Oncologie

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, 1 280 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles portent des tumeurs et reçoivent jusqu'à dix injections, certaines sous anesthésie, pour tester des signaux immunogènes recombinants censés renforcer l'immunité antitumorale. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ou in silico ne reconstruit un système immunitaire fonctionnel. Les applications cliniques transposables sont annoncées comme une ambition, quand la mise à mort des 1 280 individus, elle, est certaine.

Objectifs

Dans le cadre de thérapies anti-tumorales telles que les chimiothérapies, il est possible d’observer une forme particulière de mort des cellules cancéreuses appelée mort cellulaire immunogène. Il a été démontré que ce type de mort cellulaire joue un rôle déterminant dans l’efficacité à long terme des traitements anticancéreux. Elle se caractérise par l’émission coordonnée de motifs moléculaires associés aux dommages cellulaires. Le système RUSH (Retention Using Selective Hooks) constitue une plateforme expérimentale particulièrement adaptée pour étudier la contribution spécifique de ces différents signaux immunogènes à l’activation de l’immunité antitumorale. L’étude de populations tumorales mixtes, offre ainsi un système original pour disséquer la manière dont la signalisation de danger indépendante de l’autophagie coopèrent, ou agissent en parallèle, dans la détection immunitaire de la tumeur. Les essais de coculture entre cellules tumorales et cellules dendritiques basés sur le modèle RUSH pourraient en outre permettre d’explorer la manière dont les cellules dendritiques intègrent ces signaux spatialement et fonctionnellement distincts afin d’induire leur activation, leur maturation, ainsi que la présentation croisée d’antigènes tumoraux. Une hypothèse vérifiable est que la déplétion sélective de certaines cellules dendritiques, abolirait les réponses immunitaires dirigées contre les tumeurs RUSH. Une autre hypothèse est que les tumeurs composées de cellules modifiées par le système RUSH soient intrinsèquement plus sensibles à l’inhibition des points de contrôle immunitaire, et que les souris guéries de telles tumeurs développent une mémoire immunologique durable. Ce projet a pour ambition de définir des stratégies combinatoires directement transposables, fondées sur l’administration de signaux immunogènes recombinants et d’agents immunomodulateurs, afin d’améliorer durablement l’efficacité des traitements anticancéreux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider, dans des modèles précliniques, une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace contre plusieurs types de cancer. À court terme, nous espérons aque les résultats obtenus grâce à ce projet permettront d'affiner les stratégies de traitement anticancéreux. À long terme, nous prévoyons de définir des conditions thérapeutiques optimales transposables en applications cliniques.

Procédures

Les souris seront manipulées régulièrement (

Impact sur les animaux

Diverses procédures (immobilisations, injections, gavages) peuvent provoquer du stress chez l'animal et une légère douleur transitoire au point d'injection. La croissance tumorale, la chimiothérapie et l'immunothérapie peuvent entraîner une perte d'appétit modérée, qui peut à son tour entraîner une perte de poids modérée.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de collecter divers organes pour des analyses immunologiques.

Remplacement

L'utilisation d'animaux vivants est essentielle car ce projet vise à tester l'efficacité des traitements anticancéreux et à confirmer l'activation du système immunitaire, et actuellement, il est impossible de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro/ex vivo ou in silico à cause de la limite des technologies actuelles.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Les résultats seront analysés avec des outils statistiques.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (examen clinique quotidien, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.

Choix des espèces

Plusieurs justifications d’ordre scientifique, pratique et éthique sont à la base du choix de la souris comme modèle préclinique. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Ensuite, la souris est un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

Rendues immunodéprimées pour accepter des cellules tumorales humaines, 75 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit une implantation de cellules cancéreuses de la prostate dans l'abdomen, puis un traitement de la zone opérée par une torche à plasma froid. L'objectif est d'évaluer si ce procédé réduit le risque de récidive après ablation d'une tumeur. Le porteur décrit ce modèle comme "incontournable" et a porté l'effectif de 45 à 75 animaux.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.

Procédures

Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)

Impact sur les animaux

La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque d'une durée n'exédant pas 4 semaines. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, cette DAP correspondant à une extension d'une expérimentation précedemment autorisée, les lots d'animaux déjà traités n'ont présenté aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.

Remplacement

Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo. En parallèle, les processus de dissémination métastatique sont très complexes et, même si certains paramètres peuvent être étudiés en culture de cellule, nécessitent d'être analysés sur un organisme mammifère proche de l'humain. Dans le cas présent, le modèle utilisé est le modèle préclinique incontournable pour valider l'utilisation du plasma froid en chirurgie et analyser son potentiel sur le risque de récidive.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés au total sur des lots de 15. Les tests utilisés seront les suivants: Mann & Whitney, Wilcoxon, Kruskal & Wallis et/ou Friedman en fonction des comparaison de groupe effectué. MODIFICATION 75 ANIMAUX AU TOTAL

Raffinement

En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Concernant la chirurgie, l'ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie et des traitements post-opératoires sont mis en place pour optimiser le bien-être de l'animal. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrits dans la présente demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.

1 820 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour renforcer un traitement anticancéreux en modifiant l'environnement de la tumeur. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, puis jusqu'à six prélèvements de sang et douze séances de suivi, les tumeurs sous-cutanées réduisant l'appétit. Une partie des souris est immunodéficiente pour accepter des cellules humaines, l'autre immunocompétente. Les bénéfices pour les patients restent au conditionnel, face à un effectif de 1 820 animaux justifié par des références publiées.

Objectifs

Ce projet vise à améliorer l’efficacité d’un traitement innovant contre certains types de tumeurs. Bien qu’il soit déjà utilisé avec succès pour certains cancers, son efficacité reste limitée pour d’autres formes. L’objectif est donc de tester une approche qui pourrait renforcer l’action du traitement en modifiant l’environnement de la tumeur.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer l’efficacité de traitements innovants contre certaines formes de cancer qui restent aujourd’hui difficiles à soigner. Il repose sur l’idée que la tumeur n’agit pas seule, mais qu’elle évolue dans un environnement biologique complexe qui peut freiner l’action des traitements. En modifiant cet environnement, par exemple en réduisant les mécanismes de protection de la tumeur ou en facilitant l’accès des médicaments aux cellules cancéreuses, cette approche pourrait lever certains blocages responsables de l’échec thérapeutique. À terme, elle pourrait renforcer la réponse aux traitements existants, améliorer les résultats pour les patients et ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques.

Procédures

Nuisances liées à l'administration des cellules tumorales ou de traitements sur animal vigile avec anesthésie locale, douleur légère et transitoire possible . Nuisances liées aux prélèvements sanguins (maximum 6) : douleur légère et transitoire, après anesthésie générale. Nuisances liées à la présence de tumeurs sous-cutanées : gêne mécanique légère, possibilité de diminution modérée de l'appétit.

Impact sur les animaux

Tous les animaux seront soumis aux interventions suivantes : • Administration des cellules tumorales : une intervention par animal, associée à une douleur légère, réalisée sur animal vigile avec anesthésie locale, d’une durée inférieure à 1 minute. • Traitement tumoral : une intervention par animal, associée à une douleur légère, réalisée sous anesthésie générale, d’une durée inférieure à 2 minutes. • Administration de cellules : une intervention par animal, associée à une douleur légère, réalisée sur animal vigile avec anesthésie locale, d’une durée inférieure à 1 minute. • Prélèvements sanguins : jusqu’à 6 interventions par animal, associées à une douleur légère, à raison d’une par semaine, réalisées sous anesthésie générale, chacune d’une durée inférieure à 1 minute. • Suivi de la croissance tumorale et pesée : jusqu’à 12 séances par animal sur la durée de l’étude, réalisées sur animaux vigiles, chacune d’une durée inférieure à 1 minute.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser les prélèvements nécessaires à l'étude et les étudier au laboratoire.

Remplacement

Des études préliminaires ont montré qu’il est possible de modifier l’environnement autour d’une tumeur pour renforcer l’effet d’un traitement innovant contre certains cancers difficiles à traiter. L’utilisation de modèles animaux reste essentielle pour confirmer ces observations dans des conditions proches de la pratique clinique. Les approches in vitro et in silico, bien qu’utiles pour certaines analyses mécanistiques ou pour la modélisation, ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre la tumeur, le système immunitaire et le traitement dans un organisme entier. Pour cette raison, deux types de modèles animaux sont utilisés afin de comparer l’effet de cette approche dans différents contextes biologiques et d’évaluer son potentiel pour une application future chez l’humain.

Réduction

Un suivi régulier de la taille des tumeurs sera réalisé afin de recueillir des données longitudinales chez les mêmes animaux, permettant d’analyser la cinétique de croissance tumorale et d’éviter la répétition d’expérimentations distinctes à différents temps d’analyse, contribuant ainsi à limiter le nombre total d’animaux nécessaires. Les différentes conditions expérimentales seront testées en parallèle, ce qui permet de limiter le recours à des groupes témoins supplémentaires et d’éviter des expérimentations redondantes. Le nombre d'animaux par groupe a été défini pour permettre de tester plusieurs approches sur différents types de tumeurs, tout en assurant la reproductibilité et la robustesse des résultats. Cette organisation permet de vérifier l’efficacité des méthodes testées, d’évaluer leur impact sur la croissance tumorale et de garantir une analyse fiable des données. Le dimensionnement des groupes repose sur des résultats antérieurs et sur des références publiées. Les variations observées seront analysées à l’aide de tests statistiques appropriés,, selon le type de comparaison.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi, avec un maximum de cinq souris par cage. Les interventions, telles que les injections intratumorales et les prélèvements sanguins, seront réalisées sous anesthésie à l’isofluorane (induction à 4 %, maintien à 2 %) et les animaux seront placés sur une plaque chauffante pour maintenir leur température corporelle. Les injections de cellules, qu’elles soient sous-cutanées dans le flanc ou intraveineuses dans la veine caudale, seront effectuées sur des animaux vigiles après anesthésie locale de la peau à la lidocaïne. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place tout au long des expérimentations. Celle-ci comprendra l’évaluation de leur comportement, de leur activité, de leur état général et de tout signe clinique anormal. Conformément à la grille de scoring établie, des points limites précoces ont été définis, et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence pour ce projet car elle permet d’étudier de manière intégrée les réponses antitumorales des cellules étudiées dans des conditions in vivo. Les souris immunodéficientes sont utilisées pour évaluer l’activité de ces cellules humaines sur des tumeurs humaines implantées, sans rejet immunitaire, tandis que d'autres souris immunocompétentes permettent d’étudier l’efficacité de ces cellules murines dans un contexte immunocompétent. L’utilisation de la souris garantit ainsi la pertinence préclinique des résultats et leur transposabilité pour optimiser les stratégies thérapeutiques étudiées dans ce projet dans les tumeurs solides Les souris utilisées seront âgées de 7 à 12 semaines, une tranche d’âge correspondant au jeune adulte, qui est idéale pour les études de réponse aux traitements antitumoraux en raison de leur forme physique optimale et de l’absence de biais potentiels dus aux changements physiques et hormonaux liés au développement, ainsi qu’au vieillissement.

1 740 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour étudier le rôle de certaines cellules immunitaires dans le cancer de la bouche. Selon le modèle, elles ingèrent un cancérigène dans l'eau de boisson pendant seize semaines ou reçoivent une greffe de cellules cancéreuses dans la langue, les lésions gênant l'alimentation et faisant perdre du poids. Le suivi passe par des injections répétées et de l'imagerie sous anesthésie. Le porteur présente ce modèle comme un "outil indispensable" et pose ces travaux comme la base d'une future étude chez l'humain, encore hypothétique.

Objectifs

Le cancer de la cavité buccale est une maladie de la bouche assez fréquente, difficile à soigner car il peut ré-apparaître après traitement et devenir résistant. On sait aujourd’hui que la tumeur n’évolue pas seule : elle est entourée de nombreuses cellules, notamment des cellules du système immunitaire, qui peuvent soit la combattre, soit au contraire l’aider à se développer. Parmi ces cellules, les macrophages sont des cellules capables de s’adapter à leur environnement et de changer de rôle. Dans ce cancer, une protéine appelée tenascine C est présente en grande quantité autour de la tumeur. Cette protéine, qui joue normalement un rôle dans l’organisation des tissus, semble ici favoriser le développement du cancer et perturber les défenses de l’organisme. Nous pensons que le tenascine C agit en modifiant le comportement des macrophages, en les maintenant dans la tumeur et en réduisant leur capacité à lutter contre les cellules cancéreuses. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre ce phénomène pour identifier de nouvelles pistes de traitement contre ce cancer.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’identifier les types des contacts entre la tenascine C et les macrophages et les conséquences de ces contacts sur le comportement des macrophages et de leurs cellules voisines, et sur la croissance du cancer. A terme, ces travaux permettront d’identifier des pistes nouvelles de traitement des cancers de la bouche afin de stimuler la défense anti-cancéreuse. Le modèle sur souris de développement de cancer de la bouche représente un outil indispensable pour réaliser une étude des interactions entre les cellules immunitaires et l’environnement du cancer. Ces études chez la souris poseront les bases indispensables d'une future étude chez l'Homme.

Procédures

Modèle d'induction chimique: Administration d’un carcinogène pendant 16 semaines dans l’eau de boisson avec ou sans injection d’agents thérapeutiques (5 injections, 1 par semaine, 30sec/injection). Modèle de greffe orale : préparation des animaux et injection de cellules cancéreuses sous anesthésie générale (30 minutes), puis injections d’une molécule (3 injections, 30sec/injection) permettant de suivre les cellules cancéreuses par imagerie sous anesthésie gazeuse générale (durée max. : 5 min.) avec ou sans injections d’agents thérapeutiques (2 ou 3 injections selon condition en 14 jours, 30sec/injection).

Impact sur les animaux

Modèle d'induction chimique : lésions au niveau de la langue allant de l’épaississement du tissu de langue au cancer invasif, générant une douleur modérée avec impact sur l’alimentation conduisant à une perte de poids. Stress lié à la contention lors des injections d’agents thérapeutiques. Douleur légère liée à la répétition des injections d’agents thérapeutiques (5). Modèle de greffe orale : 1 lésion à l’extrémité de la langue côté droit pouvant produire une douleur modérée avec impact sur l’alimentation conduisant à une perte de poids. Stress lié à la contention lors des injections (anesthésie/molécule pour suivre les cellules cancéreuses/injection d’agents thérapeutiques). Douleur modérée liée à la répétition des injections des molécules en deux semaines pour suivre les cellules cancéreuses (3 injections) et d’agents thérapeutiques (2 ou 5 injections selon condition).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les analyses sur les tissus cancéreux.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative qui reproduit l’ensemble des interactions entre un cancer et le système immunitaire dans un organisme vivant. Les modèles plus simples testés (cultures sur boite ou mini-structure biologique qui reproduit certaines fonctions d’un organe) permettent d’étudier certains mécanismes, mais ne reflètent pas la complexité des interactions ni l’évolution de la maladie dans le corps. Les modèles informatiques apportent également des informations partielles, sans représenter la réponse immunitaire globale. Ainsi, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour mieux comprendre comment le système immunitaire interagit avec les tumeurs dans des conditions proches de la réalité biologique.

Réduction

Les effectifs expérimentaux ont été déterminés avec un logiciel d’analyse de statistiques prédictives afin d’assurer une forte validité statistique avec un minimum d’animaux. Les analyses statistiques des résultats seront basées sur la comparaison de groupes expérimentaux indépendants 2 à 2 garantissant ainsi une exploitation optimale des résultats tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les procédures susceptibles d’induire une douleur ou un stress (injection des cellules tumorales, imagerie) seront réalisées sous anesthésie générale. Un antidouleur sera administré si nécessaire, notamment en cas de perte de poids supérieure à 10 % en 7 jours témoignant d’une douleur. Afin de faciliter l’alimentation et prévenir une perte de poids, du gel nutritif sera mis à disposition dans la cage. Le suivi du bien-être animal reposera sur une pesée bi-hebdomadaire des animaux. Une grille de score sera utilisée pour évaluer l’état général (poids, prise alimentaire, activité, posture, pelage, croissance de la tumeur) et détecter précocement tout signe de souffrance. Des points limites éthiques prédéfinis seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile, notamment en limitant la croissance tumorale à un volume inférieur au seuil établi. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie, permettant d’observer l’évolution de la tumeur chez un même animal au cours du temps. Cette approche améliore la précision du suivi expérimental tout en contribuant à la réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des 3R.

Choix des espèces

Les modèles de tumeurs buccales chez la souris permettent d’étudier le rôle de certaines cellules du système immunitaire, appelées macrophages, dans le développement du cancer. Ces modèles reproduisent des situations proches de celles observées chez l’être humain, ce qui aide à mieux comprendre comment ces cellules peuvent soit freiner, soit favoriser la progression de la maladie. Ces travaux sont nécessaires pour identifier de nouvelles cibles de traitement, en particulier en lien avec une protéine appelée tenascine C, et pour développer de nouvelles approches thérapeutiques, notamment en immunothérapie. Les souris utilisées seront des mâles et des femelles âgés de 8 semaines, un âge auquel leur système immunitaire est pleinement fonctionnel.

Opérées de l'abdomen pendant la gestation, greffées de cellules humaines chez l'embryon puis injectées dans le cerveau à la naissance ou à l'âge adulte, 1 470 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Les chirurgies durent environ une heure, suivies d'injections d'analgésique toutes les huit heures pendant vingt-quatre heures. Le projet construit un modèle dit "humanisé" de la maladie d'Alzheimer pour en étudier les mécanismes précoces, avec une ouverture affichée vers des collaborations avec des start-ups. Les bénéfices thérapeutiques sont renvoyés au long terme, quand les atteintes chirurgicales sont immédiates.

Objectifs

Le projet à caractère scientifique a pour objectif de décrypter les mécanismes conduisant aux pathologies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer (MA), et impliquant certains récepteurs cellulaires. Le rôle important de ces récepteurs dans la mémoire et les processus cognitifs, progressivement altérés lors de l’évolution de la MA est démontré. L’avantage d’un modèle de greffe de cellules humaines ou selon l’appellation de « souris humanisée » est de fournir un contexte permettant de mieux appréhender les mécanismes de la dégénérescence neuronale évolutive, à des phases bien plus précoces que celles utilisées pour le diagnostic de la maladie, c’est-à-dire ceux de l’apparition des premiers symptômes chez les patients. Les nouvelles approches d’analyses sur cellule unique permettront de mieux caractériser et comparer les mécanismes moléculaires impliqués dans les formes familiale et sporadique de la MA, qui à ce jour sont suspectés différents mais encore non clairement identifiés dans les deux cas.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la pathogénèse des deux formes sporadique et familiale de la maladie d’Alzheimer (MA). A court terme, le projet devrait permettre de démontrer le potentiel des méthodes in-vivo utilisées pour décrypter ces mécanismes. Enfin, un transfert des compétences acquises et extension de l’étude sur cellules issues de patients devraient aussi permettre d’autres avancées. A plus long terme, le projet devrait pouvoir s’orienter vers l’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour la MA et offrir la possibilité de collaborer avec des start-ups déjà identifiées pour tester des molécules candidates pour traiter la MA.

Procédures

MODIFICATIONS texte en majuscules - 3 INJECTIONS SOUS-CUTANE (CHIRURGIES UNIQUEMENT), DUREE DE 15 SECONDES PAR INJECTION. - INJECTIONS SOUS-CUTANE SUR POUR TRAITEMENT POST-CHIRURGICAL : TOUTES LES 8 HEURES PENDANT 5 JOURS SOIT 15 REPETITIONS, DUREE DE 15 SECONDES PAR INJECTION. - UNE NJECTION INTRAPERITONEALE SUR L’ENSEMBLE DES ANIMAUX POUR ANESTHESIE LETALE EN FIN DE PROTOCOLE, 15 SECONDES / INJECTION. - CHIRURGIE ABDOMINALE CHEZ LA SOURIS GESTANTE). CHAQUE CHIRURGIE DURE ENVIRON 60 MIN, EN EXCLUANT LES TEMPS DE PREPARATION DE L’ANIMAL ET LES TEMPS POST-OPERATOIRES. -GREFFE DE CELLULES CHEZ L’EMBRYON DE SOURIS AU DERNIER TIERS DE GESTATION : DE 30 SECONDES CHACUNE. - INJECTION DANS LE CERVEAU CHEZ LA SOURIS NOUVEAU-NE: INJECTION 45 SECONDES PAR INJECTION DANS LE CERVEAU, UNE OU DEUX INJECTIONS. - INJECTION DANS LE CERVEAU CHEZ LA SOURIS ADULTE : INJECTION 30 MIN AU TOTAL /2 INJECTIONS PAR SOURIS.

Impact sur les animaux

MODIFICATIONS texte en majuscules Les effets indésirables chez les souris nouveau-nés comprennent le stress d’une courte séparation de leur mère (et réciproquement pour la mère par rapport à la portée), et une douleur modérée à l’injection difficile à évaluer à ce stade néonatal, mais bien anticipée par des antalgiques (injection s.c. de buprénorphine 30 min avant les chirurgies puis toutes les 8 heures pendant 24h (dose de 0.1 mg/kg). Pour les souris adultes subissant une chirurgie pour injection stéréotaxique sous anesthésie, les effets indésirables sont une douleur post-opératoire modérée contrôlée et gérée par des antalgiques (buprénorphine en s.c. 30 min avant la chirurgie et toutes les 8 heures pendant 24h à la dose de 0.1 mg/kg et metacam en forme injectable 5mg/kg en s.c. et en forma buvable dans l’eau de boisson pendant 5 jours). Pour les souris devant subir une laparotomie, les nuisances sont une douleur modérée post-opératoire du fait de la chirurgie abdominale contrôlée, anticipée et contrôlée par des antalgiques : injection s.c. de buprénorphine 30 min avant la chirurgie puis toutes les 8 heures pendant 24h (dose 0.1 mg/kg). L’ADMINISTRATION UNIQUE DE SUBSTANCE CHEZ LA SOURIS INDUIT UNE NUISANCE DE NIVEAU MODERE, DU FAIT DU STRESS DE CONTENTION, DE LA DOULEUR BREVE LIEE A LA PONCTION, DE L’INCONFORT ABDOMINAL TRANSITOIRE ET SURTOUT DE L’INDUCTION D’UN ETAT INFLAMMATOIRE GENERAL TRANSITOIRE. CELUI-CI PEUT SE TRADUIRE PAR UN ABATTEMENT, UNE DIMINUTION DE L’ACTIVITE, UNE PILOERECTION, UNE REDUCTION DE LA PRISE ALIMENTAIRE ET HYDRIQUE, UNE PERTE DE POIDS TRANSITOIRE ET UNE HYPOTHERMIE. LES ANIMAUX SERONT SUIVIS ETROITEMENT APRES INJECTION SELON UNE GRILLE DE SCORE CLINIQUE PREDEFINIE ET DES POINTS LIMITES SERONT APPLIQUES SANS DELAI EN CAS D’ALTERATION MARQUEE DE L’ETAT GENERAL.

Devenir

MODIFICATIONS LES SOURIS AYANT SUBI UNE OPERATION CHIRURGICALE ET TOTALEMENT CICATRISEES PEUVENT ETRE UTILISEES POUR PRELEVEMENTS DE CERVEAUX (APPRENTISSAGE DE COUPES TISSULAIRES). TOUS LES ANIMAUX INTEGRES DANS L’ETUDE SERONT MIS A MORT A LA FIN DE CHAQUE PROCEDURE DU FAIT DES ANALYSES PREVUES EXCLUSIVEMENT EX-VIVO. ILS NE PEUVENT ETRE NI REUTILISES, NI REPLACES, NI ADOPTES.

Remplacement

MODIFICATIONS texte en majuscules L’évaluation des processus associés à la maladie d’Alzheimer (MA) ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants et démontrés pour représenter un modèle d’étude pertinent. LA MA IMPLIQUE DES PROCESSUS DYNAMIQUES ET INTEGRES QUI NECESSITENT UN CERVEAU ENTIER VIVANT POUR ETRE RELIES CAUSALEMENT A DES ALTERATIONS COMPORTEMENTALES. LES MODELES IN VITRO/HUMAINS EX VIVO DECRIVENT UNIQUEMENT DES MECANISMES MAIS NE REPRODUISENT PAS TOUS LES SYMPTOMES, ET L’ETABLISSEMENT DE RELATIONS CAUSE‑EFFET ET L’EVALUATION PRECLINIQUE D’INTERVENTIONS SUR LA PROGRESSION ET LA COGNITION REPOSENT DONC ESSENTIELLEMENT SUR DES MODELES ANIMAUX. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages, atlas des régions cérébrales pour le repérage des structures en stéréotaxie), et de la manipulation plus aisée. Le modèle souris est un modèle de choix permettant de travailler sur des animaux manipulés génétiquement et est de ce fait celui retenu. Ce projet représente actuellement le seul modèle « humanisé » pour la MA permettant à terme une avancée thérapeutique ciblant les cellules humaines in-vivo et principaux acteurs en interaction constante dans l’évolution de la maladie.

Réduction

Puisqu’il s’agit d’un renouvellement de projet, les nombres d’animaux ont été optimisés par les études antérieures et sont réduits à leur minimum. Aucune étude pilote est nécessaire. Tous les protocoles d’injection sont largement maitrisés et chaque souris utilisée conduira à des résultats interprétables. Selon les résultats et leur interprétation, il est possible que la méthodologie soit à terme simplifiée sur un mode de chirurgie unique sans impact sur les objectifs scientifiques. Les analyses prévues sur cellule unique se feront selon un protocole déjà mis au point. Elles permettent d’obtenir une masse de données à partir de peu d’échantillons de tissus cérébraux. Les tissus non utilisés seront conservés à -80°C. Pour les greffes des souris dans l’utérus, les portées sont très larges, permettant de réduite à son strict minimum le nombre de souris gestantes. Le stade de greffe retenu a été optimisé lors de précédentes études, permettant une très bonne survie des nouveau-nés. Mâles et femelles seront utilisés en pourcentages les plus équivalents possibles et identifiés. Les animaux greffés seront mis à mort en fin d’expérience et non réutilisables. Le projet met en œuvre une collaboration avec un bio-informaticien possédant l’expertise des modes d’analyses transcriptomiques sur cellule unique et des tests statistiques associées. Pour les études relevant des analyses anatomiques/morphologiques, nous nous baserons sur nos études publiées selon des protocoles similaires.

Raffinement

MODIFICATIONS texte en majuscules Les chirurgies seront réalisées dans un laboratoire dédié exclusivement à la chirurgie L’élevage sera en cage individuelle par portée et des mesures seront prises pour éviter tout animal isolé au-delà d’une période de 24h. Les animaux seront placés sur dispositif chauffant pour maintenir une bonne température corporelle avant, pendant et après l’expérience et seront étroitement surveillés après chirurgie. Dans les procédures expérimentales, les souris feront l’objet d’une surveillance accrue ET RENFORCEE, de soins pré- et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur seront entreprises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris. CES MESURES COMPRENNENT UN RENFORCEMENT DE L’ANALGESIE, EGALEMENT LE MAINTIEN DES SOURIS A UNE BONNE TEMPERATURE SUR DISPOSITIF CHAUFFANT AU REVEIL DES CHIRURGIES, UNE LITIERE DOUCE. POUR LES FEMELLES GESTANTES, ELLES SERONT MAINTENUES AVEC UNE AUTRE FEMELLE POUR EVITER TOUT ISOLEMENT ET STRESS ASSOCIE. Pour les souris immunodéficientes, des conditions maximales d’asepsie seront appliquées. De façon générale et pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, nous rechercherons à minimiser la douleur par antalgiques, ajout de diet gel, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Nous renforcerons également l’enrichissement des cages. Nous surveillerons l’utilisation des cotons, et l’état de la nidification le cas échéant sous les dômes en carton. Durant les chirurgies, nous assurerons l’absence d’autres manipulations d’animaux dans la pièce de chirurgie et la préparation de tout le matériel sera réalisée en amont pour réduire les temps de manipulation. Deux expérimentateurs seront présents pour réduire les temps d’action. Tous les points limites seront contrôlés pour chaque procédure et anticipés par traitements analgésiques (injection s.c. de buprénorphine 30 min avant la chirurgie et toutes les 8 heures pendant 24h (0.1 mg/kg) pour un effet visible au plus tard dans un délai de 24 heures. En absence d’effets, l’animal est mis à mort.

Choix des espèces

L’évaluation du rôle du système nicotinique et d’un récepteur particulier chez l’homme dans les processus associés à la maladie d’Alzheimer ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages), et de la manipulation plus aisée. La souris représente un des meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également analyser et manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre de ce projet). Les animaux seront utilisés à trois stades de développement distincts : embryonnaire, néonatal et adulte. Pour la gestation, des femelles de 8-10 semaines seront utilisées. Les souris greffées seront sevrées à 4 semaines après naissance, en séparant mâles et femelles. Tous les animaux sevrés et injectés avec des vecteurs, seront utilisés à partir de 8 semaines et testés en groupe d’âge et protocoles indépendants jusqu’à 9 mois (3, 4, 5, 7 et 9 mois). Une condition de greffe de cellules sans vecteur sera initiés dès 1 mois. Le projet vise à étudier le développement de cellules humaines dans un contexte in-vivo, se rapprochant de conditions physiologiques et pathophysiologiques et mimant au mieux ce qui se passe dans la pathogénèse de la maladie d’Alzheimer chez les patients avant l’apparition des signes cliniques et également avant celle des premiers évènements cellulaires. Mieux comprendre les interactions entre les cellules greffées et celles de l’hôte présentant des stades de maturation différents, représente également un enjeu important pour le futur et les approches de médecine régénérative à venir.

Rendues immunodéficientes pour accepter la greffe de cellules humaines sans rejet, 216 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection de cellules de myélome ou d'amylose, puis des prises de sang deux fois par semaine pendant trente jours et jusqu'à huit administrations de composés, la croissance tumorale pouvant les rendre léthargiques et leur faire perdre du poids. Les molécules testées visent, à terme, un traitement chez l'humain, mais l'étape présente reste la caractérisation de leur effet sur des tumeurs greffées. Le porteur justifie le recours à l'animal par la nécessité d'un "organisme entier" pour analyser tous les organes cibles.

Objectifs

Le myélome multiple (MM) et l’amylose (AM) sont des pathologies associées à des anomalies des plasmocytes, cellules du système immunitaire produisant les anticorps. L'introduction de nouvelles approches thérapeutiques de chimiothérapies basées,entre autres, sur le blocage de complexes cellulaires qui assurent l’élimination des déchets protéiques dans les cellules a considérablement amélioré la survie des patients atteints. Cependant, ces traitements induisent souvent des effets indésirables graves ou des résistances aux traitements et les patients traités rechutent systématiquement Ces pathologies restent donc incurables et entrainent dans la majorité des cas le décès des patients. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de vaincre la résistance aux chimiothérapies et de réduire leur toxicité. Il a été montré qu’une toxine bactérienne capable d’inhiber la synthèse et l’expression de certaines protéines secrétées ou exprimées à la surface des cellules induisait un stress cellulaire associé à la production accrue de déchets protéiques qui, s’il est maintenu, évolue vers un suicide cellulaire. Cette inhibition permet à cette toxine de potentialiser l’efficacité thérapeutique des traitements du MM et permet de réduire efficacement la croissance tumorale dans un modèle animal murin immunodéficient. Ces résultats ont permis de démontrer l’intérêt thérapeutique de ce type d’inhibiteur dans le MM, et éventuellement pour l’AM car il bloquerait la production de la protéine responsable de la pathologie de l’amylose. Cependant la synthèse de cette toxine n’est pas compatible avec le développement de médicaments et ne peut donc pas être utilisée comme telle en tant que molécule thérapeutique. Le but de notre de projet est donc de caractériser de petites molécules possédant les propriétés inhibitrices de la toxine bactérienne mais facilement synthétisable, peu toxique et facilement administrable. Ces molécules seront sélectionnées par des tests in vitro sur leur capacité inhibitrice de la synthèse de protéines et plus particulièrement de la chaine légère anormale des immunoglobulines responsable de la pathologie de l’amylose et de leur capacité à induire la mort cellulaire sélective de cellules cancéreuses du MM tout en ne présentant pas ou peu d’effets secondaires délétères.

Bénéfices attendus

Dans son ensemble, le projet devrait aboutir à l’identification de médicaments permettant de traiter l’amylose et le myélome multiple chez l’homme qui sont aujourd’hui, dans la plupart des cas, incurables. Le projet consiste au développement de molécules thérapeutiques contre ces pathologies et l’obtention de résultats positifs dans le cadre du traitement chez la souris selon les critères définis devraient permettre de valider la stratégie de l’approche thérapeutique basée sur l’inhibition de la sécrétion et l’expression de protéine. Les molécules donnant les résultats les plus prometteurs seront alors testées lors d’essais cliniques chez l’homme permettant d’aboutir à un développement de médicaments pour traiter ces maladies.

Procédures

Prises de sang (quelques secondes) 2 fois par semaine pendant 30 jours. Injection de cellules humaines, 30 secondes pour une injection, une injection de cellules par animal. Effet indésirables liés à la croissance/ au développement de la masse tumorale. Administration de composés par injection ;10 secondes par administration ; maximum 8 administrations / animal.

Impact sur les animaux

Les souris seront injectées avec des lignées humaines de myélome multiple ou d’amylose en sous cutané ou par voie intraveineuse. L’injection des cellules pourra occasionner une douleur de courte durée au niveau du site d’injection. La croissance de ces cellules sera suivie et les souris dont la croissance aura atteint un point limite seront mises à mort. Ainsi la croissance de ces cellules dans les limites imposées dans le projet ne devrait pas générer de douleur particulière mais les souris pourraient subir une gêne dû à la croissance des cellules et devenir léthargiques et subir une perte de poids. La croissance des cellules pourrait être associée à des pathologies particulières, telles que celles observées chez l’homme et pourraient générer inconfort, stress et douleur. Les souris seront donc suivies périodiquement et si des symptômes révélateurs de souffrance, d’inconfort ou de stress étaient observés, les animaux seront mis à mort afin de réduire la souffrance en accord avec les points limites définis. Les traitements, quant à eux, ne devraient pas induire de souffrance particulière car ils auront été sélectionnés sur des critères d’absence de toxicité et d’effets secondaires. Mais la manipulation fréquente et périodique des souris pour l’administration des traitements et du suivi pourrait aussi générer un stress plus ou moins important en fonction de la voie d’administration choisie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous devrons prélever en fin de procédures certains organes vitaux pour analyse (effets des traitements sur la croissance tumorale et sur les pathologies étudiées).

Remplacement

Il s’agit ici de tester différentes molécules de synthèses possédant les propriétés inhibitrices de la sécrétion et de l’expression de protéine similaire à la toxine bactérienne. Toutes les questions pouvant être apportées par l’utilisation de lignées cellulaires sur cette inhibition seront réalisées in vitro pour les caractériser et définir leurs propriétés biologiques. Cependant, le projet a pour objectif d’utiliser finalement ces molécules dans le traitement de pathologies chez l’homme et viseront donc à caractériser les effets thérapeutiques de ces molécules sur la prévention et le développement de ces pathologies. Il doit être réalisé dans un modèle expérimental physiologique de ces pathologies et doit donc être analysée et validée sur un organisme entier permettant d’analyser tous les organes cibles.

Réduction

Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur la forte expérience de nos conceptions d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé. Les expériences passées ont montré que le nombre d’animaux par groupe utilisé ici (6) est le minimum requis pour obtenir des résultats pertinents et statistiquement significatifs. Un nombre inférieur d’animaux pourrait conduire à une expérience non interprétable du fait d’un manque de puissance des données générées. La répétition de l’expérience pourrait être nécessaire pour la robustesse des données établies. Par ailleurs, nous utiliserons des techniques expérimentales nous permettant d’analyser sur un seul individu de multiple facteurs caractérisant la pathologie pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé. Les groupes expérimentaux de souris seront mélangés dans les cages afin de minimiser au maximum les conséquences de l’effet cage sur les résultats, permettant ainsi d’utiliser moins d’animaux et de réduire le nombre de répétition des expériences. Si possible, les molécules seront testées au sein d’une même expériences afin d’utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs molécules et donc réduire le nombre de souris.

Raffinement

Les souris immunodéficientes seront maintenues dans un environnement protégé sans pathogène opportuniste sous armoires ventilées et hébergées en groupe, avec une litière appropriée, des matériaux de nidification, et une nourriture adaptée. La nourriture sera irradiée, l’eau de boisson autoclavée et le matériel en contact avec l’animal sera autoclavé ou décontaminé. La durée et les doses des traitements sont calculées pour ne pas induire d’effet indésirable, tout en atteignant les objectifs scientifiques. Pendant la durée de l’expérience, les animaux restent dans leur environnement habituel. La plupart des gestes opératoires susceptibles d’être douloureux ou nécessitant un temps de plus d’une minute générateurs de stress seront effectués sous anesthésie. Des observations régulières des animaux seront effectuées tout au long des expériences pour détecter les animaux qui seront en éventuellement souffrance. Dès que le point limite sera atteint, les animaux concernés seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris présente le meilleur compromis éthique entre modèle mammifère, résultats le plus proches de l’humain tout en utilisant un nombre suffisant pour l’obtention de résultats fiables. Les métabolismes sont bien caractérisés et largement comparables à ceux de l’homme. En conséquence, les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. D’autre part, la disponibilité de souris immunodéficientes nous permet d’envisager la greffe de cellules humaines sans rejet de celles-ci par le système immunitaire nous permettant d’analyser l’effet du traitement seul. Nous étudions des pathologies de l’adulte, des individus adultes de 6 à 8 semaines seront donc utilisés. Pour les xénogreffes des animaux immunodéficients, cet âge est requis car au-delà de 8 semaines une irradiation est nécessaire avant implantation des xénogreffes.