Oncologie

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte des cellules tumorales puis des composés immunomodulateurs testés pour des laboratoires clients, avec suivi de la tumeur et prises de sang répétées, l'étude n'autorisant ni anti-inflammatoire ni analgésique jugés incompatibles avec les molécules évaluées. Le porteur affirme que les doses injectées n'induiront aucun effet indésirable et que des points limites précoces limiteront la gêne liée à la tumeur. Il indique devoir se placer à l'échelle de l'"organisme entier" et écarte toute méthode substitutive.

Objectifs

Le domaine d’expertise de notre unité de service est centré sur la caractérisation et l’étude fonctionnelle des populations du système immunitaire murin en conditions normales, inflammatoires ou dans un contexte tumoral. En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. L’objectif principal du projet décrit dans cette demande, est l’évaluation de la réponse immunitaire suite au développement d'une tumeur dans des souris contrôles ou génétiquement modifiées, en présence ou non d'un traitement thérapeutique de composés immunomodulateurs. Les essais thérapeutiques récents utilisant des composés immunomodulateurs ont donné des résultats extrêmement prometteurs sur certains types de cancers comme les Mélanomes métastatiques. Certaines immunothérapies ont des effets spectaculaires sur l’inhibition de la croissance tumorale. La recherche s’intéresse donc de très près à la caractérisation de nouveaux composés immunomodulateurs et aux thérapies combinatoires pour atteindre un taux de succès plus élevé. Ce projet s’inscrit non seulement dans la validation de nouveaux anticorps thérapeutiques mais également dans la description exhaustive de toutes les cellules immunes infiltrant la tumeur et leur rôle dans le contrôle de la pousse tumorale sous l'effet d'un traitement immunothérapeutique. Dans cette dernière optique, nous envisageons de caractériser de façon plus précise les cellules ayant infiltrées la tumeur et les cellules nouvellement circulantes qui viennent de rentrer dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer de façon qualitative et quantitative la capacité d’un modèle murin à rejeter une tumeur après traitement immunothérapeutique en comparaison avec des animaux contrôles sans traitement. Ainsi, nous pourrons valider de nouveaux candidats dans le cadre d'immunothérapies anti-tumorales. Nous pourrons également déterminer l'action anti-tumorale de ces nouveaux composés grâce à l'étude du système immunitaire et définir la dose optimale à administrer. Ces études présenteront une avancée majeure dans le traitement des cancers par immunothérapie.

Procédures

Les souris seront régulièrement manipulées lors de ce projet à raison d’un jour sur deux pour différentes raisons : 1/ Les suivis de poids et de mesures tumorales : les souris seront manipulées à l’état vigile pour être déplacées dans une balance à pesée dynamique puis contenues par un manipulateur pour la mesure du volume tumoral au moyen d’un pied à coulisse. La contention sera la plus courte possible (inférieure à une minute au total par souris pour une pesée+mesure) pour limiter les contraintes subies par l’animal. 2/ Les injections de cellules tumorales (injection unique) : une contention sur souris vigile sera réalisée pour l’injection de l’anesthésique (15 à 30 secondes maximum par souris). Les souris seront ensuite manipulées une fois endormies pour l’injection des cellules tumorales et de l’Antisedan qui permettra d’écourter le temps total d’endormissement à environ 15 minutes, afin de permettre une meilleure récupération des souris. L’anesthésie par voie chimique permet d’assurer une reproductibilité de l’injection des cellules tumorales et d’éviter les grattages au niveau du site d’injection qui pourrait impacter l’implantation de la tumeur. 3/ Les injections de composés immunomodulateurs ou d’anticorps conjugué à un fluorochrome : Ces injections seront réalisées soit sur souris vigile, soit sur souris anesthésiée par voie gazeuse. Les injections pourront être réalisées de façon hebdomadaire, bi-hebdomadaire ou journalière en fonction du mode d’administration choisi ainsi que des recommandations des laboratoires porteurs de projet. Sur souris vigile, le temps de contention et d’injection n’excèdera pas 30 secondes. Selon la voie d’injection, une boite de contention pourra être utilisée. Le temps de contention sera alors le plus bref possible compte-tenu du temps de mise en place de l’animal dans la boite de contention et du temps d’injection. Sur souris anesthésiée, la phase d’induction de l’endormissement durera 3 minutes. Après sortie de la boite, le temps de manipulation et d’injection sur souris endormie sera de 10 à 20 secondes maximum. La souris se réveillera au bout de 30 secondes. 4/Les prélèvements sanguins : Les animaux seront soumis à l’état vigile à quatre ou cinq prélèvements sanguins au cours de la procédure expérimentale. La durée d’un prélèvement n’excèdera pas 30 secondes par souris. Tous les gestes techniques seront réalisés par un manipulateur expérimenté afin de limiter la durée de contention et le stress subi par l'animal.

Impact sur les animaux

Les tests de toxicité des composés immunomodulateurs seront effectués en amont par les laboratoires demandeurs. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. Les effets indésirables liés à la croissance tumorale seront limités grâce à la mise en place de points limites précoces pour limiter la gêne et l'inconfort des animaux dû à la présence de la tumeur. Cette étude ne permet pas l’addition d’anti-inflammatoires ou d’analgésiques, incompatibles avec les immunomodulateurs testés et l’étude de la réponse immunitaire associée. Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress (pesée, anesthésie, injections ou mesure tumorale). Les contentions seront réalisées par du personnel expérimenté et expert dans ces actes afin de limiter les contraintes subies par l’animal.

Devenir

Pour les deux procédures expérimentales, quel que soit le protocole choisi, tous les animaux sélectionnés pour l'Immunophénotypage seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des organes et à leur analyse. Les animaux ne rentrant pas dans les critères de sélection définis dans les procédures expérimentales seront également mis à mort. Dans le cas où une expérience de rechallenge serait envisagée, une partie des animaux ayant rejetés la tumeur (6 maximum par groupe à la fin de la première expérience d'immunophénotypage) seront maintenus pendant 60 jours au minimum (post-injection tumorale) avant de procéder au rechallenge tumoral. Après le rechallenge, les animaux seront soit maintenus 60 jours maximum pour vérifier le rejet tumoral puis euthanasiés, soit euthanasiés 3 jours après le rechallenge pour le prélèvement des organes et leur analyse.

Remplacement

Concernant le principe de « Remplacement », dans ce modèle il n’est pas envisageable d’utiliser une méthode alternative et/ou substitutive. En effet, nous devons nous placer à l’échelle de l’organisme entier pour permettre la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de modèle ainsi que pour caractériser la réponse immunitaire des animaux.

Réduction

Concernant le principe de « Réduction », les méthodes de standardisation développées au sein de notre laboratoire nous permettent de réduire le nombre d’animaux tout en ayant des résultats statistiquement significatifs. Cette standardisation est caractérisée par l’utilisation d’automates et d’instruments de mesure calibrés ainsi que d’outils d’analyse automatisés limitant les variations liées aux manipulateurs. En se basant sur ces procédures standardisées, le bio-informaticien de notre service a ainsi déterminé un calcul de puissance nous permettant de définir le minimum de souris nécessaires pour caractériser les différentes populations d’intérêt pour chaque mutation étudiée et chacune des conditions testées. De plus, certains animaux seront conservés dans plusieurs étapes des protocoles définis pour éviter d’avoir à générer à chaque fois une nouvelle cohorte d’animaux.

Raffinement

Pour ce qui est du principe de « Raffinement », les souris seront hébergées par groupe de 5 au maximum, l’aliment et l’eau seront distribués ad libitum et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout d'un carré de coton et d'un bâtonnet de papier ou « Enrichment Diamond Twists » que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Un temps d’adaptation d’une semaine minimum sera également respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Pour permettre aux souris un meilleur réveil et une meilleure récupération après l’anesthésie, de l’Antisedan sera administré aux animaux à la fin de la greffe des cellules tumorales. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de zootechnie formé et qualifié et des points limites précoces seront préalablement établis. En ce sens, une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation expérimentale (aspect et volume tumoral). Des points limites terminaux sont établis pour chaque observation (valeur maximale de la grille de score) qui entraîneront la mise à mort de l’animal s’ils sont atteints.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles. Nous avons en effet à notre disposition un grand nombre d'anticorps marqués par une grande variété de fluorochromes permettant un phénotype du système immunitaire à très haut contenu. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux adultes de 10 à 12 semaines avec un poids supérieur ou au minimum égal à 22g. Les animaux doivent en effet avoir un système immunitaire mature et un poids suffisant pour être stable au début du protocole et éviter les variations physiologiques non dues à la procédure expérimentale.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés par gavage quotidien jusqu'à cinquante jours, passent des tests de reconnaissance d'objet, de labyrinthe à quatre bras et de labyrinthe en Y, puis sont mises à mort par décapitation pour des enregistrements sur coupes de cerveau, afin de tester des composés contre la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique de possibles signes d'inconfort et une perte de poids après administration. Il affirme que les tests de mémoire et l'électrophysiologie sur coupes ne peuvent être reproduits en culture cellulaire.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) se caractérise par une perte progressive de la mémoire et des capacités de notre cerveau qui nous permettent d'être en interaction avec notre environnement : percevoir, se concentrer, acquérir des connaissances, raisonner, s'adapter et interagir avec les autres. La zone du cerveau impliquée dans l'apprentissage et la mémoire est l'hippocampe. Dans ce projet, afin d’évaluer l'effet des composés testés par voie orale, des tests comportementaux seront utilisés pour quantifier les déficits de mémoire chez les souris âgées. Puis l’effet des composés testés par voie orale sera évalué sur l’activité électrique des cellules neuronales par la technique d’électrophysiologie, sur coupes cérébrales, chez des rongeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet scientifique associé à notre plateforme d'électrophysiologie et de comportement permettra de mieux comprendre la physiologie des cellules neuronales, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme afin de traiter les pathologies cérébrales et notamment la maladie d’Alzheimer.

Procédures

-Administration quotidienne jusqu’à 50 jours, 1 à 2 maximum/jour par voie orale avec une sonde alimentaire de taille adaptée à l’espèce : 10 secondes -Test de reconnaissance d’objet dans une arène, 3 séances à 24h d’intervalles de 10 minutes avant la fin de l’étude -Test du labyrinthe des 4 bras, 1 séance de 5 minutes 48 h avant la fin de l’étude -Test du labyrinthe en Y, une séance de 15 minutes d’entrainement puis 24 h après une séance de test de 5 minutes avant la fin de l’étude. -Anesthésie pour prélèvement sanguin : anesthésie de la souris par inhalation (induction : 4-5% isoflurane) (maximum 3 minutes) -Prélèvement sanguin : 10 secondes jusqu’à 1 fois par semaine (maximum 5 prélèvements sur animal vigile ou anesthésié) et le dernier jour d’étude sur animal anesthésié : 10 secondes - Euthanasie : Administration intrapéritonéale du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), ou anesthésie de la souris par inhalation (induction : 4-5% isoflurane, maximum 3 minutes), décapitation (3 secondes)

Impact sur les animaux

Suite à l’administration des composés à tester, il se peut que des signes d’inconfort ou d’intolérance se manifestent (baisse d’activité, perte de poids, poils hérissés, modification des selles...). Dans tous les cas, un suivi quotidien de l’état général des animaux et une pesée hebdomadaire seront réalisés afin de repérer tout signe de mal-être. Les 3 tests comportementaux différents seront réalisés 48h, 24h avant et le jour de l’euthanasie et ne dureront pas plus de 15 minutes chacun. Aucune nuisance n’est attendu pendant ces tests comportementaux qui sont de l’exploration d’objets ou de territoire.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrales sur ces coupes.

Remplacement

Les tests de comportement nécessitent l’utilisation d’animaux vivants pour quantifier les déficits d’apprentissage et de mémoire. L'organisation des réseaux neuronaux peut être étudiée sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Ces expériences ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour nos animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect de l'éthique animale.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations. Les tests comportementaux et les enregistrements électrophysiologiques seront fait sur les mêmes animaux afin de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux plus âgés pourront être placés individuellement pour éviter le risque de bagarre dès leur arrivée, suite à un retour d’expérience et aux recommandations de l’éleveur. Ils resteront toujours en contact visuel et olfactif. Avant toute administration, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué sans exception (Week-ends & jours fériés), les animaux seront pesés une fois par semaine dès la fin de la période d’acclimatation par les expérimentateurs pour suivre l’état de santé général . En particulier, ils seront observés après chaque geste technique (administration, prélèvement), afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude. Ce suivi nous permettra de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. Les animaux seront évalués grâce à la fiche d’observation /points limites et l’atteinte d’un point limite entrainera les actions documentées dans cette fiche. Un entrainement (première exposition dans l’arène ou labyrinthe, présentation des objets) sera réalisé une fois, 24h avant de réaliser un test comportemental afin de diminuer le stress de l’animal et de rendre des résultats fiables. Lors des prelevement sanguins réalisées par du personnel compétent et qualifié, les animaux pourront être sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes du fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 3 semaines à 95 semaines, afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les unes reçoivent de la streptozotocine par injection cinq jours de suite pour induire un diabète, les autres un régime gras pour devenir obèses, puis toutes sont gavées douze jours avec trois composés bloquant les récepteurs CB1. Le porteur indique un risque important de déshydratation chez les animaux diabétiques et une possible dermatite chez les animaux obèses. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur l'organisme entier et qu'aucun modèle cellulaire ne peut se substituer totalement au modèle animal.

Objectifs

L’obésité et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandues et souffrent d’un manque de traitements pharmacologiques fiables. Les pathologies liées à l’obésité sont nombreuses et incluent le diabète lui-même facteur de risque de néphropathie. La néphropathie diabétique (ND) consiste en une perte de fonction rénale pouvant déboucher sur insuffisance rénale chronique touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Récemment, 3 composés visant à bloquer une nouvelle cible (A , B et C) ont été sélectionnés pour être testés in vivo après avoir démontré une absence de toxicité à travers plusieurs approches de modélisation informatique et de tests in vitro. Ainsi, notre objectif est de tester l’efficacité in vivo de ces 3 composés chez 2 modèles animaux différents. Procédure 1 : chez un modèle de souris diabétique de type 1 Procédure 2 : chez un modèle de souris rendue obèse suite à une alimentation riche en graisse.

Bénéfices attendus

Le diabète et l’obésité représentent un véritable enjeu de santé publique ; ces pathologies étant classées parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’évolution de ces pathologies et de leurs complications. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. Les bloqueurs des récepteurs aux cannabinoïdes 1 présentent un intérêt certain, l’un d’eux est d’ailleurs actuellement en cours d’évaluation au sein d’une étude clinique de phase II avec comme indication, la ND.

Procédures

Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et n’aura lieu que 2 fois par animal pour la procédure 1 et 7 fois pour la procédure 2. Les injections intrapéritonéale de streptozotocine auront lieu quotidiennement pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. Pour chaque injection, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes. Pendant les 12 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage. Pour chaque gavage, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses et des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que ces pathologies ne soient pas des points limites, les conséquences qu’elles génèrent peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont très importants chez les animaux diabétiques et nécessite une attention particulière. Pour le modèle d’obésité, une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peux également entraîné le développement passager de dermatite.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

L’obésité et le diabète sont des pathologies multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

Pour le modèle STZ, la sévérité de la pathologie est estimée par la mesure du degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 8-10. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte. Pour le modèle d’obésité, la même approche sera employée en analysant la perte de poids et la diminution de quantité de graisse contenue dans le foie.

Raffinement

Depuis leur arrivée en provenance du fournisseur, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Tout au long de ce projet, plusieurs mesures de raffinement sont prévues.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Son métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction du diabète et de l’obésité sera réalisée chez des souris de 6 semaines. Pour le modèle STZ (streptozotocine), les souris seront âgées de 20 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 22 semaines lors de la mise à mort. Pour le modèle d’obésité, les souris seront âgées de 22 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 24 semaines lors de la mise à mort. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.

1 576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales issues de patients, puis des traitements par gavage, dans l'eau de boisson ou par voie intrapéritonéale, avec une imagerie hebdomadaire, avant sacrifice pour analyser l'infiltration tumorale. Le porteur indique que l'injection de cellules tumorales peut provoquer une perte de poids rapide et une hépatite, et vise à tester des traitements contre un lymphome intestinal compliquant la maladie cœliaque. Il affirme que la réponse des cellules malignes ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

La maladie coeliaque est une maladie intestinale inflammatoire fréquente induite par l’ingestion de gluten un protéine présente dans les farine (blé, orge, seigle). Une complication rare mais sévère est l’émergence de lymphomes intestinaux chez des patients ne répondant pas au régime sans gluten. L'accumulation de lymphocytes intestinaux peut donner naissance, chez certains patients coeliaques à un lymphome intestinal aussi appelé maladie coeliaque réfractaire de type II. Les cellules formant le lymphome contiennent des mutations hautement récurrentes augmentant l'activité d'une enzyme et/ou d'un facteur de transcription ainsi qu’un spectre de complémentaire d’autres mutations. Notre hypothèse est que ces mutations confèrent un avantage dans l’environnement intestinal inflammatoire des patients coeliaques. Le clone de cellules mutées pourrait ainsi s’expandre aux dépends des cellules normales et aboutir à un lymphome intestinal. Ce lymphome évolue initialement à bas bruit mais peut dans 40-50% des cas évoluer vers un lymphome invasif de très mauvais pronostic. Un objectif important est la mise au point de traitements capables d’éliminer les cellules mutées précocement avant l'aggravation de la maladie. Il semble en particulier important de tester les inhibiteurs spécifiques de l'enzyme et du facteur de transcription muté. Néanmoins la présence d’un nombre important de mutations additionnelles expose au risque de résistance des cellules au traitement. Notre but est de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques dans un modèle de souris obtenu par injection de lignées cellulaires malignes issues des biopsies intestinales de patients atteints de maladie coeliaque réfractaire de type II. Nous chercherons à évaluer leur efficacité sur le développement tumoral mais aussi le risque de sélection de cellules tumorales résistantes aux traitements, ceci afin d’évaluer les bénéfices et risques des traitements pour les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de tester l’efficacité des différentes molécules ciblant les voies de signalisations impliquées sur le développement des cellules tumorales et de tester un possible échappement. Seules des drogues déjà autorisées en clinique humaine seront utilisées, suggérant qu’il n’y aura pas de toxicité excessive. A terme, ce projet pourrait permettre de développer des traitements permettant de prévenir ou stopper le développement de lymphomes chez les patients coeliaques.

Procédures

Injection de cellules tumorales de patient (réalisée sur 1576 souris) : Les lignées cellulaires humaines transduites ou non seront injectées par voie intraveineuse rétro-orbitaire avec des seringues menues d’aiguilles à insuline(durée de l’injection : 5 secondes). Administration de traitements (réalisé sur 1176 souris) : - un traitement délivré en per os dans l’eau de boisson tous les deux jours (réalisé sur 294 souris) (durée de l’injection : 5 secondes) - deux traitements administrés par gavage oral tous les jours à l’aide d’une aiguille de gavage d (réalisé sur 588 souris) (durée de l’injection : 5 secondes). - un traitement administré par voie intra-péritonéale deux fois par semaine (réalisé sur 294 souris) (durée de l’injection : 5 secondes). Imagerie intra-vitale (réalisée sur 616 souris) : Les souris seront imagées à l’aide de l’IVIS spectrum 1 fois par semaine depuis l’injection des cellules tumorales jusqu’au sacrifice. Le temps d’imagerie dépend de la puissance du signal mais ne dépasse pas 30 min par animal.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Les souris génétiquement modifiées que nous souhaitons utiliser ne présentent pas de phénotype dommageable dans nos conditions d'utilisation. L'injection de cellules tumorales humaines est succeptible d'entrainer une perte de poids rapide ainsi qu'une hépatite.

Devenir

Les animaux seront tous sacrifiés à la fin de chaque procédure afin d'analyser l'infiltrat de cellules tumorales dans les différents organes (rate, foie, sang, rein et intestin).

Remplacement

La réponse de cellules malignes à un traitement est un mécanisme complexe qui ne peut être récapitulée in vitro. Nous avons dans un premier temps utilisé des cultures primaires in vitro pour cerner les drogues d’intérêt, nous permettant de réduire fortement l’utilisation d’animaux. Les cellules de patients étant fragiles et difficiles à cultiver in vitro, l’utilisation de modèle murin nous permettra de les amplifier dans un contexte riche en IL-15 afin de tester plusieurs stratégies thérapeutiques et de déterminer les effets de ces molécules sur les cellules transformées et d’évaluer le risque d’échappement tumoral favorisant leur progression vers des lymphomes invasifs.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible en tenant compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse, incluant pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles et de la nécessité de reproduire les résultats. Le nombre de 5 souris/lot est choisi pour permettre les analyses statistiques. Afin de limiter le nombre de souris, la viabilité cellulaire sera quantifiée avant toute injection pour optimiser la prise de greffe.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, mâles et femelles séparés, et le nombre d’individus par cage limité entre 2 et 5 individus pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes d'agréssion ou de stress engendrés par une population trop importante. Nous serons aussi très attentifs au bien-être des animaux. Nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement par la mise à dispositionde boules de coton, de maisonnettes en carton, de bâtonnets à ronger et d’un tunnel. La surveillance du bien-être des animaux sera assurée au quotidien par le personnel de l’animalerie et hebdomadaire par les expérimentateurs. Les expériences et en particulier l’injection de cellules seront réalisées par des personnes expérimentées et qualifiées afin d'éviter toutes fausses manipulations ou un éventuel stress pour les animaux. Les procédures d’injection sont peu douloureuses mais l’utilisation d’anti-inflammatoires ou analgésiques pourrait compliquer l’interprétation des résultats sur la progression tumorale. Les animaux seront alors particulièrement surveillés lors de ces procédures. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux souris, les prélèvements de sang se dérouleront sous anesthésie locale avec de la tétracaïne et les injections de cellules malignes humaines sous anesthésie générale . Le réveil se déroulera dans un environnement calme et silencieux. Des points-limite ont été établis, consuisant à la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera surveillé de façon quotidienne et selon la progression des symptômes observés via une grille d’évaluation, la prise de greffe et les variations de poids corporel.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes constituent un modèle d’étude reconnu pour la réalisation de greffes humaines. L’expression d'un facteur de croissance humain que nous savons indispensable à l’expansion des cellules malignes in vitro et qui assurera l'expansion des cellules de patients après injection chez la souris immunodéficiente. Les souris utilisées seront des souris adultes d’environ 8 semaines.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un gène de l'autophagie invalidé, elles subissent une série de tests de développement puis des tests comportementaux nommés, dont l'activité locomotrice, l'anxiété, la résignation et la communication, avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever le cerveau. L'objet est d'étudier le rôle de l'autophagie dans les troubles du neurodéveloppement comme l'autisme, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que l'effet d'un tel défaut sur le comportement ne peut s'étudier autrement qu'in vivo.

Objectifs

Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier à différents âges le développement du système nerveux central chez un modèle souris pour lequel un gène de l’autophagie a été invalidé, par des approches complémentaires d’études du comportement et d’analyses des tissus prélevés. En particulier, nous étudierons le développement sensoriel et moteur chez le jeune animal pendant les trois premières semaines de vie, par la mise en place de tests successifs classiquement utilisés ; puis nous étudierons un ensemble de registres comportementaux individuels ou sociaux chez l’animal adolescent et adulte, tels que le niveau d’activité locomotrice, l’anxiété, les capacités cognitives, les comportements compulsifs, la résignation et les capacités de communication. Les échantillons prélevés nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests de développement ou de comportement non invasifs. Ils sont tous soumis à une procédure sans réveil de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).

Impact sur les animaux

A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans les procédures du présent projet, les animaux subissent exclusivement des tests non invasifs de développement et de comportement, jusqu’à l’euthanasie, pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place.

Devenir

A l’issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux sont soumis à la procédure 4 (sans réveil). La procédure 4 décrit une perfusion intracardiaque réalisée afin de prélever les tissus d’intérêt. Les procédures 1, 2 et 3 sont classées en degré de gravité « modéré » et la 4ème est une procédure sans réveil. Les 3 premières procédures concernent chacune 120 animaux, la 4ème est réalisés sur l’ensemble des 360 animaux soumis à l’une des 3 premières procédures modérées. Nous comptons donc dans cette demande d’autorisation de projet 360 animaux en procédure modérée et 0 en procédure sans réveil. Les animaux ne sont donc pas maintenus en vie à l’issue de la procédure 4.

Remplacement

L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 360 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, quand cela est possible, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et la réalisation de séries de coupes par cerveau nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement : La normalité de la distribution des data obtenues sera analysée par le test de Shapiro-Wilk, et des tests paramétriques (ANOVA et test a posteriori de Bonferroni pour les données issues des tests de développement et comportement ou test t de Student pour les analyses des échantillons) ou non paramétriques (test de Kruskal-Wallis puis Mann-Whitney) seront ensuite appliqués. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié par décapitation avant PND14 et dans une chambre à CO2 après PND14. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place (procédure 4). Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en oeuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement (voir 3.3.2). Plusieurs stades de développement seront analysés : nous nous intéressons en effet aux conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, correspondant chacun à un temps d’euthanasie, seront étudiés : jeune (procédure 1 de PND4 à 17), adolescent (procédure 2 de PND25 à 34) et adulte (procédure 3 de PND70 à 89).