Oncologie

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre à sept injections intrapéritonéales d'un inhibiteur d'enzyme (BAPN) ou d'un placebo, avant d'être tuées pour prélever la cornée sur tissu frais. Le porteur précise que cette expérience répond à une demande d'examinateurs pour finaliser la publication de travaux déjà réalisés. Il n'anticipe "pas de souffrance ou de douleur" sur la courte durée des injections et présente la souris comme "essentielle" pour étudier le devenir des cellules souches in vivo.

Objectifs

Le but de ce projet est de mesurer l’impact de la rigidité matricielle de la niche du limbe de la cornée sur le destin des cellules souches. L’expérience proposée ici est une demande d'examinateurs afin de finaliser la publication de nos travaux . L’effet fonctionnel a déjà été évalué sur des limbes de cornée prélevés sur souris wild type. Il faut maintenant évaluer la rigidité du tissu en question (mesure par microscopie à force atomique). Pour cela, il s’agit de répéter la modulation de la rigidité du limbe par injection intrapéritonéale d’un inhibiteur d'une enzyme de modification de la matrice extracellulaire (lysyl oxidase LOX) et d'effectuer un prélèvement d’organe après sacrifice. La mesure AFM doit effectivement etre realisé sur tissu frais.

Bénéfices attendus

Le destin des cellules souches de s'autorenouveler ou de se différencier dépend en grande partie de l'environnement extracellulaire, en particulier de l'élasticité de leur niche. Néanmoins, le rôle de la rigidité de la matrice dans la formation de cette niche et dans les fonctions souches in vivo est mal connu. Nos données montrent que la rigidité matricielle du stroma module ce destin en générant des compartiments fonctionnels différents. Ce projet vise à mesurer la rigidité de la matrice du stroma du limbe par microscopie à force atomique AFM, comme demandé par les examinateurs. En effet, nous avons montré, dans ce manuscrit, de manière fonctionnelle que c’est en compartimentalisant l’environnement que la matrice contrôle le destin souche.

Procédures

Les animaux seront soumis soit à 4 traitements par injection intrapéritonéale (lot 1 BAPN et lot 2 PBS ) soit à 7 traitements par injection intrapéritonéale (lot 3 BAPN et lot 4 PBS). Une injection intrapéritonéale prend environ 2 minutes par souris à réaliser (soit un total de 2minutes x 4= 8 minutes maximum réparti sur 5 jours pour les lots 1 et 2, et 2minutes x 7= 14 minutes maximum réparti sur 7 jours pour les lots 3 et 4).

Impact sur les animaux

Sur la base de l'expérience antérieure de nos collaborateurs avec les injections de BAPN ou le gavage oral, nous n'anticipons pas de souffrance ou de douleur chez les animaux. Le BAPN est un inhibiteur des enzymes LOX et devrait atténuer la rigidité tissulaire. Ce n'est qu'après des traitements plus longs (comme un mois, i.e. beaucoup plus long que les 4 ou 7 jours max. d'injection proposé ici) que des phénotypes dommageables peuvent apparaitre.

Devenir

La totalité des animaux sera sacrifiée à l’issue de l'unique procédure expérimentale de ce projet. En effet, la mise à mort est nécessaire pour le prélèvement d'organes prévu pour répondre à la question scientifique posée.

Remplacement

Une importante partie de ces travaux a été réalisée in vitro sur cellules en culture, en particulier l’aspect des mécanismes moléculaires impliqués. Cependant, l’étude de l’impact de l’environnement matriciel sur le destin fonctionnel des cellules souches n'est que limitée sur des cellules en culture, et c’est pour cela qu’il est essentiel de réaliser cette expérimentation sur la souris.

Réduction

Chaque souris ayant deux yeux, le nombre de prélèvements pourra être légèrement réduit. De même, les mâles et les femelles seront utilisés limitant donc le nombre de portée et d’animaux générés (début procédure à P13). Néanmoins, afin de préserver la qualité statistique des données, 12 souris par groupe et par traitement sont prévues.

Raffinement

Afin de reduire le risque potentiel de perforation des organes fixes ou de consistance plus dure (estomac, cæcum, foie...) par l'injection intrapéritopneale, le site d'injection choisi est le quadrant abdominal inférieur droit de la cavité péritonéale de l’animal en regard de la cuisse (c'est à dire autour des anses intestinales, organes lâches, qui se rétractent sous l’injection). De même, afin de réduire la douleur, l'aiguille utilisée est de très petit diamètre et le volume injecté de moins de 50 microlitres. Bien entendu, une fiche de score avec point limite bien défini (site d'injection, état général et comportement de l'animal) sera utilisée.

Choix des espèces

La réalisation du projet présenté permettra d’acquérir des connaissances fondamentales sur les processus biologiques régulant le devenir des cellules souches in vivo. La souris apparaît comme un excellent modèle pour étudier ces mécanismes car le modèle est parfaitement décrit et déjà utilisé et le traitement BAPN a déjà été testé, validé et partiellement publié par un membre de la collaboration. De plus, nous proposons ce projet dans le cadre du manuscrit en cours de révision pour lequel notre collaborateur a utilisé un modèle de souris génétiquement modifiées (LOXOE, enzyme LOX OverExpressed). Ainsi, en utilisant des souris, nous pourrons comparer nos données sur souris wild type injectées au BAPN et les données sur souris transgéniques. Ce projet sera développé dans le cadre de réponse aux reviewers sur des expériences déjà réalisées. Ainsi, la procédure sera réalisée sur des souris jeunes P13 uniquement.

310 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un test de nage à contre-courant croissant jusqu'à ce qu'elles ne puissent plus se maintenir à la verticale et soient plaquées contre une grille, puis pêchées et mises à mort. Le projet cherche à savoir si une faible proportion de muscle rouge, recherchée par sélection génétique pour la vente en tranches fumées, réduit les capacités de nage. Le porteur présente aussi l'étude comme visant le "bien-être" des poissons, alors que l'enjeu affiché est d'abord "agronomique et économique".

Objectifs

La production de truite arc en ciel en France s’oriente de plus en plus vers des poissons de grande taille destinés à la fumaison et vendus sous forme de tranches fines. La présence du muscle rouge, facilement repérable par sa couleur brune est fortement préjudiciable pour la vente. En effet, outre l’aspect visuel, le muscle rouge riche en lipides s’oxyde rapidement conduisant à des défauts de flaveur. C’est pourquoi certains cahiers des charges imposent aux transformateurs d’éliminer ce muscle. Ce niveau de parage élevé (élimination du muscle rouge) entraîne une perte en matière première et donc une perte économique pour les producteurs et les transformateurs. Il y a donc un enjeu agronomique et économique à maîtriser la croissance de ce muscle. C’est pourquoi les professionnels étudient la possibilité de diminuer la proportion de muscle rouge par sélection génomique. La musculature des poissons est très majoritairement (>90%) constituée d’un muscle blanc à contraction rapide et d’un muscle rouge à contraction lente. D’après la littérature, le muscle blanc avec un métabolisme anaérobie est surtout sollicité par le poisson pour la nage rapide alors que le muscle rouge avec un métabolisme aérobie est principalement sollicité pour la nage lente. Chez le zebrafish, l’absence totale de muscle rouge dans les stades précoces entraîne une forte mortalité résultant d’une incapacité à s’alimenter (Li et al 2019). Alors que les études sur la croissance du muscle blanc sont nombreuses et que l’impact des facteurs externes est bien connu, les facteurs qui influencent la proportion de muscle rouge chez les poissons sont très mal connus. Parmi les différents facteurs d’élevage, l’exercice modéré semble stimuler la croissance du muscle rouge sans modifier significativement la taille des fibres lentes (Davie et al 1986). Cependant, l’impact de l’exercice sur la taille des fibres du muscle rouge de truite reste controversé puisque certaines études rapportent une augmentation de 25 % du diamètre moyen des fibres (Greer-Walker et al 1978), alors qu’une autre n’observe aucun effet (Davie et al 1986) L'objectif du projet est de déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Il s'agit notamment de vérifier si une proportion faible de muscle rouge n’entraîne pas de défauts dans la capacité de nage ce qui pourrait nuire au bien-être de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Il s'agit notamment de vérifier si une proportion faible de muscle rouge n’entraîne pas de défauts dans la capacité de nage ce qui pourrait nuire au bien-être de l’animal. Étant donné que le muscle rouge est décrit comme étant principalement sollicité pour la nage lente, il s'agit de vérifier si les poissons avec une faible proportion de muscle rouge n’ont pas une capacité de nage limité ce qui pourrait nuire à leur bien-être. Il se basera sur l’utilisation d’un modèle biologique tout à fait pertinent, deux lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipide du muscle : lignée grasse (LG) et lignée maigre (LM), ainsi que des lignées isogéniques. En effet, des travaux préliminaires ont montré qu'il existait une variabilité de la proportion de muscle rouge entre différentes lignées de truites : Lignées A02 (faible), N38 (forte), AB1 (moyenne) et lignée grasse (très faible) et maigre (moyen).

Procédures

Les animaux seront soumis à un test de nage qui consiste à exposer les poissons à un courant de plus en plus fort dans un bassin expérimental avec une accélération graduelle jusqu'à 2 longueurs par seconde. Ce bassin de test de nage sera constitué d'un tunnel de nage de 300 cm de long, 70cm de large et 32 cm de haut représentant un volume de 680 L environ. Il sera alimenté en eau d’élevage par deux pompes équipées de variateur de tension afin d’assurer un renouvellement d’eau suffisant et augmenter progressivement le courant d’eau. Dès que le poisson n’arrive plus à se maintenir en position verticale dans le courant d’eau et qu’il est plaqué sur la grille disposée à la fin du tunnel de nage pendant quelques secondes, il est pêché et mis à mort. Le test doit durer 2 heures. Un test avec 10 poissons sera réalisé en préambule pour valider la fonctionnalité du système de test., Puis 5 tests avec 60 poissons seront réalisés.

Impact sur les animaux

Les poissons utilisés dans ce projet subiront un stress modéré généré par un test de nage où l’on va mesurer le temps au bout duquel ils ne parviennent plus à se maintenir en position verticale dans le courant d’eau et qu’il est plaqué sur la grille à la fin du tunnel de nage pendant quelques secondes, il est retiré du bassin de test. Pour limiter le stress, les groupes de poissons seront constitués entre 3 et 4 semaines avant le test de nage et placés dans un bac d’élevage proche du bassin de test. Les animaux seront mis à jeun avant le test afin d'éviter qu'ils ne soient malades et transférés avec une épuisette dans le bassin de test la veille pour s’habituer à ce bassin.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables de projet ou par les responsables du projet eux-mêmes. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés. Tous les éléments justifiant leur mise à mort sont conservés et transmis à la SBEA de l'établissement et au vétérinaire référent de l'établissement, ainsi qu’au responsable du projet.

Remplacement

Les objectifs du projet étant de déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage des poissons ce qui ne peut se faire que sur animaux vivants.

Réduction

D'après notre expérience et la variabilité de la réponse au test de nage, il est indispensable de réaliser le test sur au moins 60 truites de chaque lignée. Nous utiliserons pour cela au total 310 animaux : 10 animaux pour adapter le test, et 60 animaux de chaque lignée (60*5 lignées) qui possède des proportions différentes de muscle rouge (faible, moyenne et forte) ce qui nous permettra d'obtenir des mesures précises et fiables de la proportion de muscle rouge et des capacités de nage. Cet effectif nous permettra d’avoir une puissance statistique suffisante (test du khi2, test t, ANOVA) et pour mettre en évidence un impact de la proportion du muscle rouge sur les performances de nage.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, nourriture, enrichissement). Pour limiter le stress, les groupes de poissons seront constitués entre 3 et 4 semaines avant le test de nage et placés dans un bac d’élevage proche du bassin de test. Les animaux seront mis à jeun avant le test afin d'éviter qu'ils ne soient malades et transférés avec une épuisette dans le bassin de test la veille pour s’habituer à ce bassin. Pendant les procédures la manipulation des animaux sera réduite au maximum et une surveillance du comportement des animaux sera effectuée pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse subies. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Les animaux seront anesthésiés puis mis à mort dès la fin du test.

Choix des espèces

L'étude s'effectue sur la truite arc en ciel car c'est l'espèce piscicole utilisée pour le projet. C'est une espèce robuste dont l’élevage et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. De plus, il s’agit d’un poisson d’intérêt économique dans le monde entier, et qui représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement étudié dans la communauté scientifique. Nous allons réaliser les tests sur des animaux de 200g qui correspond à la taille où l’on peut mesurer le plus précisément la proportion de muscle rouge ainsi que les capacités de nage.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur osseuse leur est greffée par injection paratibiale, avec des prélèvements sanguins rétro-orbitaires puis un prélèvement intracardiaque avant la mise à mort. Le porteur indique que la croissance tumorale peut être douloureuse et provoquer une gêne à la marche et des difficultés respiratoires liées aux métastases pulmonaires, du paracétamol étant ajouté à l'eau de boisson. Il décrit un ostéosarcome touchant surtout enfants et adolescents et juge "indispensable" de tester ces combinaisons d'immunothérapies chez l'animal avant la clinique.

Objectifs

L’ostéosarcome est la tumeur osseuse la plus fréquente, touchant essentiellement des enfants et des adolescents. Le traitement de l’ostéosarcome repose sur l’association de polychimiothérapies à la résection complète de la tumeur, mais l’augmentation des chimiorésistances nécessite le développement de nouvelles thérapies. Des études montrent que la composition de l’infiltrat immunitaire de l’ostéosarcome est corrélée avec la progression tumorale (chez l’homme et dans des modèles animaux) : l’immunothérapie semble donc être applicable, mais a montré des résultats limités dans les essais cliniques. Ce projet vise à valider des combinaisons thérapeutiques induisant une meilleure réponse aux immunothérapies dans l’ostéosarcome. Il doit nécessairement se faire dans un modèle in vivo qui intègre la complexité de l’environnement immunitaire et osseux de cette tumeur.

Bénéfices attendus

Au final ce projet permettra de valider des approches immunomodulatrices en combinaison pour le traitement de l’ostéosarcome, ce qui a un potentiel très important en santé humaine, sur des indications où il y a très peu d’options thérapeutiques, et où celles dont nous disposons sont loin d’être idéales. Le nombre d’animaux par groupe est calculé de manière à permettre de détecter une différence d’approximativement 25% (cliniquement significatif) avec un écart type commun de 20%.

Procédures

Les tumeurs seront induites par injection de suspension cellulaire en position paratibiale. Cette injection a lieu une fois et est pratiquée sous anesthésie générale pour une duré total de 5 min. Deux prélèvement rétro-orbitaire de sang, un avant traitement (J0) puis un 10 jours post début du traitement seont réalisés. Ce prélèvement sera effectué après application d’un colyre anesthésique (durée du prélèvement : 5 min maximum). Un prélèvement sanguin intracardiaque de sang sera effectué sur chaque souris juste avant la mise à mort des animaux. Pour cela, les souris seront placées sous anesthésie profonde (isoflurane 5% / air 1.5%).

Impact sur les animaux

L'ostéosarcome est une tumeur osseuse ; le modèle utilisé est implanté en position paratibiale (entre l'os et le muscle) et est métastatique. De ce fait la croissance tumorale peut etre douloureuse c'est pourquoi du paracétamol est ajouté dans l'eau de boisson dès avant l'implantation des cellules et pour toute la durée de l'expérimentation. Une gène à la marche peut survenir qui est surveilléeet un point limite Et du fait des possibles métastases pulmonaires des dyspnées peuvent survenir. La survenue d'une gène respiratoire est d'ailleurs un point limite de l'expérience.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mot à l'issue de chaque procédure même en cas de non atteinte de point limite

Remplacement

Des études in vitro on été réalisées et ont montré l’intérêt de ces combinaisons thérapeutiques sur des modèles cellulaires. Cette approche in vitro a permis de remplacer des études in vivo. Maintenant afin de pouvoir valider la ou les meilleures combinaisons et les amener en clinique il est indispensable de tester ces approches dans un modèle animal mimant la clinique humaine.

Réduction

Dans ce projet, au maximum 280 souris seront utilisées et réparties dans 2 procédures expérimentales. Des tests in vitro préliminaires ont été réalisés et on déjà permis de repousser le passage chez l’animal et de réduire le nombre d’animaux à inclure. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum mais dans des mesures satisfaisantes pour pouvoir conclure de façon statistiquement significative à l’efficacité des médicaments. Ce nombre se justifie par le nombre de combinaisons de médicaments testées et par lx, les répétitions ne concernant que les groupes ayant montré un effet antitumoral (répétition faite pour confirmer effet antitumoral, groupe pas effet pas refait.

Raffinement

Tout au court de ce projet, les précautions seront prises pour ne pas stresser l’animal. Le projet se déroule en 2 temps : Temps 1 : raffinement du modèle animal et temps 2 test des combinaisons. Toutes les injections de cellules seront effectuées sous anesthésie générale et après administration d’un analgésique. Afin de limiter le nombre d’injection faite à la souris, les composés suffisamment stables dans l’eau seront administrés dans l’eau de boisson, les autres administrés par voie IP. Afin de prévenir la douleur liée à la progression de la tumeur du paracétamol est ajouté dans l'eau de boisson 48h avant l'innoculation des cellules et est maintenu tout au cours de l'expérimentation. De l'enrichissement est ajouté dans les cages (nids, croquettes déposées au fond de la cage pour pallier aux difficultés d'accès à la grille de croquettes si boiteries. L'administration d'anesthésique, d'analgésique et d'antalgique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être (perte de poids, claudication, gêne respiratoire) permettent de limiter au maximum la souffrance animale.

Choix des espèces

L’utilisation d’anti PD1 est très bien décrite dans des modèles murins, ce qui n’est pas le cas dans les modèles de rats. Dans le modèle murin proposé, les cellules greffées sont de la même espèce que l’animal greffé ; ce modèle peut donc être établi sur un animal immunocompétent, condition nécessaire pour le test d’immunothérapies. Des modèles de xénogreffes établis chez les souris immunodéficientes ne permettraient pas d’évaluer l’effet du système immunitaire sur la progression tumorale. La lignée POS-1 et K7M2 sont dérivées de souris C57BL/6j et BALB/c. Les souris sont âgées de 7 semaines au moment de l’injection de cellules tumorales en position paratibiale. Cet âge est retenu car à un âge plus précoce, il est très difficile de greffer au niveau de ce site.

16 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés en vie pour être réutilisés. Chacun subit jusqu'à douze prélèvements sanguins sur vingt-quatre heures et un prélèvement de liquide cérébrospinal sous anesthésie générale, pour étudier la pharmacocinétique d'une molécule, E846. Les chiens sont hébergés individuellement pendant toute la phase expérimentale. Le porteur affirme qu'"aucune méthode alternative" ne reproduit les effets de "l'organisme entier" et qualifie le recours au chien d'"indispensable", le chien étant l'espèce cible du produit.

Objectifs

L’objectif premier de ce projet est d’obtenir des premières informations concernant le profil pharmacocinétique de la molécule E846.

Bénéfices attendus

Il est attendu de ce projet de vérifier l'action de la molécule test sur l'inhibition de certaines kinases.

Procédures

Des prélèvements de sang seront effectués sur une période de 12 jours (le maximum étant 12 prélèvements de 1.5 mL sur 24h). Les prélèvements sanguins seront fait conformément à la règlementation en vigeur et conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Des prélèvements de liquide cérébrospinal seront aussi effectués. Ces prélèvements seront fait dans des conditions aseptiques et sous anesthésie générale des animaux. Un seul prélèvement de liquide cérébrospinal sera réalisé par animal (volume prélevé environ 0.5 mL).

Impact sur les animaux

Pas d'effet particulièrement indésirables sont attendus

Devenir

Les animaux seront gardés en vie. Décision prise par le vétérinaire désigné

Remplacement

La pharmacocinétique étudie le devenir de la molécule dans l’organisme c'est à dire son absorption, sa distribution par la circulation sanguine, son métabolisme, son élimination. Le but de ce projet est d'obtenir des premières informations concernant les caractéristiques pharmacocinétiques de ce composé impliqué dans la regulation de messagers secondaires, ici il s'agit d'un inhibiteur d'enzymes. Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire les effets de l'organisme entier sur les molécules, il est indispensable de recourir à l’animal de laboratoire. L'espèce chiens est l'espèce cible.

Réduction

Dans ce projet, 16 animaux seront inclus et divisés en 2 groupes de 8 animaux. Ce nombre et le nombre d'animaux minimal requis pour avoir des résultats interprétables compte tenu de la variabilité inter et intra individuelle.

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale (du premier jour d'administration jusqu'au Day 12), les animaux seront hébergés individuellement pour éviter les contaminations par coprophagie et un enrichissement du milieu adapté sera mis en place pour éviter l'ennui: présence de jouets, de tablettes... Un suivi des animaux plusieurs fois par jours sera mis en place permettant l'observation générale des animaux et la détection précoce d'éventuels effets du produit sur l'animal.

Choix des espèces

L'espèce chien est la cible thérapeutique du produit testé Adulte ( 1 à 6 ans) Age cible

91 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales, par voie sous-cutanée ou intraveineuse, censée provoquer un développement tumoral avec métastases cérébrales, avant d'être disséquées pour récupérer ces métastases. Le projet cherche à préciser le rôle d'un gène candidat dans la formation des métastases cérébrales, un processus que le porteur juge "difficilement modélisable in-vitro". Des points limites sont annoncés mais le résumé ne détaille pas les signes cliniques suivis.

Objectifs

Les métastases cérébrales surviennent chez environ 20% des patients atteints de cancers métastatiques. Leur survenue est de mauvais pronostic puisque moins de 10% des patients survivent au-delà de 2 ans. Le traitement de ces atteintes par chimiothérapie reste difficile en raison de la faible perméabilité du cerveau à de la plupart des molécules actuelles, par l’existence d’une barrière hémato-encéphalique entourant et protégeant le système nerveux central. Notre postulat est qu’il existe probablement une signature moléculaire propre liée à l’implantation des cellules tumorales sur le site métastatique cérébral. L’objectif est d’identifier, parmi cette signature, des gènes candidats potentiels que nous pourrions utiliser comme cible thérapeutique. A partir de prélèvements de patients, nous avons réalisé une étude comparative des gènes exprimés au niveau des métastases cérébrales et des métastases non-cérébrales. Ce travail a permis de mettre en évidence des gènes qui pourraient avoir un rôle dans le passage de la barrière hémato-encéphalique et/ou l’implantation des cellules tumorales dans le cerveau. Parmi ces gènes, l’un d’eux pourrait constituer une cible prometteuse de par les fonctions qui lui sont prêtées dans la littérature. L’objectif de cette demande est de déterminer le rôle fonctionnel de cette cible potentielle dans le processus métastatique cérébral.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet sont la validation de l’intérêt fonctionnel du gène identifié par l’analyse génomique et bibliographique dans le processus de métastase cérébrale ainsi qu’une meilleure compréhension du processus métastatique vers cet organe.

Procédures

Nous disposons de 2 lignées tumorales murines connues pour induire des métastases cérébrales chez la souris et qui expriment notre gène d’intérêt. Les animaux subiront une seule procédure d'injection des cellules tumorales. En fonction des types cellulaires, les injections se feront soit en sous cutané, soit en intraveineuse. Ce sont des actes peu douloureux qui ne nécessitent pas de sédation. Seule l'injection sous cutanée se fera sous anesthésie générale pour des raison techniques d'accès au site d'injection.

Impact sur les animaux

L'injection des cellules devrait conduire à un développent tumoral avec une possibilité de métastases cérébrales. Pour limiter au maximum les nuisances sur les animaux, un suivi quotidien et l'évaluation des signes clinique doivent nous permettre de suivre le développement tumoral dans le respect des points limtes fixés et de prévenir les domages aux animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés pour permettre leur dissection et la récupération des métastases cérébrales et non-cérébrales. Les cellules issues de ces métastases seront ensuite utiliéses pour des analyses moléculaires et fonctionnelles in-vitro.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à la poursuite de notre projet. Le phénomène métastatique est un phénomène plastique qui fait appel à des mécanismes complexes difficilement modélisables in-vitro. Si nous souhaitons mettre en évidence des différences fonctionnelles entre les cellules ayant envahis le cerveau et celle n’ayant pas envahis le cerveau, il est impératif que nous puissions les récupérer sur le site de la métastase.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé pour nécessiter le moins d'animaux possible tout en atteignant les objectifs scientifiques fixés. Pour ce projet, nous avons prévu 91 souris Balb/c Ann. Nous injecterons 2 lignées tumorales murines décrites pour induire des métastases cérébrales. Lors des dissections, nous récupèrerons les cellules tumorales de métastases cérébrales et des métastases non cérébrales pour effectuer des tests moléculaires et fonctionnels in-vitro. Une analyse informatique nous a permis de déterminer le nombre d'individus nécessaires sur la base d'une comparaison de 2 moyennes d'échantillons non appariés. L'évaluation des résultats obtenus se fera par la comparaison de 2 moyennes de groupes d'échantillons non appariés par un test de Mann withney.

Raffinement

Pour le raffinement, les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs. Si les points limites sont atteints avant la fin de l'expérimentation, l'animal sera euthanasié. Une période d'acclimatation de 7 jours sera observée à réception des animaux. Un enrichissement des cages sera systématiquement proposé. pour les souris, nous disposerons dans les cages des abris et des fagots en carton.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur des modèles murins car c’est un modèle pour lequel nous disposons de lignées cellulaires dont il a déjà été décrit qu’elles avaient un tropisme pour le système nerveux central. Nous utiliserons des souris Balb/c car il s’agit d’un modèle syngénique (H2d) pour les lignées utilisées, limitant les rejets des cellules tumorales. Souris adultes de 6 semaines. Les animaux sont identifiés par baguage à l’oreille. L’identification est réalisée 7 jours après leur arrivée. L’âge des animaux n’influe pas sur les capacités de développement tumorales et il n’est pas non plus rapporté d’influence de l’âge sur l’apparition des métastases cérébrales pour ces modèles. Aussi, nous choisirons des animaux adultes jeunes.