Oncologie
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Etude du rôle de la protéine Slc20a2/PiT2 dans le métabolisme énergétique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Une partie des souris est invalidée pour le gène Slc20a2 et ne produit pas la protéine PiT2, que l'équipe pense impliquée dans la production de chaleur par les tissus adipeux. 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour la pesée et l'analyse de leurs organes. Une partie reçoit jusqu'à 14 semaines un régime riche en graisse, certaines à thermoneutralité, et les souris subissent à jeun une prise de sang à la veine mandibulaire, puis des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avec cinq microprélèvements en deux heures par incision de la queue, sans anesthésie. Le porteur fixe le point limite à une prise de poids de 50 à 60 %, et prévoit une "légère réduction de la mobilité non dommageable".
Objectifs
Nous avions montré que l’absence de la protéine X chez la souris modifie le volume du tissu adipeux de la moelle au cours de la maturation squelettique et dans un modèle d’ostéoporose induite. Ces résultats nous ont conduit à étudier le rôle de cette protéine dans la régulation des tissus adipeux périphériques. Ces tissus adipeux jouent un rôle important dans la régulation du métabolisme énergétique grâce à leur fonction de sécrétion d'hormones, leur fonction de stockage des lipides dans les adipocytes blancs et leur capacité à dissiper l’énergie sous forme de chaleur. La régulation de la température par l'organisme est une fonction vitale qui permet de stabiliser la température corporelle et de lutter contre l’accumulation de masse grasse. Nos travaux récents indiquent que les masses de tissus adipeux sont inférieures en absence de la protéine X. Nos résultats préliminaires obtenus chez les mâles soumis à un régime riche en gras indiquent que les mâles dépourvus de cete protéine résistent à la prise de poids. Pour aller plus loin dans la compréhension des mécanismes d’action de cette protéine dans la régulation du métabolisme énergétique, nous allons poursuivre l’analyse du rôle métabolique de cette protéine chez les souris mâles et femelles, en répondant aux questions suivantes : - les femelles n'exprimant pas cette protéine sont-elles résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras ? - la faible quantité de tissus adipeux et la résistance à la prise de poids sous régime riche en gras des souris dépourvues de la protéine X sont-elles dues à une augmentation de l’activité de régulation de la température par les cellules des tissus adipeux ?
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier les mécanismes d’action de PiT2 comme nouveau régulateur de l’activité thermogénique des tissus adipeux. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de certaines maladies métaboliques, telle que l’obésité
Procédures
Les souris seront pesées une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure (Les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue, limitant le stress des animaux). Un prélèvement de 50µl de sang sera réalisé sur souris à jeun par ponction de la veine mandibulaire. Une semaine puis deux semaine avant la fin de la procédure, 5 micro-prélèvements seront réalisés sur une durée de 2h à l'aide d'une légère incision, maîtrisée par les expérimentateurs de ce projet et sous contrôle du personnel de la SBEA.
Impact sur les animaux
Ce protocole conduira à une prise de poids (maximum 50-60%) et à l’apparition d’une glycémie un peu plus élevée qu’en condition standard mais sans atteindre l’état de diabète (170-200mg/dl versus 140mg/dl). Pour les mesures de tolérance au glucose et à l’insuline, les prélèvements de sang sont faits à l'extrêmité de la queue, à l'aide d'une légère incision sur animaux vigiles : douleur légère et de courte durée. Une prise de 50μl de sang sera réalisée au niveau de la veine mandibulaire pour les dosages hormonaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélèvements d'organes (mesure du poids des organes, analyses histomorphométriques et analyses moléculaires)
Remplacement
Le projet concerne l'analyse des effets de l’absence d'une protéine sur la régulation du métabolisme énergétique dans des conditions standard ou dans un modèle d’obésité induite. Le métabolisme énergétique est sous le contrôle de plusieurs organes (tissus adipeux, muscle squelettique, foie, cerveau), nous avons donc besoin de l’organisme entier pour répondre à la question posée.
Réduction
D’après nos travaux antérieurs et nos analyses statistiques, n=12 animaux par groupe est le nombre suffisant pour observer une différence significative. Deux situations peuvent se présenter : 1/ les femelles mutantes sont résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras. Elles seront alors soumises à ce même régime à thermoneutralité pour vérifier si ce phénotype de résistance dépend du processus qui contrôle la température corporelle; 2/ les femelles mutantes se comportent comme les souris contrôles (gain de poids sous régime riche en gras). Le protocole s'arrêtera à cette étape (le nombre de souris total pour cette procédure sera alors réduit de 48 animaux).
Raffinement
Pour la mesure de poids hebdomadaire, les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue. Ce geste limite le stress des animaux. L'hébergement à thermoneutralité aura deux effets possibles : 1/ la résistance à la prise de poids est la même que celle observée à température ambiante dès les 8 premières semaines sous régime riche en gras ou 2/ les souris mutantes perdent leur capacité à résister au régime riche en gras. Dans le cas n°1, nous arrêterons le protocole après 8 semaines de régime puisque nous pourrons conclure sur les effets de la mise à thermoneutralité. La procédure sera donc réduite à 8 semaines au total. Dans le cas numéro 2, nous poursuivrons le protocole pour vérifier si la résistance apparait plus tardivement (maximum 14 semaines de régime riche en gras). Nous avons pris en compte le bien-être animal, un examen régulier permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant les analgésiques adaptés à notre procédure. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate). Nous identifions deux types de points limites. Les points limites généraux applicables à toutes nos expériences utilisant des souris et les points limites spécifiques à la procédure (prises de poids maximales attendues sous régime riche en gras de 50% à 60%). Cette prise de poids peut amener à une légère réduction de la mobilité non dommageable. Pour les tests de tolérance à l’insuline, nous utilisons une dose faible, mais si une souris présente une réponse trop marquée, celle-ci sera euthanasiée.
Choix des espèces
Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques comme l’obésité. Le modèle murin est utilisé de longue date pour comprendre les mécanismes physiopathologiques des maladies métaboliques. Ce projet est la poursuite de la caractérisation phénotypique de souris invalidées pour le gène Slc20a2 qui nous a permis de mettre en évidence, pour la première fois, un rôle potentiel de PiT2 dans la régulation du métabolisme énergétique (résultats non publiés). Sans ce modèle, cette nouvelle fonction n’aurait pas pu être découverte. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines, âge auquel le métabolisme énergétique est stable.
Evaluation des capacités d’un aliment enrichi en fibres à diminuer les effets délétères d’un stress chronique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles subissent un stress chronique de sept semaines, des prises de sang à la queue et une série de tests comportementaux dont la suspension par la queue et l'isolement en cage individuelle, pour évaluer si un aliment enrichi en fibres atténue les effets du stress. Le porteur attend des symptômes comme une toilette négligée et une perte de poids, les souris étant tuées pour analyser cerveau et tube digestif. Il présente l'axe microbiote-intestin-cerveau et affirme qu'aucune alternative non animale n'est assez sophistiquée pour cette étude, un bénéfice pour les troubles psychiatriques humains restant annoncé.
Objectifs
Le stress chronique a des effets délétères bien établis sur le cerveau et le comportement ; il favorise notamment l’émergence de symptômes d’anxiété et de dépression. Parallèlement, des études menées ces dernières années par divers groupes montrent que le stress chronique provoque un déséquilibre du microbiote intestinal. L’existence de l’axe microbiote-intestin-cerveau conduit à l’hypothèse qu’une partie au moins des symptômes neuro-comportementaux liés au stress chronique, tels que l’anxiété, la résignation ou l’incapacité à ressentir du plaisir, pourrait résulter du déséquilibre du microbiote intestinal. L’objectif du projet est de tester si une formulation alimentaire enrichie en fibres, connue pour favoriser le maintien de l’équilibre du microbiote intestinal, peut atténuer les conséquences néfastes du stress chronique sur le cerveau et le comportement.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de contribuer à documenter (i) le rôle et les mécanismes d’action du microbiote intestinal dans les perturbations cérébrales et comportementales induites par l’exposition à un stress chronique, (ii) la possibilité d’intervenir à l’échelle du régime alimentaire pour atténuer ces perturbations en préservant l’équilibre du microbiote. La progression des connaissances dans ce domaine peut avoir des bénéfices chez les êtres humains en améliorant la prise en charge des troubles psychologiques / psychiatriques liés au stress chronique. Ces bénéfices ont donc un intérêt dans le domaine de la santé humaine, mais aussi dans le domaine de l’économie de la santé, dans la mesure où des interventions nutritionnelles visant à préserver ou restaurer l’équilibre du microbiote intestinal sont moins coûteuses que le développement de médicaments.
Procédures
- 1 implantation sous-cutanée de transpondeur destinée à identifier les souris de manière unique et pérenne (souris vigiles, toutes les souris) - 2 prises de sang à la veine de la queue à 2 semaines d’intervalle (souris vigiles, toutes les souris) : 2 min maximum ; application préalable d’une crème anesthésique locale - 4 tests comportementaux impliquant une contrainte environnementale de quelques minutes (souris vigiles, toutes les souris, une fois par souris) : test de l’openfield pendant 6 min ; test du nouvel objet pendant 10 min maximum ; test du labyrinthe en croix surélevé pendant 5 min ; test de suspension par la queue pendant 6 min - 2 tests comportementaux impliquant un hébergement en cages individuelles de 6 jours (souris vigiles, toutes les souris, une fois par souris) : test de nidification consistant à fournir à chaque souris un carré de coton le soir et à évaluer le lendemain matin la qualité du nid construit ; test de préférence au sucre consistant à présenter aux souris pendant quelques jours consécutifs un biberon d’eau et un biberon d’eau sucrée ; la consommation des boissons est mesurée chaque jour. Les cages individuelles sont les unes à côté des autres de telle sorte que les souris peuvent se voir et communiquer par vocalisations ; leur environnement est enrichi (buchettes de bois à ronger, tunnels où se cacher, papier à déchiqueter).
Impact sur les animaux
Le projet porte sur le stress chronique. Il est donc attendu que les souris présentent, au fur et à mesure de la durée du stress, des symptômes tels que toilette négligée et perte de poids. Toutefois, il s’agit d’une procédure de stress chronique modéré, dont l’utilisation par de nombreux groupes montre qu’elle conduit à des symptômes modérés. Le test de suspension par la queue constituera un stress de quelques minutes ; les tests destinés à évaluer le comportement de type anxieux, qui durent au plus 10 min, provoqueront une anxiété transitoire légère ; les tests de nidification (une nuit) et de préférence pour le sucre (3 jours) nécessiteront d’héberger les souris en cages individuelles pendant 6 jours. Les prélèvements fécaux n’occasionneront aucune nuisance ou douleur aux animaux puisqu’il s’agit de selles spontanément émises. La prise de sang à la veine de la queue avant et après le test de suspension par la queue occasionnera une douleur transitoire légère.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de la procédure pour étudier différents paramètres biologiques dans les organes cibles de la procédure, à savoir le cerveau et le tube digestif.
Remplacement
A l’heure actuelle, étudier l’effet du stress chronique et d’une intervention nutritionnelle sur le cerveau et le comportement nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative technique non animale suffisamment sophistiquée pour le remplacer.
Réduction
Nous utiliserons 14 souris par groupe. L’expérience de différents groupes de recherche dans l’étude du comportement lors d’une procédure de stress chronique modéré imprévisible indique qu’un effectif de 12-15 souris par groupe est nécessaire pour mettre en évidence des effets statistiquement significatifs. En effet il arrive que certaines souris n’effectuent pas les tests comportementaux correctement ; leurs données doivent alors être éliminées, ce qui réduit artificiellement la taille du groupe et peut conduire à un effectif insuffisant pour espérer mettre en évidence un effet statistiquement significatif. Dans ce projet, les données issues des tests comportementaux seront analysées en deux étapes. Dans une première étape, nous comparerons les 3 groupes traités (stress chronique, stress chronique avec aliment enrichi en fibres à deux doses différentes) et le groupe témoin (pas de stress chronique ni d’intervention nutritionnelle) à l’aide à l’aide outils statistiques adaptés et validés pour ce type d’étude. Dans une seconde étape, nous analyserons mathématiquement l’effet dose de l’intervention nutritionnelle à l’aide des 3 groupes soumis au stress chronique : aliment témoin sans fibres (dose 0), aliment témoin avec fibres à la dose 1, aliment témoin avec fibres à la dose 2.
Raffinement
Le projet porte sur le stress chronique. Il est donc attendu que les souris présentent, au fur et à mesure de la durée du stress, des symptômes tels que toilette négligée et perte de poids. Afin de suivre l’intensité de ces symptômes, nous mesurerons le poids corporel et évaluerons l’état du pelage selon une grille de notation pré-établie, une fois par semaine pendant les 7 semaines de stress chronique. La grille de notation de l’état du pelage consiste à examiner 10 endroits du corps et à les noter 0 (pelage bien entretenu) ou 1 (pelage négligé) : les 10 notes sont additionnées pour aboutir à un score global pouvant aller de 0 à 10. Ces mesures permettront de vérifier que la procédure de stress chronique a les effets attendus et d’en ajuster les paramètres de façon à ce que ces effets restent modérés (perte de poids ne dépassant pas 15 %, score d’état du pelage ne dépassant pas 8). En effet, si la perte de poids excède 15 % du poids initial ou si le score d’état du pelage dépasse 8, la procédure de stress chronique sera immédiatement ajustée afin de diminuer ses effets. L’ajustement consistera à interrompre la procédure pendant 2 jours puis à la reprendre en atténuant son intensité. Afin de minimiser le stress subi lors des 2 prises de sang à la veine de la queue, les souris seront entraînées aux manipulations destinées à effectuer ces prises de sang. Toutes les souris disposeront d’un environnement enrichi grâce à des buchettes de bois à ronger, du papier à déchiqueter, des cylindres en plastique où se cacher et sur lesquels grimper.
Choix des espèces
La majorité des études précliniques publiées sur les effets du microbiote sur le cerveau et le comportement, en particulier celles étudiant l’influence de modifications alimentaires, font appel à des rongeurs, dont la souris. Nous pourrons donc comparer aisément nos résultats à ceux publiés dans la littérature sur ce sujet. Par ailleurs, la souris est un modèle très utilisé en neurosciences, pour lequel nous disposons de procédures de stress chronique et de tests comportementaux bien établies et utilisées par la communauté scientifique internationale de manière consensuelle. En particulier, la souris réagit au stress chronique par des comportements tels que l’anxiété, la résignation et l’incapacité à ressentir du plaisir. Elle est donc un bon modèle pour étudier le rôle du microbiote dans ce type de comportement. Nous utiliserons des animaux adultes (≥ 8 semaines), l’objectif étant d’étudier les effets d’une intervention nutritionnelle sur les effets néfastes d’un stress chronique chez des animaux dont le cerveau est complètement développé (donc après l’adolescence) et le microbiote stable (stade de vie adulte).
Utilisation du modèle murin C3(1)-Tag pour décrypter les mécanismes de la colonisation métastatique du cancer du sein triple négatif.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 716 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses pour provoquer des métastases, dans un modèle génétiquement modifié de cancer du sein triple négatif. Le porteur annonce des tumeurs pouvant s'ulcérer et saigner, une gêne respiratoire et des fractures spontanées liées aux métastases osseuses, les souris étant tuées pour prélever les organes colonisés. Il reconnaît écarter les souris au mauvais génotype issues de l'élevage et juge une étape in vivo "nécessaire", les débouchés thérapeutiques restant hypothétiques.
Objectifs
Les principaux obstacles de l'étude des métastases sont qu'elles se produisent dans un délai inconnu, qu'elles sont visuellement et expérimentalement inaccessibles, qu'elles sont généralement complexes, et qu'il est difficile de maintenir cette complexité dans un système in vitro. Par conséquent, la plupart des études sur les maladies métastatiques se sont concentrées sur le stade ultérieur du développement métastatique, une fois que les métastases sont déjà formées. Bien que ces études aient amélioré nos connaissances sur la capacité des cellules cancéreuses à métastaser, elles ne nous ont pas informés sur la façon dont les cellules cancéreuses s’adaptent à leur nouvel environnement pour former des tumeurs. Décrypter les mécanismes cellulaire et moléculaire de la colonisation métastatique est essentiel pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour limiter la récidive métastatique. L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de la colonisation métastatique des cancers du sein triple négatifs. Pour cela, nous proposons d’utiliser le modèle murin génétiquement modifié C3(1)-Tag qui développe des tumeurs et des métastases similaires aux patients. L’étude de la colonisation métastatique de ce modèle nous permettra de caractériser des acteurs moléculaires pertinents pouvant être cibler par une thérapie innovante. Le projet global consiste à étudier la formation de métastases de carcinomes mammaires, de l’arrivée des cellules cancéreuses dans un nouvel organe à la formation de tumeurs secondaires afin de définir : 1. Les différents phénotypes cellulaires présents au cours de la formation métastatique par séquençage à ARN des cellules cancéreuses à différents temps. 2. Le rôle des marqueurs mésenchymateux dans les cellules cancéreuses au niveau du site métastatique. 3. Les différences de colonisation métastatique entre les organes distants (poumons, foie, os). 4. L’impact du système immunitaire sur la colonisation métastatique.
Bénéfices attendus
Les patientes atteintes du cancer du sein triple négatif (TNBC) connaissent souvent une récidive métastatique et ont donc un pronostic plus sombre. Ces cancers agressifs constituent un groupe de cancers caractérisés par l'absence de récepteurs hormonaux (progestérone et œstrogènes) et de la protéine HER2 à la surface de leurs cellules. Ils ne sont donc pas éligibles aux traitements ciblant ces trois types de marqueurs. Pour atteindre l'objectif ultime de guérir les TNBC, il est important de développer des stratégies qui préviennent ou guérissent la maladie métastatique. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la formation et au développement des métastases de TNBC est une première étape cruciale vers le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour cibler la maladie métastatique. Le projet de recherche proposé a un potentiel important pour faire progresser notre compréhension des métastases de TNBC et donc de réduire la mortalité des patientes. La réussite de ce projet fournira de nouvelles informations sur la manière dont les cellules cancéreuses se disséminent au niveau des sites distants et si différentes stratégies thérapeutiques doivent être développées en fonction du site métastatique. De plus, les résultats obtenus ouvriront de nouvelles voies de recherche pour identifier des thérapies ciblées contre la maladie métastatique des TNBC.
Procédures
Les animaux pourront recevoir l’une des procédures suivantes : - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans les veines caudales latérales (durée : 5 minutes) - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans l’artère caudale (durée : 5 minute) - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans la veine porte sous anesthésie générale (durée : 30 minutes)
Impact sur les animaux
Le modèle C3(1)-Tag est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide mais rarement métastatique (moins de 15% des animaux développent des métastases spontanées). La croissance de la ou des tumeurs primaires peut provoquer des effets indésirables sur les animaux. Particulièrement, l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose centrale par hypoxie, associée à des remaniements cutanés ulcératifs et hémorragiques entraînant une douleur pour l’animal. L’induction de métastases par injection chez la souris peut entrainer des difficultés fonctionnelles au niveau des organes colonisés. Notamment, au niveau du poumon une dyspnée peut être observée due à la présence mécanique des métastases. Des fractures spontanées peuvent être observées due à la présence mécanique de la masse dans le fût osseux. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit. Des observations et examens cliniques seront réalisés tous les deux à trois jours afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront alors surveillés tous les jours afin de leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites majeurs.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés après chaque procédure. Pour la procédure 1 (élevage des souris C3(1)-Tag), les souris n’ayant pas le bon génotype seront euthanasiées (car elles ne peuvent être utilisées dans d'autres procédures).Lles souris femelles développant des tumeurs mammaires seront euthanasiées pour le prélèvement des tumeurs, les souris mâles trop âgées pour le croisement ou présentant des tumeurs seront euthanasiées. Pour les procédures 2 et 3 les souris seront euthanasiées aux différents temps nécessaires à notre étude sur la formation de métastases (de la colonisation d’un nouvel organe à la formation d’une tumeur secondaire) afin de collecter les organes contenant des métastases pour analyse.
Remplacement
Le projet s’intéresse à la caractérisation des mécanismes de colonisation métastatique. Il est très compliqué de mimer in vitro une implantation métastatique ectopique complexe dans un terrain pulmonaire ou autre, riche en divers éléments micro-environnementaux. Une étape in vivo est donc nécessaire pour se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales au niveau la niche métastatique. De plus, il est compliqué de maintenir in vitro l’hétérogénéité phénotypique des cellules cancéreuses in vivo. Toutefois, avant implantation in vivo dans la souris, le phénotype des cellules cancéreuses sera étudié ex vivo sur des cultures en 3 dimensions d’organoïdes fraichement isolés et en culture de tranches de poumons. Par exemple, l’effet de l’amplification ou délétion de gènes d’intérêts sera évalué ex vivo afin d’éliminer les cibles n’ayant pas d’effet sur le phénotype des cellules cancéreuses.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale (planification, randomisation et analyse) par l’utilisation de traitements statistiques des données (ANOVA, Bartlett,…). Les protocoles d’injection issus de la bibliographie sont validés et robustes permettant une prise tumorale optimale sur l’ensemble des individus de la cohorte, limitant l’utilisation d’animaux dont les prélèvements se révèlent non analysables. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en se basant sur notre expérience de ce modèle et pourra être réduit en fonction des résultats préliminaires qui seront obtenus ex vivo. L’ensemble du protocole expérimental sera précisément défini en amont afin de limiter les biais de non-homogénéité entre lots de souris. De plus, nous allons utiliser le modèle de culture de tranches de poumons. Brièvement, après injection des cellules cancéreuses par voie intraveineuse au niveau de la queue de souris, l’animal est euthanasié et les poumons sont rapidement récupérés et coupés en tranches fines puis mis en culture. Pour chaque poumon isolé, nous pouvons générer environ 20 tranches ce qui permet de tester in vitro jusqu’à 10 conditions différentes en utilisant un seul animal. En effet, selon notre expérience, au moins la moitié des tranches de poumons présentent des cellules cancéreuses. Cet essai est particulièrement utile pour étudier l’effet de molécules sur les cellules cancéreuses et le tissu pulmonaire en amont de test in vivo.
Raffinement
Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’élevage possible, notamment via un maintien des groupes sociaux (4- 5 animaux par cage) et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier ajoutés aux cages). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une contention la plus rapide et la moins fréquente possible. Nous avons une grande expérience des injections intraveineuse caudales qui nous permet de les réaliser rapidement en limitant le stress chez l’animal. La douleur des animaux utilisés sera fréquemment monitorée par un examen clinique des animaux tous les 2-3 jours afin de déterminer la présence de signes cliniques puis quotidiennement si l’état générale des animaux se dégrade afin d’adapter le plus précocement possible les points critiques chez un animal et d’adapter le protocole d’anesthésie.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - Le modèle C3(1)-Tag de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie. - Concordance du modèle C3(1)-Tag murin avec les observations cliniques chez les femmes atteintes de cancer du sein triple négatif. - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - L'organisme évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine - Certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (absence du système immunitaire pour mettre en lumière le rôle de ce dernier dans la colonisation métastatique). - Modèle C3(1)-Tag : les souris C3(1)-Tag développent des tumeurs spontanées à partir de 16 semaines avec des tumeurs d’environ 17 mm de diamètre (1500 mm3, point limite) aux alentours de 22 semaines. Afin de récupérer un maximum de tissu cancéreux, les souris seront utilisées lorsqu’elles présenteront au moins une tumeur de 17 mm de diamètre (environ 1500 mm3), sauf si un point limite est atteint avant. - Modèle NSG : les souris seront utilisées entre 10 et 12 semaines, âge adulte permettant aux souris de supporter le développement de métastases. - Modèle REAR : similaire au modèle NSG, les souris seront injectées avec des cellules cancéreuse C3(1)-Tag entre 10 et 12 semaines pour permettre le développement de métastases.
Effets d’extraits de la biodiversité sur la prise de poids chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
240 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont suralimentés pendant quatorze jours pour induire un surpoids, traités avec des extraits de plantes puis soumis à une mesure de glycémie, pour évaluer l'efficacité de plantes dites anti-obésité. Le porteur n'attend pas d'effets indésirables mais surveille locomotion, arrêt alimentaire et coloration foncée signalant un stress, les poissons étant tués pour analyser leurs paramètres métaboliques. Il présente le poisson zèbre comme une "alternative" aux modèles mammifères tout en reconnaissant qu'aucune méthode sans animaux ne permet cette étude.
Objectifs
L'objectif du projet est de déterminer si les plantes médicinales étudiées et utilisées traditionnellement pour leurs propriétés dites "anti-diabétiques" / "anti-obésité" ont une réelle efficacité sur la prise de poids et sur les effets délétères au niveau systémique et central de l'obésité
Bénéfices attendus
Si nous démontrons que certaines plantes présentent des propriétés anti-prise de poids, nous pourrons investiguer la ou les molécules responsables de ces activités afin de développer des analogues chimiques et à terme développer des médicaments contre le surpoids/obésité.
Procédures
1) Suralimentation pour les animaux traités. La suralimentation aura lieu pour une durée de 14 jours (11 groupes de 20 animaux) 2) Traitement par les plantes (10 groupes de 20 animaux) 3) Pesée des animaux et mesure de la taille des animaux pour le calcul de l'indice de masse corporelle (12 groupes de 10 animaux) 4) En fin d'expérimentation, mesure de la glycémie (12 groupes de 10 animaux)
Impact sur les animaux
Ces plantes étant enregistrées à la pharmacopée française, elles sont reconnues pour leurs absences d'effets toxiques dans les conditions d'utilisation de la médecine traditionnelle. De plus, nous avons aussi déjà réalisées des études de toxicité chez l'embryon de poisson zèbre selon les recommendations de l'OCDE. Ainsi, les doses utilisées chez le poisson adulte ont déjà été montrées comme non toxique chez l'embryon. Par conséquent, nous n'attendons pas d'effets indésirables. Cependant, nous ne pouvons extrapoler ces informations obtenues chez l'Homme et chez des stades embryonnaires de poissons zèbres adultes. Par conséquent, nous devons être vigilants quant à de possibles effets délétères/toxiques chez l'adulte.
Devenir
Après l'analyse des différentes mesures (poids etc...) les animaux seront remis dans les conditions expérimentales afin de poursuivre l'expérimentation. Néanmoins, à l'issue de l'expérimentation, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir analyser la glycémie et l'impact du traitement sur un certain nombre de paramètres d'intérêts au niveau périphérique et central (notamment inflammatoire et oxydatifs)
Remplacement
Le modèle animal est le seul modèle permettant d'étudier l'impact d'un régime alimentaire déséquilibré au niveau de l'organisme dans son ensemble (poids, perturbation hépatique, glycémique, cérébrale...). De plus, afin de tester l'effet d'extraits de la biodiversité sur les conséquences de ce régime alimentaire, le modèle animal est le seul nous permettant d'appréhender la complexité de cette approche. En effet, elle implique des effets pléiotropes à l'échelle physiologique des molécules issus des extraits de plantes et doit impérativement prendre en compte la métabolisation de ces molécules par un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d'animaux par conditionest de 20 au maximum Nous réaliserons d'abord l'expérience par groupe de 10 et si les résultats sont déjà intéressants d'un point de vue statistique, nous pourrons ainsi éviter de relancer une expérimentation avec 10 autres animaux Néanmoins, l'hétérogénéité des animaux et de la prise alimentaire individuelle ne nous permet pas dès lors de limiter l'expérimentation à 10 animaux/condition.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupe, avec une alimentation en artemia (petits crustacés) représentant une diversification et un enrichissement alimentaire. Les points limites qui seront obéservés seront la locomotion de l'animal (sil reste en bas de l'aquarium ou en haut, l'expérimentation sera arrétée). De même un arrêt de la prise alimentaire nous amènera à arréter l'expérimentation. Une coloration foncée témoignant d'un stress important sera étudiée et rapportée au vétérinaire afin d'arréter ou non la procédure (arrêt obligatoire si le changement de couleur est associé à des troubles du comportement dont la prise alimentaire).
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle solidement reconnu pour l’étude de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. Ceci tient au fait d’une forte conservation de ces processus au cours de l’évolution. Ainsi, le poisson zèbre est un modèle bien établi d’étude de l’immunité, de l’oncologie, de la réparation cellulaire et de toxicologie. Il possède toutes les enzymes de détoxification (CYP) tout comme l’Homme. De par des mécanismes physiologiques fortement conservés au cours de l’évolution, le poisson zèbre présente l’avantage d’être un modèle simplifié pour la physiologie humaine et la modélisation de maladies humaines. Il constitue une alternative à l’utilisation de modèles animaux mammifères. C'est un modèle couramment utilisé pour des études d'hyperglycémie (diabète) et de surpoids, ainsi que pour tester des extraits aux propriétés biologiques d'intérêts. Les animaux choisis seront des animaux adultes entre 3 mois et 1 an. Cet âge correspond à de jeunes adultes et la pathologie de surpoids/obésité touche particulièrement les jeunes adultes. Entre 3 mois et 1 an, il n'y a que peu de changements physiologiques. C'est pourquoi nous avons choisi cet âge.
Développement chez la souris d’une nouvelle méthode contraceptive non hormonale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Une souris qui présente démangeaisons, dermatite ou conjonctivite après l'ovule au lyral, un odorant que le porteur sait allergisant, est retirée de l'expérience et mise à mort. 640 souris Swiss CD1 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour tester une contraception non hormonale. Avant l'accouplement, l'expérimentateur introduit avec le pouce un ovule de la taille d'un grain de blé dans le vagin de la femelle, geste de deux minutes trente répétable jusqu'à trois fois, accompagné d'un massage destiné, selon le porteur, à "apporter du bien être à l'animal". La souche est retenue pour ses portées de plus de 10 souriceaux, et ces souriceaux sont immédiatement mis à mort. Les femelles retournent ensuite dans le pool pour d'autres accouplements, sans que le résumé dise ce qu'elles deviennent à la fin du projet.
Objectifs
La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Il a été montré qu’un odorant, le bourgeonal, modifiait in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes humains et que le lyral, un autre odorant, modifiait lui aussi in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes de souris. Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif, nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.
Bénéfices attendus
Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.
Procédures
L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement la souris est maintenue, sans contrainte par la base de la queue afin de permettre à l'expérimentateur d'accéder à la région vulvaire. L'ovule est introduit délicatement avec le pouce. L'expérimentateur maintient une légère pression avec son pouce sur la région génitale afin d'éviter une sortie de l'ovule et exerce un massage doux de la zone pour faciliter l'introduction complète de l'ovule et apporter du bien être à l'animal pendant ce geste. Le temps d'introduction complète est d'environ 2m30s et l'animal ne montre aucun signe de douleur ou de stress (pas de morsure, de réaction de fuite...) Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.
Impact sur les animaux
Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.
Remplacement
Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience. Par ailleurs, rappelons que les ovules sont de qualité pharmaceutique, fabriqués par une société pharmaceutique avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris mâles et femelles utilisées auront entre 8 à 48 semaines.
Isolement d’hépatocytes primaires de rongeurs (rat et souris)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 400
600 rongeurs, 400 rats et 200 souris, vont être utilisés, anesthésiés puis tués avant tout réveil, dans des procédures classées sans réveil. Chaque animal est mis à jeun douze heures, anesthésié, ouvert au niveau de l'abdomen pour que son foie soit canulé et perfusé, puis tué par section des vaisseaux, afin de récupérer des cellules du foie pour des cultures. Le porteur avance que l'opération "s'apparente davantage à du prélèvement sur organe" hors du champ de la réglementation, l'anesthésie préalable justifiant malgré tout l'autorisation. Il affirme qu'"aucun autre modèle n'existe" et qu'il est "incontournable" d'isoler ces cellules à partir d'animaux.
Objectifs
Toutes les fonctions cellulaires reposent sur la disponibilité en énergie dont la principale forme cellulaire est l'ATP. Sa production par le métabolisme intermédiaire est ajustée au mieux pour satisfaire les besoins et ainsi assurer la fonction associée, contribuant au bon état cellulaire. Un dérèglement du métabolisme intermédiaire peut être à l'origine de ou contribuer à l'installation de situations pathologiques (tumorigénèse, insuffisance cardiaque...) ou à des difficultés d'adaptation (vieillissement, nutrition...). La cellule hépatique est un excellent modèle pour l'étude de ce métabolisme intermédiaire qui représente une cible pour corriger les conséquences liées à ses altérations. Son étude est possible in vitro (cellules hépatiques en culture ou perifusées) ou sur extraits cellulaires. La quantité de cellules nécessaires est importante et ne peut pas être obtenue par culture classique de lignées. De plus, les propriétés métaboliques de la plupart des lignées cellulaires d'hépatocytes peuvent présenter des écarts par rapport au métabolisme de l'hépatocyte natif. Il est donc incontournable de les isoler à partir d'animaux, en fonction des besoins expérimentaux, des conditions à tester ou des résultats obtenus. Cet isolement s'apparente davantage à du prélèvement sur organe, donc en dehors du champ d'application de la réglementation. Cependant, une étape nécessite l'anesthésie préalable et la perfusion du foie avant prélèvement, justifiant la présente demande d'autorisation.
Bénéfices attendus
Toutes les utilisations de ces hépatocytes primaires isolés visent à contribuer à une meilleure compréhension des relations entre métabolisme énergétique et état cellulaire, à tester des molécules d'intérêt sur le métabolisme intermédiaire, à disséquer le fonctionnement de la glycolyse et de la mitochondrie. Ces travaux s'inscrivent dans l'utilisation à terme de ces deux éléments comme cible thérapeutique pouvant avoir un intéret dans la lutte contre certains états pathologiques ou pour améliorer les capacités d'adaptation cellulaire.
Procédures
La veille de son utilisation, un animal sélectionné au hasard est isolé en cage ouverte et mis à jeun pour 12h (retrait de sa nourriture à 19h). Le lendemain matin, une anesthésie/analgésie chimique est appliquée (30s) avant pratique de la laparotomie et canulation du foie (2min). Le foie est ensuite perfusé pour digestion des tissus conjonctifs (10 min) puis prélevé. L'animal est mis à mort par section des veines et artères du tronc abdominal.
Impact sur les animaux
Isolement en cage ouverte et mise à jeun pendant 12h la veille (retrait de la nourriture à 19h) pour l'animal sélectionné au hasard.
Devenir
Le prélèvement du foie entier n'est pas compatible avec la survie de l'animal. Il est donc mis à mort sans réveil préalable.
Remplacement
L'hépatocyte constitue un très bon modèle d'étude du métabolisme intermédiaire (glycolyse et fonction mitochondriale). Un indicateur de son bon fonctionnement métabolique est sa production de glucose in vitro. Certains projets imposent une mise en culture de cellules primaires afin de les exposer à divers facteurs ou molécules d'intérêt avant de les étudier ensuite. La mise en culture d'hépatocytes primaires impose leur obtention sur animaux au préalable. Seuls les hépatocytes primaires produisent suffisament de glucose en culture et permettent ainsi d'évaluer l'effet pharmocologique du produit ou de la condition expérimentale à tester. En effet, les lignées cellulaires présentent en général un métabolisme altéré (niveau métabolique trop faible et/ou peu de mitochondries). Ainsi, lorsque l'étude porte sur la fonction mitochondriale, l'obtention d'une quantité suffisante de mitochondries par fractionnement cellulaire à partir d'hépatocytes primaires est la seule solution, après les avoir mis en culture pour quelques dizaines d'heures. Aucun autre modèle n'existe à ce jour.
Réduction
Le nombre d'animaux indiqué est un nombre maximal, basé sur un rythme d'isolements d'hépatocytes de 3 par semaine en moyenne par an, sur 40 semaines d'activité. Les préparations d'hépatocytes isolés se font à la demande. En considérant deux préparations à partir de rat et une préparation à partir de souris par semaine, le nombre maximal prévisionnel est de 400 rats et 200 souris pour 5 ans.
Raffinement
La procédure est réalisée par des personnes compétentes, ayant suivi ou sous la responsabilité de personne ayant suivi une formation à la chirurgie expérimentale sur rongeurs. Une analgésie/anesthésie chimique est appliquée à l'animal avant réalisation de la laparotomie et perfusion du foie. Nous utilisons une même préparation pour faire une condition contrôle systématique. Cette méthodologie nous permet de faire des tests statistiques appariés, renforçant la puissance des tests et la confiance dans les résultats obtenus. La procédure est réalisée par des personnes compétentes, ayant suivi ou sous la responsabilité de personne ayant suivi une formation à la chirurgie expérimentale sur rongeurs. Une analgésie/anesthésie chimique (kétamine/xylazine) est appliquée à l'animal avant réalisation de la laparotomie et perfusion du foie. Nous utilisons une même préparation pour faire une condition contrôle systématique. Cette méthodologie nous permet de faire des tests statistiques appariés, renforçant la puissance des tests et la confiance dans les résultats obtenus. Avant leur utilisation, les animaux sont stabulés en groupe. La procédure étant un prélèvement sur animal anesthésié puis mis à mort sans réveil, il n'est pas défini de points limites.
Choix des espèces
L'obtention d'hépatocytes primaires se fait par une méthode nécessitant la perfusion du foie pour digestion enzymatique qui ne peut pas se faire sur des espèces de mamifères trop petites. De plus, en fonction de la quantité d'hépatocytes nécessaire, nous utilisons soit le rat soit la souris. La procédure d'isolement mise au point par perfusion du foie avec une solution de collagénase est réalisable sur ces deux espèces. Les animaux doivent être au stade adulte jeune pour avoir un métabolisme hépatique mature mais pas encore impacté par un éventuel effet de l'âge. De plus, des animaux trop âgés risquent de présenter des débuts de stéatose ou d'infiltration lipidique, d'insulino-résistance, sources de pertubations métaboliques hépatiques, empêchant l'utilisation d'animaux de réforme.
Evaluation des caractères observables de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
425 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 210 d'entre elles et modéré pour 215. Le porteur indique qu'elles ne subissent aucune intervention et sont seulement observées de la naissance à l'âge adulte, la souffrance venant du phénotype dommageable que certaines lignées génétiquement modifiées portent dès la naissance. Les 210 souris sans comportement anormal seront réutilisées dans d'autres projets, les autres seront tuées. Le porteur affirme que ces modèles sont "indispensables" et que la création de lignées est la "seule" voie pour étudier un "organisme entier".
Objectifs
Le phénotype est l'ensemble des caractères observables des souris. En modifiant génétiquement les souris nous cherchons à étudier une maladie ou un phénomène biologique important ou responsable d'une maladie. Mais cela peut provoquer d'autres dommages à l'animal, donc créer un phénotype dommageable que l'animal subira dès sa naissance, mimant ainsi la pathologie humaine. Le but de ce projet est de s'assurer qu'il n'y a pas phénotype dommageable, ou de l'évaluer s'il y en a un, afin de comprendre la maladie. L'objectif est de produire des nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées par croisement avec des lignées déjà existantes ou sur un fond génétique particulier pour répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche de l’Institut sur des maladies humaines.
Bénéfices attendus
Les projets développés dans l'Institut visent à la compréhension des mécanismes responsables de maladies humaines et au développement de traitement pour ces maladies humaines. Une étape indispensable est le développement de modèles de souris génétiquement modifiées pour reproduire la pathologie humaine et tester des approches thérapeuthiques. Le bénéfice de ce projet est donc de développer de tels modèles dans des conditions les plus adaptées au bien être animal.
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucune intervention dans le cadre de ce projet, ils seront simplement examinés et surveillés tout au long de leur développement, de la naissance à l'age adulte
Impact sur les animaux
Il n'y aura pas d'intervention sur les animaux, seulement une observation attentive des caractères visibles et du comportement. Les effets indésirables potentiels seraient liés au phénotype dommageable
Devenir
Les animaux ne présentant pas de comportement anormal pourront être réutilisés dans d'autres projets pour répondre aux questions scientifiques ayant conduit au développement de cette lignée.
Remplacement
Ce projet ayant pour but le développement de modèles souris mimant des pathologies humaines en particulier pour la mise au point de thérapies, il n'y a pas de remplacement possible par d'autres modèles.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au maximum en fonction des besoins. Les animaux ne présentant pas de phénotype associé à une douleur non controlée pourront être ré-utilisés dans d'autres projets afin de réduire le nombre d'animaux produits pour ces projets et répondre aux questions scientifiques ayant conduit au développement de cette lignée.
Raffinement
Les animaux présentant le génotype d’intérêt feront l’objet d’une surveillance particulière selon les recommandations de l'Union Européenne afin d’établir si ces créations de nouvelles lignées provoquent l’apparition d’un phénotype dommageable vis-à-vis du bien-être animal, et si c’est le cas, des points limites seront mis en oeuvre et éventuellement réadaptés en fonction du phénotype observé pour limiter toute souffrance chez les animaux. Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Ils sont observés quotidiennement et des points limites ont été définis afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus pour lesquels il sera décidé de mettre en place un traitement approprié ou une euthanasie.
Choix des espèces
Le but de ce projet est la création de modèles génétiquement modifiés pour reproduire les pathologies humaines. Le développement de souris génétiquement modifiées est l'approche la plus simple à mettre en oeuvre et la seule permettant d'étudier un organisme entier. Ces modèles vont permettre de répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche de l’Institut telles que la compréhension des mécanismes physiopathologiques et le développement d'approches thérapeuthiques pour lesquelles les modèles souris sont indispensables. Ces pathologies pouvant toucher l'homme à tous les stades du développement, tous les stades seront donc analysés dans les lignées créées.
Validation d’un test d’apprentissage spatial préservant le bien-être animal à destination de la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes et transférées vers un autre projet. Elles apprennent à trouver une issue sur un plateau éclairé, le labyrinthe de Barnes, sous l'effet de lumières et de ventilateurs dirigés vers elles pour les forcer à mémoriser le trajet, et une partie reçoit un traitement qui efface la mémoire. Le porteur présente ce test comme un remplacement moins stressant du labyrinthe aquatique de Morris et met en avant le "bien-être animal". Il décrit ces désagréments, lumière et courant d'air, comme volontairement créés pour contraindre l'apprentissage.
Objectifs
L’étude des maladies qui affectent le cerveau et en particulier celles qui réduisent la mémoire nécessite d’évaluer - chez les animaux - le souvenir des trajets que ceux-ci effectuent dans une piscine. Néanmoins, il a été montré que cette façon de procéder comporte quelques désavantages qui peuvent être réduits ou même supprimés si l’utilisation d’une piscine, et donc le placement de l’animal dans l’eau, peut être évité. La solution alternative a été trouvée par l’utilisation d’un grand plateau éclairé où le rongeur se déplace à la recherche d’une issue dont il devra apprendre l’emplacement. Nous souhaitons dans le futur utiliser cette nouvelle façon de faire chez la souris, mais auparavant nous devons valider cette procédure en nos locaux, ce qui représente le but de ce projet. Pour ce faire, nous allons devoir trouver les meilleures conditions pour que les souris se souviennent de leurs trajets et qui seront des conditions d’éclairage ou de ventilation plus ou moins fortes du plateau. Une fois que ces conditions auront été trouvées, il nous faudra ensuite montrer que des souris présentant une mémoire réduite pourront être distinguées - par cette procédure - des souris non malades. Comme il existe de multiples types de souris, nous prendrons des souris avec ou sans une bonne vision et de niveaux de témérité différents. Si la nouvelle procédure confirme bien que, et quelque soit le type de souris évaluées, les animaux sont capables de se souvenir de leurs trajets sur un vaste plateau éclairé, nous remplacerons alors la procédure de la piscine par celle du plateau.
Bénéfices attendus
Il a été montré que la procédure faisant appel à un plateau pour étudier les trajets des souris est beaucoup moins stressante pour les animaux que celle de la piscine, et donc fournit des résultats plus précis. Ainsi, si nous remplaçons la procédure de piscine par celle du plateau, cela représentera un grand bénéfice pour les animaux car cela leur évitera un stress important lorsque nous voudrons évaluer leur mémoire ; et le bénéfice sera également non négligeable pour nous, car les résultats seront plus précis et donc, en conséquence, cette alternative nous permettra d’avoir à utiliser moins d’animaux pour étudier les maladies qui affectent le cerveau.
Procédures
Lorsque nous voudrons montrer que la procédure du plateau est capable de distinguer des souris présentant une mémoire réduite par rapport à des souris non malades (seconde phase du projet), nous devrons injecter une fois par jour, sur un total de 3 jours consécutifs, un traitement qui efface les souvenirs chez les souris considérées comme malades. Les traitements seront réalisés par la personne de notre structure qui a été validée par notre vétérinaire pour les injections. La préhension de l'animal et l'injection prendront environ 10 secondes. En ce qui concerne la détermination des bonnes conditions nécessaires pour le test du plateau, les animaux subiront le même jour 3 fois la procédure sur une durée maximum établie à 180 secondes. Pour la seconde phase du projet, ce schéma sera conservé, et répliqué pendant 3 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Les souris sont des animaux qui n’aiment pas apprendre. Si elles doivent néanmoins apprendre un chemin dans un piscine, elles n’ont pas le choix mais cette façon de faire est stressante et mérite d’être remplacée. L’alternative à cette procédure de la piscine par l’utilisation d’un plateau est beaucoup moins stressante, mais peut n’aboutir à aucun résultat si les souris ne sont pas obligées d’apprendre. Pour faire face à ce problème, il peut être nécessaire d’utiliser des lumières ainsi que des ventilateurs dirigés vers le plateau. Ainsi ces légers désagréments que nous créons volontairement pour les souris seront susceptibles de les forcer à apprendre le chemin vers l’issue sombre et sans courants d’air qui constituera alors leur récompense au terme de ce test de mémoire de trajets.
Devenir
Les souris seront gardées en nos locaux avant leur sortie une fois affiliées à un autre projet.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe pas de technique in vitro ou in silico permettant d’évaluer les effets d’un traitement sur les fonctions cognitives supérieures telles que l’apprentissage ou la mémoire.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux repose sur une démarche d'essais successifs : pour la phase 1 du projet, les 24 souris de chaque souche étudiée seront réparties en 8 sous-groupes de 3 individus. Le trio d’animaux de chaque sous-groupe sera testé aux mêmes conditions expérimentales, conditions qui seront ensuite modulées en fonction des résultats obtenus pour l’évaluation du sous-groupe suivant. Cette démarche devrait aboutir in fine à la détermination des modalités optimales à mettre en œuvre pour aboutir à un apprentissage spatial, en utilisant un nombre le plus faible possible d’animaux. L’expérience acquise par le personnel opérant à la réalisation du test comportemental est suffisante pour interpréter les données issues d’un groupe de 3 individus uniquement. Si les conditions étaient trouvées adéquates avant que la totalité des 8 sous-groupes n’aient été testé, le restant des sous-groupes (animaux non testés) sera alors évalué selon les conditions optimales précédemment déterminées afin d’augmenter la puissance statistique des résultats obtenus via un accroissement des effectifs. Si malgré tout, aucun apprentissage n’était détecté à l’issue de cette première phase, les animaux seront alors gardés en hébergement pendant un mois durant, au terme duquel ils seront alors retestés pour une nouvelle phase de paramétrage. Cette période sera suffisante pour opérer chez les souris une perte de souvenir des 3 tests préalablement réalisés. Concernant les effectifs requis minimum (n=12/groupe) pour la phase 2 du projet ils ont été définis par un programme informatique spécifique.
Raffinement
Les cages seront munies d’éléments d’enrichissement (buchettes, tunnels en carton, sizzlenet), permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera évalué quotidiennement par observation de tout comportement pouvant suggérer la présence de mal être chez les animaux de cette étude. Par ailleurs, le succès de ce projet aura pour conséquence le remplacement - quand cela sera possible - en notre structure de la procédure lu labyrinthe aquatique de Morris par celle du plateau troué de Barnes lorsque l’apprentissage ou la mémoire de rétention devront être testés sur modèle souris, ce qui constituera un raffinement certain de nos pratiques d’études.
Choix des espèces
La validation de la procédure du plateau troué de Barnes sera effectuée chez la souris car ce modèle animal est celui qui est majoritairement utilisé par les utilisateurs de notre structure de recherche. Les animaux seront âgés de 6 semaines à la réception (jeunes adultes)
Contribution des canaux astrocytaires dans l’allodynie mécanique chez le rat: sensibilité cutanée et effets d’un triptan et d’un antagoniste CGRP
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection dans la moelle épinière sous anesthésie et développe une hypersensibilité douloureuse de la face, l'allodynie, avant d'être anesthésié en profondeur et tué pour prélever ses tissus nerveux, dans une étude sur la migraine. Le porteur teste un triptan et un antagoniste du CGRP et prévoit la mise à mort des animaux perdant plus de 15 % de leur poids. Il juge le développement de nouvelles molécules "indispensable" et affirme qu'"aucune méthode alternative" ne peut remplacer ce protocole.
Objectifs
La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques. Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades.
Bénéfices attendus
A moyen terme, ce projet a pour but de mettre en évidence l'implication des astrocytes dans la chronicisation de la migraine et l'installation de l'allodynie mécanique. Si nous arrivons à identifier de nouveaux acteurs ainsi que leurs rôles, cela nous permettra de mieux comprendre ces pathologies. A plus long terme, ces études peuvent aider à développer de nouveaux traitements pour soulager les patients.
Procédures
Chaque animal aura une une injection intramédullaire (sous anesthésie gazeuse, 1fois 20 min), une injection intra péritonéale (vigile 1 fois 30s) et une perfusion (sous ananesthésie profonde 1fois 30min). Elles seront réalisées par du personnel formé et compétent, sous la responsabilité des membres de la Structure du Bien Etre Animal.
Impact sur les animaux
Les résultats obtenus des travaux du laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » et les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer ses gestes habituels.
Devenir
A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après l'injection virale et pour tester les différents traitements curatifs.
Réduction
Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animauxmaximal par groupe: habituation, injections virale et systémique,comportement, stimulation et perfusion. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques.
Raffinement
Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, lors d’injection intra médullaire, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Si un amaigrissement de plus de 15% du poids total, mesuré au début de l’expérimentation, est constaté ou s’il apparaît un comportement défini dans la liste de points limites, alors les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 3 à 8 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire.
Etude du rôle des productions hépatiques et intestinales de glucose sur le diabète induit par des polluants environnementaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 120 d'entre elles et sévère pour 24. Elles reçoivent des régimes contenant un cocktail de polluants dans l'eau de boisson pendant cent vingt jours, des injections, des tests de glycémie et des jeûnes qui exposent certaines lignées à des hypoglycémies, pour étudier un diabète lié aux contaminants de l'environnement. Le porteur affirme que la maladie "influence l'ensemble du métabolisme" et que le recours à des animaux est "nécessaire". Sa rubrique de réduction annonce 114 souris là où les nombres déclarés en atteignent 144.
Objectifs
Le diabète, qui est une maladie caractérisée par des taux de sucre trop élevés dans le sang (hyperglycémie), est un enjeu majeur de santé publique. Le diabète présente des formes et origines diverses, qui restent encore mal connues. En dehors des formes classiques induites par l’obésité, il en existe des formes où les patients ne sont ni en surpoids, ni obèses. Parmi les facteurs de risque, l’exposition à des polluants de l’environnement joue un rôle important. En effet, ces produits chimiques toxiques présents dans notre alimentation, les emballages, et dans les produits d’entretien ou cosmétiques favorise l’apparition de maladies, dont le diabète. Même s’il existe une réglementation et que des seuils d’exposition maximum à ces toxiques ont été mis en place à l’échelle mondiale, ils ont des répercussions sur notre santé. En effet, il a été récemment rapporté qu’à des doses, même très faibles, ces polluants peuvent provoquer le diabète lorsqu’ils sont consommés de façon chronique. Néanmoins les mécanismes impliqués sont encore mal compris. Après ingestion via les aliments, ces molécules chimiques auraient un impact sur le métabolisme en augmentant la production de glucose(sucre) par l’intestin et le foie, ce qui conduirait à l’apparition du diabète au cours d’une exposition chronique à ces polluants. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition du diabète suite à une exposition chronique à un cocktail de polluants administré à faibles dose à des souris.
Bénéfices attendus
Des études menées dans différents pays, dont la France et l’Inde, ont exploré l'association entre les polluants environnementaux et la prévalence du diabète. En effet, l’exposition à des doses élevées de polluants est connue dans la littérature pour induire le diabète et de nombreuses autres complications. Néanmoins, bien que la dangerosité de ces composés soit généralement étudiée à court terme et à très forte dose chez l’animal, peu de travaux s’intéressent aux effets délétères d’une exposition à long terme à un mélange de faibles doses de toxiques, ce qui est pourtant la situation la plus fréquente. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du diabète associé à une exposition chronique à un cocktail de contaminants chimiques de l’environnement, et de potentiellement les différencier de ceux associés à l’obésité. En effet, les résultats préliminaires indiquent que ce cocktail de contaminants induirait un diabète sans association avec l’obésité. Ces diabètes sont toujours difficiles à traiter et résistants aux traitements. Ce projet pourrait donc d’abord contribuer à une meilleure connaissance des diabètes sans obésité, mais aussi des diabètes induits par les polluants en général. L’objectif à terme est de proposer une meilleure prise en charge des patients diabétiques obèses et non obèses.
Procédures
Une biopsie de tissu (geste réalisé en quelques secondes) sera réalisée pour vérifier la modification génétique. L’invalidation de la production de sucre par le foie ou par l’intestin sera réalisée dans des modèles de souris transgéniques qui nécessitent un traitement injecté (5jours de suite). Les souris sans modification génique recevront le même traitement pour s’affranchir de ses effets possibles. Ce geste est réalisé en quelques secondes. L’activation de la production de sucre par l’intestin ne nécessite aucune intervention supplémentaire. Les souris recevront pendant 120jour, soit une alimentation standard, une alimentation riche en graisses et en sucres ou une alimentation standard et un mélange de produits chimiques dans l’eau de boisson. Le taux de sucre dans le sang (glycémie) sera mesuré tous les mois à partir d’une goutte de sang grâce à l’utilisation d’un glucomètre(réalisé en quelques secondes). Des tests permettant de caractériser le diabète seront réalisés soit à l’état nourri, ou à jeun. Ces tests consistent à administrer du sucre, de l’insuline ou du pyruvate aux souris et de suivre l’évolution de la glycémie (mesure avec un glucomètre à partir d’une goutte de sang). Une semaine entre chaque test permettra d’éviter le stress des animaux. Une prise de sang nécessitant une contention de 1-2minutes sera réalisée. Au total: - Les souris incapables de produire du glucose par le foie seront soumises à 10interventions dont 1biopsie, 1série d’injections, 3tests avec injections et prises de glycémie, 1mise à jeun de 6h, 1 mesure de glycémie, et 1prélèvement de sang terminal. - Les souris chez lesquelles la production de glucose par l’intestin est activée ou inactivée seront soumises à 9interventions dont 1biopsie, 3tests avec injections et prises de glycémie avec 3mises à jeun, 1mesure de glycémie, 1mise à jeun de 6h et 1prélèvement de sang terminal. Enfin, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes (dont le foie et l’intestin pour analyser la production de glucose).
Impact sur les animaux
Les souris qui ne sont pas capable de produire de sucre par le foie, peuvent réguler leur glycémie grâce à une production de sucre par les reins et l’intestin, ce qui permet de limiter les hypoglycémies(baisse du taux de sucre dans le sang) au cours d’un jeûne. Les souris seront soumises à un jeûne de 6h, ce qui représente une période entre deux repas. Dès 2h après l’arrêt de la prise de nourriture ces souris peuvent développer des hypoglycémies pendant cette période. La connaissance du modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie. Ainsi, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage pour leur éviter la perte d’énergie nécessaire pour atteindre les mangeoires. Avant la mise à jeun, une partie de leur cage est placée sur une plaque chauffante pour éviter les hypothermies (baisse de la température corporelle). Un suivi très régulier de ces animaux est réalisé par le technicien en charge du protocole expérimental. En effet, le suivi des premiers signes d’hypoglycémie qui se caractérisent par une diminution de la mobilité, prostration, et/ou refroidissement de l’animal est réalisé très régulièrement afin de pouvoir mesurer la glycémie et injecter une solution de glucose en cas de mal-être ou de valeurs de glycémie trop basse(mesure avec un glucomètre sur une goutte prélevée au niveau de la queue). Chez les souris saines, la glycémie est normalement régulée lors d’une période de jeûne grâce à une production de glucose assurée par le foie(majoritaire), les reins et l’intestin. Les souris sans production de sucre par l’intestin présentent un phénotype anxieux léger. Néanmoins, les conditions d’hébergement en milieu enrichi(nid, maison pour se cacher) sont suffisantes pour atténuer leur anxiété. Après 16 semaines de régime riche en graisses et en sucres, les souris sans modification génétique deviennent obèses et diabétiques. Dans cette étude, elles seront étudiées à un stade précoce du développement de l’obésité et du diabète afin de limiter les complications liées à ces maladies. Des travaux précédents avec le cocktail de polluants dans l’eau n’ont révélé aucune modification de la prise de boisson, ni aucun effet secondaire indésirable, aucune anxiété, ni aucun changement de comportement chez les souris. Les souris soumis à l’exposition chronique de ce mélange de polluant pendant n’ont pas développé d’obésité mais présentent comme attendue une hyperglycémie, signe de diabète.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et de différents tissus. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin d’évaluer l’impact du mélange de contaminants chimiques sur le développement du diabète et la production de glucose par les différents organes producteurs de glucose (foie, reins et intestin). Des tissus non nécessaires à ce projet seront également prélevés afin de constituer une banque de tissus qui permettra à l’avenir de réduire le recours à des animaux supplémentaires.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la pathologie étudiée, le diabète, influence l’ensemble du métabolisme de l’organisme et implique des dialogues entre organes. De plus, les contaminants chimiques testés sont capables de moduler la production de sucre par le foie et l’intestin. Ainsi, puisqu’elle implique de nombreux organes (et une communication entre eux), notre étude nécessite l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, du métabolisme glucidique, et d’outils statistiques. Afin de pouvoir faire une analyse statistique adaptée, des groupes de 8 souris seront analysés. Au total, ce projet nécessitera 114 souris mâles transgéniques et non transgéniques (témoins). En fin de procédures, les animaux seront mis à mort afin de prélever différents tissus à analyser, mais également de nombreux autres tissus pour constituer une banque de tissus utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans animaux supplémentaires.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe, dans un milieu enrichi pour favoriser la nidation et limiter le stress. L’invalidation de la production de sucre uniquement dans le foie évite les hypoglycémies sévères au cours d’un jeûne long grâce à l’induction de la production de sucre par les reins et l’intestin. La connaissance du modèle a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie et en limitant les efforts pour accéder à la nourriture et à l’eau de boisson. Pour limiter les hypoglycémies, le suivi des premiers signes d’hypoglycémie est réalisé très régulièrement. Si nécessaire, un suivi de glycémie sera réalisé et une injection d’une solution de glucose ou une mise à mort de l’animal sera réalisée si l’hypoglycémie intervient en fin de procédure (prélèvement des tissus dans ce cas). Enfin, une partie de la cage est placée systématiquement sur une plaque chauffante afin de maintenir la température corporelle de la souris. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés chaque semaine pour suivre leur prise de poids. Le recours à des grilles de score ou à l’échelle de grimace de souris permettra une évaluation précoce du bien-être. Lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet, les souris pourront être mises à mort selon les méthodes autorisées par la législation. Enfin, la dose de contaminants utilisée dans ce projet n’entraine aucune altération physique. En effet, la dose utilisée dans les expériences sur les animaux est très faible (sous les seuils de tolérance admis chez l’Homme).
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la fonction étudiée, c’est-à-dire la production de sucre par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser ces expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme. De plus, le phénotype des modèles murins utilisés dans ce projet est bien caractérisé ce qui permet d’utiliser les modèles adaptés, dans des conditions limitant l’apparition de phénotype dommageable et dans le respect du bien-être animal. A l’âge de 6-8 semaines, les souris recevront des injections pour induire la modification génétique et leurs témoins (sauf pour le modèle d’activation de la production de sucre par l’intestin). Ainsi, après réalisation de la modification génétique à l’âge adulte, les animaux seront étudiés à l’âge de 11-13 semaines (soit 5 semaines après les injections, temps nécessaire à la disparition des effets potentiels de la molécule sur le métabolisme). Ensuite, les souris recevront un traitement (voir composition des groupes) pendant 120 jours. Enfin, les souris seront mises à mort pour prélever des tissus à analyser à l’âge de 28-30 semaines
Modulation de la flore intestinale (microbiote) pour améliorer les réponses anti-cancéreuses de l’hôte
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 1 440. Elles reçoivent des prébiotiques ou des probiotiques par gavage, une greffe de tumeur sous la peau ou une injection de cellules cancéreuses dans le sang, puis une immunothérapie et des prélèvements sanguins, pour tester si la modification du microbiote intestinal renforce les réponses anti-tumorales. Le porteur annonce des essais chez l'humain et des recommandations nutritionnelles dans un second temps. Il affirme que le rôle du microbiote "ne peut être étudié qu'in vivo" et qu'il n'existe "pas d'alternative à ce jour".
Objectifs
Le microbiote intestinal (flore intestinale) comprend l'ensemble des bactéries, champignons et virus contenus dans notre intestin. Il est montré que ces bactéries communiquent avec notre immunité. Les espèces bactériennes qui composent notre microbiote détermine la qualité de notre immunité, donc de nos défenses contre les infections, ou même les cancers. Ainsi certaines bactéries ont été identifiées comme bénéfiques pour la santé, et notamment pour notre immunité. On peut augmenter la présence de ces bactéries dans l'intestin pour améliorer notre immunité notamment via l'alimentation, en consommant des fibres alimentaires qui les nourrissent, c'est ce que l'on appel des prébiotiques. On peut aussi consommer des probiotiques, c'est à dire directement ces bonnes bactéries. Le but de ce projet est d'améliorer la composition du microbiote intestinal de souris soit par prébiotiques, soit par probiotiques dans le but d'augmenter les réponses anti-tumorales et ainsi prévenir l'apparition de cancers ou le développement de métastases ou enfin, d'améliorer la réponse à l'immunothérapie. Nous avons pour objectif de tester 10 prébiotiques et 10 probiotiques différents dans les 5 ans à venir.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mettre en évidence des propriétés immunostimulantes de composés alimentaires (fibres) et/ou de compléments alimentaires (probiotiques) qui pourraient être utiles dans un contexte de cancer. Les découvertes quien découlerons, permettrons d'évaluer dans un second temps ces composés chez l'Homme, à travers des essais cliniques. In fine, ce travail permettra de rationaliser des interventions nutritionnelles qui favoriserons la prévention des cancers dans la population générale, et permettront de favoriser la réponse aux immunothérapies et/ou prévenir le phénomène de métastases chez les patients atteints de cancer.
Procédures
Une partie des animaux sera nourrie avec un régime prébiotique administré dans l'eau de boisson ou de probiotiques administrés par gavage oral 5 fois par semaine durant 1 mois (1 minute / gavage). Une partie des animaux recevra une implantation tumorale par injection sous-cutanée (1 minute / souris sur souris vigile), ou une injection de cellules cancéreuses par voie intra-veineuse (5 minutes / souris sur souris vigile). Les prélèvements sanguins (2 minutes / souris) seront réalisés principalement en fin d'expérience (ou lors d'atteinte de point limite), sous anesthésie volatile, et sans réveil. Sinon, un prélèvement après 15 jours de régime enrichi pourra être effectué sous anesthésie volatile avec suivi de réveil. Ainsi les animaux auront au maximum 2 prélèvements sanguins, dont un sans réveil. Le trateiement par immunothérapie consistera à 6 injections maximum en intra péritonéale ou intraveineuse, sur souris vigiles.
Impact sur les animaux
Les animaux, hébergés en groupe sociaux dans un environnement enrichi adapté, seront abreuvés et nourris sans restriction. Le régime alimentaire n'induit aucune nuisance et représente un enrichissement en termes de bien-être nutritionnel. L’administration par gavage oral nécessite une habituation de l’animal soumis à un léger stress. Les animaux recevront jusqu'à 6 injections sans anesthésie induisant une contrainte de niveau léger. Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale induisant une contrainte de niveau léger ou sans réveil. Enfin, la tumeur implantée pourra évoluer en taille (maladie au stade léger), et dans de rare cas nécroser (lésion de niveau modéré) représentant un point limite pour l’arrêt de la procédure expérimentale.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés, à la fin des expériences ou dès atteinte des points limites. Des prélèvements seront effectués pour des analyses immunologiques complémentaires.
Remplacement
Le rôle du microbiote (flore) intestinal ne peut être étudié qu'in vivo. En effet, les interactions hôte/microbes et notamment système immunitaire de l'hôte/microbes et les réponses anti-tumorales induites nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n'existe donc pas d'alternative à ce jour.
Réduction
Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse aux différents traitements, des groupes de 12 animaux seront constitués. Ainsi, malgré la variabilité, ce nombre d'animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique. Pour renforcer nos observations, et réduire au maximum le nombre d'animaux, nous prévoyons de réaliser une première expérience avec 6 animaux par groupe et de confirmer tout effet anti-tumoral observé (ou tendance encourageante) en dupliquant l'expérience afin d'obtenir au final 12 animaux par groupes en 2 expériences indépendantes, plutôt qu'en une seule avec des groupes de 12 animaux d'emblée. De plus, dans les procédure 2 et 3, nous testerons 2 conditions expérimentales en parallèle, lorsque nous disposerons de 2 composés en simultané, afin de mutualiser les groupes contrôles, et donc de réduire le nombre d'animaux contrôles utilisés.
Raffinement
Afin d'assurer le bien-être des animaux, les souris seront hébergées par cage de 6, avec environnement enrichi. Le régime alimentaire (fibres) sera administré dans l'eau de boisson ou par gavage, et les probiotiques (bactéries) seront administrées par gavage. L'injection sous-cutanée des cellules tumorales ou l'injection IP des immunothérapies n'induisent qu'une brève légère souffrance des animaux. . Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés à la suite des implantations tumorales. Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale à la fin de l'expérience ou dès lors qu'un point limite est atteint. L'euthanasie par dislocation cervicale se fera sous anesthésie à l'isoflurane (3 %) quand il y aura prélèvement sanguin terminal.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent pour mener ce genre d'étude. La manipulation de leur flore est acquise. De plus, les modèles tumoraux ainsi que les outils pour étudier les réponses immunes induites sont parfaitement développées pour ce modèle animal. Tous nos résultats précédents obtenus dans le cadre de cette thématique l'ont été avec ce même modèle murin. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d'âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées et le système immunitaire est pleinement mature et permet donc son étude.
Effet d’huiles essentielles seules et en combinaison de molécules bioactives sur la colonisation de Salmonella chez le poulet de chair.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
405 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les poussins sont inoculés par voie orale avec la bactérie Salmonella dès leur premier jour, élevés jusqu'à trente-cinq jours puis tués, par dislocation cervicale pour les plus jeunes et par saignée à la jugulaire après étourdissement pour les autres, afin de prélever leur intestin. L'étude teste l'effet d'huiles essentielles sur la colonisation par Salmonella dans la filière avicole, dans une perspective de santé publique. Le porteur indique aussi vouloir valider un modèle sur le nématode Caenorhabditis elegans qui pourrait "réduire l'utilisation d'animaux", tout en jugeant "nécessaire" l'essai sur le poulet.
Objectifs
Le projet vise au déploiement d’une stratégie de gestion de bactéries zoonotiques chez les animaux d’élevages, grâce à des alternatives naturelles telles que les huiles essentielles. La recherche d’activités biologiques sera liée à la prévention de la colonisation digestive chez la volaille par Salmonella, une des principales bactéries responsables de zoonoses et largement répandues dans les élevages. L’objectif premier de ce projet s’inscrit dans une problématique de santé publique avec le développement d’une gamme de solutions adaptées pour réduire la colonisation chez la volaille de ces deux principaux pathogènes impliqués dans les zoonoses. Le second objectif permettra de tester un nouveau modèle prédictif in vitro reposant sur le modèle de colonisation digestive du modèle nématode Caenorhabditis elegans. Le développement de cette méthode alternative à l’expérimentation animale, pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques et ainsi de satisfaire à la règle des 3R : Réduire, Remplacer, Raffiner. Au cours de ce projet, cette procédure visera à étudier l’effet d’huiles essentielles seules et en combinaison avec d’autres moyens de lutte (traitement de l’aliment et de la litière) sur la colonisation de Salmonella Typhimurium en poulet de chair.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de valider les effets bénéfiques des huiles essentielles sur la colonisation du poulet de chair par Salmonella. En parallèle la combinaison de statégie de lutte sera étudiée pour proposer un moyen de lutte plus efficace contre la contamination à Salmonella dans les élevages. Par ailleurs, les résultats obtenus sur l’effet anti-colonisateur des huiles essentielles sur le modèle poulet et le modèle nématodes seront comparés pour confirmer l’effet prédictif du modèle nématode et ainsi valider son utilisation comme modèle alternatif à l’expérimentation animale.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation par voie orale de Salmonella Typhimurium ou de Tryptone Sel. Le prélèvement de caeca aura lieu après mise à mort des animaux. Dès la mise en place (J1), les poussins tout venant de 1 jour de l’espèce Gallus gallus de souche commerciale de chair ROSS 308, seront pesés. A J1, tous les animaux seront inoculés avec 100 µL de Salmonella Typhimurium (Lot 1, Lot 3, Lot 5 et Lot 7) ou 100 µL de de Tryptone Sel (Lot 2, Lot 4, Lot 6 et Lot 8), et l’inverse sera réalisé à J7.
Impact sur les animaux
Les infections à Salmonella chez les volailles passent généralement inaperçues et les molécules testées sont normalement inoffensives : les huiles essentielles, les probiotiques et acides organiques ainsi que l’asséchant pour litière utilisés dans cette étude sont des produits commercialisés et utilisés en élevage de volailles.
Devenir
Les prélèvements de caeca nécessitent la mise à mort des animaux. C’est pourquoi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, par dislocation cervicale les jeunes poussins (poids < 250 g) et pour les poussins plus âgés et les poulets adultes après une anesthésie par électronarcose suivie d’une saignée à la veine jugulaire.
Remplacement
La volaille et notamment le poulet de chair représente une source importante de salmonellose pour l’Homme. Ainsi, il est nécessaire de contribuer au développement d’un moyen de lutte contre Salmonella dans la filière avicole afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Salmonella. Des résultats préliminaires utilisant un modèle d'infection du nématode Caenorhabditis elegans permettant un suivi de la colonisation digestive par Salmonella Typhimurium, ont mis en évidence les activités anticolonisatrices des huiles essentielles qui seront utilisées pour ce projet. Il est necessaire de valider ces résultats lors d’un essai sur le poulet de chair. Cette validation nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo afin de réduire par la suite le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Cette étude s’interesse à l’effet d’huiles essentielles seules et en combinaison avec d’autres moyen de lutte sur la colonisation de Salmonella chez le poulet de chair. La réalisation de 8 lots distincts permettra de différencier l’effet des huiles essentielles seules ou en combinaison afin de maximiser l’efficacité d’un traitement en elevage. En raison de la variabilité interindividuelle importante des niveaux de colonisation par les bactéries étudiées, il a été déterminé qu’un minimum de 10 animaux par groupe était nécessaire pour chaque temps donné afin d’assurer la robustesse des tests statistiques. Ainsi, 8 lots x 5 temps x 10 animaux = 400 animaux. En supplément 5 animaux seront utilisés au début de l’étude pour vérifier l’absence de contamination par Salmonella. Soit un total de 405 animaux.
Raffinement
Dans des expériences précédentes d’inoculation avec la souche de S. Typhimurium choisie pour cette étude, aucun symptôme ou effet indésirable n’a été détecté chez les animaux étudiés. L’inoculation des bactéries à la pipette par voie orale et les pesées seront réalisées par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Le protocole a été établi pour limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux. Les animaux seront observés quotidiennement. Si toutefois, une altération de l’état de santé était observée quelle que soit la raison, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites suivants : blessure grave, prostration, absence de réaction après sollicitation (absence de réponse à des stimuli tactiles et visuels), anorexie ou impossibilité de s’abreuver ou de s’alimenter. Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer des conditions d’hébergement limitant l’inconfort potentiel des animaux. Quatre animaleries de type A2 seront utilisées en dépression (moyenne). Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol de 3,4 m² entourés par des panneaux en bois. La litière sera composée de copeaux de bois (qui sert d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). Les paramètres d’ambiance utilisés sont préconisés pour les élevages de poulets de chair. Les installations sont équipées de lumières électriques programmables, d'un chauffage électrique automatisé et d'une ventilation. Les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment réservé aux poulets de chair spécifiques à leur âge.
Choix des espèces
Les salmonelloses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. Ce projet à pour objectif de développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage afin de réduire la charge qui arrive sur la chaine alimentaire. Par conséquent, le poulet de chair est l’espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 35 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation). Le but est de suivre l’effet de l’ajout des huiles essentielles et en combinaison d’autres moyen de lutte sur la colonisation de Salmonella.