Oncologie

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales puis un transfert de cellules par voie rétro-orbitaire, avant d'être tuées pour analyser les cellules immunitaires de la tumeur. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les mouvements, réduire le toilettage et modifier le comportement social des souris. Il annonce une "ambition" de thérapie innovante ciblant une protéine des cellules immunitaires, en reconnaissant que l'effet anti-tumoral reste une hypothèse à valider.

Objectifs

La prise en charge thérapeutique des maladies cancéreuses reste un problème majeur de santé. Malgré des progrès significatifs dont des stratégies de détection précoce, les traitements afin d’améliorer la qualité et l’espérance de vie reste globalement en dessous des attentes. Les protocoles thérapeutiques ciblant les cellules tumorales consistent pour la plupart à l’utilisation de la chimiothérapie intervenant sur la prolifération cellulaire incontrôlée. Il en résulte une importante exposition des cellules saines à ces substances cytotoxiques, avec pour conséquence une toxicité importante à court terme et une réelle implication à moyen terme dans le développement d'autres tumeurs ou "récidives". Les récentes études ciblant de nouvelles approches thérapeutiques se sont intéressées au microenvironnement tumoral. La compréhension des processus immunitaires du microenvironnement tumoral permet l'identification de nouveaux acteurs jouant un rôle fondamental dans la genèse, la communication (interactions cellules-cellules) , le développement et la possibilité de récidive de la tumeur. Les tétraspanines (Tspans) font partie de ces nouveaux acteurs. Ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires fondamentaux tels que la migration, la communication, l'adhésion, la fusion ainsi que la formation de vésicules extracellulaires(EVs). Ce sont des marqueurs significatifs dans un grand nombre de cancers, tels que les cancers du sein, des ovaires ou de la prostate, ce qui en font de potentielles cibles thérapeutiques. La tétraspanine 29 ( Tspan29) ou CD9 est une molécule largement présente sur lescellules B régulatrices (Bregs), dont le rôle fondamental a été démontré dans le développement et la propagation du processus tumoral. Bloquer spécifiquement cette cible sur ces cellules devrait permettre de bloquer le processus tumoral à plusieurs niveaux. L’objectif de ce projet est d’étudier la tétraspanine 29 (Tspan29) ou CD9 comme cible potentielle sur les Bregs en émettant l’hypothèse qu’une action ciblée conduirait à une réduction de la progression tumorale.Plusieurs molécules visant spécifiquement le CD9 ont été identifiées en amont et seront testés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de contribuer à mieux caractériser le rôle des Bregs dans le cancer et l’intérêt de l’utilisation de bloqueurs des Tspans dans la genèse, la prolifération, la dissémination et la communication des cellules tumorales. Nous supposons qu’une action ciblée sur la molécule CD9 permettra de bloquer ou modifier les fonctions suppressives des Bregs CD9 et de leurs vésicules ce qui aura un effet bénéfique sur le cancer. Ainsi notre étude permettra d’aboutir à la sélection du ou des candidats permettant la meilleur inhibition de la molécule CD9 avec un effet anti-tumoral francs. Notre ambition est de développer et de proposer une approche innovante de la thérapie du cancer qui prenne en compte le microenvironnement de la cellule cancéreuse, notamment les Bregs.

Procédures

Les animaux seront soumis à une phase d'induction du modèle tumoral par injection en sous-cutané de cellules tumorales une seule fois. Puis une semaine après l'injection des cellules tumorales, un transfert adoptif de cellules par voie retro-orbitaire sera effectué une seule fois pour chaque souris. Les animaux ne seront pas soumis à d'autres actes, ni de prélèvements durant la phase d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Pour tous protocoles avec un modèle tumoral, les animaux peuvent éprouver des effets indésirables : Un effet sur la mobilité de la souris ou une gêne dûe aux tumeurs sous-cutanées. Une diminution du toilettage avec l’apparition des tumeurs. Une perte de poids. Une modification du comportement social avec l’apparition des tumeurs.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la procédure seront euthanasiés à la fin de celle-ci afin d'identifier les cellules immunitaires infiltrants les tumeurs et analyser les cellules spléniques en complément des données des mesures tumorales.

Remplacement

Dans nos premières phases de tests de caractérisation, les tests sur les animaux seront remplacés par des tests in-vitro sur cellules humaines. Néanmoins pour la suite du projet, l’animal reste essentiel afin de prendre en compte les interactions dans le microenvironnement et valider l’effet anti-tumoral in-vivo.

Réduction

Notre projet s’inscrit dans une démarche de la réduction du nombre d’animaux au cours des différentes phases. Nos collaborateurs synthétiseront de nombreux inhibiteurs qui pourraient nécessiter un nombre conséquent d’animaux. Néanmoins nous avons fait le choix de sélectionner que 8 inhibiteurs présentant l’interaction la plus efficace avec le CD9. De plus les molécules sélectionnées poursuivront une phase de caractérisation et validation in-vitro qui pourrait conduire en fonction des résultats à une diminution du nombre de molécules à tester in-vivo et donc du nombre d’animaux nécessaires. Les groupes seront constitués de 6 animaux par conditions (cf tableau) permettant une approche statistique pertinente. Nous opterons pour une répétabilité (triplicate) par expérimentation afin d’éliminer des biais potentiels, néanmoins celle-ci pourrait être réduite à 2 en l’absence de biais.

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnant à base de frisure de papier kraft sera mis dans les cages des animaux. Si des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation des souris pourraient être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme pour les souris isolés ou en binôme. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les animaux associeront ce stimulus sonore à une manipulation à venir. Notre expérimentation sera basée sur des études préliminaires afin de déterminer le nombre de cellules à injecter permettant un développement tumoral avec un moindre impact sur le bien-être des souris. Des points limites seront définis afin d’éviter la détresse et la douleur lors de l’expérimentation. Un système de suivi avec un score sera mis en place (cf annexe). Celui-ci tiendra compte de différents signes cliniques. La mesure tumorale sera effectuée tous les deux jours 1 semaine après l’injection des cellules tumorale et le critère du volume tumoral sera un point limite permettant l’arrêt de l’expérimentation si celui-ci dépasse la valeur définie.

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés avec de nombreuses données dans la littérature. Ce modèle tumoral étant déjà utilisé et référencé chez le rongeur, la mise au point n’est pas nécessaire. Le choix des espèces et souches est basé sur les études existantes. Les souris seront utilisées entre 6 semaines-8 semaines de vie en conformité aux articles de référence.

1 200 rongeurs, 1 080 souris et 120 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, des injections de molécules et des prélèvements sanguins sous anesthésie, avant d'être tués pour analyser la distribution des produits dans leurs organes. Le porteur présente ces actes comme des prestations de service facturées à des clients, qui définissent eux-mêmes le protocole et l'espèce, la plateforme réalisant l'imagerie sur les modèles fournis. Il affirme que les études in vitro ne peuvent représenter à elles seules "la complexité du vivant" et justifie ainsi le recours à l'animal pour valider les molécules de ses partenaires.

Objectifs

De nos jours, de nombreux laboratoires de recherche publics et privés sont fortement intéressés par des prestations en imagerie chez le rongeur dans le domaine de l’oncologie afin de développer des nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie in vivo qui permettraient d’améliorer le diagnostic ou le suivi de la réponse thérapeutique à terme chez des patients atteints de cancers. Notre plateforme spécialisée dans l’imagerie in vivo propose la réalisation de ce type prestations grâce à des équipements dédiés à l’imagerie du petit animal : scanner à rayons X, imageur optique (bioluminescence et fluorescence in vivo), imagerie radioactive en tomographie par émission de positions (TEP) et tomographie par émission mono-photonique (TEMP), ceci sur des animaux sains et des modèles animaux de diverses pathologies, dont les cancers.

Bénéfices attendus

La réalisation des prestations de service permet de faire avancer la recherche de nos partenaires et clients dans le domaine de l’imagerie et de l’oncologie. Il s’agit notamment de valider l’utilisation molécules capable de mettre en évidence, de façon non invasive par imagerie in vivo, certaines caractéristiques des tumeurs ; ceci dans le but de mieux identifier les cancers et pouvoir suivre leurs réponses à la thérapie.

Procédures

Les animaux seront soumis : - à une injection de cellules tumorales en sous-cutané réalisée sur animaux anesthésiés à l'Isoflurane (rats et souris) - durée environ 5 min. - à une injection d'une molécule d'intéret en imagerie in vivo en intraveineuse, intrapéritonéal ou intra-tumoral - réalisée sur animaux anesthésiés à l'Isoflurane (rats) ou sur animaux vigiles (souris) - durée environ 1-2min. Si besoin les injections pourront être répétées dans le temps à raison d'une injection/j maximum. - ou à une injection d'une molécule d'intéret en imagerie in vivo en intraveineuse via un cathéter inséré dans la veine caudale- réalisée sur animaux anesthésiés à l'Isoflurane (rats et souris) - durée environ 5 min. - éventuellement (si cela est nécessaire et demandé par le client) à un prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue (rats) ou en rétro-orbitaire (souris) - réalisé sous anesthésie gazeuse - durée environ 1-2min.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont liées aux différentes séries d’injections et de prélèvement réalisées sur les animaux vigiles ainsi que le stress pouvant survenir lors de l'anesthésie pour les imageries.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des études de biodistribution ex vivo.

Remplacement

Les études ex vivo ou in vitro ne peuvent représenter à elles-seules la complexité du vivant. Pour l’étude du devenir de molécules à visées diagnostique et/ou thérapeutique, la physiologie globale de l’individu, son métabolisme entrent en jeu. La biodistribution de radiotraceurs ou d’agents de contraste requiert la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés et l’imagerie fonctionnelle de tumeurs ou d’un organe particulier requiert leur fonctionnement à l’échelle de l’individu.

Réduction

Pour chaque projet, le design de l’étude est discuté et mis en place conjointement par le client et le personnel en charge en charge de la prestation dont plusieurs membres font partie du comité d’éthique local et de la Structure Bien Etre Animal de l’établissement et apportent un regard expert sur l’étude. Cet échange permet d’identifier les points pouvant être raffinés tels que le double emploi injustifié d’animaux, des procédures répétées injustifiées ou un nombre d’animaux inapproprié. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Leur nombre est calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. Les procédures d’imagerie présentent l’avantage de permettre le suivi d’un même animal dans le temps et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la validation d’une étude.

Raffinement

Les modèles animaux choisis par nos clients sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine ou pour l’expression d’une cible donnée. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela, les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques avant l'atteinte des points limites définis. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce animale est déterminé par le client compétent dans le domaine et après une étude de la littérature scientifique sur le sujet afin de modéliser au mieux la pathologie à étudier. 90% des études réalisées sur notre plateforme sont réalisées sur des souris (modèles syngéniques ou xénogreffes de cellules cancéreuses). Les 10% restant sur des rats (modèles syngéniques). En accord avec la littérature scientifique dans le domaine, les animaux utilisés seront à l’âge adulte.

539 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de greffe tumorale sous-cutanée, trois injections et trois prélèvements sanguins sous anesthésie, avec un suivi par imagerie, pour étudier la distribution de nanoparticules lipidiques censées cibler les cellules cancéreuses. Le porteur signale un inconfort modéré après la chirurgie et un risque de nécrose des tumeurs. Les retombées annoncées, une avancée majeure contre le cancer, restent renvoyées à la recherche clinique future, et le porteur juge le recours à l'animal "incontournable" pour reproduire la complexité de l'organisme entier.

Objectifs

On observe depuis une dizaine d’années un nombre croissant d’applications médicales utilisant des médicaments à base d’acides nucléique. Ces petits fragments d’ADN ou d’ARN ont la capacité de moduler l’expression des gènes et offrent de nouvelles perspectives pour le traitement de certaines pathologies comme le cancer. Malheureusement, à ce jour les champs d’applications sont encore restreints du fait de la difficulté à transporter ces acides nucléiques jusqu’à leur cible cellulaire. Leur faible capacité à circuler dans l’organisme et à atteindre leur cible sans subir de dégradation est un frein majeur à leur développement. Les nanoparticules lipidiques sont l’un des systèmes d’administration pharmaceutique les plus utilisés dans le secteur pharmaceutique. Ce sont des vecteurs efficaces pour transporter différents types de traitements, notamment les acides nucléiques. L’application la plus récente est celle de la vaccination avec les vaccins anti COVID 19 à base d’ARN messager. Cependant, les LNP administrées par voie sanguine vont se stocker majoritairement dans le foie. Notre objectif est de développer de nouvelles particules lipidiques capable de cibler les cellules cancéreuses où elles pourront délivrer leur chargement thérapeutique en acides nucléiques.

Bénéfices attendus

La mise au point de nanoparticules lipidiques chargées en acides nucléiques ciblant les cellules cancéreuses serait une avancée majeure dans le traitement des cancers car elle permettrait d’exploiter le formidable potentiel thérapeutique de cette classe thérapeutique. Les applications des acides nucléiques sont encore limitées au traitement des maladies hépatiques et en vaccination et trouver le moyen de les transporter jusqu’aux tumeurs permettrait d’ouvrir un nouveau pan de recherche clinique.

Procédures

Les souris subiront sous anesthésie générale une petite chirurgie sous-cutanée pour induire une tumeur qui durera 10 minutes. et 3 injections d’une durée de 2 minutes. Trois prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale d’une durée de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir un inconfort modéré et transitoire après la chirurgie (pendant 1 à 2 jours). Un risque de nécrose des tumeurs est possible et à surveiller.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à l’issue des procédures pour des analyses complémentaires sur les tisssus et les cellules.

Remplacement

Nous souhaitons étudier le devenir in vivo de nos nanoparticules lipidiques et plus particulièrement le ciblage des cellules cancéreuses. Les interactions multiples entre les nanoparticules lipidiques, les protéines plasmatiques, le passage dans les différents organes (notamment le foie) et l’action du système immunitaire ne sont pas encore modélisables in silico. Le recours à l’animal est donc incontournable pour reproduire cette complexité et évaluer correctement la distribution des nanoparticules lipidiques dans l’organisme entier.

Réduction

Nous avons privilégié une étude longitudinale en imagerie qui contribuera à réduire le nombre d’animaux utilisés et à optimiser la quantité de données obtenues sur chaque animal. Chaque animal sera son propre témoin. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui permet de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Un plan d’expérience sera construit afin d’éviter les biais expérimentaux. Une étude pilote sur quelques animaux nous permettra de mettre au point la technique.

Raffinement

Les procédures expérimentales s’effectueront sous anesthésie générale afin de réduire la douleur et le stress que pourraient subir les animaux lors des gestes techniques. Un protocole analgésique adapté sera mis en place en cas de besoin pour la gestion de la douleur. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de suivre leur bien-être. Une grille de score permettra de suivre l’état général des animaux et de définir des points limites adaptés au-delà desquels la procédure sera arrêtée. La technique d’imagerie utilisée dans ce projet est une technique non invasive qui favorise le bien-être animal. Les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi afin de favoriser les comportements naturels.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour notre modèle de cancer car c’est une espèce pour laquelle les modèles sont bien documentés dans la littérature et pour laquelle nous avons une expertise. Les souris seront âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à des souris adultes.

180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 mâles tués à l'issue et 60 femelles réutilisées dans d'autres projets de l'équipe. Les souris subissent une gonadectomie sous anesthésie avec pose d'implants hormonaux, puis des tests de comportement de reproduction, les femelles utilisées pour déclencher le comportement des mâles, ceux-ci étant ensuite tués pour analyser leur cerveau. Le porteur décrit des atteintes possibles allant du dos courbé et de la perte de poids rapide à l'état de choc et à la détresse respiratoire, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Les bénéfices se limitent à mieux comprendre l'action des hormones sexuelles sur le comportement, et le porteur affirme que l'étude ne peut se faire que sur "l'organisme entier".

Objectifs

La survie des espèces dépend de la capacité des individus à se reproduire. Pour une reproduction réussie, il faut non seulement une production de gamète (oocytes et spermatozoides) mais également l’expression des comportements de reproduction mâle et femelle optimisant ainsi la rencontre des partenaires sexuels et la fécondation. Chez le mâle, le comportement de reproduction est contrôlé par le cerveau sous l’action des hormones sexuelles : androgènes (testostérone) et des oestrogènes (oestradiol). Différentes études sur des modèles de souris ne possédant pas les récépteurs de ces hormones sexuelles dans le cerveau ont permis de montrer le rôle de la testostérone et de l’oestradiol dans la régulation du comportement sexuel mâle. Néanmoins, la manière dont les hormones agissent spécifiquement sur le cerveau restent encore à identifier. Dans cette étude, nous souhaitons donc identifier les modes d’actions et les cibles cellulaires dans le cerveau des androgènes et des oestrogènes Plus particulièrement, nous étudirons les effets de la délétion génétique des récepteurs des hormones sexuelles au sein du cerveau sur les structures cérébrales régulant le comportement sexuel mâle.

Bénéfices attendus

Au cours de la vie, notre corps et nos fonctions biologiques sont soumis à des variations hormonales pouvant avoir un impact sur notre système reproducteur et sur notre cerveau. Cette étude participera à faire progresser la compréhension des effets des variations des hormones sexuelles testosterone et oestradiol sur la fonction de reproduction mâle spécifiquement. Les modèles animaux transgéniques utilisés nous permettront de comparer les effets d'une absence de signalisation des hormones sexuelles, oetsradiol et testosterone, sur le comportement de reproduction chez le mâle.

Procédures

Les souris utilisées au sein de ce projet subiront une chirurgie gonadectomie et pose d’implants sous-cutanée (180 animaux) sous anesthésie générale avec réveil et analgésique d’une durée maximale de 30 minutes. Ensuite, l’ensemble des souris de cette demande d’autorisation de projet entreront dans un protocole de tests de comportement de reproduction. Pour les femelles stimuli (60 animaux), des injections sous-cutanées seront pratiquées quelques heures avant les tests de comportement de reproduction.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous anesthésie générale à l’isoflurane pendant lesquelles les gonades seront retirés et un implant contenant des hormones sexuelles estradiol/testostérone sera posé en sous-cutané. Les éventuels symptômes à court et à long terme liés à cette procédure chirurgicale sont : Apparence et position anormale (poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie); Comportements anormaux (aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation)); Une perte de poids rapide; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité; Difficulté respiratoire. Certains animaux subiront également des injections sous-cutanées pouvant entrainer un stress lié à la contention et aux injections.

Devenir

L’ensemble des mâles adultes (120 animaux) de cette demande d’autorisation de projet seront euthanasié à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvement et analyses post-mortem nécessaires à l’étude des cibles moléculaires des signalisations androgénique et oestrogénique impliquées dans la plasticité cérébrale controlant l’expression du comportement de reproduction chez le mâle adulte. L’ensemble des femelles adultes (60 animaux) utilisés pour tester les comportements de reproduction mâle seront réutilisés dans d’autres projets au sein de l’équipe.

Remplacement

L’étude de la fonction et du comportement de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Dans cette étude, nous souhaitons identifier les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction de reproduction et l’expression du comportement sexuel mâle. Cela nécessite donc l’utilisation de modèles animaux afin de pouvoir étudier les structures et populations cellulaires contrôlant la reproduction. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques récentes pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau. Des animaux vivants sont donc nécessaires pour ce projet afin de réaliser des analyses comportementales et neuroendocrines sur des souris transgéniques dont les récepteurs aux différentes hormones stéroidiennes sont délétés dans le système nerveux. Ainsi des méthodes alternatives et/ou substitutives ne peuvent remplacer l’animal entier pour ce projet.

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, nous utiliserons un total de 180 animaux sur 2 procédures qui nous permettrons d’étudier les cibles moléculaires des récepteurs aux hormones sexuelles, androgènes et oestrogènes, impliquées dans le contrôle central du comportement de reproduction mâle. Pour chaque procédure, nous avons eu à cœur de calculer au plus juste le nombre d’animaux dans chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la puissance statistique de l’étude. Pour les études comportementales, 8 à 12 animaux par groupe sont nécessaires pour des résultats fiables et consistants. De plus, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses comportementales et moléculaires. Nous péléverons également d’autres organes et les garderont pour de futures études ou afin de les proposer aux collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie spécialisée sous la supervision des soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010-63-EU en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie sous anesthésie avec réveil, les animaux seront injectés en sous-cutanée avec un analgésique en pré-opératoire 30 minutes avant la chirurgie et avec un analgésique anti-inflammatoire en post-opératoire toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Par la suite, un suivi journalier sera réalisé afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être animal. Les critères absolus suivants seront observés : Apparence et position anormale : poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie ; Comportements anormaux : aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation) ; Une perte de poids rapide et supérieur à 20 pourcent du poids corporel de l’animal mesuré avant la chirurgie. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie stéréotaxique puis 1 fois par semaine ; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité ; Difficulté respiratoire Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s’assurer que toute souris présentant une perte de poids excessive (-20 pourcent du poids corporel au début de l’étude) ou une détresse seront euthanasiées.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d’outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques, vecteurs viraux, …) et de données dans la littérature permettant de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires et ainsi d’implémenter les connaissances sur cette thématique. Les animaux seront utilisés à l’age adulte (à partir de 8 semaines). En effet, le but de ce projet est d’étudier les effets de l’invalidation des différents récepteurs des hormones stéroidiennes sur la neuroplasticité des structures cérébrales associés à la régulation des comportements de reproduction chez la souris mâle adulte.

1 200 poissons, 900 goujons et carassins et 300 truites, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et les individus de taille extrême relâchés. Ils sont capturés par pêche électrique, exposés deux à trois semaines à des cocktails de polluants en rivière ou en laboratoire, marqués et parfois injectés d'un antigène mimant une attaque parasitaire, puis euthanasiés par surdose d'anesthésique pour mesurer la contamination de leurs tissus. Le porteur indique choisir des doses faibles et des durées courtes pour observer des effets non létaux tout en limitant la mortalité. Les bénéfices se limitent à "mieux comprendre" les effets des pollutions humaines sur la faune sauvage, et le porteur juge le remplacement par culture cellulaire inapplicable à l'étude de stress multiples.

Objectifs

Les écosystèmes aquatiques sont lourdement impactés par les pollutions organiques (pesticides) et inorganiques (métaux) issues des activités agricoles et industrielles, mais leurs effets à long terme sur la santé et les capacités d’adaptation des organismes aquatiques et notamment des poissons sont encore peu évalués, notamment en conditions réalistes de stress multiples (parasites, température…). Le projet vise à évaluer les impacts potentiels des stress environnementaux multiples (notamment chimiques) en combinant des approches en laboratoire et sur le terrain, au plus près du réalisme environnemental.

Bénéfices attendus

A terme les résultats de ce projet permettront de caractériser les effets des pollutions environnementales sur la santé des poissons, et de mieux comprendre les réponses comportementales et physiologiques des animaux soumis aux stress chimiques. Ils permettront donc de mieux comprendre et anticiper les effets des pollutions d'origine humaine sur la santé de la faune sauvage.

Procédures

Pour tester leur réponse aux stress chimiques, des poissons seront exposés à des polluants en dose et cocktails réalistes au plus proche des concentrations trouvées en rivière, et ce pendant une durée maximale de 21 jours pour éviter tout effet mortel, mais observer des effets physiologiques et comportementaux. Dans un premier temps, des approches en laboratoire seront utilisées afin de tester les effets des polluants en conditions contrôlées sur carassins et goujons, notamment des cocktails de contaminants représentatifs du milieu naturel en se basant sur des bases de données existantes. Pour tester la variabilité de réponse entre populations sauvages hétérogènes, plusieurs populations sauvages de goujons ayant évolué dans des rivières plus ou moins polluées seront comparées. Dans un deuxième temps, des expérimentations d’encagement en rivière seront mises en place afin de tester les réponses des poissons en conditions réalistes de multistress sur le terrain. Des goujons issus de populations plus ou moins exposées aux pesticides, et des truites également issues de zones plus ou moins polluées par des métaux, seront transplantés en cage dans des rivières contaminées ou peu contaminées. Les cages seront de dimensions suffisante avec un grillage fin de 5 mm qui laisse passer les invertébrés pour la nourriture. Les poissons seront exposés pendant 14 à 21 jours à des rivières plus ou moins polluées que leur rivière d’origine. Après toutes les expositions en laboratoire ou rivière, les poissons seront anesthésiés, marqués avec des colorants non toxiques par injection sous-cutanée, mesurés (poids et longueur totale), une unique injection sous-cutanée d’antigène mimant une attaque parasitaire pourra être effectuée au niveau de la queue afin de tester l’immunité des poissons. Au total ces interventions sont réalisées en moins de 2 minutes. Enfin les poissons seront euthanasiés par surdose d’anesthésique, et les taux de contamination de leurs tissus seront mesurés, ainsi que leur état de santé à partir de diverses mesures dans les tissus (nageoires, foie, rein, muscles, sang).

Impact sur les animaux

Pour l’ensemble des démarches expérimentales, excepté celles impliquant le carassin domestique et les goujons d’élevage (animaux d’élevage), la capture des individus sauvages sera réalisée par pêche électrique. Cette procédure de pêche peut causer un stress mais elle sera effectuée par des personnels formés et après demande d’autorisation auprès des autorités compétentes via l’utilisation de matériel spécifique respectant la législation en vigueur. Le voltage utilisé sera adapté pour causer une sédation légère et rapide des poissons qui seront ensuite transportés dans des conteneurs isothermes oxygénés puis acclimatés en laboratoire ou dans les cages en rivière pendant 7 jours minimum pour limiter le stress de capture, de transport et de captivité. Les démarches expérimentales (en laboratoire et en rivière) impliquent des expositions à des polluants qui peuvent causer des dommages mais les cocktails et doses seront relativement faibles car représentatives du milieu naturel. De plus, les durées d’exposition seront relativement courtes (21 jours maximum) pour observer des réponses physiologiques mesurables tout en limitant les dommages pathologiques potentiels infligés aux organismes d’étude et la mortalité. En effet l’objectif étant de mimer des niveaux de stress réalistes et des effets non létaux. Le reste des procédures (mesures, prises de sang, injections) aura lieu sous anesthésie de quelques minutes et devrait causer un stress limité.

Devenir

Les animaux pêchés par pêche électrique seront euthanasiés pour être disséqués post-mortem. Les animaux pêchés mais jugés de taille extrême (trop petit ou trop grand) seront immédiatement remis à l'eau après vérification de leur état après passage dans un seau de réveil.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant de caractériser l’effet des stress multiples sur la variation des réponses physiologiques des poissons d’eau douce, l’utilisation de méthodes de remplacement (par exemple test sur cultures cellulaires) en vue de limiter le nombre d’animaux vivants utilisés dans le projet ne peut être appliquée. Néanmoins, afin de limiter le prélèvement d’individus dans le milieu naturel, des carassins seront utilisés ainsi que des goujons d’élevages pour remplacer une population sauvage (population de référence non polluée) afin d’affiner la caractérisation des processus physiologiques impliqués dans la réponse à une exposition à des stress multiples.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, un maximum d’information sera tiré de chaque individu en utilisant un maximum de mesures sur les organes pertinents. Nous avons préalablement réalisé une étude statistique pour déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser dans chaque procédure et dans chaque lot pour obtenir un résultat statistiquement probant. A posteriori, des traitements statistiques seront également effectués pour mettre en évidence des différences significatives entre les lots et les modalités d’exposition.

Raffinement

Afin de limiter le stress induit par la captivité des animaux (aquariums et cages), les individus seront maintenus en groupe de 5 à 10 individus maximum avec une densité d’environ 1 cm de poisson pour 1 L d’eau. En laboratoire, la photopériode sera fixée à 12h de jour/12h d’obscurité (lors des phases expérimentales) et la qualité de l’eau sera assurée quotidiennement via la mise en place d’un système de filtration propre à chaque aquarium et la mesure régulière des paramètres physico-chimiques. Dans le cas où certains de ces paramètres (en particulier les produits azotés) dépasseraient les optimums de chaque espèce, des renouvellements d’eau partiels seront effectués. Les aquariums d’exposition seront alimentés avec de l’eau du réseau, filtrée et stérilisée. Pour les phases de stabulation, les bacs seront alimentés par de l’eau du réseau. Des refuges seront introduits dans tous les bacs de stabulation et cages afin de limiter le stress et enrichir le milieu. Il n’est pas possible de placer des refuges dans les aquariums d’exposition en raison de l’adsorption des polluants sur les surfaces des refuges. Un suivi régulier des aquariums et des cages sera effectué quotidiennement pour surveiller l’état des animaux notamment pendant les phases d’exposition.

Choix des espèces

La pertinence de l’utilisation des poissons et plus particulièrement des 3 espèces sélectionnées se justifie par le fait que : - Le carassin domestique Carassius auratus est un animal utilisé depuis plusieurs décennies en recherche. Sa physiologie, son mode de vie et ses besoins sont connus et bien documentés. - Concernant les 2 espèces sauvages, le goujon Gobio occitaniae et la truite fario sauvage Salmo trutta trutta, ces dernières ont été sélectionnées car elles sont bien implantées dans notre zone d'étude. Comme pour le carassin, leur physiologie est connue et bien documentée. - Ces espèces ayant des exigences différentes (en termes d'habitat, de régime alimentaire, de déplacement…), elles sont exposées aux polluants de manière différente. Ainsi, les goujons seront soumis à des contaminations liées aux polluants utilisés en agriculture, alors que les truites seront soumises à des contaminations métalliques minières. Tous les poissons utilisés seront des adultes ou jeunes adultes d’une taille d’environ 10 cm (carassins et goujon adultes, truitelles jeunes adultes). Nous utilisons des adultes pour deux raisons essentielles : - la pêche d'adultes dans le milieu naturel permet de ne pas compromettre la régénération des populations sauvages - les adultes sont sexés et donc sexables. Par conséquent le sexe dans animaux étant connu, il est possible d'intégrer ce facteur de variation à notre étude statistique, pour mettre en évidence un éventuel impact du sexe dans le comportement et/ou la physiologie des animaux exposés aux contaminants.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de phalange, des injections intrapéritonéales, une chirurgie de dénervation chimique par injection d'une toxine dans le tissu adipeux, un régime hypercalorique et une exposition au froid à 6 °C, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur répète que ces gestes n'entraînent "aucune nuisance supplémentaire", la fonction étudiée étant présentée comme "bénéfique". Les retombées, une nouvelle cible thérapeutique contre l'obésité, restent renvoyées à l'avenir, et le porteur justifie le prélèvement de tissus non utilisés par une banque censée réduire le recours futur à d'autres animaux.

Objectifs

L’obésité, qualifiée d’épidémie depuis 1997 par l’OMS, touche plus de 1,9 milliards d’adulte dans le monde. De plus, l’OMS prévoit qu’un quart de la population mondiale sera obèse d’ici 2045. L’obésité se caractérise par une surcharge pondérale et favorise le développement de nombreuses complications et qui impliquent le dysfonctionnement de nombreux organes, tels que le foie et le tissu adipeux. Dans ce contexte, contrairement aux effets délétères associés à une augmentation de la production de glucose (sucre) par le foie, la production intestinale de glucose (PIG) est une fonction particulièrement intéressante, puisqu’elle améliore le métabolisme. En effet, le sucre produit par l’intestin active un signal nerveux qui se traduit, au niveau du cerveau, par une induction de la satiété (diminution de la prise alimentaire), une augmentation de la sensibilité à l’insuline et une diminution de la production de glucose par le foie. Le rôle important de la PIG dans la régulation du métabolisme a été démontré grâce à la caractérisation du phénotype de deux modèles murins : d’invalidation ou d’induction de la PIG. Ainsi, les résultats montrent que la PIG est capables de favoriser ou de protéger de l’apparition de nombreux troubles métaboliques tels que l’obésité, le diabète, la stéatose hépatique ou encore la dyslipidémie. Plus particulièrement, ces études ont permis de mettre en évidence le rôle de la PIG dans la régulation du métabolisme du tissu adipeux, et notamment sur sa fonction de production de chaleur (thermogenèse) qui est un poste de dépense d’énergie important dans la résistance au froid, mais également dans le maintien de la balance énergétique (et par conséquent du poids corporel). En effet, de nombreuses études visent à augmenter la dépense d’énergie en modulant la thermogenèse du tissu adipeux, dont on sait qu’elle est diminuée au cours de l’obésité. Puisque cette fonction est principalement sous le contrôle du système nerveux sympathique (SNS), cette étude vise à déterminer si les effets de la PIG sur le métabolisme du tissu adipeux passent une activation du SNS et préciser les mécanismes impliqués. Cette étude est réalisée dans différentes conditions nutritionnelles afin de nous d’étudier les effets métaboliques de la PIG dans un état physiologique (régime standard) et pathologique (régime hypercalorique riche en gras et en sucre).

Bénéfices attendus

La PIG est une fonction qui exerce des effets bénéfiques anti-obésité, anti-diabète et anti-stéatose hépatique lorsque les souris sont soumises à un régime hypercalorique pendant 5 mois. De plus, l’activation de la PIG améliore le métabolisme du tissu adipeux en diminuant l’adiposité et en augmentant la thermogenèse (production de chaleur) par le tissu adipeux brun (TAB) et le tissu adipeux blanc épididymaire (TAE), se traduisant par une amélioration de la tolérance au froid. Néanmoins, alors que les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques de la PIG sur la résistance au froid et la protection contre l’obésité restent encore mal compris, nous proposons ici que le système nerveux sympathique innervant les tissus adipeux jouerait un rôle essentiel. Ainsi, grâce à ce projet, une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu permettra à l’avenir de proposer la PIG comme une nouvelle cible thérapeutique contre l’obésité, dont la prévalence à l’échelle mondiale a considérablement augmenté ces dernières années.

Procédures

Les différents modèles de souris génétiquement modifiées nécessaires à ce projet seront obtenus par modification génétique. Ainsi, une biopsie de tissu (au niveau de la 1ère phalange, inférieure à 1 mm) réalisée à l’âge de 7 à 10 jours est nécessaire pour vérifier la modification de leurs gènes. Ce geste est réalisé en quelques secondes. L’activation génétique de la PIG ne nécessite aucune intervention supplémentaire. Néanmoins, l’invalidation de la PIG sera réalisée par un traitement injecté (dans le péritoine) à l’âge de 6-8 semaines (5 jours de suite). Les souris de type naturel (contrôle) recevront le même traitement. Ce geste est réalisé en quelques secondes. Afin de déterminer si les effets bénéfiques de l’induction de la PIG passent par le système nerveux sympathique du tissu adipeux brun interscapulaire (TAB) ou du tissu adipeux blanc épididymaire (TAE), nous réaliserons des chirurgies de dénervation chimique spécifique des fibres sympathiques grâce à l’injection d’une toxine directement dans l’un de ces tissus. Ces chirurgies seront réalisées chez des souris contrôles ou ayant une PIG activée, nourries avec une alimentation standard ou hypercalorique. Cette intervention est très rapide n’excédant pas 15-20min par animal. Les effets de la dénervation sur la résistance au froid seront évalués après une exposition des souris à une température froide. Les souris seront exposées à une température froide de 6°C pour 4h (7jours après la chirurgie), et la température rectale sera mesurée (avant/après). Alors que 24h d’exposition au froid n’entraine aucun dommage sur l’animal , 4h d’exposition au froid ne devrait pas présenter d’effets dommageables pour l’animal. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes, en particulier les tissus adipeux et l’intestin.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en PIG présentent un phénotype anxieux léger (comportement exploratoire diminué et plus forte résignation). Néanmoins, d’après notre expérience, l’hébergement en groupe et l’apport d’enrichissement est suffisant pour atténuer l’anxiété. Les souris chez lesquelles la PIG est activée seront nourries avec un régime standard ou riche en graisses et en sucres. Ce dernier favorise la prise de poids et le diabète, néanmoins, avec le temps de régime prévu dans ce projet, les souris seront étudiées à un stade précoce afin de limiter les complications liées à ces maladies. De plus, la PIG étant une fonction bénéfique, aucune nuisance supplémentaire n’est attendue. Nous réaliserons une dénervation chimique spécifique des fibres sympathiques grâce à l’injection d’une toxine dans les différents tissus adipeux (l’un ou l’autre) de souris contrôles ou chez lesquelles la PIG est activée (nourries avec un régime standard ou hypercalorique). Cette dénervation sympathique est une bonne alternative à la dénervation chirurgicale qui est plus invasive et moins spécifique. De plus, l’injection locale restreinte à un tissu n’entraine aucun effet délétère ou douloureux (ni aucun problème de cicatrisation). Les souris seront exposées à une température froide de 6°C pour 4h (7jours après la chirurgie), et la température rectale sera mesurée (avant/après). Alors que 24h d’exposition au froid n’entraine aucun dommage sur l’animal, 4h d’exposition au froid ne devrait pas présenter d’effets dommageables pour l’animal. Une dénervation du TAE sera réalisée chez des souris nourries avec une alimentation standard. Dès le lendemain de la chirurgie, les souris seront soumises à un régime hypercalorique pendant 1 mois (4 semaines). La dénervation du TAE ne devrait pas entrainer d’effets indésirables supplémentaires par rapport à celle du TAB. De plus, l’apport d’un régime hypercalorique pendant seulement 4 semaines permet de limiter les dommages sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et de différents tissus. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin de comprendre les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques de la production de sucres (glucose) par l’intestin. Des tissus non nécessaires à ce projet seront également prélevés afin de constituer une banque de tissus qui permettra à l’avenir de réduire le recours à des animaux supplémentaires.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la fonction étudiée, la production de glucose par l’intestin, a des impacts sur l’ensemble du métabolisme de l’organisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté au niveau des senseurs de glucose (détecteurs) dans les vaisseaux sanguins entre l’intestin et le foie, et qui vont transmettre un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie, régulant en particulier le métabolisme du tissu adipeux.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept. Afin de pouvoir faire une analyse statistique pertinente, des groupes de 10 souris seront analysés. Au total, 160 souris mâles transgéniques et de type naturel (contrôles). En fin de procédures, les animaux seront mis à mort afin de prélever différents tissus à analyser, mais également de nombreux autres tissus pour constituer une banque de tissus utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans animaux supplémentaires.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées par groupe 3-4 souris par cage en milieu enrichi pour favoriser la nidation (coton de nidation, bois à ronger) et contrôlé. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés régulièrement pour suivre leur prise de poids. Les procédures sont maitrisées par les personnes en charge de l’expérimentation animale. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole ou lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet selon les méthodes autorisées par la législation. Dans les conditions d’hébergement (groupe et enrichissement) aucun phénotype dommageable n’est observé chez les souris déficientes en production intestinale de glucose. Cependant, une attention particulière sera portée sur cette lignée ayant une susceptibilité à l’anxiété augmentée dans des conditions de challenge du stress. Une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée sera mise en place lors des chirurgies .

Choix des espèces

Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production endogène de glucose, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme. De plus, le phénotype des modèles murins utilisés dans ce projet a été largement caractérisé au laboratoire depuis de nombreuses années. Par ailleurs, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kits biochimiques…). Nous souhaitons utiliser dans nos expériences des souris C57BL/6J, lignée murine choisie pour pouvoir comparer les résultats avec nos lignées transgéniques utilisées sur le même fond génétique. Cette souche a également été choisie car c’est une bonne souche pour l’étude du diabète et des maladies métaboliques. Les animaux provenant d’un éleveur agréé (souris de type naturel: C57BL/6J) seront commandés à 4 semaines afin qu’ils soient hébergés dans les mêmes conditions que les animaux transgéniques (sevrés à 4 semaines). Cela permet de limiter les biais expérimentaux dus à des conditions d’hébergement différents. A l’âge de 6-8 semaines, les souris (qui vont devenir déficientes en PIG) recevront des injections pour induire la modification génétique. Ces injections se font à l’âge adulte pour limiter les effets de la molécule sur le métabolisme des jeunes souris. L’activation de la PIG ne nécessite aucune intervention, mais les souris seront étudiées aux mêmes âges pour pouvoir comparer les résultats. Ainsi, après réalisation de la modification génétique à l’âge adulte, les animaux seront étudiés à l’âge de 11-13 semaines (soit 5 semaines après les injections, temps nécessaire à la disparition des effets potentiels de la molécule sur le métabolisme). Ainsi, à l’issu des différentes procédures, les souris âgées de 13, 14, 17 ou 34 semaines, seront mises à mort pour prélever des tissus à analyser.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de cancer colique et des gavages répétés, puis sont tuées pour prélever tumeur, côlon, foie, rate, sang et fèces, afin d'étudier le rôle d'un acide aminé, la sérine, dans l'effet pro-cancérigène d'une bactérie E. coli. Le porteur indique que le développement tumoral devrait provoquer une perte de poids, un amaigrissement et de possibles lésions cutanées ou nécroses. Les retombées pour les patients, une alimentation appauvrie en sérine après chirurgie, restent renvoyées au long terme, et le porteur affirme l'expérimentation animale "indispensable" faute d'alternative in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour but de poursuivre nos études en précisant les mécanismes d’action impliqués dans la capacité à participer au développement du cancer colorectal (CCR) suite à une infection bacterienne. Nos travaux préalablement publiés démontraient que l’infection avec des souches d’Escherichia coli producteurs de colibactine (CoPEC) isolées de CCR humains accéléraient le développement tumoral sur des modèles murins de carcinogenèse colique et via des mécanismes induits au niveau des cellules épithéliales intestinales. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire semblent démontrer le rôle essentiel d’un acide amine, la serine, dans les effets pro-carcinogènes des CoPEC, au niveau des cellules épithéliales intestinales et dans un modèle murin de prédisposition à développer un CCR. Ce dernier est un modèle long (4 mois), et la taille des tumeurs ne suffit pas à réaliser une étude mécanistique complète de la carcinogenèse. Ainsi, nous proposons d’évaluer l’effet d’une alimentation déplétée en serine sur le rôle pro-carcinogene des CoPEC dans un autre modèle murin. Pour cela, nous évaluerons le développement tumoral de cellules d’adénocarcinome colique murines greffées en sous-cutané chez la souris. Nous avons choisi de travailler chez la souris C57BL/6 avec un modèle murin syngènique afin de nous affranchir des limites de la xénogreffe, en injectant des cellules d’adenocarcinome colique murines MC38 isolées de souris C57BL/6. Il s’agit donc d’un modele tumoral se developpant assez rapidement (20 jours) et qui nous permettra d’obtenir suffisamment de materiel biologique pour les différentes études.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus pourraient nous permettre de conclure sur l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène à distance des CoPEC. Plus précisément, à long terme les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant la colonisation bactérienne chez les patients. Suite à une chirurgie et afin de limiter la recolonisation du tratus digestif par les E. coli producteurs de colibactine, il pourra être envisagé d'administrer aux patients une nourriture artificiel déplétée en sérine.

Procédures

Aucun prélèvement ne sera effectué pendant la durée de l’expérience, en dehors du prélèvement de fèces (1 fois par semaine après gavage soit 5 fois) . En revanche, des prélèvements seront réalisés sur animaux après la mise à mort (feces, sang, tumeur, côlon, foie, rate).

Impact sur les animaux

L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal ainsi que l'aspect et la localisation de la tumeur. Une baisse d'activité́, de locomotion ainsi qu'une perte de poil et un amaigrissement sont attendus au cours de l'expérimentation. D'éventuelles lésions cutanées/nécroses lié au développement tumoral pourront aussi être observées.

Devenir

Des prélèvements de tissus (tumeur, côlon, foie, rate), de sang et de fèces seront réalisés sur chaque animal. Des études histologiques et moléculaires seront ensuite mises en œuvre afin d’évaluer l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène à distance des CoPEC et de mieux comprendre les mécanismes d’interaction bactéries/hôtes/nutrition sur la carcinogenèse colique.

Remplacement

L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n’est pas possible d’étudier le rôle de la sérine sur les effet pro-carcinogènes des bactéries suite à une infection chronique en méthode in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité de la colonisation et de prise de la greffe entre les différents animaux. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage et aux injections sous cutanées, le nombre d'animaux par lot a été réduit au minimum Ainsi, nous avons montré que l’effectif optimal était de 10souris/groupe. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d'abord, un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau et de nourriture, observera le comportement général de l’animal (activité́, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, perte de poids) ainsi que l’aspect et la localisation de la tumeur. Cela permettra de repérer d’éventuelles lésions cutanées/nécroses, ainsi que des développements tumoraux trop importants qui pourraient gêner la souris. Ce suivi sera réalisé par une personne formée en interne au suivi des animaux et désignée compétente à détecter les signes de comportement anormal. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de scooring. Une mise à mort anticipée de l’animale sera réalisée si besoin.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l'homme. Ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur des questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal.

Pour provoquer une chute des plaquettes, des souris reçoivent des chimiothérapies anticancéreuses, 5-FU, carboplatine, gemcitabine ou bortezomib, injectées sous anesthésie gazeuse et suivies de prises de sang à la queue. 269 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements et des analyses post-mortem. L'équipe étudie comment les mégacaryocytes de la moelle osseuse libèrent les plaquettes dans le sang, et retient pour l'imagerie des souris de quatre à huit semaines, dont l'os du crâne est assez fin pour laisser passer la lumière. Une opération chirurgicale sous anesthésie attend en plus 95 d'entre elles, sans que le résumé dise laquelle.

Objectifs

La thrombopénie correspond à une baisse du nombre de plaquettes sanguines exposant les patients à des risques hémorragiques. Il s'agit d'un problème clinique courant chez les patients traités par chimiothérapie. Les plaquettes sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse. Une étape clé et mal comprise dans leur formation est la libération des plaquettes dans la circulation sanguine (intravasation). L’exploration de l’intravasation in vivo constitue encore aujourd’hui un véritable défi car ces événements sont rares dans la moelle. Nous avons montré précédemment que cette étape dépend d’une structure cellulaire particulière : la PodoPZ (extensions permettant de palper son environnement). La PodoPZ permet aux MKs de libérer les plaquettes dans la circulation sanguine. Notre hypothèse est que la PodoPZ contribue à restaurer une numération plaquettaire normale après thrombopénie induite par les agents chimio-thérapeutiques anti-tumoraux (CIT). Ainsi, le but de ce projet est d’étudier l’importance de la PodoPZ dans les thrombopénies liées aux chimiothérapies.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre le fonctionnement de la PodoPZ (zone périphérique des cellules riche en actine et myosine) dans une étape clé et indispensable de la formation des plaquettes sanguines, l’intravasation des MKs. Sur le plan clinique, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de la PodoPZ pour améliorer la prise en charge des CIT, offrant ainsi une méthode alternative de traitement de la thrombopénie.

Procédures

L'ensembles des 269 animaux seront soumis au début des expériences à des injections et prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse pendant 10 minutes. De plus 95 animaux seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les traitements de CIT, les souffrances infligées aux animaux sont légères puisqu’il s’agit principalement d’injections et de prélèvements de sang à la queue sur animal anesthésié. Les protocoles liés au 5-FU et au Romiplostim ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids. Pour les trois autres substances (Carboplatine, Gemcitabine, Bortezomib), le choix des doses et des voies d’injections sont basés sur des études publiées de la littérature qui n’indiquent pas d’effets néfastes ou de saignements. En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux et classons nos procédures en modérées. Pour cela, nous allons surveiller le réveil de l’animal et son état général, des critères qui seront notés dans nos fiches de suivi. Par ailleurs, les souris feront l’objet d’un suivi quotidien basé sur l’apparence, l’abreuvement, l’alimentation, l’examen clinique et le comportement de l’animal, en utilisant les grilles de scores cliniques.

Devenir

A l’issu des procédures les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, l’intravasation met en œuvre simultanément des interactions entre MKs, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal. Nous avons effectué les études préliminaires possibles en culture cellulaire avant de passer sur le modèle animal qui s’avère être la seule solution pour étudier ces phénomènes complexes dans leur intégralité.

Réduction

Nos expériences sont optimisées pour utiliser le moins d'animaux possible ainsi le maximum de prélèvements seront effectués : sang, tissus, organes pour avoir accès aux différentes expériences nécessaires au projet. Le nombre de souris nécessaires pour obtenir des résultats significatifs est calculé en amont suivant un calcul statistique bien défini et détaillé dans la demande de projet. On estime par ce calcul que le nombre d’animaux par lot doit être de n=9 (3 souris par groupe sur 3 séries différentes), l'effet attendu de nos traitements est augmenté de 5x par rapport aux témoins (thrombopénie et rebond selon la littérature).

Raffinement

Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs (ex : anticorps, souris génétiquement modifiées GFP-myosine permettant de visualiser en temps réel la PodoPZ). La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. L’approche d’imagerie requière des animaux à un stade de développement jeune (de 4 à 8 semaines) car ils ont l’os du crâne suffisamment fin pour laisser passer la lumière. Pour les autres expériences les souris seront utilisées entre 8-18 semaines.