre nécessaire et suffisant d'animaux en amont de l'étude. Une étude de la linéarité entre la dose d'exposition et les concentrations retrouvées dans les organes des porcelets sera réalisée en 1° étape ce qui permettra de limiter le nombre d'animaux de la 2° étape. Au total, 114 porcelets seront utilisés dans ce projet.
Raffinement
L'hébergement sera réalisé en groupes sociaux de 3 porcelets par box pourvu d'enrichissement avec cordes de chanvre. Lors de l'application de la procédure de mise en cage individuelle, l’isolement limité à 4 h maximum excepté de 12h pour la collecte d’urine dans les cages et des enrichissements supplémentaires (cordes de chanvre, ballons ) seront rajoutés pour chaque individu. Un respect strict des points limites sera réalisé afin de limiter toute nuisance et assurer le bien-être des animaux durant la durée du projet.
Choix des espèces
Les porcelets ont une physiologie digestive proche de celle des humains, en particulier de l’enfant (6 mois à 3 ans), ce qui permettra d'étudier la biodisponibilité relative de ces perturbateurs endocriniens en adéquation avec le sujet de l’évaluation de risque (l’enfant). En outre, les porcs consomment régulièrement de grandes quantités de sol dans leur environnement naturel, ce qui facilite l'ingestion de poussières par voie alimentaire. Nous avons choisi des porcelets mâles castrés pour permettre de mieux comparer cette étude à celle précédemment réalisée. Les porcelets auront 30 à 40 jours d’âge et seront sevrés. Ces conditions sont en adéquations avec la précédente étude menée sur d'autres polluants organiques. Les porcelets ont une physiologie digestive proche de celle des humains, en particulier de l’enfant (6 mois à 3 ans), ce qui permettra d'étudier la biodisponibilité des contaminants.
Régulation de la traduction d’ARNm spécifiques par la voie des MAP kinases et leur implication dans les interactions réciproques entre cellules tumorales et immunitaires du microenvironnement tumoral
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est irradiée puis reçoit une greffe de moelle osseuse, toutes reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau et, pour certaines, des chimiothérapies ou immunothérapies pendant plusieurs mois, la tumeur pouvant se nécroser et s'ulcérer. Le projet étudie comment la cellule cancéreuse échappe au système immunitaire, la pertinence clinique d'inhibiteurs étant annoncée comme un espoir. Le porteur affirme que les études in vitro ne reproduisent pas les voies d'un modèle intégré et que le remplacement n'est "pas applicable".
Objectifs
La cellule tumorale a besoin de s'adapter rapidement à un environnement dynamique, parfois hostile, afin de continuer à se multiplier et à survivre. Notre système immunitaire est initialement capable de reconnaître une cellule cancéreuse et de l’éliminer. Toutefois la cellule cancéreuse est capable de s’adapter et de devenir invisible afin de ne pas être éliminée par ce système de défense. Un des mécanismes impliqués dans l’adaptation rapide de la cellule cancéreuse, permet la production de protéines spécifiques qui rendront la cellule cancéreuse invisible au système immunitaire. Une des nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du cancer consiste à utiliser des molécules qui inhibent la production des protéines. Etudier ce mécanisme d’adaptation de la cellule cancéreuse qui empêche le système immunitaire d’être efficace et définir l’impact des inhibiteurs de ce mécanisme sur le développement de la tumeur et les propriétés des cellules cancéreuses et immunitaires sont les objectifs principaux de ce projet.
Bénéfices attendus
La dynamique d’interaction entre les cellules cancéreuses et immunitaires font intervenir des mécanismes d’adaptation rapide qui impliquent la production de protéines spécifiques. Analyser cette dynamique au niveau de la production des protéines est particulièrement innovant et important car il existe des études pré-cliniques montrant l'intérêt d'utiliser des inhibiteurs de la production des protéines dans le traitement de certains cancers. Alors que nous comprenons de mieux en mieux comment ces inhibiteurs affectent la cellule tumorale, peu d’études portent sur les effets de ces inhibiteurs dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Enfin, la pertinence clinique de l'utilisation de ces inhibiteurs sera évaluée au regard des thérapies conventionnelles, d’autres thérapies ciblées et immunothérapies utilisées en clinique, en espérant définir de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Certaines souris seront irradiées. Dans les 24 heures suivant l'irradiation, les souris seront anesthésiées puis recevront de la moelle osseuse par voie intraveineuse (injection dans la veine retro-orbitale). 6 semaines après l’irradiation, ces souris seront anesthésiées afin de réaliser un prélèvement de sang et d’analyser la reconstitution de la moëlle osseuse. Toutes les souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales et les tumeurs seront mesurées au minimum 3 fois par semaines pendant 3 à 22 semaines en fonction du modèle de tumeur. Certaines souris recevront un traitement (Chimiothérapie conventionnelle, thérapie ciblée, immunothérapie) dès que le volume tumoral atteint 50 mm3. Ce traitement sera administrés per os ou par voie intrapéritonéale. La fréquence des traitements dépend de leur nature et s’étend de 5 fois par semaine à tous les 21 jours et ce pendant 21 à 154 jours selon le modèle de tumeurs.
Impact sur les animaux
Le modèle syngénique de tumeurs sous-cutanées chez la souris qui consiste à injecter des cellules tumorales murines de même fond génétique que les souris réceptrices immunocompétentes, est communément utilisé pour l’évaluation de l’efficacité d’une thérapie dans de nombreux types de cancers. Au cours du développement de la tumeur sous-cutanée, aucune nuisance ni effet indésirable n’est observé chez la souris. Si toutefois les tumeurs grossissent très rapidement, il peut arriver qu’elles se nécrosent au centre et commencent à s’ulcérer ou à saigner. Dans ce cas, c’est un point limite et les souris seront sacrifiées. Aussi, la santé des souris et l’aspect des tumeurs seront surveillés 3 fois par semaine après injection des cellules tumorales puis tous les jours lorsque l’on se rapproche de la taille tumorale maximale. La chimiothérapie conventionnelle est bien tolérée chez la souris, les effets secondaires sont faibles et les plus fréquents sont des diarrhées. Les effets indésirables les plus fréquents associés à l’immunothérapie sont d’ordre cutanés (rash, prurit dans 15 à 25% des cas) ou gastro-intestinaux (diarrhées dans 15 à 30% des cas), dans les deux cas ces atteintes sont bénignes et réversibles dès l’arrêt du traitement. Ces effets indésirables sont les mêmes dans le cas de traitements avec des inhibiteurs de la voie des MAPK. Une photosensibilité cutanée est également souvent observée dans le cas de traitements avec certains inhibiteurs de cette voie de signalisation. Aucun effet indésirable n’a été reporté dans le cas de traitements des tumeurs chez la souris avec des inhibiteurs de la traduction. Il est important de noter que les effets indésirables observés en monothérapie sont les mêmes que ceux observés en thérapie combinée.
Devenir
18 lots de souris (soit 432 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 90 lots de souris (soit 2160 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 6 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 144 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 30 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 720 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.
Remplacement
Ce projet fait suite à des nombreuses expériences réalisées in vitro dans des modèles cellulaires. Malheureusement le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiopathologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine et l’évaluation de l’efficacité des traitements pour cette pathologie.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Les résultats préliminaires ont permis de valider que des lots de 8-10 souris selon les paramètres à évaluer permettent d’acquérir des données fiables.
Raffinement
Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine dès l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, que nous aurons définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.
Choix des espèces
Nous disposons de souris knockout (KO) présentant des altérations de la voie des MAPK. Ces souris immunocompétentes seront utilisées pour générer des modèles syngéniques de tumeurs sous-cutanées. Ces modèles sont communément utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement tumoral et pour évaluer l’efficacité des thérapies anti-cancéreuses car ils reproduisent la complexité des tumeurs observées chez l’homme. Nous réaliserons des chimères hématopoïétiques qui présenteront des altérations de la voie des MAPK uniquement dans les lymphocytes B et T. La comparaison des résultats obtenus dans les deux modèles, KO total vs. chimères, permettra d’établir si l’impact des altérations de la voie des MAPK sur la croissance tumorale, le phénotype et la réponse aux traitements est extrinsèque et/ou intrinsèque aux lymphocytes. Enfin des altérations de la voie des MAPK seront réalisées uniquement dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8 ayant un récepteur permettant la reconnaissance spécifique d'antigène présent à la surface des cellules cancéreuses.
Effets de la disponibilité de la nourriture et des températures nocturnes sur la reproduction chez un lézard vivipare
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 050 lézards vivipares, espèce sauvage de la faune française, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchés dans des enclos semi-naturels sans être tués. Cent cinquante femelles gestantes capturées subissent une restriction alimentaire et des températures nocturnes élevées, trois prises de sang et une mesure de réponse inflammatoire, et leurs 900 petits sont marqués un à un. L'objet est de mesurer comment le réchauffement nocturne et le manque de nourriture pèsent sur la reproduction de cette espèce. Le porteur affirme qu'aucun équivalent cellulaire ou in silico ne peut remplacer l'animal pour une étude écophysiologique en conditions contrôlées.
Objectifs
Les changements climatiques récents ont modifié la date des évènements de reproduction, la distribution géographique et l'abondance de nombreuses espèces à travers le monde. Ces changements sont très variables en direction et en ampleur selon les espèces, et les animaux ectothermes terrestres sont particulièrement affectés par la modification des conditions thermiques. Chez ces espèces, le réchauffement climatique a des effets létaux via les températures élevées durant le jour mais aussi via des actions chroniques en provoquant une accélération du vieillissement ou des déséquilibres énergétiques. Les études climatiques indiquent une augmentation plus rapide des températures nocturnes que des températures diurnes dans la plupart des régions du globe, mais très peu d’études ont quantifié les effets écophysiologiques des températures nocturnes. Chez les ectothermes terrestres, des températures nocturnes plus élevées pourraient ouvrir de nouvelles niches temporelles en prolongeant le temps d’activité potentiel ou en permettant l’activité nocturne dans les environnements trop chauds pendant la journée, ce qui serait bénéfique. À l’inverse, elles pourraient accentuer les effets délétères déjà constatés avec l’augmentation des températures diurnes en provoquant des taux de vieillissement et des déséquilibres énergétiques accrus car les compensations comportementales durant les phases d’inactivités sont très restreintes. Au-delà des conséquences physiologiques directes de la modification des cycles thermiques diurnes et nocturnes, les changements climatiques peuvent affecter les ectothermes via des effets indirects sur l’abondance de leurs proies. Conjointement, l’augmentation des températures nocturnes et une plus faible disponibilité des ressources nutritives pourraient ainsi avoir des effets délétères sensibles, en particulier pendant la gestation chez les ectothermes vivipares, car cette modalité de reproduction impose à la mère des dépenses métaboliques et énergétiques importantes. Les effets combinés de ces deux facteurs sont rarement explorés. Dans ce contexte, il est nécessaire d’étudier les effets combinés des températures nocturnes et de la disponibilité alimentaire sur la physiologie et les comportements des femelles pendant la gestation ainsi leurs conséquences sur l’aptitude des femelles et de leur progéniture.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de faire progresser notre compréhension de la flexibilité de la phénologie de la reproduction et des effets combinés des températures nocturnes et des ressources nutritives sur la qualité de la reproduction à l’aide d’une approche expérimentale. Nos travaux antérieurs suggèrent que les femelles lézards qui mettent bas plus tôt font face à des coûts énergétiques mais augmentent la croissance, la survie et la probabilité de reproduction à l’âge d’un an de leurs jeunes. Ces effets devraient être exacerbés s’il existait des déséquilibres énergétiques forts induits par des températures importantes lors des phases d’inactivité et exacerbés par une disette alimentaire. Mettre en évidence les conséquences d’une gestation accélérée la nuit et d’une restriction alimentaire sur la condition physiologique et physique des femelles nous permettra de progresser dans la bonne direction pour quantifier ces effets. De plus, nous avons démontré que les trois dernières décennies avaient été marquées par une accélération de la croissance et de l’effort de reproduction dans les populations naturelles, mais que le réchauffement climatique pouvait aussi précipiter certaines populations vers l’extinction en accélérant de manière trop importante le rythme de vie des lézards. Dans ce contexte, l’expérience permettra aussi de mieux anticiper les effets du réchauffement climatique sur la reproduction en conditions naturelles et de mesurer si ces effets sont seulement directs ou indirectement induits par les effets du climat sur les ressources. Ces effets indirects sont difficiles à quantifier en conditions naturelles ce qui justifie cette approche expérimentale.
Procédures
Des femelles gestantes seront capturées dans un élevage en extérieur au sein d'enclos semi-naturels au printemps (n=150) et maintenues en captivité dans différentes conditions thermiques nocturnes et de disponibilité de la nourriture en fonction de leur lot expérimental (6 lots, 25 femelles par lot) pendant 1 à 2 mois. Des prélèvements sanguins (durée de manipulation de 3-4 minutes) seront effectués sur animaux vigiles au début de la gestation, au premier tiers de la gestation et en fin de gestation (n=150, 3 prélèvements par animal). Des mesures de la réponse inflammatoire (durée de manipulation de 4-5 minutes) seront effectuées sur animaux vigiles au début de la gestation, au premier tiers de la gestation et en fin de gestation (n=150, 3 mesures par animal). A la fin de la gestation, les nouveaux nés seront marqués individuellement (n=900; durée de manipulation de 2 minutes). Tous les animaux seront relâchés dans des enclos semi-naturels en extérieur pendant l'été puis recapturés au printemps pour des mesures non invasives afin de suivre leur survie, leur croissance et leur reproduction future.
Impact sur les animaux
Comme nos projets passés l’indiquent, les protocoles du projet induiront une variabilité naturelle de la vitesse de la gestation sans effets létaux pour la mère ou la descendance ainsi qu’une restriction nutritive modérée pour les femelles. Les effets attendus sont ceux d’une accélération thermique de la gestation dans la gamme de variation naturelle et une sous-nutrition modérée induisant éventuellement un stress modéré se traduisant par une moins bonne condition physique et immunitaire, un plus haut niveau de mobilisation des réserves ou de dommages oxydatifs chez les femelles ainsi qu’un nombre plus faible de juvéniles produits. Les procédures expérimentales seront pour l’essentiel non invasives en dehors de trois prises de sang et de l’évaluation de la réponse immunitaire qui nécessitera une piqure. Ces manipulations sont très bien tolérées par les animaux adultes de cette espèce et induisent principalement un stress ponctuel au moment de la manipulation. Les lézards vivipares sont par ailleurs très tolérants à la mise en élevage dans les conditions de captivité de ce projet et à la manipulation par un expérimentateur. Pendant l’expérience, les animaux sont maintenus en conditions d'élevage enrichies dans leur cage individuelle et une phase d'acclimatation sera proposée avant le début de l'expérience.
Devenir
Les animaux sont tous relâchés dans les enclos semi-naturels donc replacés en captivité dans des conditions extérieures proches du milieu naturel sans réutilisation dans de futurs projets.
Remplacement
Il est impossible de remplacer le modèle biologique par un équivalent cellulaire ou in silico car l'étude écophysiologique de la plasticité de la reproduction nécessite l'utilisation d'animaux dans des conditions contrôlées au laboratoire et aussi en conditions naturelles comme dans notre projet.
Réduction
Un échantillon important d’animaux sera utilisé pour quantifier les conséquences écophysiologiques et les effets intergénérationnels des températures nocturnes et du manque de nourriture (150 femelles adultes et 900 descendants soit 1050 individus maximum) dans la mesure où ces animaux sauvages présentent une forte variabilité inter-individuelle, parce que les animaux seront divisés en 6 groupes expérimentaux et du fait que nous effectuerons un suivi pendant une année en conditions semi-naturelles où la mortalité annuelle est identique à celle dans les populations sauvages. Ces effectifs ont été réduits au minimum par rapport aux 6 groupes expérimentaux du projet et aux besoins du suivi longitudinal sur une année. On utilisera une méthode non-invasive échographique pour valider le statut de reproduction des femelles adultes et ainsi éviter de manipuler des femelles non gestantes. Les analyses statistiques consisteront à comparer les traits des six groupes expérimentaux à l'aide d'analyse de variance (modèles linéaires classiques) ou de modèles mixtes pour les données répétées (données mesurées plusieurs fois pendant la gestation ou après la gestation).
Raffinement
Afin de raffiner les protocoles, les animaux seront manipulés dans des conditions semi-naturelles proches de leur environnement sauvage pendant la quasi-totalité de l’expérience. En dehors des périodes d'élevage, les animaux seront maintenus dans de grands enclos extérieurs de 100 m2 chacun dans une prairie naturelle avec la végétation, les proies naturelles et les interactions sociales typiques d'une population sauvage. L'habitat de chaque enclos est enrichi de zones d'abri, de thermorégulation et de boisson pour optimiser la diversité des microhabitats offerts aux individus. En élevage, on raffinera aussi les conditions d'élevage grâce à un enrichissement des cages et à l'utilisation de conditions climatiques avec des cycles jour. Les cages individuelles sont enrichies à l'aide d'un abri, d'une pierre artificielle pour la thermorégulation et d'un éclairage blanc naturel enrichi en ultraviolet. Des points limites associés à la perte de masse seront appliqués avec arrêt des procédures expérimentales en cas de dépassement du point limite et basculement des conditions d'élevage des animaux vers des conditions optimales ad libitum, si nécessaire avec soins demandés par le vétérinaire référent, avec fin des mesures et des protocoles expérimentaux si les points limites sont dépassés.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le lézard vivipare, Zootoca vivipara (Lichenstein 1823). Il s’agit d’un lézard de la faune française étudié depuis 30 ans dans notre laboratoire et dont les populations naturelles en France ont été bien décrites. Le modèle biologique est intéressant pour comprendre l’écologie de vertébrés « ectothermes » comme les reptiles ou les amphibiens terrestres. Ce groupe comprend de nombreuses espèces menacées d’extinction en Europe et à valeur symbolique et écologique forte. Une thèse a permis d'analyser la plasticité thermique de la phénologie de la reproduction dans des populations naturelles. Ce projet visera à quantifier les conséquences d’une gestation accélérée la nuit et d’une restriction alimentaire pendant la gestation sur les femelles et les juvéniles à l'aide d'une approche expérimentale. Les animaux utilisés seront tout d’abord des femelles adultes gestantes (de 2 ans ou plus). Afin de limiter les variations inter-individuelles, nous ne prendrons pas de femelle sub-adulte (1 an) qui serait gestante car cette première reproduction à 1an est plus rare en conditions naturelles et leur morphologie (taille, masse) serait trop différente de celles des femelles adultes. Le statut de reproduction sera confirmé par une échographie. Dans un second temps, les nouveau-nés issus de la reproduction de ces femelles seront étudiés. Les populations semi-naturelles seront composées par ailleurs de tous les stades de développement (juvéniles, sub-adultes et adultes) pour générer une structure d’âge et de sexe « naturelle » comparable à celle des populations sauvages. Les animaux sont tous identifiés individuellement par un marquage à la naissance et les individus adultes et subadultes sont par ailleurs photographiés en phase ventrale chaque année pour confirmer le marquage individuel à la naissance en cas de doute.
Etude des rôles du microbiote intestinal et d’une voie de la réponse immunitaire (ALPK1) dans le traitement des dérèglements métaboliques dans des modèles murins.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
4 022 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant six mois un régime riche en gras et en sucre, des gavages et injections quotidiens pouvant atteindre 210 gestes, une coupure de la queue pour les prises de sang et un isolement en cage individuelle que le porteur décrit comme stressant. L'objet est de comprendre le rôle du microbiote intestinal dans le diabète et la stéatose, avec des pistes thérapeutiques annoncées pour une "préoccupation majeure de santé publique". Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne simule le lien entre microbiote, intestin et organes, et juge le recours aux souris "nécessaire".
Objectifs
Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elle sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme le diabète ou stéatose hépatique non alcoolique. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans des conditions physiologiques (individus sains) et pathologiques (individus malades). Des travaux suggèrent que certaines bactéries du tube digestif et produits bactériens sont responsables de dérèglements métaboliques chez l’hôte. L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes, d’identifier le rôle des bactéries et les cellules associées impliquées dans ces dérèglements dans trois modèles murins de maladies métaboliques (prédiabète, diabète et stéatose hépatique non alcoolique).
Bénéfices attendus
Les maladies métaboliques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Les maladies métaboliques sont associées à un régime alimentaire déséquilibré et à l’obésité. De nombreux travaux étudiant l’obésité témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal et d’une augmentation des réponses inflammatoires dans les intestins ou dans les organes périphériques, associées à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients obèses, la persistance de l’inflammation et d’une perturbation du microbiote conduisent souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier les mécanismes impliqués pour proposer des solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies métaboliques. Ce projet amènera une meilleure compréhension de l’implication du microbiote dans la réponse inflammatoire liée à l’obésité et de ses effets sur les maladies métaboliques comme le diabète et la stéatose et ainsi proposer de nouvelles voies thérapeutiques permettant le traitement et la prévention de ces maladies.
Procédures
Pendant une durée maximale de 30 semaines, les souris recevront un régime alimentaire riche en gras, en sucre ou en cholestérol susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids. Les souris seront soumises à des injections (quelques secondes) ou des gavages (quelques secondes) quotidiens pour une période comprise entre 12 et 30 semaines soit 210 au maximum. Deux gavages et 1 injection seront aussi réalisés en fin de protocole au cours de deux tests qui seront espacés d’une semaine chacun, ainsi qu’une petite coupure à l’extrémité de la queue (1 seconde) et massage (quelques secondes). Nous effectuerons 2 collectes de fèces lors de l‘émission naturelle en début et fin de protocole. La durée maximale de la collecte est estimée à 30 min maximum. Un prélèvement de sang de la joue sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 15 à 20 secondes.
Impact sur les animaux
Pour étudier l’impact du microbiote qui est différent entre les individus et suivre la prise alimentaire qui est une donnée essentielle à nos études, les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Les prélèvements fécaux (émission naturelle de fèces par la souris en début et en fin de protocole) et pesées des animaux (une fois par semaine) seront réalisées sur tous les animaux dans des pots de récolte ou de pesée, ce qui entraine un stress léger. Les animaux seront soumis à des gavages et des injections quotidiens tout au long du protocole. Bien que chaque action engendre un stress léger et de très courte durée (moins de 10 secondes), cette répétition de gestes engendre un stress requalifié de léger à modéré. La procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie (OGTT, IPGTT) et l’insulinémie (ITT) présente une douleur légère car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'expérimentateur lors du premier prélèvement du test. . Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'expérience. Ces trois tests nécessitent une mise à jeun de 6 heures. Afin d’éviter une période de jeûne trop drastique lors de ces tests, ceux-ci ne seront pas réalisés durant la phase nocturne mais en phase diurne. Un délai minimum d’une semaine séparera deux tests (OGTT/IPGTT/ITT). Les bactéries (pro-ALPK1) et molécules (ADP-H, agonistes et antagonistes) administrées n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux. Pour les souris soumises aux régimes riches en graisse, la prise de poids associée à ces régimes sur la durée d’exposition n’affecte pas leur mobilité.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure pour le prélèvement de leurs organes et tissus utilisés pour des analyses nécessaires à ce projet.
Remplacement
Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, les tissus périphériques (foie, tissus adipeux) et la régulation de la glycémie. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal en lien avec les données biologiques obtenues à partir des différents tissus.
Réduction
Le choix des molécules et bactéries testées dans ce projet l’ont été préalablement sur des systèmes cellulaires in vitro. Ainsi, nous avons sélectionné les bactéries et molécules les plus intéressantes et les plus activatrices pour réduire le nombre de molécules et bactéries à tester in vivo. Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. Nous allons tester 2 bactéries ou molécules en même temps ce qui permettra de diminuer le nombre de contrôles entrant dans le protocole expérimental. Chaque lignée de souris provient d’élevages indépendants.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Afin de palier au stress induit par l’isolement, les cages seront en plexiglass transparentes et mises côte à côte pour permettre les interactions visuelles, sonores et olfactives entre les animaux. Ces enrichissements permettent d'assouvir au mieux les comportements naturels de l'animal. Les animaux seront observés chaque jour (surveillance visuelle) et plus précisément deux fois par semaine au moment de la prise alimentaire quantifiée (par pesée de l’aliment) et de la prise de poids des animaux. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et euthanasié. Les souris dormant le jour, nous réaliserons les mises à jeun pendant la journée afin de limiter la sensation de faim.
Choix des espèces
Les animaux auront 8 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur les maladies métaboliques, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques et metaboliques. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. De plus, les délétions de gènes spécifiques dans un type de cellules donné sont uniquement présent dans ce modèle.
Evaluation par tomographie par émission de positrons de la biodistribution d’un analogue du neuropeptide Y radiomarqué au 68Ga sur deux modèles murins de xénogreffes orthotopiques de lignées canceuses du sein (MCF-7 et MDA-MB-231)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéprimées reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein humain dans la glande mammaire, puis une injection d'un peptide radiomarqué et une imagerie sous anesthésie, avant une ponction cardiaque qui les tue. L'objectif est de vérifier où se fixe ce traceur dans l'organisme, première étape avant une éventuelle application diagnostique ou thérapeutique laissée au conditionnel. Le porteur affirme que les résultats in vitro ne suffisent pas et juge le recours à des souris porteuses de tumeurs "indispensable".
Objectifs
Le ciblage de récepteurs de neuropeptides par des médicaments radiopharmaceutiques connait un réel engouement aujourd’hui pour l’imagerie et la thérapie des cancers. Il a été montré une forte expression du récepteur Y5 au neuropeptide Y dans 11 lignées cellulaires tumorales (dont le sein, ovaire, colon, prostate) quel que soit le grade et le phénotype. Un programme de recherche a été établi visant à caractériser le récepteur Y5 dans diverses lignées cellulaires tumorales humaines et à développer le premier agent de ciblage utilisable en imagerie nucléaire et en thérapie. Un premier analogue du NPY spécifique du récepteur Y5 pouvant être radiomarqué avec des radiométaux (nom de code du composé : tg3) a été développé. Les résultats in vitro obtenus jusqu’à présent démontrent la bonne affinité du composé pour le récepteur. Le présent projet de recherche préclinique vise à tester in vivo ce peptide radiomarqué à des fins diagnostiques sur des modèles murins de cancers du sein exprimant ces récepteurs Y5.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une avancée en recherche préclinique sur la thématique des radiothéranostiques (diagnostiques et thérapeutiques). Si ce premier analogue du neuropeptide Y donne de bons résultats in vivo en imagerie TEP, nous pourrons envisager une étude thérapeutique plus poussée (TRT : Targeted Radiotherapy) en utilisant ce même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique.
Procédures
- xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales (cancer du sein) dans les glandes mammaires sous anesthésie gazeuse (durée 10min) pour les 24 souris balb/c nude - 1 Injection intraveineuse au niveau de la queue contenant les radiotraceurs sous anesthésie gazeuse pour les 36 souris (durée 5 min) - 1 imagerie pour la moitié des effectifs (soit 18 souris) sous anesthésie gazeuse (durée 35 min) - 1 ponction cardiaque terminale pour les 36 souris sous anesthésie gazeuse 3% (durée 5min)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau des glandes mammaires pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies répétées pour la mise en place du modèle et pour l'imagerie peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.
Devenir
A la fin de la procédure, les 36 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.
Remplacement
Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur Y5 est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique du peptide tg3.
Réduction
Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. Pour l'étude du peptide tg3 radiomarqué avec un radioisotope dédié au diagnostic TEP, il est nécessaire de visualiser leur biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs Y5. Deux modèles murins de cancers du sein dont la présence du récepteur Y5 a été validée in vitro seront étudiés. Une étude préliminaire sur des souris saines (sans tumeur) permettra la comparaison de fixation du radiopeptide sur les différents organes. Pour chaque groupe, le ligand spécifique du récepteur Y5 est comparé à un peptide similaire dont la fixation à Y5 est nulle. Pour cette étude de validation de la biodistribution du radiopeptide, un t-test sera réalisé avec un nombre minimum de 6 souris par condition. Ce nombre permet de prendre en compte une pousse tumorale hétérogène.
Raffinement
Les souris sont placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour/nuit 12h/12h, enrichissement des cages) au sein d’une animalerie de recherche agréée. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur.
Choix des espèces
Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la greffe orthotopique de tumeur humaine au niveau de la glande mammaire. La souris Balb/c sera utilisée pour l’étude de biodistribution sans tumeur puisqu’elle présente le même fond génétique que la Balb/c nude. Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les xénogreffes seront initiées à 10 semaines de développement. A ce stade, la souris est une jeune adulte. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes. La pousse tumorale dure entre 2 et 4 semaines (volume minimum de 150 mm3). Les études in vivo par imagerie TEP suivi des biodistributions de l'analogue tg3 radiomarqué et de sa version "scrambled" sur les souris xénogreffées peuvent être réalisées. Pour les souris Balb/c, les biodistributions des peptides radiomarqués seront réalisées entre 12 et 14 semaines de développement pour pouvoir être comparables aux souris xénogreffées.
Interactions entre les neutrophiles, fibroblastes et nocicepteurs au cours de la cicatrisation et régénération cutanée.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une plaie cutanée dans le dos sous anesthésie, puis des injections quotidiennes d'anticorps et de molécules activant ou inactivant leurs fibres nerveuses sensorielles, avant le prélèvement des ganglions nerveux, de la moelle osseuse et de la peau. L'objet est de décrire le dialogue entre nerfs sensoriels et cellules immunitaires pendant la cicatrisation, avec des retombées pour les grands brûlés renvoyées au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut se substituer à la souris, qu'il juge "incontournable".
Objectifs
En Europe, plus d’1,5 millions de personnes sont aujourd’hui traitées pour des lésions graves de peau (brûlures, coupures, ulcères). Dans la majorité des cas, ces lésions sont associées à une douleur chronique, une immobilité, une possible défiguration et très souvent des infections, pouvant entraîner des complications médicales graves, voire la mort…Les blessures ne guérissent pas car la couche profonde de la peau, le derme, ne se régénère pas. Le derme est une structure essentielle car il permet d’apporter les nutriments et l’oxygène nécessaire au bon fonctionnement de la peau. Il sert également de support mécanique à l’épiderme et aux structures annexes de la peau : les follicules pileux, les glandes sudoripares, ou encore les vaisseaux sanguins. Les stratégies mises en place pour régénérer le derme fonctionnel ainsi que ses appendices sont un enjeux sociétal majeur. En effet, la régénération dermique permettrait de rétablir la qualité de vie des patients. On sait aujourd’hui que l’innervation et les cellules immunitaires jouent un rôle important dans le maintien de l’intégrité de la peau, en condition physiologique. Cependant, leurs interactions n’ont pas été étudiées dans un contexte lésionnel. Nous proposons, dans ce projet, d’étudier le dialogue entre les cellules nerveuses de la peau et les cellules immunitaires après une lésion de la peau. Nos études préliminaires montrent qu’une dénervation est néfaste pour la réparation tissulaire. C’est pourquoi nous souhaitons désormais étudier de manière plus approfondie comment les cellules nerveuses contrôlent exactement l’arrivée de cellules immunitaires dans la peau pour améliorer la régénération. L’ensemble de ce travail va permettre de comprendre comment améliorer la régénération de la peau et devrait à terme permettre le développement des traitements qui pourraient bénéficier à des millions de patients souffrant de lésions cutanées graves telles que les brûlures et les traumatismes cutanés.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait mettre en évidence pour la première fois les dialogues entre nocicepteurs et cellules immunitaires au cours de la régénération cutanée. Cela pourrait etre bénéfique pour des milliers de patients souffrant de brulures graves ou de lésions traumatiques importantes.
Procédures
Lésion cutanée sous anesthésie gazeuse (Environ 30 minutes) : 1 par animal Injection : anticorps bloquant, 1 fois par jour par animal Injection: différentes sondes, 1 fois par jour par animal Injection de molécules permettant l'activation ou l'inactivation des fibres nerveuses sensorielles deds souris transgéniques: 1 fois par jour par animal Injection sérum physiologique et anti-inflammatoire: 15 min avant la chirurgie puis 24h après chirurgie, 1 fois par jour par animal (Toutes les injections se feront également sous anesthésie gazeuses flash ( 1 min / animal))
Impact sur les animaux
La lésion cutanée effectuée est locale (peau du dos) et transitoire. Généralement, la lésion est totalement fermée (ré-épithélisation) après 12-14 jours. Aucune infection n’a été reportée. En revanche, il est important de noter que les souris peuvent avoir une mobilité réduite pendant 48 à 72h et avoir des difficultés à se suspendre sur les grilles qui contiennent les croquettes. C'est pourquoi nous placerons des croquettes hulidifiées au sol, ainsi que de l'hydrogel. De plus, les souris recevront deux doses de metacam afin de réduire la douleur associée à cet acte chirurgical. Les différents produits injectés ne sont pas douloureux; cependant les souris seront anesthésiées pour recevoir ces injections car la préhension des souris ne sera pas possible en raison de la lésion. L'injection des produits se fera donc sous anesthésie et les injections des différents produits se feront lors d'une seule (et flash) anesthésie par jour.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures les animaux seront sacrifiés afin de prélever les organes, majoritairement les ganglions de la racine dorsale, la moelle osseuse et la peau afin d'étudier les intercations entre les cellules immunitaires, les fibroblastes et les neurones sensorielles.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les dialogues entre nocicepteurs et les neutrophiles au cours des processus de cicatrisation cutané. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire ou explant in vitro qui pourrait se substituer à l'utilisation d'un modèle animal. En effet, les nocicepteurs ayant leur corps cellulaire (Dorsal Root ganglion, moelle épinière) à distance de leur terminaison nerveuse (peau), leur étude ne peut se faire que sur des modèles animaux. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier les dialogues entre Nocicepteurs-Neutrophiles-fibroblastes, in vivo. Les neuropeptides ou cytokines identifiées dans les processus de réparation tissulaire, seront testées sur des modèles d'explants de peaux humaines.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans l'étude nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle (12 souris par groupe et par temps pour les experiences de scRNA seq, ou 4 souris par goupe / temps / conditions pour l'immunofluorescence, par exemple). Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées).
Raffinement
Moins de 0,5% de mort ont été reportés par le porteur du projet au cours de ces processus de lésion de la peau. Lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Après lésion cutanée, les souris seront monitorées deux fois par jour pendant les 24 premières heures, puis tous les deux jours jusqu'à ré épithélisation. De l’hydrogel sera placé dans le compartiment inférieur de la cage. De plus, nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels que le comportement, la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids importante ou bien un comportement apathique, les animaux seront alors euthanasiés.
Choix des espèces
Afin d'étudier les interactions entre les nocicepteurs et les neutrophiles, nous avons besoin d'utiliser des outils transgéniques permettant de suivre les nocicepteurs / neutrophiles ainsi que des outils permettant une inhibition des nocicepteurs. Pour cela, l'espece animale la plus adaptée est la souris. En effet, de nombreuses souris transgéniques sont d'ores et deja disponibles (dans le laboratoire) pour la modulation des nocicepteurs (activation, inhibition et depletion). Ainsi, la souris nous semble être la meilleure espèce animale pour étudier les interactions entre nocicepteurs / neutrophiles et fibroblastes au cours de la cicatrisation cutanée. Enfin, il a été montré que ce modele particulier de lésion se rapprochait le plus de mode de cicatrisation chez l'homme - en comparaison avec le simple modèle de punch de 8 mm ou 12 mm, qui cicatrise par contraction. Les animaux seront utilisés à l'age adolescent et adulte (30-35 jours après la naissance). Dans ce modèle, la régénération n'a été étuddiée qu'entre 28 et 35 jours après la lésion. Des données non publiées - à ce jour - tendent à montrer que la régénération du tissus cutanné diminue à partir de 6 mois d'âge.
Autophagie et stimulation immunitaire précoce : effets neuro-inflammatoires et comportementaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Une partie des souris porte un gène de l'autophagie invalidé, et des souriceaux reçoivent dans leurs deux premières semaines de vie, sous anesthésie et séparés de leur mère, des injections intramusculaires de composés pro-inflammatoires. 1 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la déclaration en comptant 60 sans réveil et 1 080 en souffrance modérée. Le protocole comprend des tests de comportement : vocalisations ultrasoniques enregistrées pendant une séparation d'avec la mère puis en interaction sociale, actimétrie, nidification, et, avant le test social de trois mois, trois semaines d'isolement "afin de stimuler les comportements d'interactions". Une chirurgie sans réveil, suivie de la mise à mort, termine le protocole pour prélever les tissus. Le porteur annonce à court terme une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie, et renvoie à "plus long terme" des tests de molécules contre des troubles du neurodéveloppement.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions différentes particules auxquelles l’organisme est exposé dans les premières semaines de vie. La toxicité de ces composés bio-persistants et fortement pro-inflammatoires a été montrée dans différentes études, notamment en lien avec un effet sur le neurodéveloppement. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autre par différents tests de comportements, à différents âges, chez un modèle souris pour lequel i) un gène de l’autophagie a été invalidé ; ii) une exposition précoce aux particules est réalisée. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes cellulaires et la mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs : enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte de séparation maternelle (5 minutes), enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte d’interaction sociale (8 minutes à trois stades : jeune, adolescent, adulte), actimétrie à 2 et 3 mois (2 heures d’enregistrement), test de nidification (suivi sur 24 heures). Les souris sont isolées pendant 3 semaines en amont de la session de test d’interaction sociale à l’âge de 3 mois, afin de stimuler les comportements d’interactions. Les injections intra-musculaires de composés pro-inflammatoires (durée du geste d’environ 10 secondes) sont réalisées sous anesthésie (5 minutes d’anesthésie) et ne sont pas de nature à impacter de manière durable le bien-être des animaux. Ils sont ensuite soumis à une chirurgie sans réveil de quelques minutes réalisée sous anesthésie et analgésie, se finissant par l’euthanasie de l’animal. Un lot de 60 animaux sera soumis uniquement à une procédure sans réveil.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, l’anesthésie gazeuse, la mise en place d’une période d’isolement pour les animaux, les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques avant la chirurgie sans réveil, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. Pour l’anesthésie une détresse respiratoire et l’hypothermie des animaux est possible.
Devenir
Le projet décrit est réalisé sur des souris. L’ensemble des 1140 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
Notre étude a pour but l’analyse des atteintes comportementales induites par une déficience de l’autophagie combinée à une exposition environnementale précoce (composés pro-inflammatoires). Ces explorations fonctionnelles ne peuvent être réalisées à l’échelle cellulaire et nécessitent une évaluation sur l’individu. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle animal, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 1140 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Les paramètres environnementaux comprennent une humidité de 50 pour cent + ou – 20 pour cent, une température constante entre 20 et 24 degrés Celsius. L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification et d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés. Les injections intramusculaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Le stress induit par la séparation est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation. Les travaux antérieurs menés au laboratoire ou par d’autres équipes indiquent que l’injection intramusculaire des molécules pro-inflammatoires d’intérêt n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les portées seront particulièrement observées après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation impactant potentiellement l’élagage synaptique et la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (test à 9 jours de vie), jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie). Les injections seront réalisées pendant les deux premières semaines de vie de l’animal, de manière à modéliser une situation d’exposition réaliste chez l’enfant pendant sa 1ère année de vie.
Validation d’un test de motivation des vaches laitières pour la diversité alimentaire
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
12 vaches laitières vont être utilisées dans une procédure classée en gravité légère, puis conservées pour le renouvellement du troupeau et réutilisables dans d'autres essais. Elles sont soumises à un test de motivation par conditionnement opérant dans une aire en U, avec isolement social partiel et privation d'accès à la nourriture jusqu'à six heures, pour valider un outil censé mesurer leur intérêt pour une alimentation variée. Le porteur indique que l'environnement nouveau et l'isolement peuvent générer un stress transitoire et que la privation d'aliment provoque une sensation de faim. Il présente l'étude comme visant à déterminer si la diversité alimentaire est un besoin participant au bien-être des vaches laitières.
Objectifs
Dans les systèmes d’élevage de bovins laitiers actuels, l’alimentation des vaches laitières peut être qualifiée de monotone car les rations qui leur sont offertes sont généralement peu complexes en termes de composition et ne varient pas ou peu dans le temps. Pourtant lorsqu’elles en ont la possibilité, les vaches laitières composent un régime alimentaire diversifié en sélectionnant, pour constituer leur ration, un large éventail de plantes dont la disponibilité et la composition varient dans l’espace et dans le temps. Cependant, la question de l’importance de la diversité alimentaire dans les systèmes d’alimentation des ruminants d’élevage n’a émergé que récemment. L’objectif de ce projet est de valider un test comportemental (appelé conditionnement opérant) permettant d'évaluer la motivation des vaches laitières pour un régime diversifié comparativement à un régime monotone. Après validation dans le cadre du présent projet, le test de la motivation des vaches laitières pour la diversité alimentaire sera mis en place lors de futurs projets dédiés à l’étude de l’importance de la diversité alimentaire pour les vaches laitières. A plus long terme, cela permettra de déterminer si la diversité alimentaire est un besoin pour les vaches laitières et participe à leur bien-être.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer et de valider un test d'évaluation de la motivation pour la diversité alimentaire chez la vache laitière. Une fois validé, ce test sera mis en place dans le cadre de futurs projets qui permettront d’apporter des connaissances sur l’importance de la diversité alimentaire pour les vaches laitières en prenant en compte le point de vue de l’animal grâce à l’étude de la motivation de ces dernières pour la diversification de leur régime alimentaire. A plus long terme, les nouvelles connaissances apportées par ce projet participeront à déterminer si la diversité alimentaire est un prérequis indispensable pour le bien-être des vaches laitières et s’il est donc nécessaire ou non de développer des systèmes d’élevage permettant aux vaches de diversifier leur régime alimentaire pour garantir leur bien-être. Les résultats de ce projet ont vocation à permettre de faire évoluer les pratiques d’élevage en faveur du bien-être des vaches laitières. Au-delà de la question de la diversité, ce projet permettra de valider le test de motivation alimentaire chez la vache laitière, qui pourra être réutilisé pour répondre à d’autres questions en lien avec le comportement alimentaire.
Procédures
Le comportement des vaches laitières sera étudié grâce à des tests comportementaux réalisés en trois phases (une phase d’habituation, une phase d’apprentissage et une phase de réalisation des tests) dans une aire de test en forme de "U", en présence d'aliments habituels et d’aliments nouveaux, avec des congénères dans un parc d'attente à proximité (maximum 20 sessions par animal sur 1 mois toutes phases confondues).
Impact sur les animaux
Le test de motivation mis en place dans le cadre de ce projet sont des tests de comportement individuel de courte durée (10 min). Ces tests seront réalisés dans une aire de test spécifique (aire en « U ») qui est localisée dans un bâtiment non connu des vaches au début du projet. La découverte d’un environnement nouveau et l’isolement social peuvent générer du stress chez la vache laitière. Néanmoins, ce stress est transitoire puisque la concentration sanguine en cortisol (hormone du stress) retrouve le niveau observé avant le début de l’isolement dans un environnement nouveau en 45 minutes. Dans notre projet, afin de limiter le stress engendré par la découverte d’un environnement nouveau et par l’isolement social, une phase d’habituation progressive à l’aire de test sera réalisée avant la réalisation des tests de motivation. Lors de cette phase d’habituation, les vaches laitières seront dans un premier temps amenées en groupe de 12 vaches dans une aire d’attente adjacente à l’aire de test dans le bâtiment nouveau, puis seront introduites deux par deux et enfin seules dans l’aire de test avant de passer à la phase d’apprentissage et à la phase de réalisation des tests. Afin de maximiser l’intérêt des vaches pour les aliments lors des différentes phases, l’accès à l’alimentation sera bloqué 3h avant d’être amenées dans le bâtiment de test (en fin de matinée vers 11h) et pendant toute la durée de réalisation des tests (durée maximale sans accès à l’alimentation = 6h). Le fait de bloquer l’accès à l’alimentation pourra générer une sensation de faim. Cependant, cette restriction d’accès à l’alimentation ne devrait pas entrainer de restriction alimentaire. En effet, les vaches laitières ingèrent la majorité de leur ration au moment de la distribution de leur ration qui a lieu 2 fois par jour (à 8h et à 16h). De plus, lorsque le temps d’accès à l’alimentation est réduit, elles sont aussi capables d’adapter leur comportement alimentaire afin d’ingérer la totalité de leur ration journalière.
Devenir
Dans le cadre de ce projet, seule une procédure légère qui n’est pas susceptible d’avoir d‘effets importants sur le bien-être et aucun effet sur la santé des animaux sera réalisée. Les animaux seront donc conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable de l’installation expérimentale. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci est effectivement possible.
Remplacement
Ce projet vise à développer et valider un test de motivation des vaches laitières pour la diversité alimentaire. Une fois validé, ce test de motivation sera mis en place dans le cadre de futurs projets qui permettront de déterminer l’importance de cette diversité alimentaire du point de vue de l’animal. A long terme, les nouvelles connaissances apportées par ce projet participeront à déterminer si la diversité alimentaire est un besoin pour les vaches laitières et si elle participe à leur bien-être. La considération du point de vue de l’animal implique d’analyser les réponses comportementales des vaches laitières vis-à-vis de la diversité et de la monotonie alimentaire. Il est donc impossible de se passer de l’utilisation de vaches laitières pour atteindre l’objectif de ce projet.
Réduction
Le nombre de vaches laitières impliquées dans ce projet a été défini sur la base des connaissances bibliographiques sur le comportement alimentaire et les capacités d’apprentissage des vaches laitières afin de pouvoir étudier la variabilité interindividuelle de la vitesse d’apprentissage du principe du test de motivation et de la motivation des vaches laitières pour la diversité alimentaire. Cela permettra de définir plus précisément le nombre d’animaux nécessaires pour les projets futurs mettant en œuvre ce test ainsi que la durée de la phase d’apprentissage nécessaire pour que les vaches comprennent le principe du test.
Raffinement
Les animaux de ce projet sont des vaches laitières habituées à être manipulées par les personnes qui réaliseront le projet. De plus, l’expérimentation mise en place est basée sur un test de comportement permettant d’étudier la motivation des vaches pour la diversité alimentaire. Ce test n’induit aucune douleur mais peut générer un stress de courte durée. Pour limiter le stress potentiellement induit par un isolement social (partiel car présence de congénères à côté de l’aire de test) et un environnement inconnu au début du projet, une phase d’habituation progressive est mise en place et une récompense alimentaire est présente dans le test. Des points limites sont définis afin de sortir une vache du protocole en cas de non habituation à la procédure. En dehors des périodes de test, les vaches sont maintenues dans leur environnement d’élevage habituel qui est adapté à leurs besoins comportementaux, environnementaux et sanitaires.
Choix des espèces
La question de l’intérêt de la diversité alimentaire a été abordée chez les petits ruminants. Cependant, il existe très peu d’études traitant de cette question chez la vache laitière, alors que ces dernières sont les ruminants dont les systèmes d’alimentation sont généralement parmi les plus monotones. La problématique de l’étude est donc spécifique aux vaches laitières et nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches laitières utilisées dans ce projet seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la principale race de vache laitière fournissant du lait pour l’alimentation humaine et de la race la plus répandue en France et dans le monde. Les vaches laitières seront des vaches adultes car le projet vise à valider un test de motivation pour la diversité alimentaire dédié aux vaches laitières et donc à ce stade.
Régulation du développement de l’épithélium intestinal par l’interaction entre la colonisation du microbiote et la signalisation des cytokines.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
16 430 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Élevés au stade larvaire dans un milieu antibiotique pour supprimer leur microbiote, ils sont collectés à différents jours, anesthésiés et enrobés dans une matrice de cellulose pour observation au microscope, puis mis à mort pour prélèvement de l'intestin ou séquençage. Le porteur indique que la privation de microbiote entraîne un sous-développement de l'intestin et que la collecte peut être une source de stress. Il justifie le choix de l'espèce par la transparence des larves et leur développement hors de l'utérus, et affirme que la culture in vitro d'un intestin colonisé est impossible à l'heure actuelle.
Objectifs
Les cytokines sont des agents essentiels du système immunitaire et constituent une partie des molécules indispensables à la communication intercellulaire. L'activité d'une cytokine est assurée par la présence à la surface de la cellule cible, de récepteurs spécifiques : ceux-ci permettront de transmettre le message. Elles sont donc des médiateurs, et leur production a lieu en réponse, principalement, à la présence d'un agent infectieux tels qu'un virus ou une bactérie, ou de l'un de leurs constituants. La colonisation de l'intestin par les micro-organismes commensaux (hôte habituel d'un organisme sans lui causer de dommage) commence avec l'ingestion de nourriture, et augmente massivement en nombre et en complexité avec les changements alimentaires tels que l'inclusion d'aliments secs dans le repas des poissons. La génération d'animaux sans germes par l'élimination de la flore commensale en début de vie entraîne un sous-développement des cellules épithéliales et immunitaires intestinales, ce qui conduit à un dysfonctionnement durable de l'organe. Les poissons zèbres dépourvus de microbiote intestinal (ensembles des micro-organismes présents dans l’intestin) présentent une prolifération épithéliale intestinale et une différenciation cellulaire défectueuses au cours du développement. Par exemple, les maladies inflammatoires intestinales peuvent résulter d’un problème d’échange entre la lumière intestinale (espace intérieur de l’intestin) et les cellules épithéliales qui la composent. En fait, la perturbation du dialogue entre le microbiote, le système immunitaire et les cellules épithéliales via les cytokines peut avoir des effets délétères sur l’état d’équilibre de l'intestin, compromettre l'absorption des nutriments et avoir un impact au-delà de l'intestin. Plusieurs études ont révélé des mécanismes par lesquels le microbiote contrôle la maturation du système immunitaire intestinal. Cependant, la manière dont le microbiote régule le développement de l'épithélium intestinal reste largement inconnue. Nous voulons donc comprendre comment les bactéries présentes dans notre intestin et l’interaction qu’elles ont avec les cytokines d’intérêt, peuvent réguler le développement de l’épithélium intestinal.
Bénéfices attendus
Le système immunitaire est bien connu pour son rôle important lors d'infections par des bactéries, des virus et d'autres agents pathogènes. Cependant, au-delà de l'immunité et de la défense, le rôle des signaux du système immunitaire, tels que les cytokines, dans le développement et la maturation des organes n'est pas bien compris. En outre, on ne sait pas comment les cytokines interagissent avec l’ensemble des micro-organismes colonisateurs, qui favorise la maturation des organes. Ces questions peuvent être facilement étudiées dans le modèle du poisson zèbre puisqu'il se développe en pleine eau et qu'il est transparent, ce qui permet d'observer directement les organes en développement dans le contexte de l'organisme complet. En outre, la manipulation de l'environnement est également très facile avec ce modèle animal. Ces avantages expérimentaux nous permettent de comprendre en détail comment les cytokines et leur interaction avec le microbiote modulent le développement et la maturation des organes intestinaux. En outre, ce projet nous permettra de révéler comment le dysfonctionnement du système immunitaire, au-delà de l'altération de la défense et de l'immunité, peut entraîner une altération de la maturation correcte de l'intestin. Ces résultats peuvent potentiellement ouvrir la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies intestinales, y compris celles liées à l'inflammation intestinale, ainsi que pour les pathologies dans lesquelles le bon fonctionnement physiologique de l'intestin est compromis.
Procédures
Les différentes interventions sur les larves dépourvues de toute flore seront les suivantes : - Observation rapide sans ouverture de boite tous les jours ou presque - Changement du milieu antibiotique, tous les jours ou tous les 2 jours - Aux temps J5, J8, J12, J15, 25 larves seront collectées, anesthésiées et incluent délicatement dans une matrice de cellulose le temps de l’observation au microscope. L’observation avec prise de photo de chaque larve pourrait prendre jusqu’à deux heures. Les larves seront mises à mort pour analyse post-mortem. - Aux temps à J12 et J15, 30 larves seront collectées et mises à mort avant de prélever l’intestin pour analyse. - Collecte de 225 larves pour séquençage. Les larves seront mises à mort pour analyses. - 15 larves seront collectées, anesthésiées et incluent délicatement dans une matrice de cellulose le temps de l’observation au microscope et seront mises à mort pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Nous allons étudier des larves de 5 jours post-fertilisation (dpf) jusqu’à 15dpf, avec prise alimentaire sans germe à partir de 7 dpf. La formule de cette nourriture contient tous les nutriments nécessaires à leur croissance en dehors des germes. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement. L’effet indésirable qui pourrait apparaitre serait une mortalité des larves au cours du processus. Un risque de stress lors de la collecte des larves pour analyse au microscope est possible.
Devenir
Toutes les larves seront mises à mort pour analyse post-mortem
Remplacement
L'étude de cellules souches en culture extraite de l'organisme vivant n'est pas suffisante pour comprendre les processus de l'embryogénèse (processus de formation d'un organisme pluricellulaire, de la cellule initiale issue de la rencontre des cellules reproductrices parentales à un être vivant autonome). La culture in vitro d’intestin et sa colonisation avec un microbiote est impossible à l’heure actuelle. Il n’existe aucune donnée sur d’autre modèle de Vertébré. Néanmoins, il existe des données de séquençage de l’ARN (technique pour identifier et quantifier le matériel génétique à un moment donné) issues du modèle poisson sur lesquelles nous nous sommes basés.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Les tailles des lots ont été déterminés en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet
Raffinement
Les espacements des observations ont été déterminés en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. D’une façon générale, les expériences sont de courte durée. Les larves seront lors de la manipulation pilote surveillées quotidiennement puis la fréquence du suivi sera ajustée. Les larves mortes seront enlevées et le milieu avec antibiotique sera changé pour garder les larves dans un environnement optimal. Pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l'angoisse de l'animal, ce dernier sera anesthésié durant toute la procédure expérimentale d’analyse au micrsocope par le biais de la tricaïne diluée dans l’eau.
Choix des espèces
Notre compréhension de la manière dont cellules, gènes de l'hôte et microbiote contrôlent le développement des organes des vertébrés est limitée dans les modèles mammifères. Il n'est pas pratique d’y réaliser des manipulations précises dans l'environnement, dans l’animal, et en même temps, de suivre en image l'intestin en développement. Pour surmonter ces limites, notre nouvelle approche consiste à combiner les avantages du modèle du poisson zèbre avec les nouvelles technologies. Le poisson zèbre est un modèle animal idéal pour étudier le développement des vertébrés en raison de sa facilité de manipulation génétique, de sa grande descendance, de sa transparence et de son développement ex utero rapide. Il est également un système modèle puissant pour étudier le microbiome (environnement spécifique d’un microbiote) des vertébrés. Enfin, la plupart des lignées et des voies immunitaires sont conservées entre poissons et mammifères. Cette étude s’effectuera sur des larves de 5dpf jusqu’à 15 dpf. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoces sous deux conditions environnementales différentes (présence de germes conventionnels et sans germe).
Rôle pathogène des auto-anticorps dans les dermatoses bulleuses auto-immunes
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
838 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 615 dans des procédures menées sans réveil et 223 en gravité modérée. Elles reçoivent des injections de protéines pour rompre la tolérance immunitaire, subissent jusqu'à neuf prélèvements de sang sur 56 jours, et certaines, gestantes ou nouveau-nées, reçoivent des anticorps destinés à provoquer un décollement de la peau. Le porteur indique que les animaux développent des érosions cutanées ou orales et une image comparable à celle des patients, une échelle de gravité servant à fixer un point limite. Il précise avoir observé la pathogénicité in vitro mais affirme que sa confirmation ne peut être envisagée que chez l'animal.
Objectifs
L'objectif général de notre programme de recherche est d'améliorer la compréhension de la physiopathologie des DBAI. Plus spécifiquement, nous viserons à : i) évaluer les nouveux antigènes cibles identifiés dans les DBAI dans le déclenchement d’une DBAI par des immunisations chez la souris. ii) établir si des auto-anticorps exercent un rôle pathogène direct par transfert passif, chez la souris grestante ou néonatale, d’immunoglobulines de patients atteints de DBAI ou de souris (avec des anticops monoclonaux d'hybrdiomes générés issus des souris immunisées) . L’étude des animaux se fera donc par (i) une observation clinique de la peau, (ii) une analyse sanguine et iii) une étude histologique des tissus cutanés prélevés post-mortem
Bénéfices attendus
La méconnaissance des processus physiopathologiques conduisant à la survenue des DBAI est un frein au diagnostic et à la mise en place d’une thérapeutique adaptée. Des études récentes suggèrent fortement que la diversité des antigènes cibles au cours des DBAI est plus hétérogène. L’évaluation du rôle de ces auto-anticorps dans les processus physiopathologiques permettra un diagnostic plus précis et la mise en place d’outils thérapeutiques plus adaptés et de potentiellement réduire les effets secondaires des thérapies actuellement utilisées.
Procédures
Injections de protèines recombinantes (immunisation) : injection en sous-cutanée entre les 2 omoplates. Les souris seront injectées au moins une fois voire 3 fois, à 15 jours d'intervalle. Chaque injection dure moins de 10 secondes. Prélèvement de sang sur animal anesthésié (suivi longitudinal ). Les souris seront prélevées 9 fois sur une période de 56 jours. Les prélevements de sang durent moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
L'objectif de l'immunisation est de promouvoir une rupture de la tolérance immunitaire comme un auto-antigène chez les patients atteints de DBAI afin d’évaluer la pathogénicité des anticorps. L’injection de la protéine chez les animaux entrainera l’apparition d'anticorps pouvant être à l'origine de signes d'érosions cutanés ou orales . Les tests de tansfert passsif ont pour objectif de confirmer le rôle pathogène des différents auto-anticorps par l’induction de l’acantholyse. Les animaux développeront des signes cutanés et l’image histologique devrait être caractéristique du phénomène d’acantholyse observé chez les patients. L’apparition d’éventuelles érosions cutanées ou orales autour du museau mesurée par un examen visuel effectué par deux observateurs indépendants permettra d’évaluer l’évolution de la maladie et le niveau de souffrance des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever en post mortem la peau pour une analyse histologique ou de réaliser des analyses biologiques permettant d'évaluer la pathogènicité des anticoprs.
Remplacement
Nous avons réalisé une étude préalable in vitro de l'activité des auto-anticorps sur les kératinocytes par un test dispase et par des tests d’immunofluorescence sur de la peau. La pathogénicité, in vitro, est observée de ces nouveaux auto-anticorps. Cependant, la pathogénicité réelle de chaque auto-anticorps ne peut être envisagée que chez l'animal car ils pourraient agir en synergie avec des cellules du système immunitaire in vivo et contribuer ainsi au phénotype complexe des DBAI.
Réduction
Le recours au modèle murin étant absolument nécessaire, le modèle murin de DBAI par transfert des auto-anticorps chez la souris néonatale est déjà connu et a déjà permis de confirmer la pathogénicité de certains auto-anticorps. Ainsi, l’utilisation du même modèle permet de réduire le nombre de souris pour la mise au point pour tester rapidement l’implication de ces nouveaux auto-anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires est réduit au minimum en tenant compte de la variabilité de l’induction de l’acantholyse. Le nombre d’animaux à inclure par lot, ne peut pas faire l’objet d'une justification par une étude statistique. En effet, il va s'agir d'une part, d’un protocole d’immunisation, la quantité de souris est le juste nombre défini d’après l’expérience du laboratoire sur ce type de procédure et dont on sait qu’il permettra de tester et de produire des hybridomes en aval. D'autre part, pour les autres procédures, pas de test statistique puisqu’il s’agit d’une observation qui doit répondre à un effet pathologique ou non des Ac. Le nombre juste de souris permet de pallier aux fluctuations expérimentales inhérentes à la variabilité des réponses, notamment immunologiques, entre les animaux et pour pallier la variabilité du nombre de petits par portée.
Raffinement
Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie (perte ou hérissement des poils, lésions du museau, posture inhabituelle pour les souris immunisées et uniquement la peau pour les souris néonatales) et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Elle permettra d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. Enfin, l’ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées dans des cages enrichies avec du papier, du coton (cell-nest) et un abri de cellulose. Une crème anesthésique sera appliquée sur les souris néonatales avant l’injection des immunoglobulines et elles seront immédiatement remises en présence de leur mère après l’injection afin de réduire le stress.
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivie des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés permettant d’étudier les mécanismes immunologiques mise en œuvre lors des pathologies auto-immunes. Animaux âgés de 6-8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature pour l’immunisation des auto-antigènes des DBAI. Femelles gestantes datées à 15 jours de gestation pour permettre l'accueil et l'injection soit des mères à la fin de la gestion (étude du transfert transplacentaire ) ou des petits âgés de 1 jour ( âge requis) pour suivre le phénomène d’acantholyse cutanée suite à l’injection des auto-anticorps.
Caractérisation de la lignée Pde2a2 +/-
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 48 dans des procédures classées sévères. Cette lignée modifiée pour réduire une protéine liée à l'autisme et à la déficience intellectuelle subit des tests sociaux et cognitifs, dont certains précédés de deux heures d'isolement, avant l'euthanasie et le prélèvement du cerveau, de la moelle épinière, des surrénales, des testicules et des ovaires, 120 animaux mourant au cours d'une perfusion intracardiaque. Le porteur qualifie les tests comportementaux de classiques et indolores et signale une anxiété possible liée au nouvel environnement et à l'isolement. Il indique avoir d'abord travaillé sur des lignées cellulaires et poursuivre directement chez la souris pour étudier les comportements.
Objectifs
Des mutations du gène PDE2A ont été découvertes chez des patients atteints d’autisme et de déficience intellectuelle, qui sont des maladies du développement du cerveau . La protéine PDE2A est très fortement présente dans le cerveau et a un rôle clé dans le développement des neurones, leur morphologie et fonctionnement. Ceci explique que des altérations de sa quantité puissent avoir un impact négatif sur le fonctionnement neuronal et induire des maladies du cerveau. La PDE2A regroupe trois protéines variantes qui se retrouvent à des emplacements distincts dans les neurones, dont la PDE2A2 que l’on retrouve spécifiquement dans la mitochondrie. Les mitochondries sont des petites unités présentes dans les cellules qui produisent de l'énergie sous forme d'ATP grâce au processus de respiration cellulaire. Des altérations de la mitochondrie sont d’ailleurs retrouvés chez les patients ayant des mutations sur le gène PDE2A ainsi que chez d'autres patients atteints de trouble du spectre de l'autisme. Nous avons récemment étudié la souris Pde2a+/- qui, comme les patients, a une quantité diminuée de tout les variants PDE2A. Nos récentes données montrent que cette souris est un bon modèle de maladie du cerveau, et qui présente des troubles socio-cognitifs similaires aux patients. Nous voulons à présent commencer l’étude de la souris Pde2a2+/- qui aura uniquement une quantité diminuée de PDE2A2, donc seulement au niveau de la mitochondrie. En effet, cela nous permettra de savoir si une atteinte unique au niveau de la mitochondrie est suffisante pour induire des troubles comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle spécifique de la PDE2A2 au cours du développement du cerveau, et le lien entre la dérégulation de l'activité de cette enzyme au niveau de la mitochondrie et les troubles du neuro-développement comme la déficience intellectuelle, l'autisme et les troubles moteurs. Finalement, l'évaluation de la pertinence de ce modèle par rapport aux patients atteints d'une mutation permettra de mettre à disposition de la communauté scientifique un potentiel nouveau modèle de maladie du neurodeveloppement.
Procédures
Différents tests sociaux et cognitifs seront réalisés ponctuellement et qui dureront, selon les tests, de 3 minutes à 2 heures. Ces tests se feront chez les souriceaux, à l'adolescence (un mois) et à l'âge adulte (dès deux mois). Certains animaux seront soumis à une perfusion intra-cardiaque, et une injection d'anesthésique et une d'antalgique seront effectuées sur chaque animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une contention plusieurs fois au cours de leur vie, que ce soit pour des pesées ou pendant les différents tests. Les tests comportementaux réalisés sont classiques et indolores. De l'anxiété peut être attendue lors des différents tests liée à un nouvel environnement notamment pour les tests d'anxiété ou lors de l'isolement dans l'actimètre ou pendant le test d'interaction sociale avec 2h d'isolement auparavant.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales. Nous récupérerons différents organes (cerveau, moelle épinière, surrénales, testicules et ovaires) afin de réaliser des études moléculaires. 120 de ces animaux subiront une perfusion intra-cardiaque, sous anesthésie générale, au cours de laquelle ils décèderont afin de pouvoir réaliser une étude sur les coupes de cerveau.
Remplacement
Avant de réaliser cette étude, nous avons préalablement travaillé sur des lignées cellulaires, ce qui nous a permis de confirmer le rôle de PDE2A2. Notre étude portant globalement sur des maladies du neurodéveloppement et sur le déficit intellectuel et les troubles du spectre de l'autisme, nous devons poursuivre ce projet directement chez la souris pour étudier les différents comportements associés à ces maladies afin de valider le rôle de la forme mitochondriale de PDE2A.
Réduction
Dans un objectif de réduction, nous analyserons nos résultats après chaque groupe expérimental. Si les résultats des 2 premiers groupes expérimentaux sont significatifs et identiques, nous n'utiliserons pas le 3ème groupe. De plus, les organes de tous les animaux utilisés au cours de ce projet seront récupérés pour réaliser des études moléculaires, ce qui évitera l'emploi d'animaux supplémentaires. Pour garantir une puissance statistique (t test) suffisante à cette étude tout en minimisant le nombre d’animaux à utiliser, nous prévoyons un minimum de n=10 animaux par groupe, avec 3 expériences indépendantes. Chaque expérience sera réalisée 3 fois afin de garantir la reproductibilité des résultats, et pour chaque répétition, nous avons besoin d'un minimum de 10 animaux par groupe afin d'obtenir un résultat significatif.
Raffinement
Lors des procédures chirurgicales, les animaux seront au préalable anesthésiés, accompagné d'un analgésique et d'un antalgique afin de réduire la douleur de l'animal.
Choix des espèces
Travailler avec des souris permet de comparer un phénotype "sauvage" avec des modèles transgéniques disponibles, comme les souris Pde2a+/-. De plus, le modèle murin permet d'étudier à la fois les comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensorimoteurs que l'on peut retrouver chez les patients atteints de troubles du neuro-développement. Des tests seront réalisés au 7ème, 10ème et 14ème jour après la naissance, ce qui correspond à l'enfance chez l'humain. Puis nous réaliserons d'autres tests à 1 mois, ce qui correspond à l'adolescence. Enfin, nous réaliserons des tests à l'âge adulte d'une souris (à partir de 8 semaines). Cela permettra d'évaluer l'impact de l'extinction partielle du gène Pde2a2 au cours du développement, et d'identifier les moments clefs où la protéine PDE2A2 est impliquée dans la pathologie.
Etude des lésions inflammatoires du cervelet après traumatisme crânien chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 182 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures classées sévères et l'autre modérées. Des souriceaux de 7 jours subissent un traumatisme crânien par lâcher de poids sous anesthésie, puis certains une chirurgie crânienne pour imagerie, avant une perfusion intracardiaque mortelle et le prélèvement du cerveau. Le porteur décrit un modèle de traumatisme crânien pédiatrique visant à comprendre l'atteinte du cervelet, et indique que les effets sur la croissance des souriceaux ne sont pas encore décrits ni connus. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reproduire in vitro les interactions entre cellules du cerveau.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) correspond aux lésions cérébrales traumatiques et aux altérations des fonctions cérébrales qui en résultent. Les TC sont fréquents chez les enfants et sous-diagnostiqués. Le traumatisme crânien pédiatrique est pourtant un enjeu de santé publique et social majeur. En effet, il est potentiellement responsable de troubles cognitifs et comportementaux, d’échecs scolaires puis de désinsertion sociale à l’âge adulte. Alors que le cervelet est rarement touché directement (3,3% des TC), des lésions indirectes provenant de la zone lésée dans le reste du cerveau peuvent être observées, notamment chez l’enfant. Ces atteintes participent aux handicaps moteur et cognitif. En revanche, les mécanismes mis en cause dans la génération de ces lésions sont mal connus et semblent reposer sur l’inflammation qui survient dans le cerveau lors du TC. Notre hypothèse est que le TC, même isolé, peut être à l’origine de lésions du cervelet, à cause de l’inflammation. Nous utiliserons un modèle de TC modéré par lâcher de poids d'une faible hauteur chez le souriceau 7 jours, sous anesthésie générale, pour étudier les phénomènes inflammatoires potentiellement impliqués dans les lésions du cervelet dans les suites de l'impact.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de compendre de manière plus précise comment le traumatisme crânien chez l’enfant peut conduire à des troubles à long terme, et quel rôle le cervelet joue dans ce phénomène. La fonction du cervelet est de plus en plus étudiée, mais la manière dont il participe à certaines maladies neurologiques, ou neurodégénératives, n’est pas encore totalement élucidée.
Procédures
Les souriceaux subiront un traumatisme crânien sous anesthésie générale. Après ce traumatisme, un groupe d’animaux de 10 jours de vie sera anesthésié, et une perfusion intra-cardiaque sera réalisée post-mortem pour éliminer le sang des vaisseaux des organes qui seront prélevés et étudiés post-mortem. Cette perfusion sera également réalisée chez des animaux à 45 jours de vie et à 6 mois, sous anesthésie générale et avec analgésie. Deux groupes de souris, l’un à 45 jours de vie et l’autre à 6 mois subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie pour réaliser des mesures d’imagerie sur le cerveau (durée : une heure maximum). Ces animaux seront ensuite euthanasiés sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets de cette procédure de traumatisme crânien sont partiellement connus . On rapporte ainsi une mortalité́ estimée à moins de 4%, principalement due à un éventuel rejet du souriceau par la mère, ainsi que dans quelques cas par le traumatisme lui-même. La chirurgie crânienne pour l’imagerie peut entraîner dans de rares cas la mort de l’animal. Les effets sur la croissance et le développement des souriceau ne sont pas encore décrits ni connus.
Devenir
L'euthanasie des animaux après imagerie répond à une nécessité d'ordre éthique puisque celle-ci impose une chirurgie au niveau du crane de l'animal, et rend l’utilisation du cerveau impossible pour toute autre analyse. Tous les autres animaux seront euthanasiés et les cerveaux prélevés pour analyses.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'implication du cervelet dans l’inflammation du cerveau après traumatisme, et dans le développement de lésions plus tardives. Cela suppose des interactions complexes entre les différents types de cellules qui constituent le cerveau, à savoir les neurones (qui transmettent les informations nerveuses), les microglies (cellules immunitaires du cerveau), les astrocytes (qui contrôlent le métabolisme), et les oligodendrocytes (qui produisent une gaine de protéine autour des neurones). Il y a également une rupture de la barrière hémato-encéphalique, qui filtre habituellement le sang avant qu’il entre dans le cerveau. Cette lésion secondaire au traumatisme est à l’origine d’une communication entre le système immunitaire périphérique (c’est-à-dire les globules blancs qui circulent dans le sang) et le système immunitaire du cerveau. Il n'est pas possible de reproduire ces interactions in vitro, et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal présentant un cerveau fonctionnel, dont la structure est proche de celle de l'homme pour reproduire ce système.
Réduction
Le nombre d'animaux estimé et les tests statistiques utilisés sont basés sur notre expérience pour ce type d'étude. Ce nombre minimum nous permettra d'être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet. L'analyse statistique de nos données peut nécessiter plus ou moins d'animaux en fonction du type d’analyse réalisé. Pour autant, les tests étant organisés en plusieurs séries, si une différence assez importante pour conclure à un effet réel est observée avant la fin de toutes les séries, les expérimentations seront interrompues.
Raffinement
Hébergement : Les animaux seront hébergés en groupe, en milieu enrichi (sopalin , maisons en plexiglas) pour minimiser leur stress. Dans les jours suivant le traumatisme crânien, on veillera quotidiennement au bien-être des animaux et on surveillera que leur retour au sein du nid se fait bien. Des arbres décisionnels cliniques seront proposés en fonction de l'âge des animaux. Avant sevrage, sur les très jeunes animaux, les soins maternels constituent la meilleure prise en charge de la souffrance chez le souriceau. Après le 15ème jour de vie, une réhydratation sera réalisée si l’animal présente des signes d’inconfort ou de douleur. A partir du sevrage, les douleurs éventuelles seront traitées à l’aide d’un analgésique. En cas d’atteinte des points limites l’animal sera euthanasié. Tous les gestes invasifs (trauma et imagerie) seront réalisés sous anesthésie générale. A la fin de l'étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Afin d'étudier les interactions entre les cellules du cerveau sur un modèle de traumatisme, il est nécessaire d'utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l'homme. La souris remplit très bien cette condition. Le modèle de traumatisme crânien utilisé est bien connu développé et étudié au sein de notre laboratoire. Notre objectif étant l'étude du rôle du cervelet dans les lésions induites par un trauma crânien, nous nous intéresserons à 3 temps de vie plus tardifs de nos animaux : 10 jours (petit enfant), 45 jours (jeune adulte) et 6 mois de vie (adulte).