Oncologie
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Impact d’APRIL sur la survenue d’une néphropathie à IgA1 murine
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 120 d'entre elles et sévère pour 120. Elles reçoivent des injections trois fois par semaine pendant trois mois et sept prélèvements sanguins, le RNT évoquant aussi un gavage et une infection par Salmonella non repris dans la description des procédures. Le projet développe un modèle de néphropathie à IgA, une maladie rénale humaine, en étudiant l'effet d'un facteur de croissance sur sa sévérité. Le porteur affirme qu'aucun remplacement n'est possible dans cette situation multifactorielle et présente les effectifs comme le minimum "indispensable".
Objectifs
Le but du projet est le développement d'un modèle de maladie rénale : la néphropathie à immunoglobuline A, chez la souris. Cette maladie rénale humaine est responsable d'une évolution vers l'insuffisance rénale terminale (dialyse ou transplantation rénale) chez 30% des patients qui en sont atteints, alors que la fréquence de la maladie est autour de 0,5% de la population. Il s'agit d'une maladie à plusieurs facteurs, génétique en partie, et faisant également intervenir le système immunitaire des muqueuses (intestin, bronches) via la production d’un type d’anticorps, nommées IgA, au niveau de ces muqueuses. Une des anomalies au cours de cette maladie est le fait que ces anticorps soient déversés anormalement dans le sang. Parmi les facteurs impliqués dans cette anomalie, le rôle d’un facteur de croissance de globules blancs produisant cet anticorps semble être très important. En effet, les patients atteints de cette maladie présentent des concentrations de ce facteur de croissance plus élevées que les volontaires sains et d’autre part une particularité génétique portant sur la production de ce facteur est plus souvent présente chez les patients. Nous disposons d'un modèle de souris produisant des IgA humain dans le sang mais aucune production de cet anticorps dans les muqueuses. Ces souris présentent des dépôts d'IgA humain dans leurs reins avec un début d'inflammation. Il s'agit au cours de ce projet, d’étudier les souris mutantes afin d'évaluer l'impact du facteur de croissance sur l’apparition d’une maladie plus sévère.
Bénéfices attendus
Si le rôle d'APRIL sur la sévérité de la néphropathie à IgA se confirme dans ce modèle, cette cytokine ainsi que ses récepteurs deviendront une cible thérapeutique évidente dans cette maladie. Des molécules visant cette voie sont déjà disponibles (ex: belimumab) pour le traitement d'autres pathologies inflammatoires (lupus). Elle permettra de mieux comprendre le rôle de l'immunité muqueuse au cours de la maladie.
Procédures
Prélèvement d'oreille pour génotypage : 30sec par animal Prélèvement sanguin: 1 mn par animal - 7 fois en 3 mois Injection: 30sec par animal - 3 fois par semaine sur 3 mois
Impact sur les animaux
Possibles douleurs liées aux prélèvements sanguins et prélèvements d'oreille, classe légère, pratique courante en laboratoire. Possible douleur et inconfort lié au gavage. Possible troubles digestifs dont diarrhées et amaigrissements dans la procédure de challenge muqueux par Salmonella, points limites définis.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements de sang et d'organes afin d'analyser les données et obtenir les résultats.
Remplacement
Il s'agit d'un modèle physiopathologique, nécessitant un environnement in vivo, aucun remplacement n'est possible dans cette situation multifactorielle
Réduction
Le nombre d'individus utilisés par génotype est le minimum d’individus indispensable pour effectuer la procédure d’expérimentation et obtenir des résultats pertinents interprétables. Le nombre d'animaux par génotype est le nombre minimal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs. Afin de minimiser le nombre d’individus nécessaires, un test statistique a permis à partir d’une hypothèse réaliste de prévoir le nombre de souris le plus pertinent.
Raffinement
Toutes les expérimentations sont réalisées dans une animalerie certifiée qui possède tous les éléments du raffinement. Toutes les mesures de réduction de l’inconfort animal sont prévues, à savoir la mise en place d’une anesthésie générale avant tout geste invasif, une analgésie lors des interventions potentiellement douloureuses et la mise en œuvre de points limite adaptés, conduisant à la mise à mort en cas de souffrance. Des observations quotidiennes seront mises en place tout au long du projet, et adaptées pour chaque individu.
Choix des espèces
L'expérimentation sur animaux de petite taille apporte des éléments de connaissance physiopathologique impossible à atteindre en expérimentation in vitro seule ou en clinique humaine car: - elle permet d'être à l'initiation de la maladie ce qui n'est pas possible chez l'homme (maladie peu symptomatique, souvent diagnostiquée après de longues années d'évolution). La mécanistique pathogénique ne peut donc être appréhendée qu'en expérimentation animale dans le cas de cette maladie. - le développement d'un modèle animal permettra d'identifier des cibles thérapeutiques, de tester des interventions thérapeutiques chez l'animal en vue de dégager des traitements candidats transférables en clinique humaine. - Les souris utilisées dans ce projet auront 3 mois: cet âge choisi est optimal pour l’étude de la réponse de l'anticorps (IgA) car il correspond à la phase de développement du répertoire immunologique muqueux.
Rôle de l’inflammation périnatale dans les troubles neurodéveloppementaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
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3 433 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent pendant leurs cinq premiers jours de vie des injections d'une cytokine inflammatoire qui provoquent déshydratation, retard de croissance et, dans cinq à dix pour cent des cas, la mort, puis subissent une série de tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature. Le projet étudie le rôle des microglies dans les troubles neurodéveloppementaux liés à l'inflammation périnatale, chez les mâles et les femelles. Le porteur affirme que ces mécanismes ne peuvent être étudiés que sur l'animal vivant et fixe pour objectif le transfert des résultats à l'humain.
Objectifs
Les troubles neurodéveloppementaux ont des causes multiples y compris environnementales. Un lien entre des épisodes inflammatoires pendant la vie périnatale et une augmentation du risque de développer des troubles neurodéveloppementaux chez le descendant ont été démontrés. Récemment, le rôle des microglies (cellules immunitaires du cerveau) dans ces troubles a été mis en évidence chez la descendance mâle. Cependant, aucune donnée sur la descendance femelle, ni sur les troubles cognitifs de la descendance n'ont été générées. Ce projet se base sur un modèle d'inflammation périnatale. L’objectif est d'étudier le rôle des microglies dans les troubles cognitifs neurodéveloppementaux chez le mâle et la femelle sur modèle murin.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir le rôle des microglies dans la mise en place des troubles cognitifs à l'âge adulte des descendants mâles et femelles après inflammation gestationelle. Cette étude permettra d'obtenir des données concrètes sur les deux sexes, ce qui n'est actuellement pas disponible, mais également sur la sphère cognitive, très peu documentée à ce jour. L'approche par l'utilisation d'une drogue permettant la recolonisation microgliale permettra par ailleurs d'établir une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement des troubles neurodéveloppementaux.
Procédures
Tests comportementaux à la période juvénile et à l'âge adulte (6 tests en juvénile et 5 à l'âge adulte) – quelques minutes par test. Injections intrapérionéales pendant les premiers jours de vie - quelques secondes
Impact sur les animaux
Les injections réalisées sur les souriceaux durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation avec leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Les injections de cytokine inflammatoire induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent montrer des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris injectées avec une solution neutre. Ces effets perdurent environ jusqu’au quinzième jour de vie. Les injections en général peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie abdominale interne chez les souriceaux, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entraîner des nuisances modérées notamment durant les tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
L’étude des microglies (cellules immunitaires du cerveau) au cours du développement nécessite des modèles non humains. L'étude des effets de l’inflammation maternelle ne peut se faire de manière fine chez l'homme et nécessite de fait l'utilisation d'animaux vivants. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser ces étapes du développement cérébral et la recherche bibliographique indique que la réponse inflammatoire correspondant à nos modèles n'est pas développée in vitro à ce jour. La proximité des microglies humaines et des souris permettra un transfert à l'homme à la suite de ce projet, ce qui reste notre priorité et notre objectif scientifique premier : comprendre chez l'homme le développement des microglies durant les phases développementales.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons choisi un nombre minimal permettant d'observer des différences menant à des conclusions statistiques. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre de destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer sur une population cellulaire triée à partir de structures cérébrales. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique.
Choix des espèces
Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris et l'accrétion de données nouvelles sur modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. De plus, les microglies de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun et permettent de conduire à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Les analyses seront conduites au cours de la période post-natale pour le comportement juvénile (P3-P16) et à l'âge adulte (après P60) pour l'évaluation comportementale et les études biologiques subséquentes.
Étude de l’effet d’une combinaison thérapeutique d’un anti-angiogénique et d’un inhibiteur de point de contrôle immunitaire sur un modèle de cancer métastatique hépatique murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ouverture de la cavité abdominale avec injection de cellules tumorales dans la rate puis ablation de la rate, suivie d'un traitement par voie intrapéritonéale, avant une mise à mort entre seize et vingt-deux jours après l'opération pour prélever leur foie. Le projet teste une bithérapie contre le cancer colorectal métastasé au foie, dont l'intérêt pour l'humain reste renvoyé au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que les méthodes in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d'un organisme et décrit la souris comme la seule espèce disponible.
Objectifs
Ces dernières années, l’immunothérapie a suscité un engouement dans le monde de la cancérologie. Cette dernière consiste à mobiliser le système immunitaire des patients pour cibler et éliminer les cellules tumorales. Les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI) ont montré des effets puissants et durables mais seulement sur un faible pourcentage de patients. L’une des raisons pouvant expliquer ces résultats pourrait être un manque d’infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs. De manière à rétablir un infiltrat lymphocytaire dans la tumeur, il est possible de cibler l’angiogenèse. L’angiogenèse correspond à la formation de nouveau vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants et est nécessaire pour assurer le transport des nutriments et de l’oxygène dans la tumeur. Au sein des tumeurs, l’angiogenèse induit un environnement immunosuppresseur et perturbe également la migration des cellules immunitaires car les vaisseaux sanguins sont anormaux. De ce fait, il est intéressant de cibler l’angiogenèse afin de normaliser les vaisseaux sanguins et de favoriser la réponse immunitaire antitumorale en réduisant l’environnement immunosuppresseur. La combinaison thérapeutique des ICI et des anti-angiogéniques a fait l’objet de nombreux essais cliniques et son efficacité est approuvée dans le traitement de plusieurs cancers solides. En dépit d’une réelle avancée ces dernières années, une compréhension plus approfondie des mécanismes d’action de cette bithérapie est nécessaire pour permettre de mieux cibler les patients répondeurs et apporter des réponses quant à son efficacité. Au laboratoire, nous avons montré que cette bithérapie améliore, in vivo, les réponses anti-tumorales dans différents modèles de cancer chez la souris. Cependant ces observations ne nous permettent pas de confirmer totalement l’intérêt de la bithérapie chez l’homme. En effet, les métastases sont la principale cause de décès du cancer chez l’homme et environ 50 % des cancers du côlon entraînent des métastases dans le foie ou encore les poumons. De plus, les cancers du côlon métastatiques sont plus difficiles à soigner. Dans ce contexte, afin de confirmer l’intérêt de la bithérapie chez l’homme nous souhaitons développer une approche d’induction de cancer colorectal métastasé dans le foie.
Bénéfices attendus
Le but de ce travail est d’explorer l’effet de la combinaison αPD-1 et αVEGR-2 dans un modèle de cancer colorectal en métastase hépatique pour confirmer son intérêt chez l’Homme. Les métastases sont la principale cause de décès du cancer chez l’Homme et environ 50% des cancer du côlon entrainent des métastases. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients et de confirmer que ce traitement pourrait être utilisé chez des patients présentant des métastases. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients afin d'augmenter leur chance de survie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale : ouverture de la cavité abdominale, injection de cellules tumorales dans la rate, splénectomie, fermeture de la cavité abdominale. Par la suite, les souris seront traitées en intrapéritonéale. 16 et 22 jours après l’intervention chirurgicale, les souris seront mise à mort.
Impact sur les animaux
L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris et de réaliser une splénectomie. Cette intervention chirurgicale pourrait entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par l’intervention chirurgicale. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les foies.
Remplacement
1. Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. 2. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.
Raffinement
Tous le long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydration (pli de peau : si le pli persiste plusieurs seconde, l’animal est fortement déshydraté) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisées tous le long de l’expérimentation : du soins pré au post-opératoire. Des antalgiques seront utilisés pour limiter la souffrance de l’animal. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. De la nourriture sera également mise dans la cage. Pour remédier aux infections qui peuvent être causées par l’intervention chirurgicale, un travail en condition aseptique sera réalisé. Pour cela, des espaces propres et sales seront utilisés. L’espace non-stérile sera utilisé pour les soins pré-opératoires, l’anesthésie, la tonte, les soins post-opératoires. L’espace stérile sera utilisé pour la préparation des consommables utilisés lors de l’acte chirurgical et l’acte chirurgical en lui-même. De plus, les deux premiers jours suivant l’intervention, une désinfection de la cicatrice sera réalisée. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. .
Choix des espèces
Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation. De plus, diverses souches de souris immunocompétentes sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, telles que les souris C57Bl/6 (MC38) et les BALB/c (CT26). Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.
Mesure de la consommation d’oxygène du bar juvénile en milieu naturel
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système respiratoire
70 bars européens juvéniles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Capturés dans leur milieu naturel, ils sont poursuivis à l'épuisette jusqu'à épuisement, exposés à l'air une minute, puis maintenus vingt-quatre heures dans une chambre de mesure avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le porteur qualifie lui-même d'intense le stress de la phase d'émersion et de la sortie de l'appareil. Il affirme que "seule l'expérimentation animale" permet d'étudier les réponses physiologiques de l'organisme entier, ici la consommation d'oxygène de poissons sauvages.
Objectifs
Ce projet vise à étudier les réponses physiologiques des juvéniles de bars européen aux changements environnementaux dans les zones côtières et estuariennes dans lesquelles le bar vit ses premières années de vie. Ces zones sont des zones naturellement très variables auxquelles les bars sont adaptés. Cependant les changements environnementaux dus aux activités humaines (réchauffement climatique, nuisances sonores, polluants, etc.) imposent des contraintes supplémentaires qui peuvent affecter de multiples processus physiologiques des poissons, dont le métabolisme qui sera l’objet de ce projet. Le métabolisme englobe les réactions chimiques permettant la synthèse de l’énergie nécessaire à la vie des organismes. Cette énergie régit la capacité des individus à survivre, se reproduire, grandir et leur permet de faire face aux variations de leur environnement. Les bars juvéniles vivant dans des habitats altérés risquent de dépenser beaucoup d’énergie pour faire face aux contraintes environnementales imprévisibles et stressantes et donc s’affaiblir. La respirométrie est une des mesures du métabolisme les plus répandues qui permet de mesurer la consommation d’oxygène à l’échelle d’un organisme. Les mesures de respirométrie nécessitent de placer un poisson dans un environnement clos dans lequel on mesure la consommation d'oxygène à partir de laquelle il est possible de mesurer les taux métaboliques maximaux et standards. Les approches classiques d'étude du métabolisme des poissons se basent sur des mesures de consommation en oxygène dans des environnements contrôlés. Ce projet a donc pour objectif de mettre en place et valider la technique de la respirométrie sur des juvéniles de bar européen sauvages pour mesurer les taux métaboliques maximaux et standards en limitant les biais liés à l'acclimatation des poissons à la vie en captivité.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet nous permettra de mesurer le métabolisme énergétique des poissons en minimisant le temps de transfert des animaux entre capture et mesure. Habituellement, les animaux sont ramenés en laboratoire et connaissent de nombreuse étapes particulièrement stressantes (pêche, transfert et transport dans un véhicule, acclimatation aux conditions de laboratoire) qui peuvent affecter à long terme leur métabolisme. Ce projet nous permettra donc de montrer comment il est possible de mesurer la consommation en oxygène du poisson dans son environnement naturel. A moyen terme, les résultats de ce projet nous permettront de comprendre plus précisément l’impact des variables environnementales sur le métabolisme des juvéniles de bar, donc de mieux décrire les contraintes écologiques qui s’exercent sur les juvéniles et impactent leur métabolisme et donc leur investissement énergétique dans la survie, la croissance ou la reproduction. A long terme, la réalisation de ce projet permettra l’application de l’outil « respirométrie de terrain » à d’autres modèles animaux. De plus, ce projet se veut d’apporter de nouvelles connaissances sur le métabolisme à l’échelle cellulaire, en lien avec les taux métaboliques mesurés à l’échelle de l’individu (respiromètre) sur le terrain.
Procédures
Les poissons seront soumis à une capture dans leur milieu naturel avec un engin de pêche, puis soumis individuellement à un exercice physique intense pendant quelques minutes. Cet exercice consiste en une poursuite avec une épuisette dans un espace confiné (dans un seau de 10L) pendant 10 minutes maximum, suivi d'une phase de récupération, puis maintenu dans une chambre de mesure à oxygène pendant 24h, et enfin transférés dans une cuve de transport jusqu'à un laboratoire pour être mis à mort. Cette manipulation entraine donc les interventions suivantes sur les poissons : - capture avec engins de pêche (moins de 10 min pour la senne et maximum 2 heures pour le verveux) ; - 2 transferts à l’épuisette (du piège au bac de transport, du bac de transport à la chambre respirométrique, chacun ≤ 1 min) ; - transport du lieu de capture au lieu d’installation des respiromètres (< 15 min) ; - protocole de chasse du poisson avec une épuisette (exercice physique intense induit manuellement en chassant le poisson avec l’épuisette jusqu’à épuisement du poisson ; procédure qui dure < 10 min) ; - émersion de 1 min ; - maintien du poisson dans le respiromètre et mesure de l’activité métabolique (isolement pendant 24h avec un courant continu léger lui permettant de maintenir une nage passive ou de routine) ; - sortie du poisson du respiromètre après la mesure et mise à mort de l’individu.
Impact sur les animaux
- Un stress léger pendant la pêche dans les zones de capture. Le temps passé dans l’engin de pêche. Si les poissons sont capturés avec la senne de plage, ce stress ne durera que quelques minutes (la senne de plage est un filet mis en œuvre à la main). Si les poissons sont capturés avec le verveux (nasse capturant les poissons au moment de la montée ou de la descente de la marée) ce stress durera 3 heures maximum. - Les 2 transferts à l’épuisette (du piège au bac de transport, du bac de transport à la chambre respirométrique, chacun ≤ 1 min) et le déplacement du bac de transport du lieu de capture au lieu d’installation des respiromètres (< 15 min) seront des stress légers. - Un stress modéré pendant la chasse du poisson (exercice physique intense induit manuellement en chassant le poisson avec l’épuisette jusqu’à épuisement du poisson ; procédure qui dure < 10 min) - Un stress intense durant la phase d’émersion de 1 min. - Un stress modéré pendant le maintien du poisson dans le respiromètre (isolement pendant 24h avec un courant continu léger lui permettant de maintenir une nage passive ou de routine). - Un stress intense pendant la sortie du poisson du respiromètre après la mesure et jusqu’à la mise à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour réaliser des prélèvements d'organes.
Remplacement
A ce jour, seule l’expérimentation animale permet de réaliser une étude qui englobe l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques. Cela permet notamment de caractériser le résultat d’interactions complexes entre différents tissus et fonctions cellulaires, offrant ainsi la possibilité d’avoir un suivi complet des réponses mitochondriales face à l’environnement de l’animal.
Réduction
Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte tenu de l’étendue de la variabilité attendue entre nourriceries des processus étudiés dans cette étude. Cette étude peut se dérouler selon différent scénarii, selon la validation des méthodes à différentes étapes. Le nombre total de poissons mis à mort demeure le même quel que soit le scénario : 60 juvéniles. Pour ces poissons nous réaliserons les mesures de respirométrie puis ils seront mis à mort pour réaliser des mesures d’activité mitochondriale en laboratoire (à partir du cœur) ainsi que d’autres analyses en laboratoire. L’analyse des données de respirométrie nécessite l’extraction des données de consommation d’oxygène (mesurées en continue sur 24h au maximum ; 2h si seul le taux métabolique maximal est mesuré). Mesurer le taux métabolique standard et maximal nécessite de nettoyer les données brutes (enlever les outsiders et points aberrants). Nous comparerons les poissons de différents groupes (âge ou site) par des analyses de variance avec les mesures de métabolisme en variable réponse et le site de capture ou l’âge en variable explicative. En laboratoire, la taille habituelle des groupes comparés est d’environ 10-15 individus. Etant donné que la variabilité inter-individuelle en milieu naturel sera plus élevée, nous prévoyons la mesure de 20 individus par site ou par âge pour avoir une puissance statistique suffisante.
Raffinement
La pêche des poissons sera réalisée à la senne de plage ou verveux permettant de réduire au maximum le stress généré par la capture des poissons. Le verveux est mis en place à la main dans le courant d’eau. Les poissons qui redescendent les cours d’eau avec la marée sont amenés progressivement vers le cul du chalut. Il est possible d’inspecter le cul du chalut et d’arrêter le travail du verveux dès que les poissons ciblés sont capturés. La senne de plage comporte une partie fixe (maintenue par un poteau) et une partie mouvante, mise en œuvre à la main. En faisant un arc de cercle il est possible de capturer des poissons sur les rivages en limitant leur stress (temps de manœuvre : 10 minutes). Ces méthodes de capture dites « passives » assurent un meilleur bien-être animal par rapport au chalutage qui peut être particulièrement stressante (poisson capturé longtemps et forcé à nager rapidement dans le chalut). Les transferts des poissons seront réalisés avec des épuisettes permettant de préserver les écailles et le mucus des poissons. Le bac de transport sera opaque, avec un couvercle pour limiter le stress. Le bac (environ 10L, diamètre 30 cm, avec des poignées) sera équipé d’un bulleur pour maintenir dans l'eau un niveau d'oxygénation proche de la saturation. Les poissons pourront se retourner dans le bac de transport. Les prélèvements d'eau se feront au point de capture permettant de maintenir les poissons dans une eau de qualité similaire à celle de son leur environnement. Les équipements pour la « chasse » (épuisette, bac de transport) et la respirométrie (respiromètres) seront installés à proximité de chaque lieu de capture et permettra de limiter les temps de déplacement entre capture-phase d’épuisement-mesures en respiromètre. L'eau du bac sera prélevée sur les lieux de captures; l'eau du respiromètre est régulièrement renouvelée à 100% (au plus toutes les 10 minutes). Afin de limiter les transferts, les poissons capturés seront immédiatement placés dans un bac de transport individuel (le même bac qu'à la phase d'épuisement puis de transfert dans le respiromètre). La chambre de respiration, immergée, sera transparente pour que le poisson voit la lumière naturelle. La zone d’immersion de la chambre sera hors vue des expérimentateurs. Les poissons seront donc soumis aux variations naturelles de leur environnement (température, salinité, marée, luminosité).
Choix des espèces
D’importantes pêcheries commerciales et récréatives dépendent du bar européen qui est également une des espèces de poisson les plus étudiées en laboratoire ou en aquaculture. Pourtant l'écologie de cette espèce dans son milieu est globalement mal connue en dehors des grandes étapes de son cycle de vie. Suite à une série de mauvais taux de recrutements et d’une forte pression de pêche, la biomasse du stock reproducteur de bar dans l'Atlantique Nord est devenue préoccupante. Comme les caractéristiques biotiques et abiotiques (paramètres physico-chimiques et biologiques) évoluent rapidement en raison des changements climatiques et des perturbations anthropogéniques, il est important de comprendre la réponse des bars européens aux changements environnementaux dans leur milieu naturel, d’où notre étude sur le métabolisme.
Étude de l’effet d’une combinaison thérapeutique d’un anti-angiogénique et d’un inhibiteur de point de contrôle immunitaire sur un modèle de cancer colorectal orthotopique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur ouvre l'abdomen pour injecter des cellules tumorales dans le caecum, avant un traitement par voie intrapéritonéale, l'intervention pouvant provoquer douleurs, perte de poids et infection. Les retombées annoncées, confirmer chez l'humain l'intérêt d'une bithérapie déjà employée en clinique, restent à démontrer. Le porteur affirme que le cancer implique des interactions "possibles seulement dans un organisme vivant" et que les expériences in vitro "ne suffisent pas".
Objectifs
Ces dernières années, l’immunothérapie a suscité un engouement dans le monde de la cancérologie. Cette dernière consiste à mobiliser le système immunitaire des patients pour cibler et éliminer les cellules tumorales. Cette approche a montré des effets puissants et durables mais seulement sur un faible pourcentage de patients. L’une des raisons pouvant expliquer ces résultats pourrait être un manque d’infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs. De manière à rétablir un infiltrat lymphocytaire dans la tumeur, il est possible de cibler l’angiogenèse. L’angiogenèse correspond à la formation de nouveau vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants et est nécessaire pour assurer le transport des nutriments et de l’oxygène dans la tumeur. Au sein des tumeurs, l’angiogenèse induit un environnement immunosuppresseur et perturbe également la migration des cellules immunitaires car les vaisseaux sanguins sont anormaux. De ce fait, il est intéressant de cibler l’angiogenèse afin de normaliser les vaisseaux sanguins et de favoriser la réponse immunitaire antitumorale en réduisant l’environnement immunosuppresseur. La combinaison thérapeutique des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI) et des anti-angiogéniques a fait l’objet de nombreux essais cliniques et son efficacité est approuvée dans le traitement de plusieurs cancers solides. En dépit d’une réelle avancée ces dernières années, une compréhension plus approfondie des mécanismes d’action de cette bithérapie est nécessaire pour permettre de mieux cibler les patients répondeurs et apporter des réponses quant à son efficacité. Au laboratoire, nous avons montré que cette bithérapie améliore, in vivo, les réponses anti-tumorales dans différents modèles de cancer hétérotopique chez la souris. Cependant ces observations ont été réalisé sur des modèles de cancer colorectaux injectés en sous cutané et ne nous permettent pas de confirmer totalement l’intérêt de la bithérapie chez l’Homme. En effet, les modèles hétérotopiques ne permettent pas d’analyser les interactions entre la tumeur et l’environnement spécifique du côlon. Dans ce contexte, afin de confirmer l’intérêt de la bithérapie chez l’Homme nous souhaitons développer une approche d’induction de cancer colorectal orthotopique : les cellules tumorales seront injectées directement dans le caecum.
Bénéfices attendus
Le but de ce travail est d’explorer l’effet de la combinaison αPD-1 et αVEGR-2 dans un modèle de cancer colorectal orthotopique pour confirmer son intérêt chez l’Homme. En effet, les modèles hétérotopiques ne permettent pas d’analyser les interactions entre la tumeur et l’environnement spécifique du côlon. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients et confirmer que ce traitement pourrait être utilisé chez des patients. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients afin d'augmenter leur chance de survie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale : ouverture de la cavité abdominale, injection de cellules tumorales dans le caecum, fermeture de la cavité abdominale. Par la suite, les souris seront traitées en intrapéritonéale. 14 jours après les traitements, les souris seront mises à mort.
Impact sur les animaux
L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris et d’injecter des cellules tumorales dans le caecum. Cette intervention chirurgicale pourrait entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par l’intervention chirurgicale. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences car ils sont porteurs de tumeurs et ne pourront pas être ré-utilisés.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur des modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.
Raffinement
Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau : si le pli persiste plusieurs secondes, l’animal est fortement déshydraté) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tout le long de l’expérimentation : du soin pré aux post-opératoires. Des antalgiques seront utilisés pour limiter la souffrance de l’animal. Des enrichissements de milieu seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leur nid. De la nourriture sera également mise dans la cage. Pour remédier aux infections qui peuvent être causées par l’intervention chirurgicale, un travail en condition aseptique sera réalisé. Pour cela, des espaces propres et sales seront utilisés. L’espace non-stérile sera utilisé pour les soins pré-opératoires, l’anesthésie, la tonte, les soins post-opératoires. L’espace stérile sera utilisé pour la préparation des consommables utilisés lors de l’acte chirurgical et l’acte chirurgical en lui-même. De plus, les deux premiers jours suivant l’intervention, une désinfection de la cicatrice sera réalisée. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations.
Choix des espèces
Diverses souches de souris immunocompétentes sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, telles que les souris C57Bl/6 (MC38) et les BALB/c (CT26). Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.
Thérapie pour la myopathie à agrégats tubulaires en utilisant des AAV dans le modèle souris – «TransTAM»
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
465 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers pour 285 d'entre elles et modérés pour 180. Ces souris portent une mutation reproduisant une myopathie humaine rare et subissent des tests répétés de force et d'activité locomotrice, un test de saignement, des injections intraveineuses d'un vecteur de thérapie génique, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie terminale avant mise à mort pour prélever les muscles. Les bénéfices annoncés, une première "preuve de concept" transposable aux patients, restent au conditionnel. Le porteur affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité musculaire ni les effets sur l'ensemble de l'organisme.
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes, et des myalgies. La majorité des patients montrent des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multi-systémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Afin de corréler les dysfonctions cellulaires avec le développement de la maladie, nous avons généré et caractérisé un modèle murin portant la mutation TAM/STRMK la plus commune. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible. Nous avons l’intention d'inverser les symptomes des souris TAM/STRMK par une régulation négative d'un gène important pour la maladie, afin de fournir une approche translationnelle pour les essais thérapeutiques prospectifs chez les patients. Nous avons effectué des injections intramusculaires de souris TAM/STRMK et déterminé un effet positif sur la fonction musculaire. Ces résultats préliminaires nous encouragent à tester la même approche sous une forme systémique, afin de pouvoir à la fois prévenir et inverser le phénotype multisystémique des souris TAM/STRMK.
Bénéfices attendus
Il est attendu que cette étude apportera la première preuve de concept pour un traitement efficace de TAM/STRMK. En effet, nos résultats préliminaires ont montré un effet bénéfique suite à l'administration du traitement dans le muscle, et il reste à démontrer que cette approche est également efficace par injection systémique et capable d’améliorer les phénotypes des plaquettes, de la peau, de la rate, et des os. De manière importante, la thérapie est conservée entre la souris et l’homme et pourra être utilisée chez les patients TAM/STRMK dans des tests cliniques ultérieurs.
Procédures
Des tests de comportement seront réalisés une fois par mois chez l’animal vivant à partir de 4 ou 16 semaines selon la cohorte jusqu’à 4 ou 8 mois d’âge. Le test de comportament permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour, avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque test. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test de comportament permettant de mesurer la force musculaire des pattes antérieures de l’animal dure 10 secondes, et sera répeté 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement est utilisé pour évaluer la coagulation sanguine et la capacité de l'organisme à former un caillot en cas de lésion vasculaire. Il sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Le test pour l'obtention du sang sera répeté 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections intraveineuses seront réalisées pour administrer le traitement. Entre l'anesthésie et l'injection, la procédure prendra environ 2 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris sont plus petites que les souris sauvages et manifestent des problemes dans le muscle, la rate, la peau, les plaquettes et l'os, démontrant que notre modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie. Pour la deuxième lignée de souris, une caractérisation complète sera bientôt effectuée pour confirmer un phénotype dommageable. Les tests de comportament peuvent induire du stress sur l'animal. Ces tests dureront le moins de temps possible pour que les tests soient significatifs, de sorte que l'animal souffre le moins possible.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.
Réduction
Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, de la couleur de la peau, ainsi que l'évaluation de la présence d'une poche de lait seront évalués tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. L'environment sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée avant le début du suivi longitudinal pour chaque test. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué.
Choix des espèces
Les souris sont nécessaires pour ces expériences afin de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes après une modification génétique. Le modèle murin nous permet d'étudier l'amélioration potentielle du phénotype musculaire, ainsi que du phénotype observé sur d'autres organes, dans ce modèle de maladie murine multisystémique. Nous devons réaliser des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur des espèces évoluant plus éloignées de l'homme, car la structure musculaire diffère davantage. C'est pourquoi nous proposons d'utiliser des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires pour réaliser ces techniques. Les tissus de souris peuvent ensuite être utilisés pour d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et réduisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par une faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît à l'âge de 2 mois et s'accentue avec l'âge, présentant un phénotype modéré à l'âge de 9 mois. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu'à 4 mois, puis à partir de 16 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement de la maladie), afin d'observer le développement des souris après le traitement.
Test de l’efficacité de molécules d’intérêt en tant qu’agent protecteur pour le syndrome d’irradiation hématopoïétique aigu
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
864 souris dites humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules humaines, des prélèvements de moelle osseuse et de sang sous anesthésie, des injections répétées et un gavage, puis une irradiation qui provoque une anémie d'une dizaine de jours, pour tester une molécule censée limiter les dommages sanguins des rayonnements. Les retombées annoncées, augmenter la survie de patients exposés à des doses aiguës d'irradiation, restent au conditionnel et à long terme. Le porteur affirme que le projet n'a "pas d'alternative non animale" et qualifie l'étape in vivo d'"indispensable", ces souris immunodéficientes étant présentées comme les "outils de référence" du développement sanguin humain.
Objectifs
Les chimiothérapies et radiothérapies peuvent altérer la production des cellules sanguines et immunitaires par la moelle osseuse (appelé myelosuppression). Les recherches menées depuis 2013, par une partenaire, portent sur le développement d'une molécule X1 pour l'indication de la myélosuppression induite par la chimiothérapie et par irradiation. Notre projet se base sur des données préliminaires, qui démontrent un effet positif de X1, en combinaison avec des facteurs stimulant la formation de cellules impliquées dans l'immunité anti-bactérienne et virale et dans la formation de plaquettes sanguines, améliorant ainsi la survie des animaux traités après une myélosuppression induite par irradiation. Le présent projet vise à valider si le traitement par X1 peut améliorer la récupération fonctionnelle des cellules sanguines humaines après irradiation. Cette étude nécessite d’explorer les effets de l’irradiation par des études d’efficacité sur des rongeurs dits "humanisés" (souris ayant reçu une greffe des cellules humaines) traités ou non avec X1. Ces modèles murins sont les seuls à l'heure actuelle à récapituler le développement sanguin normal humain. Notre projet a plusieurs objectifs: L'Objectif 1 consiste en l'étude thérapeutique de X1 dans laquelle nous allons mesurer l’effet de X1, seul ou combiné aux facteurs décrits plus haut, sur l’atténuation de la toxicité des radiations sur les cellules sanguines humaines lorsque X1 est donné à partir de 2 heures après irradiation aux souris humanisées. L'Objectif 2 consiste en l'étude thérapeutique de X1 dans une moelle osseuse humaine. Dans cet objectif, nous testerons l’efficacité de X1 comme dans l'objectif 1, mais cette fois dans des souris portant une niche de moelle osseuse humanisée contenant une production sanguine humaine active. L'Objectif 3 consiste en l'étude prophylaxique de X1 dans laquelle nous étudierons si X1 peut aussi être utilisé pour atténuer la toxicité des radiations sur les cellules hématopoïétiques humaines dans les modèles de souris humanisées en apportant X1 avant l'irradiation. Cette étude permettra de prédire au mieux la réponse sanguine humaine à ce nouvel agent thérapeutique.
Bénéfices attendus
1-Atténuation de la myélosuppression et des séquelles associées (infections, hémorragies) chez les patients à des doses myélosuppressives de irradiation aiguë. Par conséquent, augmenter la survie des patients exposés de manière aiguë à des doses de irradiation (syndrome aiguë de rayonnement). 2-Augmenter la survie des patients exposés de manière aigüe à des doses myélosuppressives d’irradiation. Les cytokines aident à la récupération des lignées granulocytaire et macrophagique, mais sont sources d’effets indésirables graves. De plus, elles sont très couteuses à produire. Il y a donc un besoin de développement de nouvelles contre-mesures médicales. Celles-ci devront se caractériser par leur efficacité à améliorer les séquelles post-myelosuppression induite par une irradiation, par une atténuation complémentaire ou plus large de la myélosuppression associée. Ces nouvelles contre mesures devront également avoir un profil d'innocuité et de tolérabilité, un stockage facile et pouvoir être administrées rapidement dans un scénario de pertes massives. X1 est une bio-molécule administrée par voie orale. Elle a été initialement développée pour le traitement des infections virales respiratoires et de la neutropénie induite par la chimiothérapie. Son utilisation est justifiée en tant qu'agent de radioatténuation pour le syndrome hématopoïétique d’irradiation. En effet, les lésions induites par la chimiothérapie et la radiothérapie ont des voies communes qui entraînent une myélosuppression aigüe et des lésions résiduelles de la moelle osseuse. La gravité des lésions des organes dépend de la dose de rayonnement et de la durée d'exposition. Les lésions par rayonnement sensibilisent les organes et les cellules cibles entraînant le syndrome d'irradiation aigüe (ARS). Ces dommages multiples nécessiteront probablement plus d'une seule thérapie pour atténuer et améliorer la récupération. Par conséquent, une approche polypharmaceutique est justifiée, en particulier lorsque les sujets sont exposés à des doses plus élevées d’irradiations aiguës.
Procédures
Nous aurons recours à un prélèvement de sang et de moelle osseuse, 3 mois après transplantation de cellules souches et de progéniteurs humains du sang. Ces deux actes, d’une durée inférieure à 2 minutes chacun seront réalisés sous anesthésie générale sur un tapis chauffant. Nous utiliserons du gel ophtalmique pour prévenir le déssèchement des yeux. Pour l’injection des molécules, via 2 actes en sous-cutané et un acte en intrapéritonéale, ils se feront sur animal vigile, une fois et pendant 4 semaines pour l’hormone parathyroïdienne. Cet acte prendra 1 minute. Il y aura un acte de gavage durant 4 jours sur animal vigile prenant une minute. Suite à ces prélèvements et injections/gavages, il sera ajouté de l’hydrogel et des cupules de nourritures enrichies dans les cages afin d’aider les animaux à récupérer. Les souris seront irradiées en 1 fois pendant une période d'environ 2 minutes.
Impact sur les animaux
Nous aurons recours à un prélèvement de sang et de moelle osseuse, 3 mois après transplantation des cellules souches/progénitrices humaines du sang, pour vérifier que nos souris sont bien humanisées ce qui induira une douleur pour les souris. L’irradiation utilisée dans ce projet est subléthale mais provoque une anémie qui dure une dizaine de jours. Les souris recevront la molécule X1 par voie orale pendant 30 jours, dans le protocole thérapeutique. Le traitement en lui-même n’induit pas d’effet secondaire notable selon les expériences préliminaires réalisées par la compagnie qui produit X1. Les souris recevront transitoirement plusieurs injections de facteurs de croissance/hormonaux ce qui induit un risque d'inflammation locale temporaire ou des douleurs osseuses à courte durée.
Devenir
Afin de mesurer la récupération en cellules sanguines humaines après traitement, nous devons euthanasier les souris. Des organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate et thymus) sont prélevés et les cellules qui y sont contenues sont soumises à une caractérisation cellulaire et à des tests fonctionnels in vitro. Ces protocoles sont importants pour pouvoir juger de la réussite ou pas du traitement effectué après ou avant l'irradiation.
Remplacement
Ce projet n'a pas d'alternative non animale. Nous allons réaliser des expériences in vitro en parallèle, mais ces tests ne récapituleront jamais l'hétérogénéité organique des réponses in vivo, étape indispensable pour l’évaluation des effets potentiels de radio-atténuation de X1 (seul ou combiné) pour le syndrome hématopoïétique aigue lié aux radiations. En effet, notre projet nécessite une étape indispensable in vivo afin d'étudier les effets de X1 en suivant la récupération et la production hématopoïétique humaine dans un modèle préclinique capable de mimer la réponse thérapeutique chez l’homme. Nous utiliserons des souris sans système immunitaire qui représentent les outils de référence internationaux pour l’analyse fonctionnelle du développement sanguin humain d'après la littérature scientifique. Ces souris immunodéficientes sont appelées souris NSG; elles combinent une série de mutations génétiques qui altèrent leur système immunitaire dans sa globalité, les rendant aptes à ne pas rejeter les xénogreffes de cellules humaines d'origine sanguine.
Réduction
Nous avons à coeur de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Pour celà, lorsque les effets de différents traitements seront testés en utilisant la même procédure expérimentale, les expériences seront combinées et réalisées en même temps afin de comparer les différents groupes testés à un seul et unique groupe contrôle (qu'il est inévitable de faire pour que le résultat soit validé). Aussi, nous avons choisi de réaliser des expériences préliminaires (objectif 1) de choisir une dose d'irradiation et une seule souche de souris, pour réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux impliqués dans la réalisation des différents objectifs du projet seront surveillés régulièrement par l'expérimentateur et les animaliers afin de détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses inutiles. Afin d’améliorer le bien-être des souris, vis-à-vis des potentiels souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement sur la litière en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de moelle osseuse réalisé pour mesurer le niveau de reconstitution du système sanguin humain avant irradiation et traitement avec X1. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale
Choix des espèces
La souris domestique Mus Musculus est un mammifère de petite taille à l'âge adulte qui peut être facilement élevé et reproduit en captivité. De plus, la génétique et le comportement de cette souris étant parfaitement connus, cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux élevés en captivité et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Enfin, la souris reproduit de nombreux mécanismes fondamentaux existant chez l'homme ; les résultats des expériences réalisées chez la souris pourraient à terme améliorer l'étude des pathologies humaines ainsi que leurs thérapeutiques. Nous utilisons plus particulièrement un modèle de souris dépourvu de système immunitaire fonctionnel permettant les études sur le développement des cellules sanguines humaines normales et pathologiques.
La modulation de la voie de signalisation KRAS peut-elle améliorer la réponse des cancers bronchiques à la radioimmunothérapie ?
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées sous la peau de cellules tumorales, les souris reçoivent une injection intrapéritonéale chaque jour pendant environ quatorze jours, trois gavages et une irradiation de leur tumeur sous anesthésie générale. 1 100 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'examen de leurs tissus. Le projet teste contre des cancers bronchiques une triple combinaison de radiothérapie, d'inhibiteur et d'immunothérapie, qui "pourrait constituer un traitement de référence dans certains cancers". Le porteur décrit une gêne quand la tumeur grossit et une "douleur légère et temporaire" due aux injections et aux gavages, puis affirme que les protocoles d'exposition aux agents anticancéreux "ne donnent pas lieu à des manifestations de gêne ou de douleur chez les animaux".
Objectifs
Le but du projet consiste en l’étude de l’efficacité antitumorale de la radiothérapie associée à un médicament inhibiteur ainsi qu’à une immunothérapie. Le rôle de la ferroptose dans les effets observés précédemment et comment mieux exploiter cette mort cellulaire afin de potentialiser les effets de la triple combinaison de traitement. L'immunnothérapie permet d'inhiber une molécule qui induit une polarisation des lymphocytes T du microenvironnement tumoral vers un phénotype anti-inflammatoire et pro-tumoral. De récentes études montrent que l’association de la radiothérapie et d’une immunothérapie ciblant cette voie est susceptible d’améliorer la réponse antitumorale en comparaison avec l’immunothérapie seule. De plus, d’autres études ont montré que l’utilisation de cet inhibiteur combiné avec la radiothérapie, entrainait une réponse antitumorale
Bénéfices attendus
Les résultats de ces expériences pourraient, en expliquant le mécanisme d’action des interactions des traitements, ouvrir la voie à de nouveaux schémas thérapeutiques, dans lesquels la triple combinaison thérapeutique pourrait constituer un traitement de référence dans certains cancers. De plus, l’utilisation d’inducteur ou d’inhibiteur pourront nous permettre (i) d’exploiter cette mort cellulaire dont les cellules sont particulièrement dépendantes et (ii) d’élucider la proportion que représente la ferroptose dans les effets observés en réponse à notre triple combinaison de traitement.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée (anesthésie locale) de cellules tumorales, à des injections intrapéritonéales quotidienne (anesthésie locale) durant environ 14 jours ainsi qu'à trois gavages lors des différentes procédures. Pour finir les souris subiront également sous anésthésie générale une irradiation localisée de la tumeur.
Impact sur les animaux
Le developpement de tumeurs sous-cutané chez la souris peut entrainer une gêne chez ces dernières lorsque la tumeur sous-cutané va grossir. De plus, les diférentes injections sous-cutanées, intra-péritonéales ainsi que les gavages sont suscetibles d'entrainer chez l'animal un stress du a la manipulation de l'animal et aux différents traitements appliqués ainsi qu'une douleur légère et temporaire. Il en est de même pour l'irradiation des tumeurs des souris qui va déclencher un stress chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédures, pour examens sur tissus post-mortem.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est indispensable car les interactions au sein du microenvironnement immunitaire tumoral est au centre des effets de la triple combinaison, impliquant des composantes cellulaires et moléculaires impossibles à reproduire actuellement dans des modèles ex-vivo. Nous allons donc procéder à des expériences in vivo utilisant des modèles murins, mais aussi des expériences in vitro complémentaires en utilisant le modèle de culture d’organoïdes murins.
Réduction
Pour chaque point expérimental nous utiliserons le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Nous comptons utiliser 4 lignées cellulaires tumorales (génétiquement modifié pour les différentes voies de signalisation étudiées). Le nombre mnimal d'animaux, nécessaire et suffisant, a été déterminé grâce à un calcul de puissance.
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupe, avec un équipement et des conditions sanitaires adéquates. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel. Les animaux seront en groupes sociaux de 5. Les protocoles d’exposition aux agents anticancéreux ont déjà été utilisés chez les souris et ne donnent pas lieu à des manifestations de gêne ou de douleur chez les animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, ils recevront un antiinflammatoire non stéroïdien ou un analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Dans ce type de combinaison thérapeutique, le recours à l’utilisation d’un modèle animal (organisme vivant entier), est indispensable car les interactions entre radiothérapie et immunothérapie au sein d’une tumeur obéissent à des processus cellulaires complexes impliquant de multiples voies immunitaires et métaboliques impossibles à reproduire in-vitro.
Rôle des phagocytes spléniques dans la physiopathologie et la réponse aux traitements de la leucémie aiguë myéloïde induite par transplantation de cellules tumorales dans un modèle murin (1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 418 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré (100 léger, 1 318 modéré). Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques en intraveineuse, des gavages quotidiens pendant cinq à quinze jours et des injections répétées, la leucémie infiltrant moelle, sang et organes avec perte de poids et altération du comportement. Le porteur indique encadrer ces atteintes par un score et des points limites déclenchant antalgiques ou mise à mort. Il affirme qu'aucune alternative in vitro, y compris les organoïdes, ne permet d'étudier ces interactions.
Objectifs
La leucémie aiguë myéloïde touche différents organes dont la rate et est le type le plus fréquent de leucémie chez l'adulte, avec un pronostic effroyable. L'identité des cellules immunitaires de la rate impliquées dans l'élimination des cellules leucémiques est inconnue. Tous comme celle des cellules responsables de l'efficacité des traitements pour induire la rémission, courament utilisés ou actuellement en cours d'essai thérapeutique chez l'homme. Nous proposons d’identifier et caractériser ces cellules par l'étude d'un modèle de leucémie aiguë myéloïde murine induite par la transplantation de cellules leucémiques dans des souris transgéniques. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L’identification des cellules immunitaires de la rate impliquées dans la progression ou la rémission d'un modèle murin de leucémie aiguë myéloïde, ou dans l’efficacité des traitements de référence ou en cours d'essai chez l'homme permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie humaine, ou de proposer de nouvelles stratégies de traitement ciblant plus spécifiquement les cellules immunitaires impliquées.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions selon les procédures : une biopsie d'oreille/queue pour génotypage (durée du geste 10 secondes/souris), une injection intraveineuse de cellules leucémiques (durée du geste 10 secondes/souris) sous anesthésie gazeuse par isoflurane ; gavage oral quotidien à l'aide d'une sonde en silicone (durée du geste 1 min/souris) en condition vigile pendant 5 à 15 jours consécutifs ; inclusion d'un traitement dans l'alimentation des souris ; injections intrapéritonéales de molécules ou véhicules sur des animaux vigiles en contention manuelle (durée du geste 30 secondes/souris) sous la forme de 5 injections avec une injection tous les deux jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables des procédures sur les animaux sont : 1) légers. Les biopsies d'oreille/queue réalisées par des zootechniciens expérimentés génèrent des douleurs négligeables. Les injections de molécules ou de cellules leucémiques sont associées à des douleurs minimes prévenues par une anesthésie gazeuse par isoflurane de durée la plus courte possible pour les intraveineuses. Le recours aux gavages oraux sera remplacé si possible par l'administration du traitement dans l'alimentation des souris, laquelle s'associe à une perte de poids transitoire, réversible et modérée qui sera surveillée et corrigée le cas échéant. 2) modérés. La leucémie induite par l'injection intraveineuse de cellules cancéreuses infiltre différents tissus (moelle osseuse, sang) et organes (rate, foie, poumons…) causant une perte de poids, d’une altération du comportement et éventuellement des douleurs. Ces évènements significatifs seront limités par la définition de points limites cotés à l’aide d’un scoring spécifique et la mise en place d’un plan d’action graduel (utilisation d’antalgiques, correction de la perte pondérale et hydrique, mise à mort).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever différents organes pour étudier le système immunitaire et/ou le développement de la leucémie
Remplacement
Tous les modèles de leucémie impliquent un envahissement progressif de la moelle osseuse, du sang, du foie, de la rate et des poumons. Par ailleurs, il existe des interactions dynamiques entre les cellules leucémiques et les cellules du système immunitaire au sein de ces différents organes. Ces phénomènes ne peuvent pas être étudiés in vitro y compris en utilisant des organoïdes. Il n'y a donc pas d'alternative à ce jour au recours à des modèles animaux vivants.
Réduction
Dans le cadre des procédures exploratoires nous avons inclus le nombre minimal d'animaux permettant d'effectuer un test statistique pertinent. Pour les études de survie nous avons utilisé des outils statistiques pour déterminer une taille d'échantillon nécessaire. Nous conserverons tout échantillon non utilisé. Nous avons mis en place une stratégie "stop and go" pour identifier si l'administration d'un traitement mélangé à l'alimentation peut remplacer le gavage oral. Cette stratégie permet également de ne pas entreprendre de tests de durées de traitements supplémentaires si l'objectif fixé est atteint pour des durées plus courtes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans un environnement adapté et enrichit de l’environnement (nids en coton, cylindre en plastique, copeaux de bois). Un protocole de surveillance du bien-être est défini a priori et appliqué pour chaque procédure, avec définition de points-limites basé sur un score composite d’items (apparence physique externe, changement de comportement des animaux, perte pondérale) d’observations cliniques. L’atteinte de points-limites de gravité variable conduit à une décision immédiate ou différée (utilisation d’antalgiques, correction de la déshydratation par de l’eau gélifiée, mise à mort) et à un renforcement de la surveillance des animaux.
Choix des espèces
Les modèles animaux représentent un organisme de choix dans l’étude des réponses immunitaires en contextes physiologiques et pathologiques, notamment dans les réponses anti-tumorales. Ils permettent une étude dynamique, spatiale et temporelle, contrôlée des mécanismes immunologiques in vivo. Le modèle murin est particulièrement adapté du fait des nombreuses similitudes dans l’organisation anatomique, cellulaire et fonctionnelle de la rate avec la rate humaine. Par ailleurs, le modèle de leucémie murine récapitule la maladie humaine. Des souris de fond génétique C57BL/6 adultes âgées entre 6 et 14 semaines en début de procédure seront utilisées car le système immunitaire est mature et la transplantation de cellules leucémiques permet d’induire une leucémie à cet âge semblable à la maladie humaine adulte.
Rôle du métabolisme des lipides sur la progression du cancer de la prostate résistant à l’hormonothérapie dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Cancers
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
196 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Sur quatorze semaines, elles reçoivent un régime hyperlipidique, une greffe de cellules cancéreuses de prostate sous la peau, des prélèvements sanguins mensuels sous anesthésie et, pour une partie, des injections quotidiennes d'un inhibiteur, pour étudier le lien entre lipides et cancer résistant à la castration. Le porteur maintient une gravité légère en indiquant que la tumeur, sous-cutanée, ne devrait pas affecter le comportement de l'animal. Il présente les statines et la metformine comme pistes possibles, à un stade encore exploratoire.
Objectifs
Le cancer de la prostate est le deuxième cancer le plus diagnostiqué chez l'homme avec 50 400 nouveaux cas chaque année en France. Plusieurs thérapies sont utilisées telles que la chirurgie, la radiothérapie, l'hormonothérapie ou la chimiothérapie, cependant, ces traitements ne conduisent souvent pas à la guérison. Dans le cas des formes agressives, si l'hormonothérapie est efficace dans un premier temps pour faire diminuer la tumeur, celle-ci va rapidement progresser de nouveau alors que le patient est encore sous traitement et devenir résistante à l'hormonothérapie ou CPRC (cancer de la prostate résistant à la castration). Face à l'échec thérapeutique, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes de cette récidive tumorale afin de la contrer. Parmi les cancers, le cancer de la prostate est l'un des plus liés au métabolisme des lipides (fabrication (lipogenèse) et dégradation (lipolyse)). En effet, dans le cancer de la prostate, le risque de développer des formes agressives de cancer de la prostate résistant à la castration est plus élevé en cas d'obésité et de régimes hypercaloriques-hyperlipidiques, et les patients atteints de CPRC présentent des taux plasmatiques élevés de cholestérol et une augmentation de la lipogenèse dans les cellules cancéreuses. Ce projet utilisera des cellules cancéreuses prostatiques humaines résistantes à la castration qui surexpriment un facteur que nous proposons d’étudier et qui est connu pour être un facteur de mauvais pronostic pouvant être activé par le cholestérol. Deux approches seront réalisées avec les cellules tumorales. La première en nourrissant l'animal avec un régime normal ou riche en graisses, en saccharose et en cholestérol pour imiter les régimes hypercaloriques-hyperlipidiques. La seconde en utilisant un inhibiteur du facteur surexprimé dans le cadre d'un régime normal et riche en graisses, en saccharose et en cholestérol afin de déterminer la valeur de cible potentielle dans le traitement du cancer de la prostate résistant à la castration. L'objectif principal de ce projet est d'identifier de nouveaux mécanismes impliquant les lipides dans la progression du CPRC et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'identifier de nouveaux mécanismes impliquant les lipides dans la progression du cancer de la prostate résistant à la castration et donc de déterminer si dans le futur, les thérapies actuellement utilisées pour traiter la dyslipidémie (excès de cholestérol) comme les statines ou traiter le diabète comme la metformine pourraient aider à diminuer la récidive du cancer de la prostate résistant à la castration et la résistance thérapeutique. Notre projet a également le potentiel d'identifier de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques pour surveiller la progression, la récurrence et la prévention des métastases du cancer de la prostate résistant à la castration.
Procédures
Chaque animal sera intégré à une procédure multi-étapes qui durera au total 14 semaines. La moitié des animaux aura un régime alimentaire hypercalorique-hyperlipidémique et l’autre moitié aura un régime normal et ce, pour toute la durée du projet (14 semaines). Certaines étapes seront communes à l’ensemble des animaux. En effet, les 196 souris seront soumises après leur temps d’acclimatation à un jeûne de 5h suivi d’une pesée (1 min) puis d’une anesthésie gazeuse afin de faire un prélèvement sanguin (2min30) pour quantifier la glycémie, l'insulinémie, le niveau de triglycérides et de cholestérol ; étape essentielle pour déterminer le niveau d’augmentation des triglycérides et du cholestérol sanguins qui attestera de leur disponibilité à la tumeur pour la suite. Les animaux seront pesés hebdomadairement (1min) et 3 prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (2min30) seront réalisés à raison d’un prélèvement par mois. En fin de protocole, les souris recevront une injection d’analgésique (30 sec) avant prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) et mise à mort. Parmi ces souris, 24 recevront une injection de médicaments (inhibiteur pharmacologique du facteur que nous voulons étudier) ou de placebo quotidienne pendant les 2 dernières semaines (10x30sec) ; 80 recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse à la 8ème semaine (2min30) et 80 recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse à la 8ème semaine (2min30) et une injection de médicaments ou de placebo quotidienne pendant les 2 dernières semaines (10x30sec).
Impact sur les animaux
Les cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée (sous la peau), et donc la tumeur ne se développera que sous la peau et ne devrait pas se propager à d'autres parties du corps. La taille de la tumeur ne dépassera pas celle autorisée à savoir qu’elle ne devra engendrer aucune conséquence significative sur le comportement de l'animal. Cependant, les animaux peuvent perdre du poids. Les animaux anesthésiés peuvent ressentir une aversion pour l'anesthésie et trouver l'expérience désagréable. Les animaux auxquels seront injectés la thérapie peuvent ressentir une gêne passagère lors de l'insertion de l'aiguille. Aucun effet indésirable n'est prévu concernant la molécule thérapeutique, cependant, les animaux seront surveillés afin de s'assurer du maintien de leur bien-être.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort humainement à la fin du projet pour permettre l’analyse histologique de la tumeur, nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de l’étude
Remplacement
Les interactions complexes qui existent entre le microenvironnement tumoral (vaisseau sanguin pour l'apport en nutriments, cellules graisseuses…) et une tumeur ne peuvent pas être correctement étudiées en utilisant exclusivement des systèmes de culture cellulaire ou des tissus humains. De plus, cette étude nécessite de l’expérimentation animale pour déterminer les effets du traitement sur la tumeur, la santé et le bien-être général de l'animal.
Réduction
Le nombre minimum d'animaux requis pour obtenir des résultats scientifiquement valides a été déterminé par des calculs de taille d'échantillon en utilisant les résultats de projets antérieurs entreprenant des expériences similaires.
Raffinement
La croissance tumorale, le poids corporel et le bien-être des animaux seront surveillés régulièrement afin de s'assurer que la tumeur n’ait pas d’impact sur le comportement de l’animal. Les cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée (sous la peau) pour éviter les risques de propagation du cancer à d'autres parties du corps. Les opportunités de raffinement seront continuellement explorées et mises en œuvre dans la mesure du possible pendant la durée du projet en réduisant le nombre d'animaux/cages et en apportant un environnement constamment enrichi. L’ensemble des personnes en charge de ce projet respectera les lignes directrices sur les meilleures pratiques et consultera le personnel de soins des animaux tout au long du projet. Afin d’éviter toute expression du phénotype dommageable lié au caractère immunodéprimé des animaux, ceux-ci seront hébergés sur des portoirs comportant des cages individuellement ventilées et à un maximum de 5 animaux par cage dans une zone placée en surpression afin de limiter l’entrée de pathogènes véhiculés dans l’air. Les cages sont autoclavées avec la litière et l’enrichissement. La nourriture est irradiée à 25kGy et l’eau de boisson est osmosée. L’ouverture des cages et la manipulation des animaux seront réalisées sous PSM de type II et tout le matériel utilisé sera stérile.
Choix des espèces
Les souris constituent le modèle animal le mieux établi pour la recherche sur le cancer. La souche de souris choisie pour ce projet a été sélectionnée comme modèle de croissance des cellules cancéreuses de la prostate. Des souris mâles adultes seront utilisées car le cancer de la prostate n’affecte que les mâles adultes et, par conséquent, cette recherche sera transposable à la condition humaine.
Utilisation de l’Imagerie par Résonance Magnétique pour évaluer l’effet de nouvelles techniques de radiothérapie chez le rat
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 182 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, cette autorisation ne couvrant que les séances d'IRM, à l'issue desquelles les animaux repartent dans un autre établissement pour la suite du projet. Porteurs de tumeurs cérébrales greffées et irradiés dans le cadre d'autres procédures, ils subissent ici des examens d'IRM répétés sous anesthésie, jusqu'à huit sessions sur un an, pour suivre les effets d'une radiothérapie à mini-faisceaux. Le porteur décrit l'IRM comme non invasive, les effets attendus se limitant à l'anesthésie et à une légère perte de poids. Il présente le suivi longitudinal d'un même animal comme une réduction du nombre d'individus et juge le recours au modèle animal "indispensable".
Objectifs
Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Le but de ce projet est d’utiliser l’IRM (Imagerie par Résonance Magnétique, technique non invasive et atraumatique utilisée en clinique chez l’homme) chez le modèle rongeur pour étudier le mode de fonctionnement et les conséquences morphologiques de nouveaux modes d’irradiation, et notamment la Radiothérapie avec Mini-Faisceaux (MBRT).
Bénéfices attendus
La radiothérapie avec mini-faisceaux (MBRT) étant une technique novatrice, il est primordial de très bien comprendre les mécanismes microscopiques et macroscopiques intervenant lors de son utilisation, pour pouvoir optimiser les conditions d’utilisation : pour ce faire, la réaction de différentes lignées de cellules cancéreuses plus ou moins agressives doit être étudiées et ce, avec différentes géométries et puissances de faisceaux. Par le suivi IRM des animaux implantés (différentes lignées cancéreuses) et irradiés (différentes conditions d’irradiations), nous espérons pouvoir établir les meilleures conditions de MBRT en vue d’applications futures en clinique.
Procédures
Pour les sessions d’ IRM (objet de la présente DAP) permettant de suivre les effets de la radiothérapie, les animaux recevront une anesthésie gazeuse. Ce suivi sera d’un an maximum et comportera une session IRM à plusieurs moments après irradiation (2, 7, 14, 21, 30, 40 jours, 3 et 6 mois après irradiation). Chaque session IRM n’excédera pas 1 heure.
Impact sur les animaux
L’examen IRM étant une modalité de neuroimagerie totalement non-invasive et non-irradiante, les potentiels effets indésirables sont liés au fait que l’examen est réalisé sous anesthésie générale légère. Afin de vérifier que cette dernière n’a pas d’effet néfaste sur la respiration du sujet anesthésié, la fréquence respiratoire est surveillée en permanence tout au long de l’examen. Il est également possible d’observer une légère perte de poids le lendemain de l’examen, suite au stress potentiellement induit par la combinaison transport/examen entre les deux animaleries.
Devenir
Après l’examen IRM, tous les animaux retourneront dans l’autre établissement utilisateur pour continuer le projet (utilisation continue).
Remplacement
Nous désirons valider un potentiel nouveau mode de traitement par radiothérapie dans le cadre du cancer du cerveau. Pour évaluer l’efficacité de la technique, nous allons étudier la préservation des tissus sains environnants de la tumeur et contrôler la croissance des tumeurs irradiées. Les mécanismes biologiques activés impliquent très probablement des effets vasculaires et immunologiques. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux. En effet, une culture in vitro de tissus ne permettrait pas d’apprécier l’effet des traitements, ni un modèle in silico.
Réduction
L’IRM permettant un suivi longitudinal des animaux, et chaque animal étant observé à 8 stades différents, nous utiliserons 8 fois moins d’animaux que par une méthode classique d’histologie. Le nombre d’animaux (1182 rats au total) a été statistiquement défini pour permettre l’obtention de résultats fiables avec le moins d’animaux possible. Une analyse de puissance a été effectuée comme décrite et validée par le projet précédent.
Raffinement
Que ce soit durant leur transport sur le lieu de l’examen IRM, ou lors de l’examen lui-même, une grande attention est apportée au bien-être des animaux, et tout est mis en œuvre pour éviter les sources potentielles de stress. Transports : Les animaux sont transportés dans leur boîte habituelle (enrichie), avec leurs partenaires habituels et manipulés par les personnes assurant leur suivi quotidien. Les boîtes sont protégées du froid ou du chaud éventuel. Manipulations/anesthésie avant/après examen IRM : Ces actes sont réalisés par les personnes qualifiées assurant le suivi quotidien des animaux. Examen IRM : Il est réalisé sous anesthésie, dans un berceau chauffé uniquement dédié à ces animaux, avec contrôle de la respiration et de la température. Manipulations après examen IRM : Le réveil naturel de l’animal se fait au calme en cage individuelle sur un matelas chauffant. Lors de l’examen IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. Par ailleurs, le temps de l’examen IRM a été réduit à son minimum. En dehors des sessions d’examen IRM, une grille de scoring et des points limites ont été définis pour suivre le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiations proposées dans le cadre des procédures expérimentales que celle des souris. De nombreux articles ont déjà été déposés avec le modèle « rat », nous poursuivons donc nos études avec ce modèle. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.
Évaluation du rôle du tissu adipeux sur la régulation du métabolome systémique au cours du vieillissement EU2/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation chirurgicale d'un ou plusieurs dépôts de graisse (lipectomie) sous anesthésie et deux prises de sang, pour étudier le rôle du tissu adipeux dans le vieillissement musculaire. Le porteur fixe comme point limite une perte de poids rapide de 20 %, seuil déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous réaliserons des lipectomies (résection des dépôts adipeux situés au niveau souscutané et viscéral) chez des animaux jeunes et âgées afin d'étudier l’implication de ce tissu dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de caractériser l’implication du tissu adipeux blanc (TA) dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du TA ayant un impact négatif sur le fonctionnement musculaire, l’identification d’un pool de métabolites dérégulés avec l’âge appartenant à l’axe TA-muscle devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter pour lutter contre la sarcopénie liée à l’âge.
Procédures
Les souris seront soumises à des prises de sang à la veine de la queue (2 fois au total), leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système RMN et elles subiront une chirurgie (30 minutes d’intervention environ) sous anesthésie et traitement analgésique afin de leur retirer un ou plusieurs dépôts adipeux.
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée) - perte de poids et douleur à court terme consécutives à la chirurgie (une administration d’analgésique sera effectuée lors de la chirurgie et un suivi post-opératoire quotidien sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux) - isolement/individualisation des animaux en cas d'agressivité (enrichissement des cages)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.
Remplacement
Notre projet consiste à étudier la communication entre différents tissus (tissu adipeux et muscles squelettiques) via de petites molécules organiques, les métabolites. Bien qu'un volet de notre projet ait déjà été réalisé sur des cellules cultivées, aucune technique de remplacement du modèle animal n’existe à ce jour. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme entier impliquant des échanges de métabolites entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.
Réduction
Au regard de la bibliographie, 10 souris par condition sont classiquement utilisées pour des études de métabolomique sur tissus de rongeurs. Les tissus prélevés seront utilisés non seulement pour étudier le métabolome au sein des tissus mais aussi pour des analyses d'expression de gènes, de protéines et des analyses biochimiques (mesures d’activités enzymatiques). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet
Raffinement
La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré aux animaux afin d’éviter la perte de poids et les douleurs. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours pendant 7 jours suite à la chirurgie puis 2 fois par semaine par la suite, ce qui permettra de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Les points limites sont : perte de poids rapide (20% en quelques jours), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté, comme indiquant un état de souffrance. De plus le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage. Nous enrichirons également l’environnement de toutes les souris de façon à favoriser leur bien-être.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). De plus, c’est un modèle pour lequel nous avons une expertise depuis de nombreuses années dans l'équipe. Pour cette étude, nous utiliserons des souris C57BL/6J de différents âges (3-6 mois pour les souris « jeunes » et 18-24 mois pour les souris « âgées ») afin de caractériser la contribution du TA dans la régulation du métabolome circulant et musculaire au cours du vieillissement.