Oncologie

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés seuls pendant huit à dix-sept jours, reçoivent des repas enrichis en tannins pour simuler une mauvaise assimilation des protéines, passent sept heures en cage métabolique, puis sont tués par ponction cardiaque sous anesthésie pour prélever le contenu de leur tube digestif. L'objectif est de mettre au point un test peu invasif qui pourrait ensuite être adapté à l'être humain, notamment aux enfants souffrant de malabsorption, le porteur renvoyant cette application au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe aucun modèle in vitro capable de reproduire une malabsorption protéique.

Objectifs

La capacité d’assimilation des protéines alimentaires par l’organisme est un des déterminants de la satisfaction du besoin protéique de l’être humain, notamment pour les populations vulnérables. Dans les pays en voie de développement, un apport protéique satisfaisant en quantité et en qualité n’est souvent pas assuré, ce qui entraîne des retards de croissance chez l’enfant. Les affections intestinales liées à l’environnement, dont les affections parasitaires, peuvent détériorer l’assimilation des protéines et donc aggraver l’insuffisance d’apports en protéines. L’objectif global du projet est d’évaluer l’efficacité de suppléments protéiques chez les enfants atteints de ces affections, et pour cela, il faut développer des tests peu ou pas invasifs pour rendre compte d’une amélioration de l’absorption intestinale. Pour cela, nous mettons en œuvre une étude sur rongeurs. Nous faisons varier la digestion des protéines grâce à l’ajout de tannins dans l’aliment. En effet, les tannins, présents dans des produits végétaux, perturbent la digestion des protéines, ce qui permet de mimer une malabsorption protéique. Par ailleurs, nous incorporons des traceurs de la protéine dans le repas, suivis dans l’air expiré et dans les urines. Grâce à ces données ainsi que les analyses effectuées sur les organes et le sang, nous testerons l’hypothèse qu’une baisse de la digestibilité des protéines induite par les tannins va se traduire par une baisse de l’apparition des traceurs dans le sang et l’urine. Si le test s’avère concluant, il pourra être développé chez l’humain, en comparant des individus sains ou atteints de pathologies qui détériorent l’assimilation des protéines.

Bénéfices attendus

Les données obtenues permettront d’évaluer si ce test est sensible à une perte de digestibilité des protéines. Si c’est le cas, il pourrait être adapté chez l’être humain pour révéler des situations de malabsorption protéique liée à des dysfonctions du tube gastrointestinal, dont la dysfonction entérique environnementale qui est susceptible d’altérer l’assimilation protéique.

Procédures

→ Les animaux seront hébergés en cage individuelle en permanence (pendant une durée de 8 à 17 jours selon le jour du test métabolique) . Ils auront un régime alimentaire standard et des petits repas test le matin, dans lequel des tannins sont incorporés (afin de diminuer la digestion des protéines de ce repas). Lors de l’exploration métabolique , ils seront placés dans une cage individuelle cylindrique pour mesurer les échanges respiratoires pendant 7 heures . Le jour de la mise à mort, les rats reçoivent 10 minutes avant le prélèvement sanguin, une injection intra péritonéale de xylazine (10mg/kg), puis ils sont anesthésiés par l’isoflurane (masque) et analgésiés localement par administration sous-cutanée au point d’incision (lidocaïne). Nous réalisons une ponction cardiaque pour prélever du sang. Les rats sont euthanasiés par injection intrapéritonéale d’Exagon (180mg/kg).

Impact sur les animaux

Il sera nécessaire d’héberger les animaux en cages individuelles car nous devons contrôler leur prise alimentaire et les habituer à l’ingestion d’un repas-test. Le jour du test, le rat sera placé dans une cage métabolique individuelle (une cage spécifique pour mesurer les échanges gazeux) différente de sa cage habituelle, ce qui peut générer un stress modéré. L’introduction des repas tests contenant des tannins peut perturber la motivation des rats à consommer leur repas. Bien que peu probable au regard de la dose administrée, les tannins pourraient provoquer des perturbations intestinales, type diarrhée.

Devenir

Les 48 rats seront euthanasiés afin de collecter les contenus des différents segments du tube digestif et mesurer la digestibilité des protéines.

Remplacement

A l’heure actuelle il n’existe pas de modèle in vitro permettant de mimer une malabsorption protéique qui pourrait être détectée dans les produits de dégradation finaux

Réduction

Les résultats pour chaque groupe d’animaux seront comparés entre eux en utilisant une analyse de la variance. A partir des données déjà publiées sur le sujet et dans des conditions expérimentales comparables, le nombre minimum d’animaux requis pour atteindre une puissance statistique suffisante est de 8 par groupe.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles seront enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque ainsi que des billes. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Les animaux seront regroupés lors des pesées et des prises alimentaires pour faciliter leur interaction, dans des cages avec des tunnels suspendus. Si une perte de poids de plus de 20% par rapport au poids de la dernière pesée, sans cause apparente et sans récupération, des diarrhées sans cause apparente ou des difficultés à uriner ou une modification de l’aspect des urines sont détectées grâce au suivi rapproché de chaque animal, il sera sorti du protocole expérimental et euthanasié si son état de santé ne s’améliore pas rapidement. A certaines étapes de la procédure, un traitement peut être envisagé (anti-inflammatoires gastro-intestinaux, etc., en conformité avec la posologie et voie d’administration indiquée par le référent vétérinaire). L e jour de la mise à mort, les rats reçoivent une injection intra péritonéale 10 minutes avant le prélèvement sanguin, puis une analgésie est pratiquée sous la peau au point d’incision. Nous réalisons une ponction cardiaque pour prélever du sang. Les rats sont euthanasiés par injection intrapéritonéale d’un produit léthal.

Choix des espèces

Le régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. De plus, le rat est une espèce de référence pour les études nutritionnelles quel que soit le stade de développement, ici le jeune rat post-pubère.

4080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un régime obésogène, des mises à jeun, un hébergement individuel de 48 heures, des gavages et des prélèvements de sang répétés à la queue, avant d'être tué pour prélever tissus et organes. Le porteur classe ces actes de léger à modéré tout en reconnaissant que le régime peut gêner les déplacements et que l'isolement génère du stress. Il présente le projet comme une meilleure compréhension des maladies métaboliques liées au vieillissement et à l'obésité, les perspectives médicales restant à venir.

Objectifs

L’inflexibilité métabolique, commune à l'obésité et au vieillissement, est associée à la progression du diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires représentant la première cause de mortalité dans le monde. Ces pathologies résulteraient d’un défaut de gestion des lipides par le tissu adipeux mais les mécanismes impliqués sont encore mal compris. Les travaux de la littérature soutiennent l'hypothèse selon laquelle les cellules endothéliales vasculaires des tissus adipeux jouent un rôle central via leur capacité de gestion des flux lipidiques en fonction de l'état énergétique et que l’altération de cette fonction serait un événement précoce de l’altération de l’homéostasie lipidique systémique. Nous étudierons la contribution de signalisations cellulaires propres aux cellules vasculaires. Notre objectif est d’identifier des mécanismes propres aux cellules endothéliales vasculaires du tissu adipeux et d’évaluer l’impact de la modulation de leur phénotype sur l’expansion, la fonctionnalité du tissu adipeux et sur la progression des pathologies associées au vieillissement naturel et accéléré par l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir la contribution des altérations du système vasculaire dans la genèse des maladies métaboliques et cardiovasculaires associées au vieillissement naturel et accéléré par l’obésité et ce, en tenant compte du sexe. En particulier la complétion de ces travaux ouvrira de nouvelles perspectives médicales personnalisées pour diagnostiquer et traiter les individus à risque de développer un diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires associées.

Procédures

Les animaux seront soumis à des interventions de classes légère à modérée. -Prélèvements d’une goutte de sang à la veine caudale : maximum 1 fois 8 prélèvements espacés de 15 à 30 minutes (2 secondes par prélèvement) -Prélèvement de sang à la veine caudale par capillaire : maximum 4 fois sur 24 heures (15-30 secondes par prélèvement) -Gavage : maximum 1 fois par animal (10 secondes) -Mise à jeun : maximum 1 fois pour 12 heures effective (phase active) -Hébergement individuel : maximum 1 fois pendant 48 heures

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisées dans ce projet sont peu invasives indolores (pesée, régime riche en lipides, jeûne) ou de classe légère et modérée (test de tolérance au glucose, gavage, placement en environnement nouveau et seul pendant 48h pour la calorimétrie par exemple, mesure de la composition corporelle). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : - Régime obésogène peut induire une prise de poids pouvant gêner les déplacements - Hébergement individuel de 48h peut générer du stress - L’analyse de la composition corporelle peut générer un stress pendant le maintien immobile dans la cage de lecture (90 secondes) - Gavage peut générer du stress et inconfort durant la procédure (quelques secondes) - Prélèvement à la veine caudale peut générer du stress et une douleur légère - Mise à jeun peut entrainer du stress

Devenir

Les procédures d’études phénotypiques et métaboliques (Calorimétrie indirecte, Composition corporelle, Tolérance au glucose) sont des mesures faites sur l’animal au cours de la procédure de régime obésogène. Les animaux seront alors remis dans leur cage d’origine et seront soit euthanasiés à la fin du temps de régime défini afin de prélever les tissus et organes pour les analyses histologiques et cellulaire des tissus, soit étudiés lors des procédures terminales d’adaptation au jeûne/réalimentation ou challenge lipidique aigue. Au terme de ces procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus et fluides pour des études multi-omiques permettant de répondre aux questions scientifiques énoncées.

Remplacement

L’utilisation du modèle murin nous permettra d’identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le système vasculaire qui surviennent avec le régime alimentaire, la prise de poids et le vieillissement. Les prélèvements humains représentent un point fixe de l’état individuel et ne permettent pas de contrôler l’historique de perte et/ou gain de poids. Aucun système de culture cellulaire n’a pu reproduire les variations circadiennes des apports en lipides qu’auront à subir les cellules endothéliales chez des souris alternant des phases d’apport nutritif et de repos. Notre objectif est d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en place avant l’apparition des désordres métaboliques et cardiovasculaires.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, plusieurs procédures expérimentales de classe légère puis modérée seront réalisées sur les mêmes groupes d’animaux dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général et dans la mesure où les procédures ne peuvent pas interférer entre elles.

Raffinement

Lors de leur arrivée en zone expérimentale les souris sont placées en salle d’acclimatation et y resteront pendant 1 semaine en présence de ouate pour réduire le stress qui pourrait être causé par le transport. Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge par le personnel de la zootechnie compétent qui vérifiera leur état et bien-être. Les animaux issus de différentes cages de transport ne sont jamais mélangés dans les cages d’hébergement. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance : dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessous, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement par les zootechniciens et par les expérimentateurs du projet. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié par dislocation cervicale. Observation quotidienne pendant la durée de la procédure. Dans nos connaissances actuelles, les procédures ne doivent pas modifier le comportement général des animaux ni altérer leur bien-être, même si les animaux sont gardés jusqu’à un âge avancé.

Choix des espèces

La souris de fond C57BL6/J est un modèle reconnu dans l’étude du métabolisme et de l’obésité. Nourrie en alimentation riche en gras, elle développe des anomalies similaires à celles associées au syndrome métabolique chez l’Homme. Animaux âgés de 8 semaines et 12 mois en début de protocole. Nous souhaitons utiliser des animaux à maturité et nous affranchir de la phase exponentielle de croissance. L’utilisation de 2 tranches d’âge (8 semaines et 12 mois + 1, 4, 12 semaines) nous permettra d’évaluer si l’adaptation vasculaire peut avoir des effets variables en fonction de l’âge.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal, immunodéficient, reçoit une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire puis des injections péritumorales et péritonéales répétées et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire, avant d'être tué pour prélever tumeur et rate. Le porteur indique que la pousse tumorale et les injections répétées peuvent provoquer nécrose, œdème et douleurs. Il présente l'activation des cellules NK comme une "piste thérapeutique intéressante" contre le cancer, les retombées restant conditionnelles.

Objectifs

Le cancer est un problème majeur de santé publique etant la première cause de décès en france. Il est maintenant avéré que le système immunitaire est capable de reconnaitre et d’éliminer les cellules tumorales. Cependant, certaines tumeurs mettent en place des mecanismes de resistance afin d'échapper à cette surveillance du système immunitaire. L'avancée de ces connaissances ont permis le développement de nouvelles thérapies très efficaces pouvant réactiver le système immunitaire et ainsi éliminer les cellules tumorales. Toutefois,ce type de thérapie ne fonctionne pas chez de nombreux patients, c'est pour cela qu'il est necessaire d'identifier de nouvelles voies thérapeutiques activant d'une autre manière le système immunitaire. Parmis les cellules immunitaires, les cellules naturelles tueuses (cellules NK) jouent un rôle majeur dans la réponse anti-tumorale. mais leur activité est souvent altérée. Ainsi, l’identification de molécules capables d’activer les fonctions anti-tumorales des cellules NK représentent une piste thérapeutique intéressante.

Bénéfices attendus

Les cellules NK font partie de la première ligne de défense contre le développement de tumeurs. Ainsi, l’identification de molécules capables d’activer leurs fonctions anti-tumorales représente une piste thérapeutique intéressante. Nous pensons que cette étude devrait déboucher sur l’identification d’un nouveau mécanisme de surveillance immunitaire et potentiellement d’une nouvelle cible thérapeutique permettant de moduler positivement l’immunité dans les cancers.

Procédures

Rasage des souris sur le flanc sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (1x5min/souris) - Injection de cellules tumorales en position intra mammaire sur le flanc des souris sous anesthésie gazeuse (1x4min/souris) - Injection péri-tumorale de molécules (14x30sec/souris) - Injection intrapéritonéale (4x20sec souris) - Prélèvement de 100µl de sang au niveau du sinus retro-orbitaire sous anesthésie locale et gazeuse (3x5min /souris)

Impact sur les animaux

Souris Immunodeficiente = Possible infections pouvant entrainer l'apparition de maladie Injection de cellules tumorales et pousse tumorale = piqure/necrose de la tumeur pouvant entrainer des douleurs chez l'animal Injections répétées = piqure/oedeme/infection pouvant entrainer des douleurs chez l'animal Multliple contentions et anesthésie gazeuse pouvent engendrer un stress répété chez l'animal. Prélèvement de sang au niveau du sinus retro-orbitaire peuvent entrainer des douleur chez l'animal.

Devenir

A l'issu de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et des organes (tumeur, rate) seront prélevès pour des analyses en laboratoire

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo afin de determiner un nouvel axe thérapeutique impliquant des cellules du système immunitaire dans le traitement du cancer du sein. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie, en particulier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement immunitaire, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 10 souris par groupe. Chaque procédure expérimentale sera réalisée en 2 expériences indépendantes, avec dans un premier temps 5 souris par groupe. Ainsi, la deuxième expérience ne sera réalisée uniquement si la première montre des résultats encourageants. De plus chaque procédure sera réalisée uniquement si la procédure précédente à montré les résultats attendus validant notre hypothèse. Il n’y a pas de double emploi des souris.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus, un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (2 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé en cas de douleur et angoisse de l'animal. Par ailleurs, de la litière en cellulose sera également utilisée pour les souris porteuses de tumeur afin de diminuer l'inconfort lié au frottement.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation in vivo chez la souris est justifié par l’existence de la ligné tumorale et des réactifs qui à notre connaissance n’ont pas été développés dans d’autres modèles pré-cliniques. De plus, notre laboratoire a développé une expertise unique dans l'analyse du système immunitaire et du cancer chez la souris, et a tous les réactifs nécessaires à disposition. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 semaines.

54 chèvres en lactation vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour être réutilisées dans une épreuve inflammatoire ultérieure. Chaque animal subit une diète de 48 heures suivie de prises de sang répétées, avec dosages sanguins et laitiers, pour caractériser la réponse métabolique du ruminant laitier. Le porteur affirme que ces modifications biologiques "ne peuvent être étudiées qu'in vivo". Il précise que les chèvres sont habituées aux prélèvements, la mise à mort n'étant prévue qu'en cas de non-récupération de leur santé.

Objectifs

Les changements climatiques impactent les animaux ainsi que les fourrages (Qualité et quantité), l’établissement utilisateur possède des lignes sélectionnées pour leur longévité et résilience au niveau phénotypique. Dans cette saisine nous soumettons les animaux à une épreuve alimentaire qui consiste à substituer une ration standard (foin + concentré) par de la paille pendant 48h. Cette épreuve vise à mimer ce que des chèvres d’élevage pourraient rencontrer à l’avenir Ce changement de régime alimentaire va induire des changements métaboliques au niveau de l’animal, induire un stress transitoire. Les animaux vont mobiliser des réserves. Par cette épreuve alimentaire, nous allons réaliser des prises de sang et de lait préalable à l’épreuve, au cours de l’épreuve et suite à l’épreuve. L’objectif de ces prélèvements est d’identifier des marqueurs biologiques dont la présence serait significative pour identifier des animaux mieux adaptés et plus résilient au sein d’une population. En effet nous souhaitons identifier au sein de nos 54 chèvres qui ont un phénotype longévité plus (LGV+) ou longévité moins (LGV-) des individus ayant montré une meilleur réaction à l’épreuve (perte de poids moindre, diminution de la production laitière moindre, perte d’état corporel moindre) et qui au niveau sanguin et lait contiendrait des marqueurs biologiques d’interet par rapport aux autres. L’objectif est d’identifier ces marqueurs biologiques, de chercher ensuite au niveau génétique des différences. Pour in fine, utiliser ces différences génétiques et phénotypiques en sélection pour les agriculteurs de demain

Bénéfices attendus

A court terme, le projet doit permettre de vérifier que des dosages de certains métabolites du sang (N=7) et du lait (N=13) peuvent prédire la résilience des chèvres à un stress d’origine alimentaire. Ces dosages pourront ensuite être utilisés par les éleveurs pour piloter les pratiques d’élevage (nutrition, soins) et par les organismes de sélection pour améliorer la résilience génétique des chèvres

Procédures

Les animaux sont soumis à des prises de sang en amont de l'épreuve alimentaire (n=5) de 9ml autour de la mise bas sur l'intervalle J-27 à J+14, de prise de sang (n=13) durant l'épreuve alimentaire de J-7 à J+9 et de 3 prises de sang après épreuve alimentaire (en avril, aout et Octobre). Deux prises de sang additionnelles (10 ml) seront nécessaires pour le génotypage des animaux et le dosage de Glycoproteines associé à la reproduction (Pregnancy Associated Glycoprotein= PAG). Soit un volume de sang prélevé inférieur à 140 ml correspondant à moins de 2% du volume total de l'animal sur une période de 15 jours. La prise de sang est effectuée en moins d'une minute et le nombre de prise de sang est de 23 . Les animaux sont soumis à un changement alimentaire de 2 jours (diète à base de paille) avec un retour progressif de l'alimentation contrôle.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous réalisons des prises de sang. Les chèvres peuvent éprouver un stress léger lors des contentions nécessaires pour les prises de sang. Une nuisance éventuelle serait l'apparition d'hématome suite aux prises de sang effectuées. Par ailleurs, nous proposons dans ce projet une épreuve nutritionnelle transitoire correspondant à une diète de 48h. Les chèvres feront l’objet d’une surveillance journalière pendant toute la durée de la diète et du retour à une alimentation normale (J-7 à J9 ; 15 jours), au moins 2 fois par jour au moment de la traite, et dans leur lot d’élevage, afin de veiller au bien-être des animaux. En cas de manifestation simultanée de plusieurs signes cliniques (animal prostré, isolé, respirant vite, ayant une forte température >41.5°C pendant plus de 2 heures, anorexique) une intervention vétérinaire aura lieu et l’animal sera sorti du protocole si nécessaire. D’après la bibliographie, nous attendons des réductions de poids de 8% en moyenne pendant la période de restriction alimentaire. A ces pertes moyennes, peuvent s’additionner des variations individuelles parfois importantes (écart type = 4.3% ; variations observées entre -1% et -19% ; données personnelle) mais dans tous les cas, toutes les chèvres avaient récupéré 90% de leur poids initial dès 2 jours après la reprise alimentaire. Des pesées et l’évaluation de l’état corporel seront réalisées tous les jours sur la période d’épreuve alimentaire (J- 7 à J9 ; 15 jours). Une perte de poids >15% s’accompagnera d’un retrait immédiat de l’animal du protocole, et celui-ci intégrera l’alimentation contrôle de façon anticipée

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. Aucune mise à mort n’est prévue, car les chèvres auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Dans le cas, peu probable, d’atteinte des points limites, les animaux concernés seront sorties du protocole et soignés . Dans le cas de non recouvrement de leur santé, la mise à mort sera opérée par le veterinaire sanitaire soit en urgence par un opérateur expérimentés et habilités de la structure. Les animaux sont prévus d'être réutilisés pour une épreuve inflamatoire au minimum 1 mois après l'epreuve alimentaire et selon l’avis de la vétérinaire SBEA.

Remplacement

La réponse suite à la diète nutritionnelle du ruminant laitier implique des modifications biologiques complexes, qui incluent également leur impact sur la production de lait et le métabolisme énergétique qui nous intéressent ici et qui donc ne peuvent être étudiés qu’in vivo

Réduction

Nous demandons une nouvelle saisine pour 54 chèvres. Ces 54 chèvres étaient prévues dans une precedente saisine mais du fait du covid et de changements sur l'etablissement utilisateur , cela n’a pu avoir lieu et nous n’avons pas utilisé ces 54 animaux dans la précédente saisine (autorisant 100 chèvres au total). Cet effectif de 100 se justifie comme suit. Nous voulons observer des différences entre 0.5 et 1 x l’écart type de la valeur du dosage de métabolite. Il s’agit de 7 variables pour des dosages sanguins et 13 variables pour des dosages de lait. Ceci implique que nous ayons entre16 et 63 animaux par groupe (2 lignées LGV+ et LGV-), soit un total de 32 à 126 chèvres. Au vu des possibilités expérimentales nous avons donc proposé d’évaluer 100 chèvres au total sur 2 années. Les analyses statistiques des métabolites s’appuieront sur des analyses de variance, intégrant les effets de l’année (100 chèvres sur 2 années), du jour de mesure et de la lignée. Des classifications non supervisées seront également conduites (ACP, clustering hiérarchique) pour identifier des types de réponse différents, indépendamment de l’appartenance aux lignées.

Raffinement

Les chèvres seront hébergées en groupe, sur une litière paillée. Le milieu sera enrichi avec des brosses et des plateformes en bois. Elles seront nourries à volonté (hors diète de 48h et retour progressif +24h à la ration normale). Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être manipulés. Les prélèvements seront réalisés alternativement à gauche et droite du cou pour ne pas sensibiliser la zone de ponction. Un baume décongestionnant, antiseptique et cicatrisant sera appliqué, en massage sur les veines, en cas de besoin. Un apprentissage aux prises de sang sera mis en place avant la période où la fréquence des ces prélèvements sera élevée, soit durant le mois précédent la diète. Les chèvres feront l’objet d’une surveillance journalière pendant la durée de la diète (48h) et pendant les 7 jours suivants. Des points de limites ont été mis en place -hyperthermie >41,5 °C pendant plus de 2 heures -décubitus sternal -anorexie Un animal presentant 2 des signes suivants sera traité et écarté de l’essai et placé sous surveillance jusqu’à son rétablissement complet. Par ailleurs une perte de poids >15% s’accompagnera d’un retrait immédiat de l’animal du protocole, et celui-ci intégrera l’alimentation contrôle de façon anticipée.

Choix des espèces

L’espèce caprine est l’espèce cible. La physiologie et la réponse métabolique des ruminants sont particulières à ces especes. Nous utilisons des chèvres primipares non gestantes en lactation, afin d’évaluer la réponse à une épreuve nutritionnelle (diete de 48h) mais également l’impact de l’épreuve sur la production de lait et le métabolisme énergétique en phase productive.

300 rongeurs, 200 souris et 100 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce sont des animaux sains, soumis à des examens d'IRM sous anesthésie pouvant durer jusqu'à trois heures avec injection d'un agent de contraste, uniquement pour mettre au point des séquences d'imagerie. Le porteur indique que l'anesthésie provoque hypothermie, dépression respiratoire et cardiovasculaire, et présente pourtant l'IRM comme "en parfaite adéquation avec les 3R". Ces animaux sains sont tués à l'issue, jugés non réutilisables du fait de leur âge et des anesthésies répétées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre au point, optimiser et développer de nouvelles méthodes d’imagerie par résonance magnétique (IRM) afin d'offrir le plus grand panel d'outil pour la caractérisation, la recherche de biomarqueurs de pathologies. L’IRM, technique d’imagerie biomédicale en perpétuelle évolution, est extrêmement attractive pour les études précliniques et cliniques. Elle est non invasive et non irradiante en parfaite adéquation avec les 3Rs. Elle permet : 1) de remplacer l’utilisation de techniques plus invasives pour l’obtention d’information similaire ; 2) d’avoir des informations anatomo-fonctionnelles complémentaires et/ou inaccessibles par d’autres techniques dans des conditions de bien-être animal sans comparaison. Ces nouvelles informations peuvent être intégrées dans une étude pour la raffiner comme nouveau critère d’inclusion ou d’exclusion. Cela permet d’obtenir une meilleure qualité des résultats qui n’auront pas besoins d’être répétés, réduisant ainsi le nombre d’animaux; 3) un suivi longitudinal individuel des modifications anatomo-fonctionnelles permettant ainsi de réduire très significativement le nombre d’animaux nécessaires ; 4) d’avoir accès à des informations déjà utilisées chez l’homme quotidiennement dans les services hospitaliers, permettant de développer des projets de recherche translationnelle.

Bénéfices attendus

L’IRM est une technique d’imagerie biomédicale non-invasive et non irradiante largement utilisée chez l’Homme. Son utilisation dans les projets précliniques permet de remplacer des techniques plus invasives, de réduire le nombre d’animaux avec des suivis longitudinaux, de raffiner en donnant accès à de nouveaux points limites précoces.

Procédures

Examen IRM sous anesthésie d'une durée maximum de 3h. Injection d'agent de contraste sous anesthésie (durée du geste 1 min max.).

Impact sur les animaux

L’anesthésie entraîne une hypothermie, une dépression respiratoire et cardiovasculaire.

Devenir

Dans la mesure du possible, afin de respecter la règle des 3Rs, les animaux de ce projet seront des animaux sains de réforme non au-préalable utilisés dans un autre projet. Ne pouvant pas être réutilisés au-delà de ce projet du fait souvent de leur âge (animaux de réforme), la répétition de l'anesthésie et surtout la présence d'agent de contraste, ils seront mis à mort à l'issue des procédures.

Remplacement

Des objets tests seront utilisés autant que possible pour limiter l’utilisation des animaux vivants. Malheureusement, à l’heure actuelle, aucun ne reproduit le tissu vivant et les contraintes pour l’IRM de ce dernier (mouvement respiratoire, cardiovasculaire, flux sanguin, hétérogénéité des tissus…). De ce fait, nous sommes contraints de valider nos paramètres sur des animaux vivants.

Réduction

Plusieurs stratégies vont être utilisées pour limiter au maximum le nombre d’animaux dans ce projet consistant à la mise au point de protocole : l’utilisation d’objet test, le passage à l’IRM à plusieurs reprises du même animal et, dans la mesure du possible, nous utiliserons des animaux de réformes.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés et monitorés durant les examens IRM et pour les injections limitant ainsi la douleur. Ils seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi (tunnel, élément pour nidification, baton à ronger). A noter que le tunnel permettra la manipulation des animaux éveillés limitant ainsi le stress de la manipulation. Des points limites ont été définis et adaptés par procédure.

Choix des espèces

L’IRM préclinique est un appareil dédié aux études sur les rongeurs. Le rongeur (souris, rat) est depuis toujours le modèle de prédilection pour la recherche biomédicale, par sa taille, son coût, sa manipulation aisée et son taux élevé de reproduction. Il est utilisé comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies. Les organes ayant des tailles et des caractéristiques à l’IRM différentes au cours du développement, les animaux sains utilisés seront à différents stade de développement allant de quelques jours après la naissance à l’état adulte.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules tumorales sur le flanc et deux à trois injections sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser leurs tissus. Le porteur indique que les injections causent un inconfort transitoire et que la tumeur peut provoquer une gêne modérée. Il cherche à confirmer in vivo l'effet du Déruxtécan sur le système immunitaire, jugeant l'étude impossible autrement que dans un "organisme entier", pour élargir l'usage de deux anticorps déjà en essai clinique.

Objectifs

La recherche et l’innovation évoluant constamment, nous arrivons à développer des traitements contre les cancers de plus en plus performants. C’est dans ce cadre-là que notre projet s’inscrit. Nous travaillons sur un type de traitement en particulier : les anticorps conjugués aux médicaments. Ce sont des traitements anticancéreux ciblés qui délivrent une chimiothérapie cytotoxique aux cellules cancéreuses via un agent de liaison attaché à un anticorps qui se lie à une cible spécifique exprimée sur les cellules cancéreuses. Il a été montré in vitro que les traitements que nous souhaitons tester, activaient la mort cellulaire immunogène. Nous souhaitons, à présent, vérifier in vivo que l’agent cytotoxique est responsable de cette activation de la mort immunogène et voir ses effets sur la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations nous permettront de confirmer dans un modèle préclinique les effets anti-tumoraux du Déruxtécan via l’activation du système immunitaire , ce qui permettra d’élargir le champ d’action de deux nouveaux anticorps conjugués aux médicaments, en cours d’essai clinique.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux recevront 2 ou 3 injections, d'une durée d'1 minute chacune, sous anesthésie générale ou locale suivant les injections.

Impact sur les animaux

Les injections entraineront des inconforts transitoires et limités. Les animaux recevront des cellules tumorales qui pourront croître et provoquer une gêne modérée sur le flanc.

Devenir

Toutes les souris auront reçu des cellules cancéreuses, il n’est donc pas possible de les laisser en vie à la fin de la procédure. De plus, des tissus et cellules seront analysées post-mortem.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’existe pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’effet anti-tumoral d’anticorps conjugués au médicament via l’activation du système immunitaire. En effet, cette étude qui implique le système immunitaire nécessite un oganisme entier (cellules et cytokines circulantes).

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés; nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux,, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale ou locale dépendamment de l'intervention à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués

Choix des espèces

La souris possède un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à l’homme. En outre, sa petite taille permet d’héberger un grand nombre d’animaux en même temps et permet donc de réaliser des analyses statistiques valables des résultats obtenus. La souris est le modèle le plus utilisé dans notre centre de recherche, ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux sont utilisés au stade adulte (environ 7-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire complet et fonctionnel.

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est soumise à un régime gras pendant dix semaines pour provoquer obésité et diabète, et toutes reçoivent jusqu'à vingt-deux injections sous anesthésie locale et une dizaine de prélèvements sanguins, avant la mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur cherche à neutraliser une protéine pour traiter la prise de poids provoquée par un médicament de la schizophrénie. Il affirme l'usage d'animaux vivants "indispensable", l'appétit et le comportement alimentaire étant selon lui impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

Le médicament étudié est utilisé pour le traitement de la schizophrénie. Contrairement à d’autres molécules, ce produit ne provoque pas d'effets secondaires notables. Cependant, le traitement par ce médicament a été associé à des augmentations de poids cliniquement significatives et à l’induction du diabète. Il a récemment été découvert qu'une protéine libérée par les cellules et les organes agit comme un stimulateur. L'augmentation systémique de cette protéine augmente de manière extracellulaire l'apport alimentaire, réduit la glycémie et favorise la génération de graisses au niveau systémique. La neutralisation de cette protéine apparaît comme une cible d'intérêt dans la lutte contre l'obésité, du fait de son expression ubiquitaire, de ses liens avec la régulation centrale de l'appétit et de son rôle dans le métabolisme des lipides. L’objectif de cette étude expérimentale est de déterminer si la neutralisation de cette protéine peut traiter l'obésité induite par le médicament étudié.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie thérapeutique dans des modèles précliniques pour prévenir ou traiter l'obésité induite par certains médicaments.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections (pour un groupe 22 injections (sur 11 semaines), pour un un groupe 4, et pour un groupe 5 injections, durée 1 minute, sous anesthésie locale). La moitié des souris sera soumise à des régimes riches en gras pendant 10 semaines. Tous les animaux seront soumis à 10 micro-prélèvements de sang (durée 1min) et à 1 prélèvement de sang plus important en fin de procédure (durée 2min, sous anesthésie locale).

Impact sur les animaux

Les injections ou prélèvements sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les régimes riches en gras induisent une prise de poids et peuvent être obésogènes et induire le diabète. Les prélèvements de sang, très limités en volume, ne provoqueront qu'un inconfort local et transitoire.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Le nombre nécessaire d'animaux a été déterminé grâce à une analyse statistique préalable. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, leur score sera déterminé, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un antiinflammatoire non stéroïdien (metacam). Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Pour le projet proposé, la physiologie et la génétique de la souris sont suffisament proches de celles de l'être humain pour pouvoir tirer des conclusions valides des procédures envisagées. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.