Oncologie

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une fibrose du foie, elles reçoivent des injections intrapéritonéales puis des gavages quotidiens pendant quatorze jours, avant d'être anesthésiées et vidées de leur sang pour analyse des tissus. Le porteur décrit des nuisances limitées à un stress, une perte de poids ou une déshydratation, sans détailler davantage les effets du modèle de fibrose. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour étudier ces molécules de façon intégrée, la communication entre organes ne pouvant selon lui être reproduite in vitro.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie représentent plusieurs syndromes qui vont de la simple stéatose hépatique à la stéatose hépatique inflammatoire et peuvent évoluer vers la fibrose, la cirrhose et le cancer hépatocellulaire. Nous nous intéressons aux mécanismes impliqués dans le développement de ces maladies hépatiques. L’objectif du projet est de tester des molécules à potentielles thérapeutiques pouvant reverser ces pathologies. Cette étude sera réalisée sur un modèle de souris invalidé de manière inductible pour notre gène d'intéret spécifiquement dans le foie. Ces souris développent une fibrose spontanée sans phénotype dommageable.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans l'urgence clinique de trouver des traitements thérapeutiques contre les maladies du foie, puisqu’aucun traitement n'a été cliniquement approuvé à l'heure actuelle. Ainsi, cette étude permettra de tester des molécules pharmacologiques intéressantes et de comprendre à partir de quel stade de développement de la maladie ces molécules peuvent avoir un effet positif. Nous étudierons également les mécanismes mis en jeu dans l’amélioration du phénotype.

Procédures

Il y aura une identification permettant aussi le génotypage des animaux ( durée 15 secondes). Les animaux auront des injections par voie intrapéritonéale (durée 15 secondes) pendant 3 jours de suite. Ensuite, les animaux auront des gavages oraux quotidiennement pendant 14 jours. Cet acte dure 1 minute/souris. Enfin ils auront une injection par voie intrapéritonéale d'un mélange anésthésique. L'injection se fait en 15 secondes. Une fois endormie, nous prélèverons le sang par exsanguination, cet acte prend 45 secondes.

Impact sur les animaux

Nous réaliserons des injections par voies intrapéritonéale ensuite les souris seront gavées quotidiennement pendant 14 jours. Un stress de l'animal peut être observé avec éventuellement une perte de poids ou une deshydration.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin d'analyser des paramètres biochimiques et moléculaires.

Remplacement

Les molécules pharmacologiques ont déjà été testées in vitro cependant l’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier les effets de ces molécules de manière intégrée puisque ces molécules agissent sur différents organes, la communication entre les organes est indispensable. Par ailleurs, l'identification et la validation de cibles thérapeutiques par des traitements pharmacologiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine. La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux nécessaires afin de vérifier nos résultats et les valider sans que cela conduise à des répétitions inutiles. Pour cela, nous faisons en sorte, dans la mesure du possible d'exploiter au maximum nos animaux pour ne pas avoir recours à d'autres groupes expérimentaux. Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Notre expertise chez la souris et un nombre minimum de 10 animaux par groupe est requis pour avoir des données statistiquement analysables.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés par 4 à 6 et l'isolement est évité. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft ou maisons en carton. Le suivi de ces animaux sera suivi quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Le traitement pouvant induire une variation de poids, nous suivrons le poids des souris par une pesée hebdomadaire et un suivi sur fichier excel. De plus, des points limites ont été définis, s'ils sont atteints, une mise à mort anticipée sera réalisée.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus,l'utilisation de modèles de souris transgéniques permet une étude approfondie des méladies hépatiques et de tester de nouvelles pistes thérapeutiques. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes entre 8 semaines et 18 semaines. A ce stade développement, toutes les voies métaboliques hépatiques et les voies de l'inflammation sont mises en place.

1 440 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie intraveineuse ou intra-tibiale, puis subissent des prélèvements sanguins répétés, jusqu'à trente-six ponctions étalées sur dix-huit mois. Le projet vise à anticiper la rechute de patients atteints de leucémie aiguë en amplifiant leurs cellules chez la souris pour tester des médicaments. Le porteur affirme que ni les cellules de patients en culture ni les lignées cellulaires ne conviennent et conclut que la xénogreffe reste le modèle "indispensable".

Objectifs

Les leucémies aiguës sont des cancers agressifs et rares du sang. Les rechutes surviennent dans ~40% des cas et sont presque systématiquement mortelles à défaut de traitement codifié efficace. Pourtant de nouveaux traitements émergent, en particulier les thérapies ciblées. Mais nous ne savons pas quels patients peuvent en bénéficier en situation de rechute. Il est impossible de de réaliser des tests de nouveaux médicaments directement sur la leucémie du patient. La seule méthode actuellement validée dans la littérature est d’injecter les cellules leucémiques du patient au diagnostic dans un modèle de souris immunodéprimée pour amplifier les cellules leucémiques et modéliser la rechute. Aussitôt la greffe obtenue et la leucémie amplifiée, l’expérimentation est arrêtée pour récupérer les cellules leucémiques et réaliser les tests de drogues en laboratoire dont il est établi qu’ils sont parfaitement corrélés avec la réponse thérapeutique du patient en rechute. Il s’agit par conséquent d’anticiper la rechute avec ce modèle afin de proposer au patient un traitement efficace aussitôt qu’il rechute. Nous n’injecterons chez les souris que des leucémies pour lesquelles nous avons identifié qu’elles étaient à haut risque de rechute (~40% des patients).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus se situent à deux niveaux. Le premier niveau est individuel : nous pourrons identifier avant même la survenue de la rechute du patient un traitement prédit efficace par le modèle qui pourra alors être proposé dès la rechute du patient. Le deuxième niveau est collectif : nous pourrons corréler les données de ce modèle avec d’autres informations biologiques collectées dans le laboratoire afin d’identifier des biomarqueurs prédictifs de la sensibilité à chacune des thérapies ciblées. C’est un atout majeur, car les patients qui rechuteraient sans avoir bénéficié d’un tel modèle pourront disposer d’un traitement ciblé sur la base de ces biomarqueurs ; et nous pourrons ne plus utiliser le modèle murin lorsque nous aurons identifié des biomarqueurs capables de se substituer à l’utilisation du modèle animal.

Procédures

Injection de cellules leucémiques dans la veine caudale (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile contentionnée, sous anesthésie locale : 1 injection unqiue/souris (durée : 30sec). Injection de cellules leucémiques par voie intra-tibiale (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 injection unique/souris (durée 2 min). Prise de sang au niveau de la veine sub-mandibulaire (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile : 2 fois par mois, puis 1 fois par semaine (durée : 30 sec) jusqu'à atteinte d'un point limite (maximum : 36 prélèvements de 30 sec étalés sur 18 mois). Prise de sang au niveau intra-tibial (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 fois/mois à partir de 3 mois après injection des cellules leucémiques (durée : 2 min, maximum : 15 prélèvements de 2 min étalés sur 18 mois).

Impact sur les animaux

Les éventuels nuisances/effets indésirables peuvent se produire à 3 niveaux : -1/injection (éventuelle douleur post-injection, rapidement résolutive). -2/prise de greffe (éventuelles douleurs, perte de poids, changement de comportement). -3/monitorage biologique (éventuel stress momentané). -4/Le cas échéant, survenue de pathologies liées à l'âge.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les cellules leucémiques de patients (dites cellules primaires) ne peuvent pas être obtenues en quantité suffisante pour tester in vitro l’efficacité des médicaments innovants. Ces cellules sont fragiles et ne peuvent être maintenues en culture suffisamment longtemps pour les besoins des expériences. L’utilisation de lignées cellulaires de leucémies aigues ne constitue pas une alternative, car elles ne représentent pas les spécificités individuelles des patients. Le modèle murin est le seul pertinent dans cette étude pour modéliser la rechute des patients individuels dans le cadre de la médecine personnalisée. Pour toutes ces raisons, l’utilisation de xénogreffes dérivées de patients reste le modèle préclinique indispensable pour l’étude des leucémies aiguës, et pour tester l’efficacité de nouveaux traitements, comme rapporté dans la littérature scientifique.

Réduction

6 prélèvements de patients à haut risque de rechute seront reçus par mois. La prise de greffe se produit pour environ 50% des souris injectées. Pour chaque patient, il est nécessaire de récupérer les cellules leucémiques provenant de 2 souris pour espérer avoir suffisamment de cellules leucémiques pour tester notre panel de médicaments innovants en duplicats et ainsi avoir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, afin de maximiser les chances de greffe et pour espérer obtenir suffisamment de cellules pour tester leur sensibilité aux traitements innovants, les cellules leucémiques de chaque patient seront injectées dans 4 souris âgées de 8 à 12 semaines (âge auquel le taux de prise de greffe est le plus haut).

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux : Les cages sont ventilées et enrichies à l’aide de cotons, petits bouts de bois et tunnels rouges, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera assuré par un zootechnicien Les responsables du projet tiendront une fiche d'observation des points limites 1 fois/semaine ou plus, si un animal présente des signes de mal-être ou de souffrance. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques au niveau de la veine caudale se fera sous anesthésie local. Les injections et prélèvements au niveau intra-tibial seront effectués sous anesthésie gazeuse (durée totale d'environ 2 minutes) avec couverture antalgique générale (30 min avant l'injection/prélèvement) et locale (immédiatement avant et après l'injection/prélèèvement) au point d'injection. Les prélèvements au niveau de la veine sub-mandibulaire et au niveau tibial pour le suivi de la prise de greffe seront réalisés en alternant successsivement les côtés gauche et droit pour chaque souris.

Choix des espèces

Voici les facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) Les souris immunodéprimées ont été abondamment décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des leucémies humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouveau traitements. 2) L'hématopoïèse (=la fabrication des cellules du sang) et la leucémogénèse (=l'apparition de la leucémie) ont été largement étudiés chez la souris. Nous pourrons donc analyser nos résultats à la lumière de toute cette connaissance accumulée chez la souris. 3) Leur durée de vie est particulièrement adaptée par rapport à la cinétique de prise de greffe et pour un programme de recherche sur 5 ans. 4) Les 2 sexes seront utilisés sans distinction car il n'y a pas d'influence des hormones sexuelles sur la survenue des leucémies. Afin de maximiser les chances de greffe et d'obtenir suffisamment de cellules, chaque prélèvement de patient sera injecté dans 4 souris, âgées de 8 à 12 semaines (car présentent le plus haut taux de succès de prise de greffe).

Environ une souris sur cinq de la partie service, celles dont le sang compte moins de 25 % de globules blancs humains, est mise à mort dans les jours qui suivent le contrôle qualité, les autres étant expédiées à des laboratoires. 5 120 souris immunodéficientes de quatre à cinq semaines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et le champ structuré en déclare 5 000 réutilisées, soit 120 seulement mises à mort. Elles reçoivent une molécule chimique deux jours de suite ou une irradiation de 218 secondes, puis une injection intraveineuse de cellules souches humaines sous anesthésie, et jusqu'à neuf prises de sang en 23 semaines pour les nouvelles lignées, dont les souris sont tuées à l'issue de 32 semaines. Six mois après la greffe, environ 5 % des souris maigrissent, blanchissent aux extrémités et perdent leur énergie. Le porteur décrit une production destinée à "un large panel d'utilisateurs finaux", académiques et industriels, et range le transport jusqu'à eux parmi les sources de stress.

Objectifs

Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules souches humaines capables de générer un système immunitaire humain. Le recours à ces souris humanisées permet de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine. Les objectifs du présent projet sont de générer une gamme de souris humanisées pour le système immunitaire afin de les distribuer à un large panel d’utilisateurs finaux (académiques et industriels) aussi bien dans une perspective de recherche fondamentale que d’évaluation préclinique industrielle dans des domaines tels que l’hématopoïèse, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccinologie, l’oncologie… Ce projet couvrira la génération de souris humanisées déjà validées en tant que "service" et également la génération de nouveaux modèles immunodéficients humanisés en tant que projet « nouveaux modèles en Recherche et Développement "R&D" ». Ceci permettra d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Bénéfices attendus

Le recours à ces souris humanisées devrait permettre de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine (souris humanisées pour des composants cellulaires et moléculaires du système hématolymphoïde).

Procédures

Aucune procédure chirurgicale ne sera faite sur les animaux dans cette demande. Afin de rendre les souris permissives à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux immunodéficients seront soit injectés avec une molécule chimique (1 injection par jour pendant 2 jours d’une durée de 30 secondes), soit irradiés 1 seule fois pendant 218 secondes afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection intraveineuse de cellules souches humaines, et ce, après anesthésie générale gazeuse. Cette intervention dure 3 min pour la phase d’endormissement et 30 secondes pour la phase d’injection. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera suite à un unique prélèvement sanguin sur souris vigiles pour la partie « Service », ou suite à 9 prélèvements sanguins, toutes les 3 semaines sur une période de 23 semaines pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D". Le prélèvement sanguin dure 30 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Les effets néfastes du pré-conditionnement apparaissent sur environ 5% des animaux adultes humanisés et tardivement (6 mois après la greffe de cellules souches humaine). Ils se manifestent souvent par une perte de poids et une modification de l’apparence (extrémités blanches) et du comportement naturel de l’animal (animal sans énergie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour prévenir tout inconfort animal et prendre la décision appropriée selon notre grille d’évaluation de projet. Notre surveillance sera donc accentuée à 6 mois notamment pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D" » puisque les souris seront observées jusqu’à 32 semaines. De plus, du stress pourra être généré lors des prises de sang et du transport des animaux vers les utilisateurs finaux.

Devenir

Pour le Service : Tous les animaux humanisés validés par le ‘contrôle qualité’ soit environ 80% des animaux produits, présentant une proportion sanguine de leucocytes d’origine humaine >25% des leucocytes totaux sont expédiés aux utilisateurs finaux. Les animaux ne satisfaisant pas le critère requis sont écartés de tout groupe expérimental ultérieur. Ces animaux sont mis à mort dans les jours suivants le contrôle qualité car ils ne pourront plus être utilisés dans d'autres protocoles expérimentaux. Pour les nouveaux modèles : A l’issue des 32 semaines, les animaux seront mis à mort pour caractérisation du système immunitaire reconstitué (=humain).

Remplacement

Ce projet vise à produire des souris humanisées comme modèle expérimental préclinique à destination d’utilisateurs finaux des secteurs académique et industriel. Un tel modèle correspond à une attente forte pour pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques transposables à l’Homme. En proposant comme modèle la souris humanisée pour le système immunitaire, nous offrons la possibilité d’utiliser un modèle expérimental préclinique permettant le criblage d’approches thérapeutiques directement adaptées à la situation humaine. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine sans avoir recours aux modèles de primates non humains.

Réduction

Nous réalisons le projet d’humanisation en fonction des besoins exprimés ou pressentis de nos partenaires utilisateurs finaux. De plus, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux pour un rendement maximum. En exprimant le système immunitaire humain, la souris humanisée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ses applications ultérieures. Grâce au contrôle qualité systématique sur chaque souris implantée et au retour d’expérience qui en découle, nous optimisons sans cesse notre modèle de souris humanisée pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris humanisée souhaité. De plus, la génération de nouvelles lignées humanisées permettra de se rapprocher au plus près du système immunitaire humain et d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera également à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Nous veillerons au bienêtre animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet / pâtée SAFE Energy, l’ajout de coton…

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. De plus, les conditions zootechniques actuelle et le niveau d’ingénierie génétique des souris de laboratoire sont tels qu’il est possible de construire à façon, des lignées profondément immunodéficientes, une condition sine qua non pour une prise efficace et durable de xénogreffe hématopoïétique humaine. Le projet utilisera des souris juvéniles après sevrage (4 à 5 semaines) pour une meilleure prise de greffe.

96 rongeurs Arvicanthis vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumis pendant 16 semaines à un régime gras et sucré, ils subissent trois séries de huit microprélèvements sanguins sur animal vigile, que le porteur reconnaît pouvoir provoquer une douleur aiguë et une inflammation, avant un prélèvement sanguin terminal. Tous sont tués pour des analyses moléculaires et biochimiques post-mortem. Le porteur retient ce rongeur diurne pour sa proximité avec le rythme humain et affirme qu'aucune méthode sans animal ne peut caractériser la prise alimentaire, la retombée en chrononutrition humaine restant hypothétique.

Objectifs

Non seulement la quantité et la nature des aliments ingérés impactent la santé, mais le moment auquel sont pris les repas influence également le bien-être des individus. C'est notamment le cas des personnes qui ont des dîners à haute teneur énergétique et des personnes qui ont des habitudes alimentaires erratiques ou nocturnes chez lesquelles on observe une incidence accrue de diabète de type 2, d'obésité et de maladies cardiovasculaires. Au sein du système nerveux central, une région du cerveau appelée l'hypothalamus est impliquée dans le contrôle de la prise alimentaire, de la satiété et dans l'équilibre énergétique. Cette région est également responsable de l'organisation temporelle de toutes les fonctions et comportements biologiques car elle héberge une horloge biologique, les noyaux suprachiasmatiques (NSC) , qui donne le tempo à l'ensemble de l'organisme. Lors d'un régime alimentaire déséquilibré, il devient donc pertinent de pouvoir discriminer si les perturbations métaboliques observées viennent d'un déséquilibre dans les quantités d'aliments ingérés ou si elles s'accompagnent également d'une désorganisation temporelle du rythme de prise alimentaire. Le projet vise donc à étudier la chrononutrition chez Arvicanthis ansorgei, un modèle de rongeur diurne qui présente une organisation temporelle de ses fonctions biologiques similaire à celle de l'homme, comme par exemple un éveil diurne, un sommeil nocturne et une rétine riche en cônes. L'objectif sera sur des animaux nourris avec un régime équilibré 1/ de caractériser le rythme journalier de la prise alimentaire (structure temporelle sur 24h des repas, leur nombre et leur durée) ainsi que de la sécrétion des principales hormones métaboliques (insuline, leptine et corticostérone) equi la contrôlent 2/ de réaliser un phénotypage métabolique complet des animaux (volumes d'oxygène consommé et de CO2 rejeté avec calcul du quotient respiratoire et dela dépense énergétique) afijn ensuite d'évaluer les conséquences chez arvicanthis d'une exposition à un régime déséquilibré (graisse ou glucide) sur tous ces paramètres et in fine d'évaluer si les conséquences métaboliques observées sont uniquement dues au régime alimentaire déséquilibré seul ou combiné à une modification spontanée du rythme circadien de la prise alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus pourraient permettre d'envisager chez l'homme des traitements basés sur des protocoles de chrononutrition visant à proposer certains aliments à certains moments de la journée sans rompre l'équilibre énergétique. La mise en évidence qu'un régime déséquilibré riche en graisse ou sucre ne conduit pas au développement d'une obésité et d'un diabète de type 2 sur le modèle animal choici pourrait ouvrir de nouvelles pistes pour de futurs traitements chez l'humain.

Procédures

Lers animaux seront soumis à 3 séries de 8 microprélèvements sanguins (durée de chaque prélèvement = quelques secondes) réalisés sur animal vigile. Chaque série de prélèvements est séparée de la précédente par 8 semaines de récupération. Chaque animal sera soumis à un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie profonde et analgésie (durée quelques minutes). Les animaux seront soumis à 16 semaines de régime alimentaire déséquilibré (gras et sucré).

Impact sur les animaux

Les tests métaboliques réalisés par microprélèvement sanguin pourront induire une douleur aigue et pourraient créer de l'inflammation. L'exposition au régime déséquilibré pendant 16 semaines pourrait induire des perturbations métaboliques pouvant conduire à la mise en place d'une obésit et / ou d'un diabète de type 2.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements post-mortem et analyses moléculaires et biochimiques.

Remplacement

L'objectif du projet étant de caractériser la prise alimentaire (nombre de repas, durée des repas,intervalles entre les repas, quantité de nourriture ingérée), il n'est pas possible d'utiliser des méthodes alternatives. L'animal reste donc le modèle de choix pour mener à bien cette étude.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires au projet (96 animaux sur 5 ans de projet) a été calculé pour permettre d'obtenir des résultats fiables et exploitables statistiquement. Nous avons privilégié une étude longitudinale pour le métabolisme où chaque animal sera son propre contrôle. Les résultats seront analysés par des tests statistiques permettant d'établir l'impact d'un régime déséquilibré sur la prise alimentaire et le métabolisme sur arvicanthis, modèle de rongeur diurne à l'instar de l'humain et établir si arvicanthis pourrait être résistant au diabète et à l'obésité.

Raffinement

Les mâles arvicanthis sont agressifs entre eux et sont donc maintenus en cage individuelle enrichie (bâton et matériel de nidification). Les animaux sont hébergés dans le même pièce ce qui permet de maintenir les contacts olfactifs, visuels et auditifs entre les congénères. Afin de limiter le stress lié à la préhension, arvicanthis étant un animal diurne particulièrement actif, les animaux sont habitués à la manipulation qui est réalisée avec une serviette ce qui permet de prendre les animaux délicatement par le corps. Les procédures invasives sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été définis permettant d'interrompre la procédure et ainsi soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le moment du repas tout comme la quantité d'aliments ingérés ou leur qualité nutritionnelle concourrent au maintien de l'équilibre énergétique et donc au bien-être des individus. Il est donc important pour notre étude d'utiliser un modèle animal dont la niche temporelle de prise des repas se rapproche de celle de l'homme. Arvicanthis Ansorgei est un rongeur diurne qui présente des caractéristiques similaires à l'homme : rythme veille/sommeil avec un éveil diurne et un sommeil nocturne et une rétine riche en cônes. Il s'avère donc être un modèle pertinent pour étudier les conséquences d'un régime déséquilibré sur les rythmes circadiens (hormones, métabolites et gènes horloges). Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 2 à 4 mois afin de travailler sur des animaux mâtures. Pour limiter les variations entre individus il est important pour l'étude de travailler sur des groupes avec un cerveau intégrant les centres régulateurs du comportement alimenatires (hypothalamus notamment mâture).

1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis jusqu'à huit injections d'un complexe métallique dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie, avec un suivi par imagerie, le traitement pouvant provoquer des lésions d'organes et des ulcères tumoraux. Le projet évalue la biodistribution et l'efficacité antitumorale de complexes métalliques présentés comme des alternatives aux sels de platine. Le porteur indique avoir écarté in vitro les formulations les moins prometteuses et décrit la souris comme le meilleur modèle.

Objectifs

L'élaboration de nouvelles/meilleures stratégies thérapeutiques pour lutter contre le cancer et les maladies infectieuses semble être aujourd’hui nécessaire. En effet, la plupart des chimiothérapies induisent des effets indésirables importants et certains traitements impliquent un très mauvais pronostic. La mise en place de traitements thérapeutiques alternatifs est donc un enjeu majeur. L'un des médicaments les plus fréquemment utilisés contre le cancer est un complexe de platine. Ce complexe métallique présente plusieurs inconvénients importants dont celui d’induire des effets secondaires graves. La recherche s’oriente donc vers d’autres complexes métalliques actuellement en essai clinique, comme les complexes de ruthénium ou d’osmium, qui sont devenus des acteurs de premier choix en montrant des résultats extrêmement prometteurs. Cependant la chimiothérapie est un traitement médicamenteux qui s’administre par voie générale, ce qui présente deux principaux inconvénients : - une toxicité sur les cellules non cancéreuses ; - une élimination rapide des molécules donc un effet limité dans le temps. Pour pallier ceci, des formulations galéniques peuvent être utilisées afin d’augmenter la durée d’action des chimiothérapies et de réduire les effets secondaires associés, en ciblant plus spécifiquement les cellules cancéreuses. Ce projet propose d’étudier l’effet de nouveaux complexes métalliques (« principes actifs ») ainsi que l’effet de la formulation (« forme gallénique ») de ces complexes sur leur biodistribution et leur efficacité in vivo (effet antitumoral sur modèles de tumeurs pulmonaires, ovariennes, colorectales, cérébrales ou mammaires) en comparaison aux traitements standards actuellement utilisés. Le but étant de tester in vivo ces complexes qui ont été sélectionnés in vitro sur leur spécificité d’action contre les cellules tumorales et leur importante biodistribution. Enfin, ce projet propose également d’étudier les mécanismes immunitaires induits par la mort des cellules traitées par les complexes métalliques et responsables de la réduction des tailles de tumeurs. La recherche de ce projet sera donc centré sur la mort cellulaire par immunologie qui est le mécanisme clef dans l’effet des chimiothérapies sur la réduction des métastases et des tumeurs distales.

Bénéfices attendus

Les traitements chimiothérapiques actuels présentent une totoxicité et une faible spécificité ayant pour concéquence des effets secondaires graves, ce qui limite leur utilisation et entraine de mauvais pronostics. Il est donc indispensable de trouver des complexes métalliques présentant de meilleures totoxicités, ciblées plus spécifiquement vers les cellules cancéreuses, en proposant des formes galéniques innovantes. Le principal bénéfice de ce projet est de proposer de nouveaux complexes métalliques plus performants (haute toxicité préalablement identifiée sur culture cellulaire), ayant un temps de demi-vie rallongé et ciblant plus spécifiquement les cellules cancéreuses et donc qui présentent une efficacité augmentée sur la réduction des croissances tumorales tout en induisant moins d’effets indésirables. L’objectif de cette étude est de déterminer l’activité antitumorale de ces complexes sur des modèles de tumeurs colorectales, mammaires, ovariennes, cérébrales ou pulmonaires, toutes associées à la luciférase (qui permet une bioimagerie non invasive). Enfin, ce projet propose également d’étudier l’immunité induite par la mort cellulaire immunogénique. Cette immunité qui est induite par certains processus de mort cellulaire résultant du traitement chimio-thérapeutique, permet la mise en place d’une mémoire immunitaire in vivo qui entraine un cercle vertueux de mort des cellules tumorales et donc limite les rechutes et les métastases. Ce projet propose donc d’étudier le potentiel d’induction de la mort cellulaire immunogénique par les complexes métalliques étudiés, en utilisant un protocole récent et standardisé de vaccination. Pour résumer, l’étude des nouveaux complexes métalliques et de leur formulation permettrait la mise en place de traitements chimiothérapiques plus efficaces dans la réduction des tumeurs traitées, présentant moins d’effets secondaires indésirables et prévenant les rechutes et métastases.

Procédures

Pour étudier la biodistribution, les animaux recevront une implantation de tumeur ou une injection de cellules tumorales en sous-cutanée une seule fois. Cette injection est rapide et sans douleur. Puis 4 à 6 jours après cette implantation, les animaux recevront une dose unique de traitement en injection intraveineuse par le sinus rétro-orbital. Cette injection sera réalisée sous anesthésie générale et durera au maximum 6 minutes anesthésie comprise. Pour étudier l'efficacité, les animaux en rémission seront rechallengés par une injection de cellules tumorales en sous-cutanée. Les souris subiront 8 injections en rétro-orbitale de traitement au maximum (injection lundi, mardi, jeudi et vendredi pendant deux semaines). L’injection rétro-orbitale sera réalisée sous anesthésie générale et durera au maximum 6 minutes anesthésie comprise. Pour les souris receveuses de fragments, nous établirons un suivi à différents temps (à partir de J4 (temps minimum requis pour le début de croissance des fragments) et jusqu’à la fin de l’expérience (trois fois par semaine) et une imagerie non invasive de la croissance tumorale sera effectuée par imagerie optique sous anesthésie également 3 fois par semaine. Suivis par bioimagerie : les souris sont anesthésiées à l’isoflurane 5 minutes avant chaque temps d’imagerie puis placées dans l’appareil. L’acquisition de l’image ne dure que 10 minutes, soit une durée d’anesthésie totale de 15 min. Les souris sont ensuite placées en cages thermostatées pour leur phase de réveil (qui représente un risque d’hypothermie chez la souris)10 minutes puis replacées dans leur cage d’origine. Dans le cadre de l'étude de la mort cellulaire immunogénique, les animaux recevront une seule dose de vaccin sous cutané. Ils reçevront une injection de cellules tumorales au minimum et deux injections de cellules tumorales au maximum (pour les animaux en remission). Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie de la bioluminescence in vivo sur souris sous anesthésie générale. Les souris sont anesthésiées à l’isoflurane 5 minutes avant chaque temps d’imagerie puis placées dans l’appareil. L’acquisition de l’image ne dure que 10 minutes, soit une durée d’anesthésie totale de 15 min. Les souris sont ensuite placées en cages thermostatées pour leur phase de réveil (évite l’’hypothermie) 10 minutes puis replacées dans leur cage.

Impact sur les animaux

L’injection des chimiothérapies peut entrainer une totoxicité donc des effets indésirables chez la souris. En effet, ces complexes présentent une totoxicité importante, principalement dirigé vers les cellules tumorales, mais les études préalable sur lignées cellulaires ne nous permet pas d’estimer la totoxicité sur l’ensemble des cellules saines. Le traitement peut donc entrainer des lésions dans certains organes engendrant plus ou moins d’effets indésirables en fonction de l’importance des lésions. L’implantation de tumeurs sous-cutanées ou de métastases par injection de cellules tumorales peut provoquer des douleurs (ulcères, lésions).

Devenir

Les études mettent à mort les animaux à la fin de l'expérimentation.

Remplacement

Nous avons préalablement évalué, par des expériences in vitro, la totoxicité et le potentiel dans l’induction de la mort cellulaire immunogénique de plusieurs formulations dans de nombreuses lignées cellulaires pour ne tester chez l’animal que les formulations les plus prometteuses.

Réduction

Les différentes expérimentations ont été consciencieusement pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Stratégie statistique : Pour les échantillons de faible taille, les tests non paramétriques sont les tests les plus appropriés. Le choix de ce test a été effectué selon anastat.fr. Le nombre d’animaux doit être de 5 souris par groupe pour les expériences qui présentent une faible variabilité comme la biodistribution. Cependant, pour l’étude de l’efficacité ou de la mort cellulaire immunogénique, nous nécessiterons l’utilisation de 10 souris par groupe car les expériences présentent une variabilité importante. Ce nombre est calculé selon notre expérience et en tenant compte de la variabilité inter-individuelle. De plus dans une demarche de réduction, les formulations ne donnant pas une pharmacocinétique favorable ne seront pas evaluées en procédure 2 ou 3.

Raffinement

Nous nous attacherons à réduire au maximum la souffrance des souris. Les procédures d’administration en rétro-orbitale seront réalisées sous anesthésie générale. Nous utiliserons l’imagerie optique, non invasive et non traumatisante, pour évaluer l’efficacité du traitement, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés au minimum. L’implantation des tumeurs, ainsi que l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale (isoflurane). Une grille d'évaluation de la douleur adaptée à ce projet a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera la mise a mort anticipée de l'animal. Chez la souris anesthésiée, tout signe de douleur (mouvement soudain, vocalisation) induira un arrêt de l'expérimentation, une analgésie (Buprénorphine) et une nouvelle induction de l’anesthésie dans une boite à l’isoflurane. Une surveillance trois fois par semaine sera assurée après les inductions de tumeurs. Après l’anesthésie, la souris sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération interventionnelle et post examen d’imagerie. Plus généralement, un animal peut être isolé de ses congénères s’il y a présence de blessures. Les blessures seront le cas échéant désinfectées à la vetedine (en deux étapes, pour une action netoyante puis désinfectante).

Choix des espèces

Pour l’étude de la biodistribution, de l’efficacité antitumorale et de la mort cellulaire immunogénique induite par les complexes métalliques, seul un système complexe tel que l’animal peut permettre de répondre à cette question. La souris est le meilleur modèle animal permettant d’étudier la biodistribution, la pharmacocinétique et l’efficacité antitumorale d’un complexe métallique. Ce modèle relativement petit est un ensemble de systèmes biologiques proches de ceux de l’humain, qui permet d’étudier assez précisément les effets antitumlorale mais surtout les effet indésirable potentiels d’une molécule. De plus, un protocole expérimental récent chez la souris permet une étude standardisée de la mort cellulaire immunogénique. Souris BALB/c ou C57BL/6 adultes de 8 semaines donc mature : bonne immunité, pas de tumeur spontanée dans ces lignées syngéniques.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et insulinorésistantes par un régime riche en graisses, elles reçoivent dix injections dont un agent mimant l'exposition au froid, subissent sept prélèvements de sang à la queue et des pesées hebdomadaires pendant dix-huit semaines, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à savoir si une protéine, PIEZO1, joue un rôle dans l'apparition de l'obésité, retombée que le porteur formule au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'étude sur un "organisme entier".

Objectifs

L’obésité et ses complications métaboliques comme l’insulinorésistance et le diabète de type 2 (DT2) sont des problèmes de santé majeurs. L’obésité résulte principalement d’un déséquilibre entre apport et dépense énergétique. Les adipocytes blancs dans le tissu adipeux blanc sont impliqués dans le stockage du surplus énergétique sous forme de graisse. Les adipocytes bruns présents dans le tissu adipeux brun sont des cellules impliquées dans la dissipation de l’énergie sous forme de chaleur, processus appelé thermogenèse non frissonante. Au sein du tissu adipeux blanc sous-cutané coexistent, avec les adipocytes blancs, des adipocytes beiges qui comme les bruns, sont capables de dissiper de l’énergie sous forme de chaleur et dont le nombre augmente en cas de besoin thermogénique. L’obésité entraine des anomalies de fonctions des adipocytes thermogéniques bruns et beiges et la réactivation de ces adipocytes et/ou l’augmentation de leur nombre permet de corriger les anomalies métaboliques associées à l’obésité. Il existe cependant des lacunes importantes dans la compréhension des mécanismes et dans l’identité des facteurs qui régulent l’activité et/ou la formation des adipocytes thermogéniques bruns et beiges. Il a été récemment montré que ces adipocytes thermogéniques sont des cellules mécanosensibles suggérant que des protéines activées par des stimulations mécaniques puissent contribuer au contrôle des fonctions biologiques de ces cellules. Nous avons récemment découvert que les adipocytes bruns expriment en grande quantité un canal ionique mécanosensible fonctionnel. L'objectif de ce projet est de déterminer le rôle de ce canal ionique mécanosensible dans la fonction et le développement des adipocytes thermogéniques bruns et beiges et d'évaluer si son absence dans ces adipocytes thermogéniques conduit au développement de l'obésité et de ses complications métaboliques. Pour cela nous générerons des souris n'exprimant plus ce canal ionique mécanosensible dans les adipocytes bruns et beiges. Nous étudierons l’impact de l’absence de cette protéine dans ces adipocytes sur le développement de l’obésité induite par un régime riche en lipides et sur le développement de l'insulinorésistance et du diabète. Nous déterminerons si cette protéine contrôle, in vivo, le développement et/ou la fonction de ces adipocytes thermogéniques.

Bénéfices attendus

A l’issue de ce programme, nous espérons comprendre si la protéine PIEZO1 joue un rôle dans l’apparition de l’obésité. Si cette hypothèse est vérifiée, ces connaissances pourraient servir à développer des méthodes de prévention et de lutte contre le surpoids et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Tous les animaux (vigiles) sont soumis à : 1) une injection de glucose, une injection d’insuline, 7 injections d’un agent mimant l’exposition au froid, une injection d'anesthésique. Au total 10 injections sur les 18 semaines de la procédure. Chaque injection dure quelques secondes ; 2) sept prélèvements d’une goutte de sang au niveau de la queue (une quinzaine de secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Nuisances attendues : 1) obésité et insulinorésistance 2) contraintes des pesées hebdomadaires 3) contention et douleur lors des injections et des prélèvements

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure . Ceci est nécessaire pour prélever les différents tissus et les analyser.

Remplacement

Le diabète et l’obésité sont des maladies d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Ces pathologies affectent la régulation du métabolisme insulino-glucidique et lipidique. De plus, elles s’expriment àl’échelle d’un organisme et font donc intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose et des lipides. Ainsi, son apparition et sa gravité résultent de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Il n‘existe pas pour l’instant de modèle in vitro qui pourrait remplacer l‘expérimentation sur un organisme entier pour répondre aux questions posées ici.

Réduction

Réduction: Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un nombre d’animaux minimum, grâce à l’utilisation d’outils statistiques et de l’expérience d’études précédentes menées dans notre équipe. Nous constituerons des groupes de 10 souris (contrôles et mutées). Le nombre total de souris nous permettra d’obtenir en quantité suffisante tous les échantillons tissulaires nécessaires à notre étude. Ce nombre nous permettra également de réaliser des études statistiques adaptées.

Raffinement

Raffinement : Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées avec le souci de préserver le bien-être de l‘animal : hébergement à 30°C correspondant à leur température de confort (thermoneutralité) ; enrichissement de l’environnement (maisonnettes, buchettes, tiges papier), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur ; surveillance régulière suivie selon une grille d’évaluation prévoyant le recours à des points limites précoces et adaptés; prélèvements sur animaux vigiles effectués par des personnes expérimentées; prélèvements espacés dans le temps au maximum et volumes prélevés correspondant au minimum nécessaire.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris . Ce modèle correspond à l'espèce et à la souche sur laquelle nous travaillons dans notre laboratoire et pour laquelle nous avons plusieurs données de référence pour notre étude. De plus cette souche est connue pour répondre aux régimes riches en graisse en développant une obésité et une insulinorésistance. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 12 semaines. Ces expériences étant d’une durée maximum de 18 semaines, l’âge maximum des souris en fin d’expérience sera d’environ 30 semaines. L’obésité nutritionnelle prend du temps à se mettre en place et nous voulons examiner des sujets adultes. Ces durées de régime et stades de développement ont déjà été utilisés dans notre équipe pour étudier l’obésité induite par le régime. Ceci nous permettra de comparer nos résultats aux études précédentes.