Oncologie

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales puis peut être traité par chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie, avec prélèvements sanguins et imagerie sous anesthésie, avant d'être tué pour prélever organes et fluides. Le porteur reconnaît que le développement de la tumeur et des traitements encore mal connus peut provoquer des effets délétères et des douleurs. Il affirme qu'aucune méthode de substitution n'existe pour évaluer une nouvelle molécule contre le cancer du sein, l'animal restant selon lui un "passage obligatoire" avant l'humain.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles pertinents de cancers du sein.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer que les traitements testées sont actifs dans un modèle de cancer du sein et aussi d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage chez l'être humain.

Procédures

Les animaux recevront une greffe de cellules tumorales. Dès lors, ils pourront être traité par chirurgie, radiothérapie et/ou traitements chimiothérapeutiques. En cas de prélèvement de sang ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères. De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les procédures chirurgicales d'exérèse induiront des douleurs suite à l'incision et à la cicatrisation. Les effets de la radiothérapie.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer du sein. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : classiquement 10 par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu. L’analyse statistique sera par la comparaison des groupes d'animaux en fonction du traitement réalisé.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • des conditions d'hébergements garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

6 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie inguinale bilatérale d'une heure pour implanter deux prothèses de renfort de paroi abdominale à comparer, suivie d'un examen radiologique sous anesthésie et d'un suivi de trois mois, avant d'être tué pour prélever les tissus et observer le comportement de la prothèse. Le porteur présente cette étape comme la preuve de concept d'un dispositif déjà testé in vitro, qu'il affirme "nécessaire" de valider sur l'animal vivant avant les malades humains. Il justifie le recours au cochon par les similitudes anatomiques avec l'humain.

Objectifs

Les Hernies De Paroi Abdominale (HDPA) sont dues à une déficience de la paroi ou un traumatisme de la paroi voire un relâchement d’une cicatrice de d'opération de l'abdomen. Ce sont les affections les plus fréquentes de la paroi abdominale. Le seul traitement efficace des HDPA est chirurgical et nécessite l’emploi de prothèses de renfort de paroi que l'on appelle communément Mesh en chirurgie. Beaucoup de prothèses de type Mesh existent mais il y a une grande disparité dans leur efficacité : taux variable de complications et/ou récidives en partie liées à l’approche opératoire et plus précisément à la méthode de fixation de la Mesh sur la pario. Aucun consensus n'est établi sur la meilleure méthode de fixation ou de non-fixation. Il a été démontré que la fixation de la prothèse avec des agrafes induit des douleurs post-opératoires plus importantes par rapport à la non-fixation de la Mesh qui dans ce cas doit être adhésive. Notre équipe a mis au point un système de Mesh qui se fixe dans traumatiser la paroi abdominale. Ce modèle a été testé in vitro et nous avons besoin de le tester sur des animaux vivants avant de les utiliser chez des malades humains. Les objectifs de ce projet sont : 1) évaluation du positionnement sans fixation atraumatique de la nouvelle prothèse sur la paroi abdominale 2) tolérance par la paroi abdominale de la présence permanente de la prothèse candidate 3) efficacité du système de fixation mécanique spontanée de cette prothèse comparée à une autre prothèse concurrente sur une période de 3 mois après l'implantation chez le porc. La preuve de concept in vivo de ce nouveau type de prothèse permettra d'améliorer la qualité des prothèses curatives et/ou préventives des HDPA.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette recherche permettront d'avancer dans la mise sur le marché de prothèses de renforcement de la pario abdominale parce que nous pourrons répondre à deux critères : 1. la tolérance sur le plan clinique et biologique de la nouvelle prothèse auto-fixante ; 2. l’efficacité de l’attachement de cette prothèse au tissu abdominal mou suffisamment fort lui évitant une migration et/ou le rétrécissement.

Procédures

Les Porcs subissent une chirurgie au niveau inguinal qui va provoquer une douleur et une gêne post-opératoires. Avant la chirurgie, ils seront mis à jeun la veille au soir. Après la chirurgie, ils recevront des traitements par injection ou par médicaments par voie orale. la chirurgie est bilatérale et dure 1h. La période post-opératoire dure 10 à 12 jours au cours de laquelle les porcs euvent être hébergés seuls selon la qualité de la cicatrisation. La radiologie sous anesthésie dure 10 à 15 minutes. Suite à la chirurgie, ils subiront un examen radiologique de contrôle sous anesthésie. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs d'animaux à des fins scientifiques que nous appellerons EU1 et EU2Pour passer de l'EU1 à l'EU2, ils seront transportés en camion de moins d'une heure.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut provoquer une douleur et une gêne mécanique au lieu d'intervention.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissu et observer in situ le comportement de la prothèse.

Remplacement

L'objectif de cette étude est de vérifier l'efficacité et la sécurité de la nouvelle prothèse candidate auto-fixante in vivo. Cette prothèse a déjà fait l'objet d'une étude de caractérisation in vitro sur un banc d'essai et doit maintenant être validée in vivo. La preuve de concept de ce nouveau type de prothèse permettra de mettre au point des prothèses auto-fixantes de qualité et efficace dans le traitement des HDPA. Il est nécessaire de tester la prothèse dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent pas être reproduit en in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

6 animaux répartis en 2 groupes de 3 seront utilisés. Ce nombre total a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Etant donné que c'est une preuve de concept, il n'y a pas besoin de plus de 3 animaux par groupe pour obtenir la réponse au questionnement (aucune approche statistique n'a été réalisée). Pour réduire le nombre d'animaux, des tests in vitro ont déjà été réalisés pour la caractérisation de la prothèse candidate. Dans un principe de réduction, il sera implanté sur un même animal les 2 prothèses à comparer pour chaque groupe. Il s'agit d'une preuve de concept, ce faible nombre d'animaux permettra d'obtenir les résultats suffisants pour cette étape du projet.

Raffinement

Après une phase d'acclimatation pour réduire leur stress, les porcs seront opérés par une équipe chirurgicale expérimentée, qui maîtrise les techniques utilisées dans les hôpitaux. Durant toute la chirurgie et en période post-opératoire, la douleur sera prévenue et traitée. L'anesthésie durant l'opration sera suivie, et assortie d'une couverture analgésique. Par la suite, ils seront transportés dans un établissement spécialisé dans les soins de longue durée. Durant tout l'hébergement les animaux seront maintenus en groupes sociaux harmonieux. Ils seront hébergés dans des enclos propres, équipés d'enrichissement, qui leur permet de fouisser, manipuler des objets et se coucher dans des litières sèches. Un suivi quotidien par des équipes spécialisées permettra de suivre tous les signes indésirables, les traiter et els prévenir. Nous privilégions les techniques de renforcement positif pour obtenir la coopération des porcs pendant les pesées, les changements de cage ou les manipulatinos.

Choix des espèces

Les nombreuses similitudes anatomo-physiologiques, qui rapprochent l’organisme du porc à celui de l’Homme, permettent d’obtenir une comparaison fiable des données obtenues et une meilleure compréhension des phénomènes physio-pathologiques étudiés. Nous implantons les dispositifs chez de porcs de 30 à 35 kg, en croissance. Ainsi nous pouvons vérifier si le dispositif remplit son rôle de renforcement de la paroi inguinale, résiste aux efforts mécaniques et accompagne la croissance sans incident.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent des injections d'alcool en fin de gestation, puis leurs souriceaux subissent des mesures cardio-respiratoires, des tests psychomoteurs et des séparations maternelles jusqu'au onzième jour de vie, avant d'être tués pour prélever leurs organes, les mères étant tuées après la mise bas. Le porteur indique que l'alcoolisation fait perdre aux femelles la coordination de la marche et que la séparation maternelle est une source de stress pour les souriceaux. Il affirme que l'étude des effets moteurs et cognitifs de l'alcoolisation foetale passe par un "organisme entier" et ne peut être évitée.

Objectifs

Dans l'altération de l’environnement fœtal, notre objectif est de caractériser l’impact d’une alcoolisation fœtale importante au dernier trimestre de la grossesse. L'alcoolisme foetale est la première cause d'handicap mental non génétique. Le placenta est perméable à l'alcool qui arrive alors au foetus dont le foie n'a pas l'efficacité pour l'éliminer. Il est ainsi exposé plus longtemps aux effets toxiques de l'alcool. Nous souhaitons évaluer et comprendre les fonctions du gène Hsf2, un gène important pour la réponse au stress dont le stress lié à l'alcool. Pour cela, nous utilisons un modèle génétique murin dépourvu de ce gène. Nous étudierons les conséquences physiologiques, motrices et cognitives dès la naissance des souriceaux issus de mères alcoolisées. Nous comparons les résultats obtenus avec les souriceaux issus de mères non alcoolisées. A ce jour, la France compte encore environ 15000 naissances avec des troubles causés par l'alcoolisation foetale. Les retombées de ce travail sont ainsi directement utiles en terme de prévention et d’implications thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Résultats attendus : Les conséquences d’une alcoolisation fœtale pourraient être plus étendues avec des atteintes précoces motrices, cognitives et physiologiques. Nous préciserons les fonctions du gène Hsf2 dans ces atteintes. Les retombées de ce travail sont directement utiles en terme de prévention et d’implications thérapeutiques.

Procédures

Sur les femelles gestantes : injection intrapéritonéale (au quart cadran inférieur de l'abdomen) d'alcool ou de solvant servant à diluer l'alcool au 15ème jour de gestation (deux fois espacés de 8h) et un fois au 16ème jour de gestation - Aucun prélèvement sur animaux vigiles - Aucune procédure chirurgicale, Sur les soucriceaux : des mesures cardio-respiratoires (30 min une fois à un jour de vie, 30 min une fois à deux jours de vie, 50 min une fois à 8 jours de vie), bilan psychomoteur de 7 à 11 jours de vie à l’aide de 3 tests distincts répétés 2 fois, chaque test dure 20 secondes, enregistrement des sons émis par l’animal (une fois à 8 jours de vie, pendant 3 min)

Impact sur les animaux

L'alcoolisation de la mère ne modifie pas la prise de poids ni la température corporelle au cours de la gestation. Ce que l'on peut constater est un retard de mise bas chez les femelles alcoolisées et dans ce cas les petits ne rentreront pas dans le protocole. La modification de ces deux variables (la modification corporelle (poids et température = variable 1) et le retard de mise bas (variable 2) constitue un signe de souffrance et/ou de modification inattendue dans la procédure et nous tenons à les prendre en compte. Titubation des femelles alcoolisées : les femelles alcoolisées perdent temporairement la coordination de la marche sous l’effet de l’alcool. Ces femelles retournent en pièce d'hébergement si et seulement si elles recouvrent une marche coordonnée normale. Nuisance post-natale : séparation maternelle (durée maximale de 50 min en condition de thermoneutralité pour les mesures physiologiques, 10 min pour le test de préférence maternelle, 3 min pour la mesure des vocalisations ultrasoniques), les souriceaux sont libres de se mouvoir pour toutes les mesures/observations effectuées.

Devenir

Les souriceaux sont maintenus en vie jusqu'à 11 jours, jour de la fin des expériences. IIs seront euthanasiés et les organses sont récupérés en post-mortem pour une étude histologique. Les mères traitées sont euthanasiées après la mise bas. Comme nous nous intéressons sur l'empreinte que peut laisser l'alcoolisation, les mères ne seront pas réutilisées, elles sont euthanasiées après la mise bas selon la methode règlementaire par un personnel qualifié.

Remplacement

L'étude préclinique concerne l'expérimentation animale et permet d'obtenir les informations de toxicité notamment dans l’alcoolisme maternel. Pour étudier les effets de l'alcoolisme foetale sur le plan physiologique, moteur et cognitif, l'utilisation d'un organisme entier est pertinente et ne peut être évitée.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. Nous privilégions une étude longitudinale c'est à dire que nous suivons les souriceaux sur plusieurs jours ce qui réduit le nombre d'animaux utilisés. Un groupe expérimental nécessite 30 souriceaux pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif découle de nos expériences. Toutefois, cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.

Raffinement

Nous utilisons des techniques de mesures non invasives et contrôlées (mesure moins d'une heure, température 32-33°C dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. Les cages avec les portées sont enrichies en papier absorbant doux pour le nid. La séparation maternelle n'excède pas l'heure. Une surveillance quotidienne visuelle est assurée tous les jours. Un suivi clinique est assuré les jours avec protocole de test prévu (poids, température, mobilité des souriceaux, aspect des poils). En somme, nous avons établi une liste de points limites intermédiaires basées sur le comportement et l'aspect des animaux qui conduit à la mise en place d'action adaptée et précoce permettant de diminuer la souffrance.

Choix des espèces

Choix de l'espèce souris : largement utilisée dans l'étude des mécanismes physiopathologiques d'une maladie génétique, souris transgénique disponible pour étudier le rôle d'un gène, organisme entier pour étudier les conséquences de l'alcoolisation sur les descendances Stades de développement : Pour l'alcoolisation foetale, il s'agit de cibler les conséquences d'une consommation excessive d'alcool en fin de gestation. Pour les souriceaux, il s'agit de déceler précocément les modifications induites par l'alcoolisme foetale. Tests psycho-moteurs et cognitifs choisis avant l'ouverture des yeux

225 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 200 mâles tués à l'issue et 25 femelles réutilisées pour d'autres projets. Les mâles subissent une chirurgie stéréotaxique ouvrant la boîte crânienne pour injecter un vecteur viral supprimant le récepteur aux androgènes, puis des tests de comportement sexuel, d'anxiété, de locomotion et de fertilité. Les 25 femelles, utilisées comme animaux stimulus, subissent une gonadectomie et des injections de progestérone. Le porteur affirme que l'étude du comportement de reproduction ne peut se faire que sur "l'organisme entier" et signale des risques de douleur post-opératoire, d'hypothermie et d'arrêt cardio-respiratoire liés à la chirurgie et à l'anesthésie.

Objectifs

Ce projet vise à identifer les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction et du comportement de reproduction chez la souris adulte mâle. La survie des espèces dépend de la capacité des individus à se reproduire. Une reproduction réussie requiert la production de gamètes mais également l’expression des comportements de reproduction mâle et femelle afin d’optimiser la fécondation. Chez le mâle, la fonction de reproduction ainsi que le comportement de reproduction sont contrôlées par le cerveau sous l’action des androgènes. Des études précédentes ont démontré un rôle de la signalisation androgénique au sein du cerveau contrôlant la fonction de reproduction ainsi que l’expression du comportement de reproduction mâle. Ces études ont utilisé des souris dont la délétion du récépteur aux androgènes ciblait l’ensemble du tissu neural tout au long de la vie sans distinction du type cellulaire (i.e. cellules gliales versus neurones) ni de la région cérébrale. Ici, nous souhaitons décrypter plus en profondeur les phénotypes cellulaires et les régions cérébrales régulées par les androgènes dans la fonction et le comportement de reproduction mâle à l’âge adulte. Dans ce but, nous déléterons spécifiquement le récepteur aux androgènes au sein d’une région spécifique du cerveau, la region préoptique médiane, dans les cellules gliales ou neuronales à l’âge adulte puis nous étudierons la fonction et le comportement de reproduction suite à ces délétions.

Bénéfices attendus

Les perturbations hormonales au cours de la vie peuvent avoir un impact majeur sur les réponses neuroendocrines et comportementales liées à la reproduction par le biais d’altérations des structures cérébrales impliqués dans ces réponses. Cette étude participera à faire progresser la compréhension des mécanismes d’action sous-tendant cette régulation. Les modèles transgéniques utilisés nous permettront de comparer les mécanismes neuraux des deux voies de signalisation majeures impliquant les récepteurs des oestrogènes et des androgènes chez le mâle.

Procédures

Un nombre de 200 souris mâles subiront une chirurgie sous anéthésie générale avec réveil qui durera entre 30 et 45 minutes maximum. Après 3 semaines de rétablissement, les souris subiront différents tests de comportements sexuels, d’anxiété et de locomotion ainsi que des tests d’étude de leur fertilité. L’ensemble de ces tests n’a pas d’effet indésirable. Un lot de 25 souris femelles subira des gonadectomies sous anesthésie générale avec réveil qui durera entre 15 et 30 minutes maximum. Ces femelles subiront également 2 injections sous-cutanées de progestérone avant les tests de comportement sexuels.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous anesthésie générale à l’isofluorane pendant lesquelles une ouverture de la boîte cranienne est réalisée afin d’injecter dans une région cérébrale donnée un vecteur viral qui nous permettra de déléter le récepteur aux androgènes (AR). Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont : - Une hypothermie - Arrêt cardio-repsiratoire liée à l’anesthésie - Une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux - Une perte de poids rapide. La délétion de l’AR dans l’ensemble du système nerveux dès la conception n’entraîne pas d’effets indésirables : nous ne nous attendons donc pas à des nuisances ou des effets indésirables suite à la délétion restreinte de l’AR dans la région préoptique à l’age adulte.

Devenir

Au sein de cette demande d’autorisation de projet 200 animaux seront euthanasiés à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvements et analyses post-mortem nécessaires à l’étude du role du récepteur aux androgènes dans la régulation de la fonction et du comportement de reproduction mâle. Les animaux stimuli nécessaires à l’étude du comportement sexuel mâle (25 femelles) seront réutilisés pour des projets au sein de l’équipe de recherche ou par des collaborateurs afin de respecter la règles des 3Rs.

Remplacement

L’étude des fonctions et comportements de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Dans cette étude, nous souhaitons identifier les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction de reproduction et l’expression du comportement sexuel mâle. Cela nécessite des modèles animaux afin de pouvoir étudier les structures et populations cellulaires contrôlant la reproduction et les méthodes alternatives et/ou substitutives ne peuvent remplacer l’animal entier pour ce projet. La souris est le modèle animal sélectionné afin de tirer profit des techniques récentes (transgénèse conditionnelle et transduction virale) pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, nous utiliserons un total de 1125 animaux (225 souris adultes et 900 souriceaux) sur 4 procédures qui nous permettront d’étudier le rôle du récepteur des androgènes dans la régulation de la fonction et du comportement de reproduction mâle. Pour chaque procédure, nous avons eu à cœur de calculer au plus juste le nombre d’animaux dans chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la puissance statistique de l’étude. Pour les études comportementales, 8 à 12 animaux par groupe sont nécessaires pour des résultats fiables et consistants. Un même groupe d’animaux est utilisé pour plusieurs tests. De plus, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses comportementales et immunohistochimiques. Nous péléverons également d’autres organes et les garderons pour de futures études ou nous les proposerons aux collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie spécialisée sous la supervision des soigneurs et du vétérinaire-référent. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Au cours des chirurgies, les animaux seront anesthésiés par anésthésie gazeuse. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie, les animaux seront injectés en sous-cutané avec un analgésique en pré-opératoire 30 minutes avant la chirurgie et avec un analgésique anti-inflammatoire en post-opératoire toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Par la suite, un suivi journalier sera réalisé afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être animal. Les critères absolus suivants seront observés : - Apparence et position anormale : poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie - Comportements anormaux : aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation) - Une perte de poids rapide et supérieur à 20 pourcents du poids corporel de l’animal mesuré avant la chirurgie. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie stéréotaxique puis 1 fois par semaine. - Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité - Difficulté respiratoire Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s’assurer que toute souris présentant une perte de poids excessive (-20 pourcents du poids corporel au début de l’étude) ou une détresse seront euthanasiées. Suite à l’observation de ces critères et au diagnostic d’une douleur ou d’un mal-être animal, celui-ci sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d’outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques, vecteurs viraux, …) et de données dans la litérature permettant de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires et ainsi d’implémenter les connaissances sur cette thématique. Les animaux utilisés sont issus d’accouplements réalisés au sein de notre établissement utilisateur et seront utilisés à l’âge adulte lorsque leur maturité sexuelle est atteinte (à partir de 8 semaines). Chaque souris est identifiée soit par tatouage soit par encoche aux oreilles.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux d'un jour sont anesthésiés pour recevoir de l'ADN par électroporation dans les neurones du bulbe olfactif, puis tués entre deux et vingt-huit jours plus tard par perfusion intracardiaque après surdose d'anesthésique. Le porteur affirme pratiquer cette électroporation en routine depuis une douzaine d'années sans jamais avoir observé d'effet nuisible conséquent, et juge très limité le stress de l'injection intrapéritonéale. Il indique que la culture in vitro ne convient pas et retient la souris comme seul mammifère permettant les tests génétiques recherchés, pour éclairer le rôle de mutations du gène Ago2 identifiées chez des patients.

Objectifs

Certaines mutations du gène Ago2 chez des patients humains provoquent dans l’embryon des anomalies de formation des neurones (neurogenèse) conduisant ultérieurement à l’apparition de déficits cognitifs. Le présent projet cherche à comprendre les mécanismes qui conduisent les mutations du gène Ago2 à provoquer ces anomalies. Pour mener cette étude, nous utiliserons un modèle de neurogenèse (formation de nouveaux neurones) particulier chez la souris : la formation de nouveaux neurones dans le bulbe olfactif. Ce modèle de neurogenèse, qui perdure tout au long de la vie de l’animal, autorise la modification de l’expression des gènes au cours du processus. Ainsi, en utilisant ce modèle nous pourrons étudier les conséquences de l’expression induite des formes mutantes du gène Ago2 au cours de la neurogenèse sur les propriétés des jeunes neurones qui en sont issus.

Bénéfices attendus

La meilleure compréhension des mécanismes conduisant aux anomalies de formation des neurones liés aux mutations du gène Ago2 est susceptible d’aboutir au développement de nouveaux traitements permettant d’atténuer les effets de ces mutations. Ce projet permettra aussi de mieux comprendre la fonction du gène Ago2 dans les neurones en développement.

Procédures

Pour l'étape d'électroporation, les 300 animaux de ce projet seront traités avec le même protocole: les souriceaux âgés de 1 jour seront anesthésiés et de l'ADN sera introduit par électroporation dans les jeunes neurones du bulbe olfactif en développement. L’ensemble de ces actes ne dure que 30 secondes. Les souriceaux seront réveillés progressivement en les ramenant à une température de 37°C et replacés auprès de leur mère. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l'électroporation par perfusion intracardiaque après injection d'une surdose d'anesthésique. De plus, les animaux du lot 1 recevront une injection intrapéritonéale d'une solution non dommageable 2 heures avant perfusion.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 28 jours après électroporation. Nous pratiquons l’électroporation de cerveau en routine depuis une douzaine d’années et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à cet acte sur l'état de santé et le bien être des animaux. Concernant l’injection par voie intrapéritonéale, l’acte entraine probablement un stress des animaux mais au regard de la durée extremement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits par l'introduction de l’aiguille sont très limités dans le temps. Les produits injectés n’entrainent pas d’effet indésirable sur les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin d’analyser au niveau histologique le devenir des jeunes neurones modifiées génétiquement.

Remplacement

Les jeunes neurones peuvent être cultivés in vitro. Cependant nous savons que in vivo leur prolifération et leur développement en neurones matures sont contrôlées par des facteurs extrinsèques ou environnementaux que nous ne savons pas reproduire in vitro. Ces facteurs sont sécrétés par exemple par les cellules gliales ou celles du système vasculaire. D'autre part nous ne sommes pas capables de cultiver suffisamment longtemps les progéniteurs neuronaux et les jeunes neurones qui en découlent pour leur faire atteindre un niveau de maturité suffisant pour qu'ils puissent entrer en communication avec d'autres neurones. Or il est fortement suggéré que les anomalies chez les patients causées par des mutations du gène Ago2 soient dues, au moins en partie, à un défaut de connectivité entre neurones. Pour ces raisons, le modèle de la culture in vitro n'est pas approprié à ce projet.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des jeunes neurones directement dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette méthode par électroporation des cerveaux in vivo est utilisée en routine depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et la variabilité entre échantillons réduite au minimum. Les résultats seront analysés par des tests statistiques dédiés aux petits échantillons (tests non paramétriques) que nous maitrisons grace aux formations en biostatistique que nous avons suivies. Les animaux des 2 sexes seront utilisés pour ces expériences.

Raffinement

Selon les recommandations règlementaires, les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. Six personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin des animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation postexpérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises.

Choix des espèces

Le projet vise à reproduire et à étudier le mécanisme d'apparition de défauts de développement et/ou de fonctionnement des neurones exprimant une forme mutante d’Ago2. Nous privilégions donc un modèle de mammifère pour ce projet. Chez les mammifères, seule l’espèce souris permet de réaliser des tests génétiques sophistiqués tels que ceux décrits dans ce projet. Les animaux seront électroporés à 1 jour après leur naissance (stade P1) car c'est à ce stade que l'efficacité d'électroporation est optimale. Les animaux ayant subi l'électroporation seront euthanasiés pour analyse aux stades P3 (jour 3 après la naissance, les jeunes neurones électroporés sont en pleine phase de prolifération), P15 (jour 15 après la naissance, à ce stade la majorité des neurones électroporé ont atteint le bulbe olfactif mais restent immatures) ou P29 (29 jours après la naissance, les neurones électroporés sont complètement matures).