Oncologie
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Contrôle de la balance énergétique par l’incrétine GIP via le bulbe olfactif
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940 souris vont être utilisées pour étudier une hormone intestinale et l'obésité, 600 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 340 modéré, toutes tuées par surdose d'anesthésique. La moitié est rendue obèse par un régime hypercalorique de trois à six mois, opérée pour implanter une canule dans le cerveau, puis isolée jusqu'à douze semaines. La queue est sectionnée aux ciseaux, un geste que le porteur classe comme douleur légère. L'isolement, qu'il reconnaît comme un stress en soi, sert à protéger les canules.
Objectifs
L’obésité est un problème de santé publique en forte augmentation et constitue un facteur de risque majeur pour le diabète de type 2, une maladie caractérisée par un excès de sucre dans le sang. Ce dérèglement est lié à une mauvaise régulation de l’insuline, une hormone essentielle produite par le pancréas. Dans ce projet, nous étudions une hormone intestinale, déjà utilisée dans le traitement du diabète, mais dont le rôle au niveau du cerveau reste encore mal compris. Nous nous intéressons plus particulièrement au bulbe olfactif, une région cérébrale impliquée dans la perception des odeurs. Des travaux récents suggèrent que le cerveau pourrait influencer très précocement la sécrétion d’insuline, dès la perception des signaux alimentaires. Nous faisons l’hypothèse que cette hormone intestinale agit dans le bulbe olfactif pour activer des circuits nerveux reliant le cerveau au pancréas. À l’aide de modèles animaux, nous étudierons les effets de cette hormone intestinale administrée directement dans le cerveau ou par voie intranasale, une méthode non invasive permettant d’atteindre le cerveau via le museau de l'animal.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les liens entre perception sensorielle, cerveau et métabolisme, et pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour l’obésité et le diabète.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : #1. La moitié des animaux sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 3 à 6 mois, ainsi ces animaux deviendront obèses et diabétiques. #2. Les animaux seront opérés pour placer une canule au niveau du cerveau permettant l’injection de molécules directement dans le cerveau. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. #3. Les animaux seront injectés avec des médicaments une fois par jour pendant 7 jours, par voie intranasale ou intrapéritonéale. #4. Les animaux seront utilisés pour faire des tests métaboliques : quatre fois pendant deux heures, à 7 jours d’intervalle. Pendant ces 2 heures nous mesurerons leur glycémie 6 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 4 fois). Les animaux seront toujours libres de leurs mouvements dans nos expériences. #5. Nous devrons isoler une partie des animaux (seul dans une cage) pendant 2 à 12 semaines, en fonction de nos expériences.
Impact sur les animaux
#1. Régime hypercalorique : Après 3 mois de régime hypercalorique les animaux ont un surpoids et présentent les premiers signes d'apparition du diabète de type 2 (intolérance au glucose et résistance à l'insuline), ces nuisances sont modérées. #2. Les animaux qui subiront une injection intranasale peuvent avoir une gêne respiratoire par l'irritation passagère due au liquide placé dans les fosses nasales. #3. Chirurgie : Plusieurs effets indésirables sont possibles. Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie. La chirurgie peut entrainer des douleurs modérées et des problèmes de récupération modérés. #4. Tests métabolique : le gavage, l’injection intra-péritonéale et les prélèvements sanguins peuvent stresser les animaux (nuisances légères). La queue des animaux sera coupée au ciseau, cela entraine une douleur considérée comme légère. Un faible risque d'hypoglycémie suite à l'administration d'insuline est possible (uniquement chez les animaux non obèses). #5. Isolement : Après la chirurgie, les animaux seront isolés afin d'éviter que les canules de perfusion ne soient endommagées dans leurs interactions sociales et ne les blessent. Cet isolement est un stress en soi. #6. Analyse de calorimétrie indirecte : les animaux seront individualisés pendant 15 jours, cela entrainera un stress et une possible perte de poids (nuisance modérée).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésique afin de prélever des tissus.
Remplacement
Afin d'étudier le rôle d'une hormone intestinale sur le cerveau, nous utiliserons une lignée de souris génétiquement modifiées au niveau d'une zone précise du cerveau : le bulbe olfactif. Nous souhaitons également injecter et faire pénétrer une molécule pharmacologique dans le cerveau par voie intranasale, afin d'obtenir une voie d'accès non-invasive, pour moduler positivement le métabolisme énergétique des souris obèses. Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle de cette hormone dans le contrôle de l’homéostasie énergétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’humain.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et afin d’ obtenir des données statistiquement analysables, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 10 à 12 souris par condition de traitement. De plus, les procédures n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux, intercalées avec des périodes de repos de 7 jours, au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués par nos soins. Nous prendrons soin d'utiliser les mêmes souris pour effectuer des injections croisées entre placebo et molécule pharmacologique. Ainsi les souris seront leur propre témoin à l'intérieur de chaque procédure, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entraîner une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront un traitement analgésique avant l'acte, qui pourra être poursuivi après l'acte pour prévenir la douleur. Une légère perte de poids peut-être observée après les premiers jours suivants la chirurgie, et un complément alimentaire de type gel enrichi en calorie pourra être proposé aux animaux pour leur permettre une meilleure récupération. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance. Pour éviter tout problème respiratoire pendant l'administration intranasale chez la souris, il sera procédé à une administration par narine à la fois, avec un temps de pause de 3 minutes entre les 2 narines, pour laisser le temps à la souris de récupérer de la première contention et également d'observer son comportement. Pour les tests métaboliques, nous avons limité au maximum les prélèvements de sang nécessaires aux mesures du glucose et de l'insuline, afin de réduire l'impact sur le bien-être animal. Le bien-être de l’animal sera évalué régulièrement par le suivi du poids, la mesure de la prise alimentaire et de la prise hydrique. Des points limites ont été établis préalablement pour chaque procédure afin de veiller au bien-être animal. A tout moment, si un point limite est atteint l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance. Nous utiliserons les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle physiologique de notre hormone d'intérêt dans le contrôle de l’homéostasie énergétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2, et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. Les expériences seront effectuées sur des souris agées de 8 semaines et au-delà, ce qui permet de travailler sur des animaux adultes, lorsque que toutes les structures cérébrales sont stabilisées dans leur développement.
Les Effets Longitudinaux de la Psilocybine sur le Sommeil Chez La Souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
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- Autre recherche fondamentale
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- Système nerveux
336 souris reçoivent une injection unique de psilocybine, dont 56 après l'implantation chirurgicale d'un dispositif d'enregistrement cérébral de deux heures, dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à sévère. Toutes sont tuées à l'issue pour analyse histologique du cerveau. Certaines subissent des privations de sommeil répétées et deux tests comportementaux de locomotion et d'anxiété, pour décrire comment la substance modifie le sommeil sur un mois. Les améliorations du sommeil rapportées chez l'humain, que le porteur invoque, restent au conditionnel face à ces atteintes.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre comment les champignons hallucinogènes, une substance psychoactive, modifient temporairement l’activité cérébrale, et peuvent influencer le sommeil à court terme et/ou sur plusieurs semaines. Le sommeil joue un rôle essentiel dans la santé mentale et physique, mais les mécanismes biologiques expliquant pourquoi cette substance peut modifier durablement la qualité du sommeil restent mal compris. L’objectif est donc de décrire précisément les changements de sommeil induits par cette substance et d’identifier quels circuits cérébraux et quelles cellules pourraient être impliqués dans ces effets. Pour répondre à ces questions, l’étude utilisera des souris adultes. Le sommeil sera enregistré de manière répétée au cours du temps afin de comparer, chez un même animal, une période de référence (avant administration) et plusieurs périodes de suivi (immédiatement après, puis une semaine, deux semaines et un mois plus tard). En complément, des tests comportementaux simples et non invasifs permettront d’évaluer l’exploration et des indicateurs liés à l’anxiété, car ces dimensions peuvent interagir avec le sommeil.
Bénéfices attendus
La psilocybine fait l’objet d’un intérêt clinique croissant en psychiatrie, avec des essais contrôlés rapportant des améliorations rapides et parfois durables des symptômes dans la dépression (notamment épisodes dépressifs majeurs et formes résistantes), et un champ de recherche en expansion pour d’autres troubles liés au stress et au trauma dans des cadres thérapeutiques encadrés. Parallèlement, de nombreux travaux et retours cliniques chez l’humain rapportent, après une prise, une amélioration subjective de la qualité du sommeil (sommeil perçu comme plus réparateur), même si la physiologie du sommeil reste encore insuffisamment caractérisée. Le projet vise donc à mieux caractériser les effets aigus et long terme de la psilocybine sur l’architecture du sommeil et son homéostasie et identifier les effets cellulaires. Ces résultats pourraient améliorer l’interprétation des effets thérapeutiques rapportés en clinique et contribuer à l’optimisation de stratégies de prise en charge où le sommeil est un déterminant majeur du pronostic et de la résilience psychique.
Procédures
Les contraintes pour les animaux proviennent principalement de : (i) l’implantation d’un dispositif d’enregistrement chez 56 souris, correspondant à une chirurgie unique, qui dure environ 2H , suivie d’une récupération de 4 jours ; (ii) une injection expérimental unique (15s) du psychoactive sur 336 souris au total; (iii) des sessions d’enregistrement du sommeil de 24 h réalisées chez 56 souris réalisé 4 fois à 7 jours d’intervalle ainsi que, pour certains de ces animaux, des privations douces de sommeil limitées à 4 h suivies d’un enregistrement de 2 h post-privation pour étudier comment l’organisme essaye de récupérer 4h de sommeil en moins. Deux tests comportementaux non invasifs seront réalisés chez 56 souris à raison de 3 sessions espacées de 24H minimum pour chacun des tests. Le premier test consiste à mesurer la locomotion et l’anxiété (une durée de 10 minutes et qui sera réalisé deux fois pour étudier les effets de la substance psychoactive avant et après son injection). Le deuxième test étudie seulement l’anxiété, et dure aussi 10 minutes, et sera répété qu’une fois 30 jours après l’administration de la substance psychoactive.
Impact sur les animaux
Les nuisances principales sont liées à la chirurgie d'implantation (douleur post-opératoire, inconfort lié aux implants, risques d'infection). La psilocybine peut induire des modifications transitoires du comportement (hyperlocomotion, réactivité accrue); la surveillance post-injection est donc renforcée.
Devenir
Le sort prévu pour tous les animaux sont une mise à mort adaptée pour chaque procédure. Les objectifs poursuivis dans cette étude nécessitent des analyses histologiques des tissus cérébraux ainsi que certains enregistrements ex vivo, ce qui oblige à mettre les animaux à mort en fin de procédure.
Remplacement
L’étude cherche à comprendre comment une substance pouvant modifier l’activité cérébrale influence le sommeil dans un organisme entier, et comment ces effets s’accompagnent de changements durables dans certaines régions du cerveau. Ces questions nécessitent d’observer simultanément le sommeil, l’activité, la température et des réponses biologiques intégrées (réseaux cérébraux, interactions entre différents types de cellules), ce qui ne peut pas être reproduit de façon fiable par des méthodes entièrement alternatives. Des approches non animales (cultures cellulaires, organoïdes, modélisation) peuvent aider à explorer certains mécanismes isolés, mais elles ne permettent pas de mesurer l’architecture du sommeil ni ses régulations physiologiques sur plusieurs semaines. L’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Le projet est conçu pour utiliser le moins d’animaux possible tout en assurant des résultats robustes. La stratégie repose sur des suivis dans le temps d’un même animal et sur plusieurs types d’expériences quand celles-ci ne sont pas invasives ou que c’est possible en respectant le bien-être des animaux, diminuant ainsi la variabilité statistique.
Raffinement
Toutes les procédures sont organisées pour limiter la douleur, le stress et la durée de contrainte. Une habituation progressive est mise en place (manipulation douce, acclimatation aux conditions d’enregistrement) afin de réduire l’anxiété liée aux manipulations. Pour les animaux nécessitant une chirurgie, l’intervention est réalisée sous anesthésie avec des mesures de prévention de la douleur en utilisant des analgiques avant et après l’opération, et une surveillance post-opératoire renforcée ; une période de récupération est respectée avant les enregistrements. Les périodes de privation de sommeil sont limitées dans le temps et réalisées par des stimulations douces, sans recours à des méthodes aversives, avec un retour rapide à des conditions calmes. Les tests comportementaux sont non invasifs, effectués sur des durées minimales, dans une salle dédiée, avec nettoyage systématique et retour rapide au logement. Des critères d’arrêt anticipé (points limites) et une mise à mort précoce sont prévus en cas de signe de souffrance non contrôlée, afin de garantir le niveau de bien-être maximal compatible avec les objectifs scientifiques.
Choix des espèces
La souris est utilisée car elle constitue un modèle de référence pour l’étude du sommeil : elle présente des états de vigilance bien caractérisés et permet des suivis répétés à l’échelle de plusieurs semaines nécessaires à l’analyse des effets persistants. Enfin, l’espèce murine permet le recours à des outils génétiques et histologiques indispensables aux objectifs du projet. De plus, nous étudierons ces effets sur des souris âgées de 80 jours, là où la maturation du cerveau est finie, et donc le sommeil stabilisé, assurant que les effets que nous allons voir ne peuvent pas être attribués à l’âge.
Effet du monoxyde de carbone (CO) intracellulaire sur le métabolisme énergétique et la cicatrisation chez la souris (MODIFICATION 1)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rendues obèses par un régime riche en graisses puis, pour une partie, opérées pour créer une plaie cutanée, 670 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue sans anesthésie et une excision de peau sous anesthésie, pour tester des molécules libératrices de monoxyde de carbone censées agir sur le poids et la cicatrisation. Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids en une semaine sont mises à mort. Le porteur indique avoir d'abord trié vingt composés sur des cellules en culture, ce qui n'a pas écarté le recours final à des centaines de souris.
Objectifs
Le monoxyde de carbone (CO) est un gaz produit par les cellules à de très faibles concentrations. Il a été démontré qu'il régule d'importants processus physiologiques chez les mammifères, y compris les humains. Plusieurs études ont mis en évidence les actions pharmacologiques polyvalentes du CO et les scientifiques ont donc commencé à exploiter ce gaz pour des applications thérapeutiques. Dans ce contexte, une nouvelle génération de composés capables de libérer du CO a été développée. Le grand avantage de ces composés est que la quantité de CO qu'ils libèrent peuvent être mieux contrôlés en comparaison au CO gazeux. En fait, dans des expériences utilisant des rongeurs, il a été rapporté que ces composés exerçaient des actions thérapeutiques prometteuses contre diverses maladies telles que l’infarctus du myocarde, l’inflammation et les dysfonctionnements métaboliques. Plus récemment, il a été publié que l'administration orale de ces composés qui libère du CO avec une très grande efficacité chez des souris nourries avec un régime riche en graisses mène à une réduction significative du gain de poids corporel associée à une amélioration de la glycémie et à une diminution de la résistance à l'insuline. Le présent projet consiste à utiliser le même modèle d'obésité pour tester l'effet de nouvelles molécules développés récemment et qui ciblent plus efficacement le tissu adipeux. L'objectif principal est d'évaluer l'action thérapeutique de ces nouvelles molécules chez les jeunes souris et les souris âgées, puis d'évaluer si le CO possède également un effet thérapeutique sur l'obésité au cours du vieillissement. De la même manière, seront étudiés les effets protecteurs de ces nouvelles molécules, mais aussi une nouvelle technique générant localement du gaz CO dans le traitement des plaies cutanées. En effet, il est bien connu que la cicatrisation cutanée est altérée dans les maladies affectées par un dysfonctionnement métabolique tel que le diabète.
Bénéfices attendus
Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques de composés novateurs. Les résultats de cette étude nous fourniront des notions importantes sur le mécanisme d'action et l'applicabilité thérapeutique de ces molécules dans le contexte du dysfonctionnement métabolique et des plaies cutanées.
Procédures
Dans les modèles de régime riche en graisses, les animaux seront soumis à plusieurs reprises (0, 7 et 14 semanines) à un prélèvement de sang sans anesthésie (cela ne prend que 5 minutes) au niveau caudale, en tant qu'intervention invasive. Dans le modèle de plaie cutanée, les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour retirer un morceau de peau afin de créer la plaie. Cette chirurgie est très rapide, modérément invasive et ne nécessite pas plus de 20 à 30 minutes.
Impact sur les animaux
Le modèle de régime riche en graisses est un modèle largement utilisé, il est sans douleur pour les animaux et n'implique pas de procédures invasives. Le degré de sévérité de la procédure de plaie de la peau, bien maîtrisée, est considéré de classe modérée. Cette procédure est réalisée sous anesthésie et les animaux se rétablissent complètement avec peu ou pas de douleur puisque la cicatrisation de la peau est très rapide. Concernant le prélèvement sanguin sans anesthésie, nous recueillerons un très faible volume et l’adéquation volume/méthode permet de respecter le bien-être animal.
Devenir
Comme nous avons besoin de collecter les organes pour une analyse fonctionnelle, génique et biochimique, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Avant de finaliser et d'optimiser les protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons initialement synthétisé et testé 20 composés pour déterminer leurs effets bénéfiques sur le métabolisme dans des adipocytes en culture remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. Tous les 20 composés avaient la capacité de libérer efficacement du CO et d'exercer un effet positif sur la respiration mitochondriale et la glycolyse mais seulement 4 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires. Ces tests in vitro nous ont permis de sélectionner les 4 meilleurs en fonction également de leur structure chimique diversifiée. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses, nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée, nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.
Réduction
Pour chacun des groupes étudiés (groupes contrôles vs groupes traités) dans les procédures (souris jeunes), nous utiliserons 10 souris, en raison de la variabilité entre les différents animaux, et ce afin d’obtenir des données significatives. Chaque protocole nécessite son propre contrôle. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d’autres molécules aux mêmes propriétés. Après collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. Notez que la stratégie expérimentale implique l'administration par voie orale ou i.p. de différentes doses aux souris, suivi par le prélèvement de tissus. Et ce, dans le but d’effectuer des mesures de paramètres fonctionnels et biochimiques et de déterminer quelle voie d'administration et quelle dose fournit les effets thérapeutiques les plus efficaces. Pour les experiences sur des souris jeunes et âgées, nous avons besoin d'un minimum de 30 souris par groupe pour obtenir une puissance significative afin d’étudier la longévité et la survie de souris âgées.
Raffinement
En optimisant les protocoles expérimentaux, nous avons privilégié des approches peu invasives afin de minimiser la douleur, la souffrance et la détresse des animaux. Nous avons déjà montré que le régime riche en graisses pendant 14 semaines et le traitement avec l’une de nos molécules n’induisent ni stress ni impact sur leur santé. Si les animaux perdent plus de 15 % de leur poids en une semaine, nous procéderons à leur mise à mort. Pour le protocole de plaie cutanée, une mise à mort compassionnelle sera pratiquée en cas de surinfection ou de signes de détresse tels que : prostration, dos voûté, pelage terne et hérissé, refus de se nourrir ou de s’abreuver, et perte de poids >15 %. Nous avons limité le nombre de composés et de doses utilisées. Le logement et l’élevage tiendront compte du bien-être animal. Des anesthésiques appropriés, et si nécessaire des analgésiques, seront utilisés pour minimiser la douleur. Les souris seront logées par groupes de trois, avec nettoyage hebdomadaire des cages et accès à la nourriture et à l’eau ad libitum.
Choix des espèces
Le modèle de souris est un modèle largement utilisé pour étudier l’effet des régimes alimentaire riche en graisse (« High Fat Diet », HFD). De manière analogue, les modèles de cicatrisation de la peau chez la souris ont été établis et bien décrits dans la littérature. Les souris diabétiques et les souris avec un régime alimentaire riche (HFD) ont été largement utilisées pour déterminer l’effet des drogues et des réponses inflammatoires suite à des désordres métaboliques liés au diabète et á l’obésité. Le choix de cette espèce de souris se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses, nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée, nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.
Etude des cellules souches lors de la régénération des épithéliums glandulaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Les procédures se limitent à quelques injections brèves, mais elles concernent 2 016 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Après leur mise à mort, neuf à quatorze organes sont prélevés sur chaque animal, des glandes mammaires et salivaires à la prostate ou au vagin. L'étude porte sur les cellules souches qui redeviennent multipotentes lors de la réparation des tissus, un mécanisme réactivé dans certains cancers. Le RNT fonde ce total de plus de 2 000 souris sur la seule littérature, sans autre justification de l'effectif.
Objectifs
Certaines cellules adultes peuvent, dans des contextes particuliers, retrouver des caractéristiques qu’elles n’avaient plus depuis le stade embryonnaire. C’est ce qu’on observe notamment dans le développement de certains cancers. L’une de ces caractéristiques est la multipotence, c’est-à-dire la capacité d’une cellule à se transformer en plusieurs types de cellules différents. Nous nous intéressons à plusieurs types de tissus glandulaires : les glandes mammaires, salivaires, lacrymales et prostatiques. Chez l’adulte, ces tissus sont composés de cellules spécialisées qui ne produisent qu’un seul type cellulaire. Mais lors de la réparation d’un tissu endommagé, certaines cellules retrouvent temporairement cette capacité à se diversifier. Or, dans les cancers de ces tissus, les cellules tumorales semblent réactiver ce programme de manière incontrôlée. Notre objectif est de mieux comprendre comment ces tissus se régénèrent après une blessure. En étudiant les mécanismes qui contrôlent le passage d’un état cellulaire flexible (multipotent) à un état plus stable et spécialisé, nous espérons identifier ce qui, lorsqu’il est déréglé, peut favoriser l’apparition ou la progression de tumeurs.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’étudier le comportement des cellules souches et leur état de différentiation pendant la régénération tissulaire dans les épithéliums stratifiés (à plusieurs couches) chez la souris. Nos résultats aideront à identifier les mécanismes régulant le destin des cellules souches. Ces mécanismes étant déstabilisés lors de la formation de tumeurs, nous pensons qu’à long terme nos recherches contribueront à une meilleure compréhension du processus tumoral dans les tissus épithéliaux étudiés.
Procédures
Les animaux recevront une ou un maximum de 5 injections (durée de chaque injection inférieure à 10 secondes) Maximum 1 injection/jour pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gène de courte durée). Suite à l’injection des traitements, une perte de poids, ou de la diarrhée pourraient être observés pendant quelques jours.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Au fil des années, beaucoup d'efforts ont été déployés pour développer des modèles 3D in vitro, comme les organoïdes, qui soient physiologiquement pertinents pour analyser le comportement dynamique des cellules souches au cours du développement et de la régénération tissulaire. Cependant, les cellules épithéliales modifient leur comportement lorsqu’elles sont cultivées in vitro sous forme d'organoïdes et détachées de leur niche tissulaire physiologique, ce qui nous empêche d'utiliser cette technique pour toutes les questions concernant le potentiel de différenciation des cellules souches De plus, les animaux seront essentiels pour suivre les cellules souches lors de la régénération tissulaire, étant donné qu’il n’existe actuellement aucun modèle in vitro qui puisse récapituler le processus global de régénération. L’absence de structure similaire aux épithéliums étudiés dans des modèles de vertébrés non mammifères rend l’utilisation de la souris nécessaire à notre étude.
Réduction
Le nombre de souris utilisées sera réduit au minimum possible. Pour réduire au minimum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements, des informations seront obtenues au niveau des organes, cellules et molécules à partir du même animal. Des schémas de reproduction des souris transgéniques seront réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris avec le génotype souhaité. . Pour chaque souris 9 organes seront collectés (glande lacrymale, salivaire, épiderme, muqueuse orale, trachée, cornée, œsophage, thymus, vessie + 2 organes chez les mâles: prostate et urètre + 3 organes chez les femelles: glande mammaire, vagin, col de l’utérus. Le nombre d'animaux de notre étude est initialement fondé sur les données de la littérature.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions réglementaires. Pour l’injection des traitements, les animaux seront observés quotidiennement. En cas de diarrhée aigue, une solution de réhydratation sera apportée. Les signes de mal être ou de déshydratation ou de perte de poids visibles seront observés avec vigilance.
Choix des espèces
L'organisation générale, le développement et le fonctionnement glandes étudiées ici sont très similaires chez la souris et chez l’Homme. Le modèle souris est donc très utilisé dans la communauté scientifique afin d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement normal du tissu ainsi que de la régénération. De la même manière, les évènements cancéreux survenant chez l’homme et chez la souris suivent les mêmes étapes dans les différentes glandes étudiées ; perte d’identité cellulaire, activation de traits embryonnaires, prolifération non contrôlée. Les animaux utilisés pour l’étude de la régénération tissulaire seront âgés de 8 à 16 semaines. Les glandes de ces animaux sont alors constituées de progéniteurs qui réactivent la multipotence après différents dommages cellulaires
Etude de la prolifération intestinale lors de la malnutrition protéique chez la souris juvénile
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
Des seuils d'alerte déclenchent le retrait de l'étude et la mise à mort des animaux qui se dégradent trop. 64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant une à cinq semaines pour reproduire une malnutrition infantile, avec trois injections et un retard de croissance attendu. Le projet, présenté comme pilote, cherche à décrire comment ce régime modifie la multiplication des cellules de l'intestin, en comparant mâles et femelles.
Objectifs
La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur dans le monde. Elle peut provoquer des troubles durables de la croissance, de la gestion de l’énergie et du développement. Des études récentes montrent que les garçons semblent plus touchés que les filles. L’intestin, qui absorbe les nutriments et joue un rôle central dans de nombreux processus du corps, est au cœur de cette problématique. Pourtant, on connaît encore mal la façon dont il réagit à une alimentation pauvre en protéines. Nos premiers résultats suggèrent que ce type de régime pourrait altérer le développement des cellules qui contribuent à l’absorption des nutriments. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment un régime pauvre en protéines influence le fonctionnement de l’intestin, essentiel à la digestion et à la communication entre les organes. Nous utiliserons une procédure pilote qui guidera le protocole pour la procédure complète, l’idée étant de comprendre à quel rythme les cellules intestinales se divisent en fonction du régime, celui-ci étant un indicateur important de la santé du système digestif. Ce projet aidera à mieux comprendre l’effet de l’alimentation sur l’intestin, en tenant compte des différences entre sexes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment le fonctionnement intestinal est affecté par la malnutrition protéique juvénile, en tenant compte du sexe. Cette description de la multiplication des cellules dans l’intestin permettra à terme d’éclairer de nouvelles pistes de prévention ou d’intervention en santé humaine, où les enfants en malnutrition sont généralement sujets à des symptômes intestinaux associé à un mauvais fonctionnement intestinal (comme le transit).
Procédures
64 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 1 ou 5 semaines. Chaque animal sera injecté avec 3 produits différent (30 secondes / injection) : un jour et demi avant, un jour avant, et juste avant la fin de la procédure. A 28 jours, 36 souris seront anesthésiées (3 minutes). A 56 jours, 28 souris seront anesthésiées (3 minutes).
Impact sur les animaux
Les trois injections de produits peuvent entraîner un gonflement ou un oedème, dont l’apparition sera surveillée après la procédure. Le régime faible en protéines a pour conséquence un retard de croissance en taille.
Devenir
L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d’intérêt.
Remplacement
Pour comprendre comment le corps réagit à différents types d’alimentation, en particulier en cas de manque de protéines, il est nécessaire d’étudier l’organisme dans son ensemble. Aucun modèle en laboratoire (sans animal) ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité du corps humain, où plusieurs organes communiquent entre eux et influencent ensemble l’état nutritionnel. C’est pour cette raison que l’utilisation d’animaux est indispensable dans ce projet. La souris a été choisie car elle représente un bon modèle pour étudier les effets d’une alimentation pauvre en protéines dans des conditions proches de la physiologie humaine. L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans l’intestin. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été limité autant que possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Nous avons choisi d’inclure 7 animaux par groupe, sur la base d’un calcul statistique garantissant la solidité des conclusions. Ce calcul s’appuie sur des données que nous avons déjà pour la mesure de la prolifération chez les souris adulte. La mesure de plusieurs paramètres sur chaque souris permet d’éviter la multiplication des cohortes. Les analyses prévues permettront de comparer les effets du régime alimentaire et du sexe.
Raffinement
L’étude commencera uniquement avec des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. La nourriture sera mise à portée des plus jeunes pour qu’ils puissent y accéder facilement. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance.
Choix des espèces
La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour étudier le fonctionnement de l’intestin lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 1 ou 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment un manque de protéines dans l’alimentation influence l’intestin durant la période juvénile. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car l’intestin joue un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments dès les premiers stades de la vie et peut ainsi influencer de nombreux aspects du développement, comme la croissance.
Élevage, génotypage de lignées murines transgéniques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
- Système urogénital
Environ 3 000 de ces souris sont maintenues en vie pour la reproduction des lignées, les surnuméraires et celles au mauvais génotype étant tuées. 5 000 souris au total vont être utilisées, dans des procédures classées légères à modérées, pour l'élevage et le génotypage de lignées transgéniques. Chaque animal subit au sevrage une biopsie de la queue et la pose d'une bague auriculaire, certaines lignées développant un prolapsus anal ou des troubles respiratoires à l'âge adulte. Le porteur décrit ces lignées comme "indispensables" et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les défenses des muqueuses à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Les souris sont utilisées pour le maintien et l’amplification de lignées transgéniques, y compris des lignées présentant ou susceptibles de présenter un phénotype dommageable. Elles sont identifiées au sevrage par pose de bague auriculaire et, lorsque nécessaire, par génotypage à partir d’une biopsie de queue.
Bénéfices attendus
Les lignées transgéniques sont indispensables pour des projets visant à démontrer le rôle d’une famille de gènes fortement conservée entre l’Homme et la souris dans la protection des muqueuses. Elles permettent également de mieux comprendre les relations entre la variabilité de ces gènes et les altérations des mécanismes de défense des muqueuses sécrétrices. Ces modèles contribuent au développement de stratégies thérapeutiques et, à terme, à la mise en place de méthodes alternatives à l’expérimentation animale pour des études mécanistiques. Le projet permet également de maintenir un noyau de lignées transgéniques et de fournir des animaux à des laboratoires partenaires dans le cadre de collaborations scientifiques.
Procédures
La biopsie de queue (< 1 mm) est réalisée au sevrage sur des animaux vigiles, sous contention, pour le génotypage, concomitamment à la pose d’une bague auriculaire pour l’identification. Dans de rares cas, un génotypage complémentaire peut être réalisé à l’âge adulte par prélèvement au poinçon auriculaire sur animal vigile, sous contention.
Impact sur les animaux
Certaines lignées présentent un phénotype dommageable avéré ou potentiel. Des souris d’une lignée peuvent développer un prolapsus anal associé à une inflammation colorectale, tandis que des troubles respiratoires peuvent apparaître dans une autre lignée. Ces phénotypes sont observés uniquement chez des souris homozygotes âgées de plus de 5 mois. Sur la base de l’expérience acquise sur ces deux lignées, suivies depuis plusieurs années chez des souris âgées de moins de 6 mois, le phénotype dommageable reste peu fréquent (
Devenir
Les souris avec des génotypes requis sont maintenues en vie pour l’établissement et l’entretien des lignées ainsi que pour leur utilisation dans les protocoles expérimentaux du présent projet ou de projets associés. Les souris ne présentant pas de génotype requis (souris surnuméraires ou non nécessaires) sont mises à mort, soit dans le cadre de la gestion des colonies, soit en fin d’utilisation expérimentale. Les souris présentant un phénotype dommageable sont également mises à mort en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses sécrétrices, en particulier les interactions entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles alternatifs actuels ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions au niveau de l’organisme entier. Les investigations chez l’Homme restent limitées et reposent principalement sur des observations cliniques et des analyses ex vivo. Le développement de stratégies thérapeutiques dans ces pathologies nécessite une compréhension approfondie des mécanismes biologiques et de leur régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent, permettant le contrôle de l’environnement expérimental et de la variabilité génétique. Son système immunitaire est bien caractérisé, son génome entièrement séquencé, et de nombreuses lignées transgéniques sont disponibles pour étudier des gènes impliqués dans la défense des épithéliums. Certaines lignées utilisées dans ce projet contribueront également au développement d’approches complémentaires visant à réduire à terme le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
La production de souris est planifiée en fonction des besoins expérimentaux, estimés à partir d’approches statistiques et de l’expérience acquise. Les schémas d’accouplement sont optimisés afin de produire le nombre nécessaire de souris présentant les génotypes requis. Le maintien de certaines lignées par accouplement d’animaux homozygotes permet de limiter le recours aux prélèvements invasifs pour le génotypage. Les lignées qui ne seront plus utilisées sont conservées par cryoconservation.
Raffinement
Les souris sont élevées et utilisées dans des locaux agréés disposant d’un statut sanitaire « exempt de pathogènes spécifiques » (EOPS). Elles sont hébergées en cages enrichies, par groupes de 2 à 5 individus, avec accès ad libitum à une alimentation standardisée stérile et à de l’eau de boisson stérile. Le personnel en charge de l’élevage et des manipulations est formé et habilité conformément à la réglementation en vigueur. Les souris font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter précocement tout signe de mal-être. Les procédures réalisées dans le cadre du projet sont peu invasives et associées à une douleur de faible intensité. L’identification par bague auriculaire et le prélèvement d’une biopsie de queue (< 1 mm) pour le génotypage sont réalisés par du personnel formé, selon des gestes rapides et standardisés. Le poinçon auriculaire réalisé à l’âge adulte est effectué par du personnel formé, sur animal correctement maintenu, avec une contention brève et un geste rapide limitant le stress et permettant une lésion de petite taille à cicatrisation rapide. Les conditions d’hygiène sont adaptées afin de limiter tout risque de complication locale. Une anesthésie locale peut être envisagée en cas de sensibilité accrue ou d’évolution des pratiques. Les animaux susceptibles de développer un phénotype dommageable sont identifiés afin de permettre un suivi adapté. En cas d’apparition de signes cliniques évocateurs d’un phénotype dommageable, ils sont soumis aux points limites définis dans le protocole et retirés de l’étude si nécessaire.
Choix des espèces
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses, en particulier les interactions entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles alternatifs actuels ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions à l’échelle de l’organisme entier. Les investigations chez l’Homme sont limitées et reposent principalement sur des observations cliniques et des analyses ex vivo. Le développement de stratégies thérapeutiques dans ces pathologies nécessite une compréhension détaillée des mécanismes biologiques et de leur régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent de recherche, permettant le contrôle de l’environnement expérimental et de la variabilité génétique. Son système immunitaire est bien caractérisé, son génome entièrement séquencé, et de nombreuses lignées transgéniques sont disponibles pour l’étude de gènes impliqués dans la défense des épithéliums. Tous les stades de développement postnataux peuvent être concernés, dans le cadre du maintien et de l’amplification des lignées utilisées pour les besoins de projets de recherche faisant l’objet d’autorisations spécifiques.
Impact de l’hyperactivité amygdalienne au cours du développement sur l’apprentissage émotionnel (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Pour étudier comment une hyperactivité de l'amygdale à l'adolescence dérègle les émotions, 288 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chaque animal reçoit une injection de virus dans le cerveau, subit un conditionnement par chocs électriques aux pattes, des séances d'IRM sous anesthésie et une restriction alimentaire de deux mois et demi pour le motiver à une tâche. Le RNT reconnaît que cette étude longitudinale cumule les nuisances de chaque étape sur le même animal, de la chirurgie aux électrodes implantées. La mise à mort, par perfusion intracardiaque pour une partie des rats, sert à analyser leur cerveau.
Objectifs
Chez l’humain, l’hyperactivité d’une structure cérébrale particulière, l'amygdale, est souvent corrélée avec des dysfonctionnements émotionnels. De plus, l’adolescence correspond à une période du développement particulièrement sensible au stress dont l’impact pourrait être observable chez l’adulte. L’objectif scientifique de ce projet, mené en collaboration par deux établissements multisites, est de manipuler l’activité de cette structure au cours du développement post-natal, grâce à l’augmentation de l’activité d’une voie de signalisation intracellulaire et d’analyser son impact sur le comportement d’anticipation temporelle d’un stimulus aversif et ses corrélats neuronaux dans la connectivité de cette structure avec d’autres structures cérébrales. Nous chercherons à perturber l’activité de cette structure chez le rat au stade juvénile ou au début de l’adolescence grâce à l’injection d’un lentivirus qui a pour but d’augmenter l’activité d’une voie de signalisation ubiquitaire dans les neurones principaux de cette structure. Nous étudierons l’impact de cette suractivation sur les comportements émotionnels chez les jeunes animaux et chez les adultes, ainsi que sur l‘activité du réseau pendant les comportements émotionnels, par IRM fonctionnelle et enregistrements électrophysiologiques in vivo. Le but de notre recherche à long terme est donc de comprendre les mécanismes impliqués dans des dérèglements émotionnels déclenchés avant et pendant l’adolescence et ayant des conséquences importantes chez l’adulte.
Bénéfices attendus
Chez l’humain, l’hyperactivité de l’amygdale est souvent corrélée avec des dysfonctionnements émotionnels et l’adolescence correspond à une période du développement particulièrement sensible au stress dont l’impact pourrait être observable chez l’adulte. Ce projet vise à comprendre la dynamique de l’impact d’une modification de l’amygdale par le virus anti-Tsc2 pendant la période critique de l’adolescence sur la connectivité du circuit neuronal sous-tendant le comportement de la peur à l’adolescence jusqu’à l’âge adulte. Au niveau fondamental, ce projet apportera des informations sur la dynamique développementale des circuits sous-tendant les processus émotionnels, le traitement temporel des événements aversifs et leurs corrélats neuronaux, ainsqi que le contrôle par l’amygdale de la maturation de ces circuits et leur connectivité au cours de l’adolescence. Ce projet pourra constituer un modèle animal d’étude des mécanismes sous-tendant la prédisposition à certains syndromes psychiatriques chez l’Homme à la jonction entre la pathologie autistique associée à TSC2 et le stress post traumatique (PTSD).
Procédures
Tous les animaux subiront une chirurgie pour injection virale chez le jeune (juvénile ou adolescent) dans l’amygdale, procédure invasive qui nécessite une anesthésie générale (~1h) et un suivi post-opératoire après réveil. A la fin de l’adolescence, ils seront ensuite soumis à un conditionnement aversif (1 séance d’une heure), puis 24-48h plus tard testés (1 à 2 séances d’une heure). Ils seront ensuite transportés vers l’EU 2 dans un véhicule agréé avec des cages dédiées (eau à volonté, pas de modification des groupes sociaux, présence d'enrichissement, durée du transport ~ 10 min), afin de réaliser une session d’acquisition IRM sous anesthésie légère (durée maximale de 2 heures). Ils seront ensuite transportés dans les mêmes conditions vers l’EU 1 pour être à nouveau testés pour leur mémoire du conditionnement, puis entraînés à réaliser une tâche comportementale à la fois appétitive et aversive qui nécessite un apport de nourriture contrôlé (~2,5 mois) à raison d’une séance d’une heure à une heure et demi par jour au moins 5 jours sur 7. Une nouvelle session d’acquisitions IRM sera réalisée (durée maximale de 2 heures), impliquant un aller-retour vers l’EU 2 et une anesthésie légère. Puis ils seront ré-entrainés pour subir ensuite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (durée environ 1h30) pour implanter des électrodes dans trois régions d’intérêt. Après une semaine de récupération, ils seront ré-entrainés à la même tâche comportementale et enregistrés pendant la réalisation de cette dernière (~2,5 mois). Ils seront tous euthanasiés sous anesthésie, suivi pour certains d’une exsanguination par perfusion intracardiaque permettant de fixer le cerveau.
Impact sur les animaux
La chirurgie (injection de virus, implantation des électrodes) engendre dans certains cas une douleur post-opératoire. Le conditionnement Pavlovien aversif nécessite de donner de légers chocs électriques de durée brève (500ms) au niveau des pattes de l’animal, ce qui peut provoquer un léger stress initialement. Cependant, avec l’apprentissage, le fait qu’un stimulus prédise l’arrivée du choc diminue rapidement ce stress et ne laisse plus qu’un comportement d’immobilité lors du stimulus en préparation de la réception du choc, avec un léger sursaut de l’animal. La tâche comportementale appétitive n’est pas stressante en soi, mais nécessite que l’animal ait une certaine motivation pour chercher le renforcement positif (récompense alimentaire). L’alimentation est contrôlée, en donnant la nourriture immédiatement après la séance comportementale en quantité suffisante (90-95% de la ration normale), de façon à ce qu’il n’y ait pas de reste de nourriture le lendemain, mais que l’animal ait une légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux. Cette restriction est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale et impacte très peu leur bien-être. L’IRM étant une modalité de neuroimagerie non-invasive et non-irradiante, les potentiels effets indésirables sont liés au fait que l’examen est réalisé sous anesthésie légère. Une légère perte de poids peut être observée le lendemain, suite au stress potentiellement induit par la combinaison IRM et transport des animaux vers l’établissement où sont réalisées les IRM, même s’il est très proche. Une légère douleur peut faire suite au placement de l’animal dans des barres d’oreille lors de l’examen IRM. Le fait que cette étude soit longitudinale induit un cumul des nuisances de chaque étape (chirurgie, conditionnement aversif, nourriture contrôlée, IRM) chez le même animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (pour analyse des cerveaux).
Remplacement
Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences Comportementales. L’évaluation des réseaux neuronaux et comportementale au cours du développement post-natal jusqu'à l'adulte nécessite l’utilisation d'animaux vivants possédant les structures et les connectivités neuronales requises. Cela ne peut donc pas être réalisé in silico ou en cellule isolée ou chez les invertébrés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible. Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe pour obtenir des résultats significatifs et exploitables, en tenant compte de la perte de certains animaux (perte à la chirurgie, mauvaise localisation de l’injection virale et/ou des électrodes, mauvais signal d’enregistrement). Pour l’ensemble des données, une analyse statistique classiquement utilisée dans la littérature pour ce type de données sera effectuée. L’étude, prévue chez les mâles et femelles, commencera avec l’injection chez les rats mâles, en raison des données pilotes déjà obtenues sur les coordonnées des sites d’injection et les enregistrements électrophysiologiques in vivo simultanément dans les trois structures cérébrales (coordonnées d’implantation déjà validées). Cela permettra de focaliser ensuite les expériences avec les analyses pertinentes pour une comparaison avec les femelles. De plus, les deux virus actifs sont censés produire les mêmes effets. Nous commencerons avec la comparaison d’un des virus actifs avec le virus contrôle pour caractériser les effets. Si les premières données montrent que les deux virus actifs ont des effets similaires, nous pourrons alors poursuivre l’étude sur des mâles et femelles, mais en ne comparant que deux groupes (Contrôle et virus actif) au lieu de trois, ce qui réduira grandement le nombre d’animaux.
Raffinement
Afin de maximiser l’acclimatation et réduire le stress des animaux, leur naissance sera faite dans la salle dédiée adjacente aux salles de chirurgie pour injection virale. Après sevrage, les rats sont manipulés et pesés fréquemment (au moins 1j/3) jusqu’au début de l’expérience, afin de les habituer à l’expérimentateur. Pour la chirurgie, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement par l’expérimentateur ou les zootechniciens pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de la chirurgie ne seraient pas suffisantes. Une grille de score sera utilisée pour évaluer la douleur et l’inconfort des animaux notamment pendant le suivi post-opératoire. Nous avons aussi optimisé les équipements comportementaux pour permettre aux animaux porteurs d’implants cérébraux de se mouvoir avec le maximum de confort (mangeoire de haute taille pour minimiser le risque de cogner l’implant). De plus, nous utilisons un cache des implants permettant de loger les animaux à deux par cage et nous avons des supports d’implants cérébraux améliorant le confort des animaux en réduisant les possibilités d’accroches dans l’environnement de test. L’enrichissement des rats implantés est aussi modifié (maison en carton à la place des tunnels de plastique) pour réduire les risques de se coincer l’implant. Les transports entre les deux bâtiments d’expérimentation se faisant face se feront par transporteur et véhicule agréés. Le confort et la sécurité des animaux seront garantis durant toute la durée du transport (eau à volonté, sans modifications des groupes sociaux, présence d'enrichissement). Une période d'acclimatation à l'arrivée sera observée pour garantir aux animaux une période de repos. L’IRM est réalisée sous anesthésie, dans un berceau chauffé, avec contrôle de la respiration et de la température et si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les conseils vétérinaires.
Choix des espèces
D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude des circuits neuronaux des processus cognitifs, largement conservés le long du phylum. Le rat est le modèle de choix du laboratoire, car les structures cérébrales étudiées ici chez le rat ont leur correspondant chez l’humain et l’animal permet un accès à des méthodes invasives ne pouvant être faites chez l’humain. La taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central (en particulier pour l’injection chez le juvénile). La littérature scientifique pertinente à ce projet, en particulier les analyses des comportements anxieux, est riche en études réalisées sur le rat. Nous bénéficierons et nous contribuerons donc d’une base de données importante. Il est connu que la période de l’adolescence est associée à une susceptibilité au stress et un développement important des structures impliquées, notamment l’amygdale, dans les réponses à la peur. Toutefois de nombreuses structures, dont le cortex préfrontal, qui sont impliquées dans la majorité des comportements émotionnels sont encore immatures à l’adolescence. Nous voulons modifier l’activité de l’amygdale à deux stades du développement, le stade de préadolescence (juvénile) et dès le début de l’adolescence, qui correspondent à des périodes critiques dans le processus de connectivité de cette structure avec d’autres structures du réseau. Les expériences commenceront donc dès que les virus sont incorporés dans les neurones principaux de l’amygdale, soit ~10 jours après l’injection et se poursuivront jusqu’à l’âge adulte, avec des analyses comportementales et d’IRM en fin d’adolescence, puis chez l’adulte au niveau comportemental et en corrélation avec des analyses au niveau fonctionnel par IRM et enregistrements électrophysiologiques.
Analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans la transmission à la descendance du risque de maladie par l’obésité paternelle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
691 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Rendues obèses par un régime hypercalorique donné dès le sevrage, elles sont accouplées, et leurs embryons comme leurs descendants adultes sont mis à mort pour l'analyse des tissus. L'objectif est d'identifier les composants du liquide séminal qui transmettraient à la descendance un risque métabolique lié à l'obésité du père. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal, l'étude sur "organisme entier" restant selon lui indispensable.
Objectifs
Tout comme la nutrition maternelle, l'état nutritionnel du père au moment de la conception détermine la santé à long terme de la progéniture. En effet, les enfants de pères obèses ont un risque beaucoup plus élevé de développer une obésité et des troubles métaboliques et cognitifs que les enfants de pères ayant un poids corporel normal. Ce risque accru de maladie résulte d'un processus de « programmation métabolique » sous-tendu par des modifications épigénétiques au niveau des spermatozoïdes. Cependant, le dépôt des spermatozoïdes dans le système reproducteur féminin s'accompagne de la libération d'un cocktail complexe de substances fonctionnellement diverses qui constituent collectivement le liquide séminal. Ces substances sont produites par les organes sexuels accessoires masculins, à savoir la prostate, l'épididyme, les vésicules séminales et les testicules, et agissent pour maximiser les chances de réussite de la conception en favorisant la survie des spermatozoïdes et le développement de l'embryon préimplantatoire. Bien que plusieurs rapports ont montré que les composants du liquide séminal sont également impliqués dans la « programmation » de la santé postnatale de la progéniture, à ce jour, ces composants et leurs mécanismes d'action n'ont pas été identifiés. Ce projet vise à identifier les métabolites et les microARN du liquide séminal agissant comme vecteurs de "programmation métabolique" par l'obésité paternelle et à caractériser les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation par lesquels ils modifient l'activité métabolique et le profil épigénétique de la progéniture.
Bénéfices attendus
Outre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la susceptibilité pathologique induite par l'obésité via la lignée paternelle, les résultats acquis à la fin du projet pourraient contribuer à l'établissement d'un nouveau paradigme pour prévenir le risque de maladie pour l'enfant à naître. Celui-ci serait basé non seulement sur les recommandations pour les femmes enceintes, mais aussi sur des conseils nutritionnels et des recommandations adressés aux futurs pères pour qu’ils adoptent une alimentation équilibrée et non hypercalorique de même que des habitudes de vie sains avant la procréation.
Procédures
Aucune intervention chirurgicale sera effectuée sur les animaux vivants. Tous les prélèvements d’échantillons biologiques seront effectués chez des animaux décédés.
Impact sur les animaux
Les expériences qui seront réalisées pour atteindre les objectifs du projet, ne provoqueront aucune souffrance ni nuisance particulière aux animaux. Toutefois, une vigilance constante leur sera apportée pour détecter des signes cliniques sévères ou notables afin de prendre une décision d’euthanasie en cas d’atteinte des points limites comme décrit dans le tableau en annexe.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour l’obtention des échantillons biologiques sur lesquels des analyses moléculaires seront effectuées.
Remplacement
Nous cherchons à obtenir des informations fondamentales sur les mécanismes de transmission de risque de maladies métaboliques et des désordres cognitifs chez la descendance de mères et de pères obèses. Cela implique la réalisation d’analyses moléculaires dans des tissus et d’études comportementales chez l’organisme entier. Il n’y a pas d’alternative à l’utilisation d’animaux pour atteindre les objectifs scientifiques visés par ce projet.
Réduction
Le projet est basé sur l’accouplement d’animaux mâles obèses et non-obèses avec de femelles non-obèses ou obèses (animaux géniteurs F0), pour l’obtention d’embryons à trois stades distincts de développement et des animaux adultes (génération F1). Sur ces derniers, des analyses moléculaires et des études comportementales seront réalisées. Afin de minimiser au maximum le nombre d’animaux, un même animal mâle sera accouplé à deux femelles distinctes. Par ailleurs, le nombre d’animaux à utiliser est le minimum nécessaire pour pouvoir observer des différences statistiquement significatives entre les divers groupes expérimentaux. Ce nombre a été déterminé sur la base des résultats de nos expériences précédentes et en considérant comme paramètre une puissance de 90% et un pourcentage d’erreur de 5%.
Raffinement
Toutes les manipulations chez les animaux (accouplements, constitution des portées, pesées…), seront faites dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale par du personnel avec plusieurs années d’expériences dans la manipulation et le soin des animaux de laboratoire. Afin de minimiser au maximum le stress pouvant être subi par les animaux, leur environnement sera enrichi par l’introduction à l’intérieur des cages de dômes en plastique, de bâtons en bois et de frisottis pour le nid. Lors de la constitution des portées, les personnels frotteront leurs gants avec la litière souillée par la mère avant de manipuler les animaux de la portée afin de réduire les perturbations olfactives. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement, y compris les week-ends et les jours fériés. L’évaluation de l’état des animaux sera alors effectuée en référence au tableau fourni précédemment (point 3.3.2.4). Cette évaluation conditionnera les éventuelles décisions d’euthanasie dans le cas d’observation de signes attestant d’une souffrance (dos vouté, ventre rétracté, facies contracté, agressivité, vocalisation).
Choix des espèces
La souris C57BL/6 est le modèle de choix pour l’étude de l‘obésité et ses complications car elle présente une très grande susceptibilité au développement d’une obésité, du diabète et de l'athérosclérose. De plus, sa variabilité génétique est très réduite et sa petite taille rend son hébergement, entretien et alimentation bien plus économique que celui du rat. La Souris BALB/c présente les mêmes avantages en termes d’homogénéité génétique et de facilité et d’économie d’hébergement que la souris C57BL/6. Mais, contrairement à la souris C57BL/6, elle ne développe pas de signes d’obésité lorsqu’elle est exposée à une alimentation hypercalorique. L’utilisation combinée de ces deux souches, nous permettra donc de délimiter la contribution du fond génétique, par rapport aux modifications épigénétiques, dans le risque de maladie transmis par l’obésité parentale. Des souris mâles et femelles âgées de 21 jours (géniteurs, génération F0), seront utilisées pour obtenir des embryons de 13 et 17 jours d’âge gestationnel et des animaux adultes de première génération (F1). L’utilisation de souris de 21 jours d’âge se justifie par le fait que l’exposition à une alimentation hypercalorique dès le sevrage est nécessaire pour l’acquisition d’un phénotype clair d’obésité. Concernant les embryons, leur utilisation se justifie par les raisons suivantes. L’objectif de ce projet, est d’établir le lien de cause à effet entre les modifications épigénétiques et métabolomiques induites par l’obésité sur les spermatozoïdes et les altérations cognitives et métaboliques observés chez les descendants de pères ou de mères obèses. Nous nous intéresserons en particulier à l’analyse de la synthèse de la sérotonine et de la kyunurenine à partir du tryptophane, car nos études précédentes indiquent que cette voie métabolique est affectée dans le cerveau des animaux de pères obèses. L’étude des embryons au 13ème jour du développement nous permettra de déterminer si l’obésité parentale entraîne une déficience de la synthèse de sérotonine dans le placenta qui se traduirait par une diminution de la concentration de ce neuromédiateur dans le cerveau embryonnaire, tandis que les analyses dans les embryons de 17 jours de gestation, nous permettront de déterminer si les altérations dans la concentration cérébrale de sérotonine résultent d’une modification de la synthèse de ce neurotransmetteur dans les neurones sérotoninergiques eux-mêmes. Les expériences qui seront effectuées chez les animaux adult
Implication de la kisspeptine dans l’intégration des signaux olfactifs par la région cérébrale de l’habénula latérale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
197 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, pour étudier le rôle d'un neuropeptide, la kisspeptine, dans le traitement cérébral des odeurs sociales. Chaque animal subit une neurochirurgie d'environ cinquante minutes, les femelles une ovariectomie, des frottis vaginaux et des prélèvements d'urine répétés, plus six injections avant des tests olfactifs. La chirurgie peut provoquer hémorragies, baisse de température et douleurs pendant deux à trois jours, et l'isolement sept jours avant les tests ajoute un stress. Les souris ayant reçu un traitement sont tuées pour prélever le cerveau, celles servant aux prélèvements d'urine étant tuées ou remises à d'autres chercheurs.
Objectifs
Chez la plupart des animaux, les odeurs sont cruciales pour communiquer des informations sur leur identité, leur organisation sociale, leur maturité sexuelle et leur territoire. Ces odeurs sociales sont perçues, intégrées et codées par des voies cérébrales spécifiques, afin de déclencher des comportements sociaux appropriés. Il a été montré que la kisspeptine, un neuropeptide déterminant dans le contrôle de la reproduction, ou son récepteur, sont exprimés dans deux structures cérébrales connectées participant au relai des informations olfactives. Récemment, une de ces deux régions cérébrales participant à l'apprentissage à partir d'expériences aversives, a été impliquée dans la régulation des comportements sociaux et reproducteurs chez les mammifères. Les lésions de cette structure chez les rongeurs entraînent une altération de la sensibilité aux stimuli olfactifs et provoquent une diminution de la réactivité sexuelle et un évitement des contacts sexuels. Cependant, le rôle de la Kisspeptine dans les deux structures cérébrales d’intérêt comme centres de traitement olfactif régulant les comportements sociaux reste peu compris à ce jour. L'objectif de ce projet est donc de déterminer le rôle de la Kisspeptine dans la modulation du traitement des odeurs d'attraction sexuelle par le cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de montrer que la Kisspeptine n'est pas seulement un régulateur clé de l'axe « cerveau-appareil génital » mais qu’il peut aussi agir en amont dès la transmission des odeurs. Les résultats issus de ce projet pourront potentiellement permettre d'ouvrir la voie vers l'utilisation de la Kisspeptine en voie intranasale pour la modulation des comportements sexuels chez les rongeurs de manière non invasive.
Procédures
Les neurochirurgies seront d'une durée moyenne de 50 minutes par animal. Une seule neurochirugie sera effectuée par animal. Les ovariectomies sont d'une durée de 15 minutes environ par animal. Pour déterminer le stade du cycle sexuel, les femelles auront 4 à 8 frottis vaginaux, prélévement de quelques secondes. Ces femelles seront vigiles et maintenues pendant le prélèvement. Selon les résultats des tests comportementaux, l'urine sera prelevée entre 4 à 8 fois pour chaque animal, en maintenant la souris et en massant délicatement son ventre afin de favoriser la miction dans le tube et ainsi récolter l'urine. Quelques secondes suffisent pour récolter l'urine. Chaque souris recevra au total 6 injections de traitement (Kp10, Kp54 ou contrôle) (1 fois/semaine) juste avant le test olfactif. Chaque test olfactif durera 10 minutes. Toutes les injections sous cutanées ne dureront que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La chirurgie nécessaire à l'injection des traitements ou du retrait des ovaires peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. Elle peut induire une douleur post opératoire pendant 2-3 jours essentiellement localisée au niveau du site d’incision du crâne ou des flancs. Un stress dû à la manipulation des animaux pour récolter leurs urines ou réaliser les administrations intranasales est possible. Il s’agira d’un stress aigü de quelques minutes n’induisant pas d’effet à long terme. Les animaux expérimentaux isolés 7 jours avant les tests de comportement sexuel pourront présenter du stress lié à leur hébergement solitaire.
Devenir
Tous les animaux test recevant un traitement intranasal ou dans la LHb seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures. Les animaux utilisés pour les prélévements d'urine seront euthanasiés par le personnel animalier ou mis à disposition d'autres chercheurs pour d'autres études.
Remplacement
A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou de modélisation) ne peut être utilisée pour ce projet qui est dépendant de l'interconnectivité de neurones appartenant à plusieurs structures olfactives et cérébrales. Il est donc impératif d’utiliser un animal entier pour comprendre les mécanismes de transmission et de régulation interconnectant l’olfaction et les fonctions comportementales des mammifères.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observé dans la littérature. Nous avons aussi tenu compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, et de l'efficacité des injections. Le nombre d’individu défini par groupe permet d'assurer une puissance statistique suffisant pour obtenir des résultats robustes. Dans l'optique de réduire la quantité de souris nécessaires, nous réutiliseront les mêmes animaux pour l’étude comportementale d’évitement et de préférence sexuelle. Enfin la significativité des résultats sera testée en utilisant les tests statistiques appropriés. Dans le détails, nous aurons donc besoin de 197 animaux au total, 65 animaux stimuli (15 mâles pour les comportements sexuels et collecte d'urine, 30 femelles pour la collecte d'urine et 20 femelles pour le comportement sexuel); 60 animaux pour la procédure 1 : 10 animaux pour chacun des 3 groupes et pour les 2 sexes; 72 animaux pour la procédure 2 : 12 animaux par groupe pour chacun des 3 groupes et pour les 2 sexes
Raffinement
Lors des chirurgies, les souris recevront une sédation analgésique suivi d’une anesthésie. Les animaux recevront un traitement analgésique post-opératoire par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroidien. L’administration d'anti-inflammatoire sera poursuivie pendant 2 à 3 jours post-opératoires si nécessaire. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant les chirurgies pour éviter le dessèchement. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux seront maintenus sur un matelas chauffant et leur température sera monitorée afin d'éviter une hypothermie. La fréquence respiratoire sera également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal recevra un antagoniste de l'anesthésique et la procédure sera interrompue. Si l’état de santé de l’animal le permet, une nouvelle tentative sera effectuée après 7 jours de récupération. Dans le cas contraire, l’animal sera euthanasié conformément aux points limites définis dans nos procédures. De plus, une surveillance quotidienne des animaux ayant subi la chirurgie sera effectuée tout au long de l'expérimentation.
Choix des espèces
Notre recherche porte sur la mise en évidence des régulations des comportements socio-sexuels induits par l’olfaction chez les mammifères. La souris est un excellent modèle animal de référence. La souris est une espèce sociale présentant des comportements socio-sexuels innés et bien décrits majoritairement régulés par les signaux olfactifs. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes qui seront âgés de 8 semaines, âge minimum de la maturité sexuelle, nécessaire à notre étude.
Génération et validation de souris génétiquement modifiées par techniques de transgénèse
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Générées pour créer des lignées transgéniques, 26 300 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère à modérée. Les femelles donneuses reçoivent des injections d'hormones, les receveuses une chirurgie de réimplantation d'embryons sous anesthésie, et les souriceaux de moins de huit jours sont identifiés par prélèvement de phalanges. Ce nombre, le plus élevé du lot, tient à la production en série d'animaux génétiquement modifiés. Les femelles fécondées sont tuées, les souris transgéniques transférées vers des partenaires et les non fécondées réutilisées pour de la formation.
Objectifs
Génération de souris génétiquement modifiées par des différentes techniques de transgénèse additive ou ciblée et validation génotypique
Bénéfices attendus
Les projets de transgénèse de cette demande vont contribuer à l’élargissement des connaissances scientifiques à partir de résultats ciblés liées aux différents modèles souris créés pour une vaste variété de sujets de recherche dans multiple domaines (immunologie, cancérologie, audition, développement, infectiologie, etc.). Les modèles murins de nouvelle création, seuls ou en combination avec d’autres déjà existants contribueront ainsi au progrès de la recherche fondamentale et/ou appliquée
Procédures
-Pour les femelles donneuses : injection d’hormones 2 fois à 46 heures d’intervalle. Durée 1-2 minutes -Pour les femelles receveuses, chirurgie bilatérale de réimplantation avec anesthésie chimique/gazeuse avec analgésie complémentaire. Intervention: 1 fois, 15 minutes d’intervention/femelle -Pour les animaux nés des femelles receveuses/accouplements, Identification des souriceaux par prélèvement de phalanges distales
Impact sur les animaux
-Douleur et inconfort légers de courte durée (1 min) liés à l’injection des hormones. -Douleur et inconfort modérés de durée de 3 jours, liés à la chirurgie. -Douleur et inconfort léger de courte durée liée à l’introduction de la aiguille (quelques sec-quelques min) liés à un putatif prélèvement sanguin (le cas échéant)
Devenir
-Toutes les femelles qui ont été fécondées devront être mises à mort (au moment du prélèvement d’embryons ou du sevrage des souriceaux). -Les souris mâles et femelles transgéniques positives identifiés seront utilisées pour la suite de l’établissement des modèles de souris génétiquement modifiée chez nos partenaires -Les souris mâles et femelles non fécondées peuvent être re-utilisés dans le cadre de formations sur animaux
Remplacement
Malgré le développement actuel croissant de différents modèles ex vivo incluant des modèles organoïdes, le modèle souris continue à être essentiel en recherche afin d’avoir accès à toutes les régulations dans le cadre de l’organisme entier. L’intérêt et besoin de recourir à l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées dans les projets scientifiques de nos collaborateurs est évalué et justifié dans le cadre de chacun des projets autorisés. Toutefois, nous avons réussi à remplacer un nombre important de nos femelles grâce à des embryons fertilisés congelés commerciaux capables de remplacer les embryons frais avec efficacité pour leur modification par transgénèse. Ainsi des embryons frais seront seulement nécessaires en cas de superovulation de souris génétiquement altérées précédemment et/ou fonds génétiques particuliers.
Réduction
-Le nombre de souris femelles donneuses vient principalement de notre longue expérience et est dépendant principalement du fonds génétique des embryons à modifier et du type de manipulation. Pour chaque fonds génétique de femelles donneuses, nous essayons d’optimiser l’âge et les conditions de d’injection afin d’obtenir un maximum d’embryons par femelle et réduire ainsi le nombre de femelles donneuses. -La technique montre une viabilité plus élevée des embryons modifiés et permet une réduction des femelles donneuses requises. -Le nombre de souris receveuses à réimplanter est en fonction du nombre d’embryons qui auront survécu à la manipulation. -Pour chaque transgène ou chaque clone de cellules injecter, nous arrêtons les séries de manipulation dès que nous arrivons dans un premier temps à une dizaine de femelles réimplantées. Nous attendons ensuite la naissance des souriceaux afin de décider, à partir du nombre de petits obtenu, de la reprise ou pas de nouvelles séries de micromanipulation. Ce qui nous permet encore de réduire le nombre de femelles donneuses et receveuses utilisées. -Le fonds génétique choisi pour les femelles receveuses (excellentes mères et capables de donner naissance à de grandes portées de nouveau-nés) permet aussi d’optimiser le nombre de femelles mères-porteuses utilisées par rapport à l’utilisation d’un autre fonds génétique moins « efficace » -Le renouvellement de la batterie de mâles reproducteurs et vasectomisés environ chaque 6-9 mois permet d’améliorer leur performance quant aux capacités d’accouplement et de fécondation permettant à son tour d’optimiser le nombre de femelles donneuses et receveuses et réduire son nombre.
Raffinement
Le souris injectées et les femelles ayant subi la chirurgie seront surveillées quotidiennement. Les femelles receveuses reçoivent un traitement antalgique avant et après l'acte chirurgical et sont surveillées soigneusement pour assurer la bonne cicatrisation pendant au moins les 5 premiers jours après-chirurgie. Nous serons toujours particulièrement attentifs à tout signe de détresse (signes cli-niques externes, prostration, poils hérissés évaluation du Body Condition Score-BCS) afin de réduire/éliminer la souffrance des animaux transgéniques fondateurs et leurs descendants. En cas de souffrance et avant la mise à mort au plus tard au bout de 24h après con-firmation des signes cliniques externes, nous aurons recours au besoin de la nourriture humidifiée / gel hydrique, la réhydratation sous-cutanée ou le chauffage des animaux si hypothermie associée.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui montre 90% d’homologie avec le génome humain, d’où l’intérêt majeur de la création de souris gé-nétiquement modifiées pour la découverte de mécanismes globaux en recherche fon-damentale ainsi que pour la modélisation de maladies humaines. La pertinence du choix de la souris pour ces projets est justifiée dans les projets scientifiques des parte-naires demandeurs. -Les mâles et femelles reproducteurs sont des adultes matures sexuellement (2-12 mois), les femelles receveuses sont des adultes (matures sexuellement, âgées de 8-12 semaines). -Les femelles donneuses d’embryons sont des jeunes, généralement prépubères âgées de 3-4 semaines, pour bien répondre au traitement hormonal de superovulation (âge dépendant du fonds génétique). -Les souris transgéniques positives seront des jeunes remises aux entités de recherche peu de temps après le sevrage une fois caractérisés génétiquement (pour avancement du projet)
Synchronisation circadienne renforcée pour l’immunothérapie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour tester si une immunothérapie anticancéreuse agit mieux le matin, 430 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes mises à mort pour prélèvement. Une tumeur est greffée sous la peau, puis les animaux reçoivent le traitement, des séances d'échographie sous anesthésie tous les deux ou trois jours, un accès à la nourriture limité à huit heures par jour et trente minutes d'activité physique imposée trois fois par semaine. Le RNT décrit les douleurs possibles de la tumeur, pression sur les tissus, nécrose, posture voûtée, vocalisations. L'hypothèse de départ vient d'études rétrospectives et d'un essai déjà menés chez l'humain, que le modèle murin est censé conforter.
Objectifs
L’immunothérapie, un traitement qui stimule le système immunitaire pour combattre le cancer, pourrait être plus efficace si elle est administrée le matin plutôt que l’après-midi. Cette découverte, issue d’études rétrospectives et d’un essai clinique mené en Chine, s’explique par le rôle de notre "horloge circadienne", un mécanisme naturel qui régule de nombreux processus biologiques, comme le sommeil ou l’immunité, en fonction des cycles jour-nuit. Pour renforcer cette synchronisation, deux facteurs clés entrent en jeu : une alimentation limitée à des plages horaires précises (comme manger uniquement entre 8h et 18h) et la pratique régulière d’une activité physique. Les objectifs du projet sont triples : évaluer si une alimentation temporellement limitée améliore la réponse au traitement matinal, déterminer si cette approche permet d’étendre les bénéfices du traitement à d’autres moments de la journée en synchronisant les organes périphériques, et analyser si l’activité physique apporte un avantage supplémentaire. Pour étudier ces interactions complexes entre organes, nous utiliserons des souris, dont l’horloge circadienne et la réponse aux traitements sont comparables à celles des humains. Cette recherche ouvre des perspectives prometteuses car en optimisant l’heure d’administration des traitements et en les combinant avec l’alimentation et l’exercice, il pourrait être possible d’améliorer significativement leur efficacité pour les patients.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet vise à vérifier si, chez l’animal, on peut augmenter l’efficacité de l’immunothérapie contre le cancer en améliorant la synchronisation de l’horloge interne. Si cette hypothèse se confirme, à plus long terme, ces résultats pourraient servir de base pour concevoir de nouveaux essais cliniques chez l’humain. Ces essais combineraient l’immunothérapie avec des méthodes naturelles pour renforcer l’horloge circadienne, comme administrer le traitement le matin, limiter les horaires des repas ou pratiquer une activité physique régulière. Chacune de ces approches (traitement matinal, alimentation ciblée, exercice) a déjà prouvé ses bienfaits séparément. On pense donc que leur combinaison pourrait amplifier les effets positifs de l’immunothérapie classique, qui ne tient pas compte des horaires optimaux. En somme, ce projet pourrait conduire à modifier l’utilisation des immunothérapies en les rendant plus efficaces, simplement en adaptant leur administration au rythme naturel du corps.
Procédures
Implantation de cellules tumorales : 1 injection (la tumeur se développe pendant 15 jours ensuite). Traitement antitumoral : 1 injection au jour 5. Anesthésie : tous 2 ou 3 jours à partir du jour 6. Echographie : tous 2 ou 3 jours à partir du jour 6. Accès à la nourriture pendant 8 heures : chaque jour pendant 15 jours. Activité physique : 30 minutes 3 fois par semaine pendant 15 jours.
Impact sur les animaux
Quand une tumeur se développe sous la peau, elle peut provoquer des effets indésirables tant au niveau local qu’à l’échelle de l’organisme entier. Localement, la tumeur peut exercer une pression sur les tissus environnants, entraînant des douleurs, des inflammations, voire une nécrose (dégénérescence des tissus). À un niveau plus général, elle peut causer des douleurs diffuses, des troubles métaboliques, une perte de poids, une réduction de la mobilité et un état de stress. Chez un animal porteur d’une telle tumeur, ces douleurs peuvent se traduire par des comportements agressifs, des vocalisations, un manque de soin personnel et une posture voûtée. L'alimentation limitée temporellement et l'activité physique améliorent la santé métabolique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever des échantillons nécessaires au projet.
Remplacement
Pour étudier l’effet combiné de l’heure d’administration de l’immunothérapie, d’une alimentation limitée à des horaires précis et de l’activité physique, il est impossible de se contenter d’expériences en laboratoire (in vitro) ou de simulations numériques. En effet, ces trois facteurs interagissent de manière complexe et impliquent des mécanismes qui ne peuvent être observés que chez un organisme vivant (in vivo) : ils font intervenir plusieurs types de cellules immunitaires, les effets métaboliques de l’alimentation, les impacts globaux de l’exercice physique sur le corps, ainsi que la synchronisation de multiples horloges biologiques internes, présentes dans différents organes. C’est pourquoi on utilise un modèle animal déjà éprouvé dans des études similaires. En parallèle, nous travaillons avec des mathématiciens et informaticiens à la création d’un modèle numérique de l’horloge circadienne. L’objectif est de disposer, à terme, d’outils de simulation performants. Pour affiner ces modèles, nous nous appuyons sur des données expérimentales déjà collectées dans des projets antérieurs, ainsi que sur celles obtenues dans le cadre de cette étude. L’approche adoptée est donc double : réutiliser au maximum les connaissances existantes pour éviter de répéter des expériences déjà réalisées, et préparer le terrain pour des simulations futures en intégrant les nouveaux résultats dans des modèles mathématiques. Cela permettra, à long terme, de mieux comprendre et optimiser ces traitements combinés.
Réduction
L'objectif de réduction est abordé selon plusieurs approches complémentaires. Afin de n'utiliser que le strict minimum d'animaux nécessaire, des calculs statistiques sont réalisés pour définir l’effectif nécessaire pour chaque condition expérimentale. Nous utilisons une méthode statistique d'analyse des rythmes biologiques qui ne nécessite que 4 horaires de traitement. Plusieurs prélèvements d'organes et de tissus seront réalisés post-mortem afin d'éviter le recours à des animaux supplémentaires pour les analyses histologiques et moléculaires ultérieures.
Raffinement
Les souris vivront en groupe de 3 ou 4 dans un espace adapté, avec des jouets et des cachettes pour leur bien-être. Avant les expériences, elles s’habitueront aux manipulations et au matériel (tapis roulant, distributeur de nourriture). Les cellules cancéreuses leur seront injectées en fin de journée, un moment où la croissance des tumeurs est moins rapide. Leur poids sera vérifié trois fois par semaine, et une équipe surveillera leur état, même le week-end. Un complément alimentaire sous forme de gel pourra être donné aux souris pour améliorer leur état de santé. Aucun anti-inflammatoire ne sera utilisé, car cela pourrait fausser les résultats. En revanche, si une souris perd plus de 10 % de son poids, montre des signes de souffrance (pelage négligé, blessures, apathie) ou développe une tumeur trop grosse ou abîmée, elle sera euthanasiée. La croissance des tumeurs sera suivie par échographie sous anesthésie douce. Pour l’exercice, on privilégiera des encouragements tactiles plutôt que des chocs électriques, afin d’éviter tout stress.
Choix des espèces
1 - La souris est un modèle scientifiquement pertinent (modèle préclinique adapté à la cancérologie, son système circadien est très conservé par rapport à l'humain, les effets bénéfiques des protocoles d'alimentation limitée temporellement et d'activité physique en termes de santé métabolique ont déjà été documentés par des études antérieures). 2 - Les protocoles d'implantation sous-cutanée de cellules tumorales chez la souris sont largement éprouvés et robustes. 3 - Dans le cadre de la poursuite du projet, nous pourrions être amener à l'avenir à utiliser des modèles génétiquement modifiés disponibes uniquement chez la souris. Des souris adultes d'un âge compris entre 8 et 12 semaines seront utilisées. Cet âge garantit un système immunitaire pleinement mature et permet d'avoir une taille et un poids des animaux suffisant pour limiter les effets indésirables de la tumeur lorsqu'elle grossit. Cet âge a aussi été utilisé dans d'autres expériences similaires avec lesquelles nous souhaitons faire des comparaisons.
Fonction des myofibroblastes dans la transformation des adénomes du colon
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour étudier le rôle d'un type de cellules dans le passage d'un adénome au cancer du côlon, 300 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles développent des polypes intestinaux dont la multiplication peut provoquer perte de poids et déshydratation, suivis par échographie sous sédation. Les intestins sont prélevés après la mise à mort. Le porteur annonce un bénéfice thérapeutique "à long terme" pour le traitement du cancer du côlon, sans échéance.
Objectifs
Nous souhaitons comprendre le rôle des différents types de cellules dans la progression du cancer du côlon. Nous savons qu'un facteur est détectable dans un type de cellule spécialisé dans les tumeurs bénignes du côlon, mais pas dans les tissus sains. La présente étude vise à étudier la fonction de ce facteur dans ces cellules lors de la transition entre tissu normal et cancer. À cette fin, nous utiliserons des souris qui développent des tumeurs du côlon et chez lesquelles nous pouvons éliminer ce facteur. Ces études nous permettront de caractériser les fonctions de notre facteur d'intérêt dans ce type de cellules spécialisées de l'intestin, de clarifier son rôle dans la croissance du cancer du côlon et d'identifier de nouveaux mécanismes dans la tumorigenèse du côlon.
Bénéfices attendus
Dans l'ensemble, ces expériences permettront de déterminer les mécanismes dépendants du gène d'intérêt dans la progression du cancer de l'intestin. À long terme, ces données permettront de développer de nouvelles approches pour le traitement du cancer du côlon.
Procédures
Injection intrapéritonéale =6 (quelques secondes), injection sous-cutanée = 20 (quelques secondes), Mesures par ultrasons (30 minutes, réalisées sous sédation)
Impact sur les animaux
Les nuisances seront les injections intrapéritonéales et sous-cutanées (quelques secondes, douleur légère), les mesures échographiques (30 minutes), réalisées sous sédation (nuisances mineures) et, potentiellement, le développement tumoral. En effet, la prolifération des polypes (augmentation de leur nombre et de leur taille) peut entraîner l'apparition de symptômes cliniques (perte de poids et déshydratation) chez les animaux. Pour éviter cela, nous surveillons de près leur état clinique, leur administrons un régime alimentaire adapté et procédons à leur euthanasie avant que les symptômes cliniques ne s'aggravent.
Devenir
À la fin de l'examen final, les souris sont mises à mort, leurs intestins sont prélevés puis conservés en vue d'analyses (immuno)histochimiques et moléculaires ultérieures.
Remplacement
L'homéostasie et le remodelage au cours du développement du cancer sont des processus complexes. Bien qu'il existe des modèles de culture cellulaire in vitro, l'interaction entre différentes populations cellulaires ne peut être reproduite par une approche in vitro. Notre stratégie est bien conçue pour prendre en compte les objectifs de remplacement, car nous avons déjà validé toutes les analyses moléculaires dans des cultures cellulaires ou des systèmes purement biochimiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire pour valider un effet significatif. Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, et dans la mesure du possible, les échantillons prélevés sur les mêmes souris seront utilisés dans différents types d'analyses.
Raffinement
L'anesthésie et l'analgésie seront utilisées comme méthodes principales afin de minimiser autant que possible la souffrance potentielle des animaux. Les animaux seront élevés sans isolement, en groupes du même sexe, dans des conditions d'hébergement conformes aux exigences réglementaires (densité) et bénéficiant d'un enrichissement environnemental (abri, matériel de nidification) tout au long de la procédure. Un score clinique sera évalué chaque semaine et chaque jour dès que les premiers adénomes seront visibles à l'échographie. Une liste de points limites est établie. Lorsque ceux-ci sont atteints, les animaux seront mis à mort afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
L'homéostasie et le remodelage au cours de la tumorigenèse intestinale sont des processus complexes. Bien qu'il existe des modèles in vitro, l'interaction entre différentes populations cellulaires ne peut être reproduite par une approche in vitro. Après avoir déclenché la formation d'une tumeur du côlon, il est important de surveiller la transformation maligne d'un adénome dans son environnement. L'utilisation d'un modèle animal tel que la souris est donc essentielle en raison de ses similitudes génétiques et physiologiques avec l'être humain. Le choix d'animaux adultes se justifie par le fait que les adénomes et les cancers du côlon touchent principalement les adultes.