Oncologie

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracrânienne de lentivirus pour induire un gliome, avant d'être mises à mort en raison du développement tumoral. Le porteur, dont les rubriques restent très brèves, n'annonce pas d'effets indésirables et vise à valider la protéine Rad18 comme cible contre le glioblastome. Il affirme que la validation in vitro ne suffit pas et qu'un contexte plus global reste "indispensable".

Objectifs

Obtenir une preuve de concept pour valider Rad18 comme nouvelle cible thérapeutique pour le traitement du glioblastome

Bénéfices attendus

Améliorer l'espérance de vie des patients atteint de glioblastome

Procédures

Injection intracranial de lentivirus

Impact sur les animaux

Pas d'effets indésirables

Devenir

Mis à mort car développement tumorale

Remplacement

La validation de la cible par approche in vitro ne saurait être suffisante pour étudier l’effet de l’inhibition de la protéine Rad18 sur l’efficacité de la chimiothérapie. En effet, la réponse à la thérapie est également contrôlée par le microenvironnement tumoral. Les modèles de culture in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs ni la difficulté pour une molécule d’atteindre les cellules cibles. Il est donc indispensable de valider notre preuve de concept dans ce contexte plus global qu’il est impossible de reproduire à l’heure actuelle in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux est maintenu au strict minimum (5 par conditions) afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

L’hébergement, l’enrichissement et la manipulation des animaux répondent à la règlementation pour le bien-être des animaux. Pour les protocoles expérimentaux, lorsque cela est nécessaire, l’animal est manipulé sous anesthésie (induction des tumeurs et traitement thérapeutique des animaux). Une grille d’évaluation de la douleur avec des points limites spécifiques du protocole est mis en place pour assurer une prise en charge adaptée de l’animale en expérimentation (perte de poids supérieure à 15% de leur masse en quelque jours, changements de comportement et des réactions de l'animal, un déficit moteur, déshydratation, entre autres).

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris transgéniques Knock-out Rad18 (rad18 -/-) de fond génétique C57bl6. L’invalidation du gène Rad18 ne donne lieu à aucun phénotype dommageable à part une stérilité partielle chez les mâles. Rad18 est surexprimé dans les cellules souches de cancer comme le glioblastome. La protéine Rad18 intervient dans les mécanismes de réparation d’ADN et de la tolérance aux lésions de l’ADN. La dérégulation de Rad18 peut avoir un potentiel oncogénique inattendu sur l’efficacité de la thérapie. Cela fait de cette lignée, un modèle pertinent pour les expérimentations de xénogreffe de lentivirus induisant des gliomes malins ayant des caractéristiques histologiques et morphologiques similaires au glioblastome multiforme de l’homme. Des souris de 8 semaines seront utilisées pour ces expériences. La prise tumorale est plus efficace chez des animaux jeunes et à ce stade du développement ces souris sont sevrées et leur âge n’affecte pas les résultats obtenus.

252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de cellules cancéreuses coliques greffées, elles reçoivent des injections et des prélèvements sanguins sous anesthésie, pour étudier le rôle des cellules Natural Killer et des macrophages dans l'effet antitumoral de la molécule H89. Le porteur indique que le développement tumoral peut entraîner perte de poids et gêne des mouvements, les souris étant mises à mort si la tumeur devient trop volumineuse ou si elles perdent plus de 20 % de leur poids. Il affirme que le modèle souris ne peut être remplacé car un système immunitaire complet est "nécessaire".

Objectifs

Ce projet de recherche a comme but celui d’étudier le rôle de certaines cellules de l’immunité innée (Natural Killer (NK) et macrophages) dans l’effet antitumoral d’un inhibiteur de kinases, le H89. Le H89 est un inhibiteur de kinases non spécifique (Davies et al., 2000), qui inhibe la protéine kinase A (PKA), mais également d’autres kinases. Cette molécule induit la mort des cellules cancéreuses coliques in vitro (Ali-Boina et al., 2013 ; Cortier et al., 2015). Nous avons préalablement montré que le H89 est capable d’inhiber la croissance tumorale dans deux modèles de cancer colorectal chez la souris. De plus, d’autres études effectuées montrent que le système immunitaire est impliqué dans l’effet antitumoral du H89. Le H89 est également capable d’induire le recrutement des cellules T effectrices dans la tumeur, en augmentant la réponse immunitaire antitumorale. Le H89 augmente l’expression du récepteur à l’IL-15, IL-15ra, indispensable dans l’activation des cellules T à activité antitumorale mais également des cellules NK. Pour cette raison nous souhaitons déterminer plus en détail le rôle de ce récepteur (IL-15ra) dans l’activité antitumorale du H89, en effectuant une expérience de blocage de son activité in vivo. Une autre étude réalisée in vivo nous montre que le H89 empêche la prise tumorale dans un modèle de cancer colorectal chez la souris Balb/c. Cela suggère que le système immunitaire inné pourrait également être impliqué dans l’effet de la molécule. Pour cela, nous envisageons de diminuer le nombre de cellules NK et les macrophages, acteurs importants de l’immunité innée, afin d’évaluer leur rôle dans la prévention de la prise tumorale observée sous l’effet du H89. Cette étude prévoit, au total, l’utilisation de 252 souris Balb/c femelles.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettrait de bien établir le lien entre la surexpression du récepteur à l’IL-15 (IL-15ra) observée dans les tumeurs de souris traitées avec H89, et l’effet antitumoral de la molécule. En effet ce récepteur est impliqué dans l’activation des cellules T CD8 effectrices, mais aussi bien des cellules NK, qui sont indispensables à l’établissement d’une réponse immunitaire afin d’éliminer la tumeur. Le rôle des cellules T dans la réponse antitumorale du H89 ainsi que la capacité du H89 à induire le recrutement des cellules T CD8 effectrices, donc des cellules immunitaires à activité antitumorale, ont déjà bien été établis. Cette expérience nous permettrait donc de bien déterminer les mécanismes impliqués dans l’effet antitumoral et du H89. De plus, la déplétion de cellules NK et des macrophages, acteurs de l’immunité innée importants dans le développement de la tumeur, nous permettrait de mieux comprendre l’effet du H89 sur l’inhibition de la prise tumorale in vivo précédemment observé.

Procédures

En plus des injections prévues dans les procédures, des prélèvements de quelques gouttes de sang (sous anesthésie) pourraient être effectués de manière occasionnelle afin de monitorer le bon déroulement de l’expérience.

Impact sur les animaux

Les molécules utilisées ne causent pas d’effets indésirables aux souris. Le H89 n’a pas d’effets secondaires, et cela a déjà bien été établi par nos études précédentes. La seule gêne que les animaux pourraient rencontrer est celle liée au développement tumoral. Cela pourrait entraîner une perte de poids, une difficulté de mouvements, même si cela reste rare. Si un de ces signes apparaît, les animaux seront mis à mort sous anesthésie quand la taille de la tumeur devient trop importante ou si la tumeur gêne les mouvements des animaux. Si la perte de poids est supérieure à 20% du poids initial ou si les animaux présentent le moindre signe de souffrance l’euthanasie sera également effectuée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure

Remplacement

Pour cette étude, nous ne pouvons pas remplacer le modèle souris. En effet, cela s’avère nécessaire car nous avons besoin d’un système immunitaire complet afin de mieux comprendre l’effet du H89 et avancer dans la recherche de nouvelles thérapies anti-cancéreuses en immunothérapie.

Réduction

Nous réduisons au minimum les animaux utilisés pour cette étude, en nous limitant au nécessaire afin d’avoir des résultats reproductibles et statistiquement fiables. Nous effectuerons des tests statistiques (two-way ANOVA) afin de vérifier la significativité des expériences effectuées.

Raffinement

Nous veillons toujours au bien-être des animaux de l’étude. Les animaux seront observés régulièrement, tous les deux à trois jours, afin de vérifier leur bien-être. L’hébergement se fera en groupes pour éviter le stress, étant la souris un animal social. Du matériel d’enrichissement permettant la construction d’un nid sera également fournie et le calme sera maintenu dans la salle d’hébergement. L’injection des cellules cancéreuses se fera sous anesthésie à l’isoflurane afin de réduire le stress des animaux. Si le moindre signe se souffrance apparaît, les animaux seront mis à mort (sous anesthésie) dans les cas suivants : 1) si le volume tumoral devient trop important 2) si les animaux perdent plus de 20% de leur poids ou si des signes montrent une douleur ou une souffrance importante (comportement/posture), 3) si les tumeurs présentent des lésions qui ne peuvent pas être traitées avec produit cicatrisant et causant une gêne aux animaux.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris Balb/c porteuses de cellules cancéreuses coliques CT26. Nous maîtrisons parfaitement ce modèle de souris qui nous permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’effet antitumoral de la molécule, ainsi que le rôle de certaines cellules de l’immunité innée. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 8 semaines. Cela permet d’avoir un système immunitaire entièrement développé et des souris assez jeunes pour garantir une réponse immunitaire efficace, que l’on ne retrouverait pas chez les animaux plus âgés.

96 souris glaneuses vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Les jeunes sont separes de leur mere aux jours 9 et 12 pour enregistrer leurs cris de separation, puis testes en champ ouvert et face a un objet nouveau aux jours 35 et 50, avant d'etre tues au jour 55 pour peser leurs organes, dont les glandes surrenales comme marqueur de stress. Le porteur reconnait que la separation maternelle peut, dans de rares cas, conduire la mere a un infanticide et que les tests repetes imposent un stress. Il affirme qu'une etude du comportement individuel ne peut se passer d'animaux, l'objectif etant de mesurer l'effet de l'age de la mere sur la personnalite de la descendance.

Objectifs

Les effets de l'âge maternel sur le développement de la personnalité de la progéniture ont rarement été étudiés dans des modèles animaux. Dans notre étude, nous visons à examiner les différences potentielles de différences individuelles cohérentes dans le comportement (c'est-à-dire les différences de « personnalité ») entre la progéniture née de mères jeunes et âgées. Ceci sera fait par le phénotypage comportemental des jeunes. Tout d'abord, pendant la période de nidification, cela se fait par des tests répétés de vocalisation de séparation, libérant généralement des fréquences variables de cris de séparation ultrasoniques chez les petits. Plus tard, après le sevrage, nous effectuons deux tests combinés, qui sont également répétés, les tests en champ libre et directement après, un nouvel objet est introduit dans l'arèneet l'exploration de l'objet par l'animal est quantifiée. Ainsi, ces deux tests servent à quantifier des différences individuelles cohérentes (différences de personnalité) dans la tendance à l'exploration. Le premier type de test a été fréquemment utilisé pour phénotyper les différences individuelles chez les jeunes mammifères, y compris chez les souris. En outre, la tendance à l'exploration, quantifiée par des tests de champs libre et des tests du nouvel objet, est un trait de personnalité clé chez de nombreuses espèces de petits mammifères.

Bénéfices attendus

Nous pourrons mettre en évidence la contribution de l'âge de la mère dans la personnalité de la progéniture, ce qui est un aspect jusqu'à présent peu exploré des caractéristiques maternelles dans ce contexte. Deuxièmement, en associant les vocalisations ultrasoniques des petits en réponse à la séparation à leur tendance à l'exploration lors des tests effectués après le sevrage, nous serons en mesure de conclure dans quelle mesure les vocalisations au cours de la vie précoce sont prédictives des différences de personnalité au cours des étapes ultérieures de la vie.

Procédures

Seules des mesures comportementales seront effectuées. Les tests suivants sont effectués sur des animaux vigiles : (1) Une séparation maternelle est effectuée les jours postnatals 9 et 12 (5 minutes chacun), c'est-à-dire pendant la période de nidification. Au cours de ce test, on quantifie la fréquence des vocalisations non ultrasoniques des animaux lorsqu'ils sont séparés de leur mère et de leurs frères et sœurs (appel de séparation). (2) Les jours postnatals 35 et 50 (5 minutes chacun), les animaux sont introduits dans une nouvelle arène et leur exploration et leur activité locomotrice sont quantifiées. Directement après ces 5 minutes de test, un nouvel objet (une boîte métallique, par exemple) est introduit dans l'arène et les réponses de l'animal (pendant les 5 minutes suivantes) à ce nouveau stimulus sont quantifiées.--- Au total, chaque individu sera soumis à 6 tests comportementaux entre les jours postnatals 9 et 50, chaque test ayant une durée de 5 minutes. -- Une fois l'expérimentation terminée, les animaux sont euthanasiés au jour postnatal 55 et seront disséqués par la suite.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux que nous utilisons peuvent être considérés comme peu ou modérément invasifs. De brèves séparations des petits de leur mère, comme cela a été fait lors du test de vocalisation de séparation aux jours 9 et 12, peuvent, dans de rares cas, conduire à un infanticide par la mère. En outre, les tests répétés aux jours 35 et 50 peuvent imposer un certain stress aux jeunes. Cependant, nous considérons que les effets négatifs d'un tel stress plutôt léger ou modéré n'affecteront pas notablement le bien-être.

Devenir

A la fin de la procédure, au jour postnatal 55, les 96 animaux expérimentaux seront euthanasiés. Ensuite, les animaux seront disséqués et nous allons mesurer et peser leurs organes. Sur la base de ces données, nous comparerons, par exemple, le poids des glandes surrénales (en tant que marqueur du stress chronique) entre les petits issus de mères âgées et de mères jeunes.

Remplacement

Les conséquences de l'âge maternel sur l'émergence de différences individuelles constantes de comportement ("différences de personnalité") ne peuvent être évaluées par d’autres moyens que ceux où l’utilisation d’animaux est requise. S’agissant d’une étude sur le comportement des individus il n’est pas possible de se passer des animaux.

Réduction

Selon notre hypothèse, la cause sous-jacente des différences potentielles de personnalité entre les descendants de mères jeunes et de mères âgées sont les effets de l'âge des mères, qui trouvent donc leur origine au niveau maternel. Ainsi, il est nécessaire de tester un nombre suffisamment élevé de mères, c'est-à-dire 12 portées de mères jeunes et 12 portées de mères âgées. Cependant, il est également nécessaire de tester plusieurs jeunes par portée afin de démêler les effets de facteurs tels que le sexe et la masse corporelle des jeunes, qui peuvent également influencer l'émergence de différences de personnalité. Ainsi, nous avons décidé de tester 4 jeunes par portée, de préférence 2 mâles et 2 femelles. Cette stratégie nous permettra également de garder les 4 frères et sœurs ensemble dans un groupe après le sevrage, ce qui est favorable du point de vue du bien-être animal. La taille d'échantillon (au total: N = 96 animaux expérimentaux) nécessaire pour obtenir des résultats fiables a été calculée par un test de puissance.

Raffinement

Des enrichissements environnementaux (matériaux de nidification, rondins à ronger) seront fournis aux animaux à tout moment, aux couples reproducteurs ainsi qu'aux jeunes après le sevrage. Après le sevrage, les animaux expérimentaux (N = 96) sont toujours gardés en groupe avec leurs frères et sœurs de la même portée, ce qui leur procure un environnement social stable. En outre, la présence de frères et sœurs apporte généralement un soutien social et contribueront ainsi à amortir les conséquences négatives du stress. Tous les transferts d'animaux d'une cage à une autre ou à un dispositif de test se feront sans manipulation directe mais par l'utilisation d'une petite boîte dans laquelle l'animal sera encouragé à entrer. Les différents tests auxquels les animaux sont soumis sont brefs (5 minutes chacun) et peu invasifs. Lorsque les jeunes sont séparés de leur mère lors des tests effectués pendant les jours postnatals 9 et 12, nous empêchons le refroidissement des jeunes par un sol chauffé à 30°C dans le cadre du test. En outre, pour éviter efficacement un éventuel infanticide de la mère lors du retour au nid, nous avons pris diverses mesures, par exemple : utilisation de gants portant uniquement l'odeur de la portée particulière, séparation courte seulement, la mère n'entendra pas les cris de séparation des petits pendant la procédure. Un point limite majeur de cette expérimentation est d'éviter l'utilisation de petits pour le test de vocalisation de séparation dont la température corporelle s'est déjà refroidie trop bas avant l'expérience. Il s'agit d'un processus réversible, qui peut se produire car certains petits, au cours de leur dynamique naturelle dans le nid, perdent parfois temporairement le contact avec leurs frères et sœurs de portée avant d'être récupérés au nid par la mère. Par conséquent, lorsque nous sortons les petits pour l'expérimentation, nous mesurons leur température de surface corporelle à l'aide d'un thermomètre infrarouge sans contact. Seuls les petits dont la température de surface corporelle est supérieure à 34°C sont utilisés. Si la température de surface corporelle du petit choisi est trop basse, il est ramené au nid et peut être testé après 1-2 heure, lorsqu'il s'est remis de son épisode de basse température. Les tests comportementaux aux jours postnataux 35 et 50 donnent généralement aux animaux la possibilité d'adopter une solution comportementale qui leur convient.

Choix des espèces

La souris glaneuse a, dans des conditions naturelles, une durée de vie très courte. Seuls les juvéniles nés pendant les mois d'été survivent à l'hiver. Pour cette raison, le schéma suivant se dessine : (1) Au printemps, toutes les femelles qui se reproduisent sont primipares mais sont les vieilles femelles (environ 7-8 mois) nées au cours de l'année précédente. (2) Plus tard au cours de la saison de reproduction, les mères sont principalement nées au cours de la même année (=des mères plus jeunes). Il existe des différences distinctes dans l'âge maternel au printemps et en été chez cette espèce. Notre projet utilise ce phénomène intéressant de l'histoire de vie de cette espèce, et explorera dans une étude en laboratoire si les différences d'âge maternel conduisent à des différences de personnalité chez la progéniture. Nous quantifierons la vocalisation des jeunes pendant la période de pré-sevrage, vers les jours 9 et 12. À cet âge, les petits émettent des cris de séparation ultrasoniques lorsqu'ils sont séparés de leur mère et de leurs frères et sœurs. Plus tard, à l'âge de 35 et 50 jours (stade juvénile, avant la maturité), nous testerons la tendance à l'exploration des animaux dans une arène ouverte et lorsqu'ils sont confrontés à un nouvel objet. Des études précédentes ont montré que tester les animaux à ces jours est approprié, car ils sont généralement très motivés pour explorer l'arène de test.

80 souris modeles de la trisomie 21 vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal est gave quotidiennement pendant dix-sept jours avec une molecule a visee therapeutique ou sa forme inactive, subit un poincon d'oreille pour le genotypage, passe des tests de memoire spatiale et de reconnaissance d'objets, puis est tue pour doser l'effet du compose dans le cerveau. Le porteur indique que les gavages repetes peuvent devenir douloureux et espere une amelioration des performances cognitives du modele. Il affirme que l'etude de ces deficiences intellectuelles d'origine genetique passe par un organisme vivant proche de l'homme, sans autre methode possible.

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) aussi appelé Trisomie 21 (T21), est dû à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observées dans la T21. Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la T21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. Des collaborateurs proposent de tester 1 nouveau composé (et 1 composé non fonctionnel, utilisé comme contrôle négatif) pour leur propriété à améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons déterminer si ce composé sera efficace en terme de restauration des fonctions intellectuelles. En parallèle, le composé non fonctionnel devrait avoir aucun effet. Ces composés ont été synthétisés et testés pour l’ADME (Administration, Distribution, Métabolisation et Excrétion) pharmacologique, par nos collaborateurs. Ces composés seront ainsi administrés par notre équipe à des souris modèles de T21. Les souris traitées feront l’objet de différents tests comportementaux afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir une amélioration significative des performances cognitives (notamment dans 2 types de mémoires : mémoire de reconnaissance spatiale et mémoire explicite de reconnaissance d'objets) dans un modèle murin de trisomie 21, qui montre de faibles performances dans ces 2 tests. Cette amélioration sera caractérisée également par un dosage de l'activité de phosphorilation de Dyrk1a, activité qui devrait être diminuée par l'effet du composé testé. Les animaux traités avec la forme non active du composé devraient présenter les mêmes déficits que les individus contrôles sauvages non traités.

Procédures

Les animaux seront gavés quotidiennement avec des molécules à visée thérapeutique pour une durée maximale de 17 jours. Le temps du gavage est de 20 à 30 secondes maximum. Pour le genotypage des animaux, un poinçon d’oreille sera effectué, conjointement à la pose d'une bague d'identification . Ce geste est rapide et ne prend que quelques secondes

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules per os. Une douleur peut apparaitre à cause de la répétition des gavages, au maximum 17 jours au total, soit 1 par jour. Stress léger et rapide dû à la pose de bague et prélèvement d'une biopsie d'oreille.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des 17 jours de traitement. Les cerveaux seront prélevés pour réaliser un dosage de l'effet des molécules à visée thérapeutique.

Remplacement

L’utilisation de la souris dans cette étude est justifiée par le fait que les anomalies à observer (altération des capacités d’apprentissage et déficit de la mémoire) nécessitent un modèle vivant et suffisamment proche de l’homme pour pouvoir être transposé.

Réduction

Pour ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisés à partir de 3 mois, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons le composé sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. L'étude nécessitera 5 groupes de 16 animaux (8 femelles et 8 mâles), soit 80 souris au total. 13 animaux par groupe sont nécessaires pour avoir une puissance statistique suffisante. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne répondront pas, c'est pourquoi nous testerons 3 animaux de plus dans chaque groupe.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi quotidien à partir du début de leur traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Et dans le cas où les animaux présenteraient des signes de souffrance, de mal-être, ou de douleur, ils seront exclus des analyses et soignés ou euthanasiés selon leur état. Pour la manipulation des animaux, et afin de limiter le stress, nous utiliserons des tubes de manipulation, ce qui évite de les prendre par la queue. Les tubes seront laissés dans les cages d'élevage comme enrichissement du milieu. Les animaux seront élevés par groupe de 2 animaux minimum pour éviter l'isolement.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement. En outre, le génome de la souris étant manipulable, il permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du syndrome de Down. Les souris seront étudiées à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 3 mois, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présents.

578 souris immunodeprimees vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une greffe de cellules de glioblastome humain dans le cerveau par ouverture du crane, puis des seances hebdomadaires d'imagerie sous anesthesie et des instillations nasales de candidats-medicaments, une moitie etant en plus irradiee, avant d'etre tuee pour analyser la progression tumorale. Le porteur decrit surtout le stress lie aux anesthesies repetees et prevoit une mise a mort des qu'un point limite de degradation est atteint. Il affirme qu'aucune alternative n'existe, les organoides cerebraux ne reproduisant pas selon lui la complexite du microenvironnement tumoral.

Objectifs

Avec plus de 3000 nouveaux cas par an en France, les récidives de gliomes de bas grade ainsi que les glioblastomes sont des tumeurs cérébrales avec un mauvais pronostic et pour lesquelles les traitements sont lourds mais peu efficaces. Néanmoins, la chirurgie en association à la radiothérapie et la chimiothérapie permet de prolonger de quelques mois la survie. En effet, la survie des patients après diagnostic n’excède pas 2 ans y compris après un traitement. Dans des études in vitro, nous avons sélectionné de nouvelles molécules qui en association avec la radiothérapie réduisent la croissance des cellules tumorales. Nous proposons de tester ces nouvelles molécules dans un modèle préclinique. La transplantation intracérébrale de cellules issues de gliomes humains chez des souris est le modèle de choix pour tester l’efficacité d’approches pharmacologiques en combinaison avec la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Cette étude préclinique permettra d’évaluer l’efficacité in vivo de molécules pour réduire la croissance de cellules de gliomes. Ce travail pourra servir de référence pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques du cancer du cerveau le plus fréquent chez l’Humain adulte.

Procédures

L’opération de xénogreffe comporte 4 étapes : injection d’un antalgique, une anesthésie, ouverture minime de la boîte crânienne et injection de cellules issues de gliomes humains dans le cerveau de l’animal, pour une durée totale de l’opération de moins de 20 min par souris. L’imagerie par bioluminescence sera réalisée de façon hebdomadaire durant 5-9 semaines. Cette mesure nécessite une anesthésie gazeuse de l’animal pour 15-20 min et l’administration intrapéritonéale d’un composé. Deux mois après la greffe, les candidats-médicaments seront administrés par instillation nasale sous anesthésie légère à raison de 5 fois par semaine et pour 1 ou 3 semaines selon la procédure. L’administration est réalisée sous anesthésie gazeuse et dure moins de 5 min. Les jours de mesure de bioluminescence, l’administration sera réalisée au cours de la même anesthésie. La moitié des animaux sera exposée à une radiothérapie sous anesthésie gazeuse pour une durée de 20-30 min.

Impact sur les animaux

La nuisance majeure attendue de cette expérimentation concerne le stress provoqué par les anesthésies gazeuses répétées (opération de transplantation, instillations nasales). L’opération de transplantation est un acte chirurgical qui représente des effets indésirables mais celui-ci est bien maîtrisé et les animaux se rétablissent rapidement après l’opération. L’instillation nasale d’un petit volume d’une solution saline est une méthode non-invasive permettant l’administration de petites molécules qui vont diffuser dans le cerveau. Le stress lié à cette approche réside dans les anesthésies répétées, la contention et l’obstruction momentanée d’une narine. La radiothérapie requiert une anesthésie générale afin d’immobiliser l’animal mais l’exposition à l’irradiation ne génère pas de souffrance et la dose utilisée n’engendre pas d’effets néfastes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever le cerveau afin de réaliser des analyses histologiques et d’évaluer l’effets des composés pharmacologiques sur la progression tumorale.

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune alternative à l’utilisation d’animaux pour l’étude du glioblastome, particulièrement en raison du microenvironnement tumoral qui joue un rôle défavorable et ne peut être reproduit dans un système in vitro. Des cultures d’organoïdes cérébraux sont en cours de développement mais ce modèle expérimental, dépourvu de certains types cellulaires impliqués dans la croissance tumorale, ne représente pas à ce jour toute la complexité du modèle in vivo.

Réduction

Dans ce projet, deux candidats-médicament seront évalués dont l’un d’entre eux est connu pour ne pas présenter d’effet indésirable in vivo. Des essais de non-toxicité pour la deuxième molécule seront réalisés au préalable et en cas d’effets cliniques néfastes, son utilisation sera interrompue ; l’étude sera limitée à la première molécule. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été défini en fonction de la littérature et notre expérience sur la variabilité des expériences de transplantation. Plusieurs types de cellules de glioblastomes représentant différentes caractéristiques des glioblastomes sont inclues dans cette étude. Les expérimentations seront réalisées indépendamment pour chacun des types de cellules de glioblastome et de façon séquentielle si bien qu’en cas d’évolution tumorale défavorable le protocole pourra être interrompu plus précocement et éviter l’utilisation de tous les groupes d’animaux.

Raffinement

Afin de protéger d’une éventuelle contamination par l’environnement, ces animaux immuno-déficients seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes dans des cages avec un système de ventilation contrôlée. Mise en place d’un protocole d’anesthésie/analgésie. Mise en place d’un suivi clinique régulier avec l’aide d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Des critères de point limite ont été établis et leur expression justifiera l’interruption de l’expérience et la mise à mort de l’animal pour lui éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La greffe de cellules humaines sera réalisée sur des animaux immunodéprimés pour éviter tout rejet. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris présentant un thymus rudimentaire, connu pour supporter la transplantation et la croissance de cellules de gliomes humains dans leur cerveau. Par ailleurs, ce modèle de souris présente une faible radiosensibilité et permet l’étude de la radiothérapie contrairement à d’autres modèles de souris immunodéficientes. Le gliome est une tumeur cérébrale fréquente chez l’adulte qui affecte sans distinction les mâles et les femelles. Nous utiliserons donc des animaux adultes mâles et femelles.