Oncologie

Une injection de lentivirus dans le cerveau, par chirurgie stéréotaxique de trente à quarante minutes, provoque chez chaque souris une tumeur cérébrale de type glioblastome. 460 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de la tumeur dans leur cerveau. Elles reçoivent ensuite des séries d'injections renouvelées toutes les deux semaines, drogues sénolytiques ou anticorps bloquants, pendant que la tumeur peut entraîner fonte musculaire, prostration, déshydratation et lésions cutanées. Le porteur indique que ces tumeurs se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles, et retient les femelles parce qu'elles sont "moins agressives et donc plus faciles à manipuler".

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'effet de drogues dites sénolytiques (drogues qui éliminent les cellules sénescentes) seules ou en combinaison avec d'autres traitements, dans un nouveau modèle immunocompétent de tumeur cérébrale de type glial appelée glioblastome. Le modèle de glioblastome de type mésenchymateux proposé dans le projet récapitule au mieux les altérations moléculaires identifées chez les patients en utilisant une nouvelle technologie d'invalidation de l'expression de gènes.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait générer un modèle préclinique immunocompétent de glioblastome de type mesenchymateux qui récapitule au plus près les altérations moléculaires des glioblastomes de patients. En effet, afin de traduire de façon efficace nos résultats de recherches fondamentales à la clinique il est indispensable de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine. Nos résultats devraient permettre de proposer des nouvelles aprroches thérapeutiques pour la prise en charge des patients avec un glioblastome.

Procédures

La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 4 actes techniques incluant une injection intra-crâniale de lentivirus nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par bioluminescence et des traitements. La chirurgie prendra environ 30-40min par animal. Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs. La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min. Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines.

Impact sur les animaux

Ce projet comporte deux étapes où des effets indésirables sont attendus sur les animaux, la procédure chirurgicale et la charge tumorale. La procédure chirurgicale est invasive, il s'agit d'une injection stéréotaxique de lentivirus dans le ventricule latéral effectué sous anesthésie/analgésie mais qui entraîne des nuisances (risques anesthésiques, douleur post-opératoire, risque infectieux). Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées). Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et les animaux seront pesés quotidiennement pendant les 5 jours suivant la chirurgie et deux fois par semaine par la suite.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris et d'analyser la tumeur cérébrale induite pendant la procédure, au niveau moléculaire et histologique.

Remplacement

En parallèle de ce projet in vivo, nous caractériserons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patient collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare car la survie des patients après diagnostic est inférieure à 15 mois. Cette étude fondamentale demeurera néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans un modèle animal. Dans un souci de remplacement et réduction, nous projetons de générer des organoides à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle d'organoides conservant le microenvironnement global (notamment, la microglie, les monocytes et les cellules T infiltrants, les cellules endothéliales et les péricytes). Notre équipe de recherche participe activement à un projet collaboratif visant à générer des organoides de glioblastomes incluant de la microglie et des monocytes infiltrants. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.

Réduction

Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, leur nombre est de 460 pour cette prodédure. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 10 animaux. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, ganglions, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescence sera localisée dans le cerveau disséqué à la loupe binoculaire. Immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux conformément à la réglementation. L'enrichissement initial de la cage est composé bandes de papier kraft pliées en accordéon. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée pour détecter toute anomalie potentielle de la procédure anesthésique. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. A cet effet, nous avons mis en place une grille de score afin d'établir un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance. Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et le poids des animaux deux fois par semaine.s

Choix des espèces

Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour induire de novo des glioblastomes. En effet ce type de tumeur est diagnostiqué chez des sujets adultes d'âge médian de 59 ans, cette tumeur se développe donc à l'âge adulte. Notre projet, qui vise à évaluer l'effet de drogues sénolytiques dans un nouveau modèle immunocompétent de glioblastome, utilisera uniquement des souris femelles. En effet, les modèles de glioblastomes murins se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles. De façon plus importante dans une étude récente, nous avons montré que l’enrichissement de la signature murine de sénescence chez les patients avec un glioblastome est un facteur de mauvais pronostique quel que soit le sexe. Ces résultats montrent donc que l’étude de la sénescence dans le contexte des glioblastomes peut être réalisée sur un seul sexe. Nous avons choisi pour ce projet de travailler sur des femelles en effet, elles sont moins agressives et donc plus faciles à manipuler, ne se battent pas et peuvent être regroupées dans une même cage si besoin.

636 souris vont être utilisées, toutes tuées au soixantième jour ou plus tôt si elles atteignent un point limite, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau du flanc une greffe de cellules tumorales, trois injections de virus et deux prises de sang d'une vingtaine de minutes, et la tumeur qui grossit peut entraîner perte de poids, mobilité réduite et défaut de toilettage. Les vésicules étudiées, libérées par des cellules infectées par un virus thérapeutique, "pourraient devenir des vaccins très efficaces", écrit le porteur, qui en espère à terme un candidat médicament pour "soigner certaines tumeurs chez l'Homme". La mise à mort anticipée dépend de signes observés trois fois par semaine : posture, toilettage, vocalisations, aspect des tumeurs. Aucun seuil chiffré de taille tumorale ni de perte de poids n'est donné.

Objectifs

Les vésicules extracellulaires (EVs) circulent dans l’organisme et agissent comme des messagers entre les cellules. Elles suscitent un intérêt croissant lié à leur capacité à transférer du contenu biologique entre cellules. En effet, les EVs ouvrent la porte à de nouveaux concepts et opportunités tant biologiques que thérapeutiques. Les cellules cancéreuses sont particulièrement de bonnes productrices d’EVs. Elles peuvent favoriser la croissance tumorale ou jouer un rôle dans l'inhibition de la croissance tumorale. Ainsi, les EVs ont un double rôle dans la régulation du cancer. Les données actuelles montrent que l'immunothérapie basée sur l’utilisation d’EVs est une approche prometteuse dans le cadre du cancer, suggérant que les EVs pourraient devenir des vaccins très efficaces. Ainsi, des études récentes avec un virus candidat dans le cadre de la thérapie contre le cancer ont montré l'apparition d'EVs contenant des protéines codées par ce virus thérapeutique. Le but de ce projet est donc d’analyser l'effet des EVs libérées par des cellules infectées par des candidats viraux et leur utilisation potentielle dans la thérapie anticancéreuse. Ce projet vise ainsi à mettre en évidence l'effet des EVs sur des lignées de tumeur greffées dans un modèle de Souris. Les effets seront suivis sur la croissance tumorale mais aussi sur les facteurs circulant au niveau sanguin. Les données générées nous permettront d'améliorer notre compréhension des mécanismes d'action dans un organisme complexe et d’envisager le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d'action et son efficacité en fonction de la vitesse de croissance tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets d'un candidat médicament sur une lignée tumorale. Nous pourrons ainsi comprendre sa capacité d'action et l'impact sur des lignée tumorales déjà installées. Cette connaissance nous permettra de mettre en place un candidat médicament permettant de soigner certaines tumeurs chez l'Homme.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par injection sous-cutanée, durée 1 minute. Par la suite, des injections de virus seront pratiquées (3 fois), durée moins d’une minute. Deux prélèvements sanguins seront aussi effectués chacun durant environ 20 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous anticipons l'apparition de tumeurs sous-cutanées, qui pourra déclencher une éventuelle perte de poids, une mobilité réduite, un mauvais toilettage. Ce protocole aura une durée maximale de 60 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J60 ou à l'atteinte d'un point limite. Ils ne sont pas réutilisables du fait de la présence de cellules tumorales et de candidats médicaments dans leur organisme.

Remplacement

L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que l'oncologie ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèle non animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexe à l'oeuvre dans la mise en place de tumeurs ou la réponse immunologique associée.

Réduction

Ce projet a été mise en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Ainsi, pour l'étude pilote 6 animaux par condition seront utilisés. De plus, nos connaissance des modèles tumoraux sous-cutanés chez la Souris nous permet de dimensionner les groupes à 15 animaux par condition pour la deuxième étude. Cet effectif nous permettra de disposer de conclusions statistiquement relevantes. Nous mesurerons les tailles de tumeurs et le poids de manière répétées. Nous analyserons ces données par analyse de variance à deux paramètres (avec ou sans EVs/ concentration de celulles) en mesures répétées.

Raffinement

Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement avec la présence d'un enrichissement (Maisonnettes en carton ou de kraft). Nous injecterons les cellules tumorales sur le flanc. Ensuite l'apparition de tumeurs et leurs croissances seront mesurées trois fois par semaine afin de suivre la progression ainsi que l'effet possible du candidat médicament sur celle-ci. Nous suivrons à chaque pesée (trois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, les sites d'injection et l'aspect des tumeurs. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle Souris constitue un bon modèle pour l'étude de modèle tumoraux. En effet, il s'agit de mammifère au système immunitaire assez proche de l'Homme pour disposer d'une apporche translationnelle valide. Nous analyserons des animaux agés de 8 semaines au moment de l'injection. A cet age, le système immunitaire est suffisamment développé.

10 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation des ovaires avec pose d'un implant d'œstradiol, puis une injection de colchicine directement dans le cerveau, pour identifier les neurones impliqués dans le déclenchement de l'ovulation. Le porteur indique que la colchicine peut provoquer diarrhée et douleurs abdominales, les souris étant mises à mort vingt-quatre à vingt-sept heures après l'injection, avant l'apparition de ces effets, pour prélever leur cerveau. Il affirme que la reproduction "ne peut s'observer" que sur un organisme entier et renonce à toute analyse statistique, l'objectif déclaré étant de pouvoir publier des données descriptives.

Objectifs

Les mammifères présentent soit une ovulation spontanée soit une ovulation induite. L’ovulation dépend de la sécrétion de deux hormones la gonadolibérine ou GnRH et l’hormone lutéinisante ou LH. Les mécanismes permettant la sécrétion de la GnRH et de la LH sont encore mal connus. Chez les espèces à ovulation induite, un facteur de croissance (βNGF) semble être une molécule clé dans le déclenchement de l’ovulation, rôle qui semble tenu dans les espèces à ovulation spontanée par un autre neurotransmetteur, la kisspeptine. Nos données suggèrent l’implication du facteur de croissance aussi pour induire l’ovulation chez les espèces à ovulation spontanée via une action sur la sécrétion de la kisspeptine. Nous souhaitons établir si cette action est directe ou indirecte. Cette information est essentielle pour pouvoir publier nos données. Nous envisageons de réaliser des marquages multiples pour détecter la kisspeptine et le récepteur du facteur de croissance. Les données obtenues permettront de déterminer si le récepteur est exprimé ou non sur les cellules à kisspeptine. Dans le cas où il n’y aurait pas de co-localisation entre la kisspeptine et le récepteur, nous établirons la possibilité d’une action indirecte via des neurones à catécholamines. Nous allons donc utiliser des souris femelles et des marquages multiples pour vérifier ces hypothèses.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de comprendre si les mécanismes qui déclenche l’ovulation après la stimulation avec le βNGF comportent une stimulation directe des neurones à kisspeptine ou nécessitent d’un interneurone. Cette information nous permettra de vérifier si du point vu évolutive les mécanismes d’induction de l’ovulation sont conservés entre ovulations induites et spontanées. Ceci représente une information très importante pour la compréhension de l’évolution des modalités d’ovulation chez les mammifères.

Procédures

Les animaux seront soumis a des procédures chirururgicales pour enlever les ovaires et positionner un implant sous-cutanée d'oestradiol. Cette procedure durera environ 15 minutes. Entre 7 et 10 jours plus tard les animaux seront soumis à une deuxième intervention pour réaliser une injection intracerebroventriculaire de colchicine. Cette procédure aussi aura une durée d'environ 15 minutes.

Impact sur les animaux

L’ovariectomie avec implant d’oestradiol est une technique largement utilisée dans les recherches en neuroendocrinologie de la reproduction et des douleurs peropératoires au site d’opération et de suture sont envisagées. Toute neurochirurgie peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies, ainsi qu'une douleur localisée en post-opératoire au niveau du site d'incision de la peau du crâne. Les effets indirects peuvent découler de la chirurgie (trouble comportemental, baisse d'activité locomotrice) et du produit injecté (diarrhée). Les effets directs sont de courte durée (de quelques heures à quelques jours). Les effets indirects peuvent survenir après quelques heures mais se poursuivre sur plusieurs jours. L’administration de colchicine sera effectuée par injection intracerebroventriculaire. L'injection de colchicine peut induire des effets indésirables tel que la diarrhée, des douleurs abdominales, des troubles du système nerveux. L’euthanasie des animaux sera effectuée dans les 24-27 heures après l’injection de colchicine et donc préalablement à la manifestation de ces effets.

Devenir

Dans la première partie de l'expérience toutes les souris (10) seront soumis aux chirugies indiquées dans le protocole détaillé. Par la suite toutes les souris (10) seront euthanasiées pour prélever le cerveau et rélaiser l'immunocytochimie.

Remplacement

La fonction de reproduction étant une fonction intégrée (sous influence de facteurs environnementaux et hormonaux endogènes) contrôlée par l'hypothalamus, elle ne peut s'observer que sur des organes entiers provenant d’un organisme vivant. Nous ne pouvons donc pas remplacer l’utilisation d’animaux pour notre expérience.

Réduction

Notre étude ce base sur l'analyse des données descriptives : coexistence ou non de marquage et éventuelle pourcentage de cellules marques par rapport à l’ensemble de la population. Nous n’avons donc pas besoin de réaliser des analyses statistiques pour cette expérience. Le choix du nombre d’individus par lot s'appuie sur les données de la littérature et notre expérience antérieure. Les souris utilisées seront ovariectomisées. Les ovaires produisent les hormones stéroïdes qui rétroagissent au niveau cérébral pour moduler le cycle ovarien. Ces hormones présentent des fluctuations endogènes de leurs taux au cours du cycle, l'ovariectomie (suivie d'un traitement substitutif : implant d’estradiol) va permettre de standardiser les taux endogènes circulants et donc de réduire l'effectif d'animaux à inclure dans l’expérimentation. Pour établir le nombre d’animaux à utiliser nous avons prix en considération le fait que les animaux seront soumis à deux chirurgies, à une perfusion intracardiaque et aux aléas de la coupe après congélation. Nous estimons que pour pouvoir obtenir 6-7 échantillons exploitables de la région d’intérêt, nombre que nous permettra d’avoir des données solides, nous devons partir d’un groupe de 10 animaux. L’utilisation d’un nombre moindre d’animaux pourrait être suffisant, mais vu le risque d’avoir à répéter l’expérience, suite aux aléas liés aux différentes manipulations, et donc augmenter ultérieurement le nombre de souris, ce choix nous semble le plus pertinent pour réduire aux minimum le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris seront hébergées par trois ou cinq par cage en présence d'objets en carton (boites à œufs, frisottis en papier). Une semaine d' habituation à la manipulation par l'expérimentateur est prévue pour réduire le stress lors des différentes manipulations prévues par le protocole. Les souris seront anesthésiées lors des chirurgies et recevront un traitement antalgique consécutivement à la neurochirurgie. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant la neurochirurgie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de référence utilisée en routine par de nombreux laboratoires est aussi l'espèce sur la quelle nous avons obtenu les résultats d'induction de l'ovulation avec le beta-NGF. Pour étudier l'ovulation nous avons besoin de souris femelles adultes.

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est soumise à un régime riche en graisse pendant treize à seize semaines pour développer obésité, diabète et athérosclérose, avec implantation d'une sonde de télémétrie, mesures de pression artérielle, injections et induction d'une fibrillation cardiaque. Le porteur indique que le régime réduit la mobilité des souris et que la chirurgie et les manipulations génèrent du stress, les animaux étant mis à mort pour prélever leurs tissus. Il affirme qu'il n'existe "aucun moyen de remplacer" de telles études portant sur l'ensemble de l'organisme.

Objectifs

L’obésité est associée avec une inflammation chronique de faible intensité impliquée dans le développement des facteurs de risque du diabète de type 2. La consommation d’un régime riche en graisse s’associe en effet à une inflammation précoce d’une partie du cerveau, l’hypothalamus, contrôlant la dépense énergétique, suggérant son rôle critique dans le développement de l’obésité et de ses conséquences. Cependant, les mécanismes impliqués dans l’initiation de l’inflammation hypothalamique ne sont pas totalement connus. Dans ce projet, en utilisant une nouvelle stratégie ciblant spécifiquement les cellules hypothalamiques, nous cherchons à diminuer l’inflammation associée à la prise d’un régime riche en graisse utilisant différents modèles de souris avec prédisposition à l’inflammation et au diabète. L’expérimentation animale prévue dans ce projet permettra d’obtenir des données pour améliorer les altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l’obésité ainsi que favoriser le développement de thérapies plus effectives.

Bénéfices attendus

Démontrer l'implication de la protéine NLRP3 dans le processus inflammatoire associé au développement de l’obésité et du diabète au niveau hypothalamique. En plus, la confirmation de l’implication de NLRP3 dans la dérégulation hypothalamique de la prise de poids et les dépenses d’énergie impliquerait sa validation en tant que nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l’obésité.

Procédures

Six interventions : - Régime riche en graisse : 13 (procédure 1) ou 16 semaines (procédure 2) – Implantation sous-cutanée : 1 implantation/animal, durée 20 minutes (procédure 2) - Mesure pression artérielle : 6 mesures (6 jours, procédure 1) et 12 mesures (28 jours, procédure 2), durée : 10 minutes/mesure - Prélèvement de sang : 6 prélèvements d’une goutte de sang par souris à la fin du régime (procédure 1), durée de chaque prélèvement < 5 minutes. - Injections intraveineuses : 2 ou 12 injections (une injection tous les 3 jours pendant les dernières 7 jours dans la procédure 1 ou 4 semaines dans la procédure 2), durée de chaque injection < 5 minutes. - Induction d’une fibrillation atriale : une fois (procédure 2), durée 20 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris seront les suivants : 1) Prise de poids liée à un régime enrichi en graisse ; 2) Développement de maladies liées à cette alimentation spécifique : obésité, diabète de type 2, athérosclérose ; 3) Mobilité réduite dans des cages à cause de la prise de poids ; 4) Stress liée à la chirurgie après l’implantation de la sonde de télémétrie ; 5) Stress lié aux manipulations (échographie, prise de la pression artérielle sur animal éveillé, pris de la température au niveau rectal, prise de sang de la queue, injection de vésicules extracellulaires). Les 3 premiers effets concerneront 288 souris sur 672, qui seront nourris avec le régime riche en graisse. L’effet 4 concerne 168 souris puis l’effet 5 concerne l’ensemble des souris.

Devenir

A la fin du protocole, des prélèvements de tissus seront effectués sur les animaux mis à mort. Il est nécessaire d'analyser chaque tissu pour évaluer les effets du régime riche en graisse.

Remplacement

Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse physiopathologique, et seule l’expérimentation animale permet un suivi complet des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l’obésité et au diabète, comme la formation de la plaque d’athérome depuis ses phases les plus précoces.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé pour chaque expérience en fonction des données de la littérature, de notre expérience avec ces modèles maitrisés au laboratoire depuis plusieurs années et à l’aide du logiciel statistiques avec un écart-type de 20%, un risque alpha=5% et une puissance beta=95%, il est nécessaire d’inclure 12 animaux par groupe. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserions un même animal pour plusieurs mesures.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera donc évalué de façon hebdomadaire en observant leur comportement. Les indices pouvant suggérer une douleur au moyen du score de grimace (rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, renflement du nez, renflement des joues, positionnement des oreilles vers l'arrière, changement de position des vibrisses) seront surveillés. En plus, plusieurs paramètres seront évalués (évolution du poids, suivi des plaies, apparence physique, comportement, réponses comportementales aux stimuli) sur la base d’attribution de scores. La grille de scoring des points limites est montrée dans chaque procédure. De plus, comme les animaux vont prendre du poids et pour favoriser leur sociabilisation, nous mettrons au maximum 4 animaux par cage. Cependant, dans certains cas, il est possible d’avoir un animal mâle isolé. Dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. De même, ils auront à disposition des bâtonnets de peuplier afin de leur permettre de ronger quelque chose de dur puisque le régime riche en graisse rend les croquettes moins dures que leur nourriture habituelle. Les souris diabétiques étant polyphagiques, polydispisques et polyuriques, elles seront placées avec une litière abondante et absorbante. La fréquence du changement de litière sera augmentée en fonction des besoins des animaux.

Choix des espèces

Ce projet vise à analyser les mécanismes moléculaires impliqués dans la favorisation de l'inflammation au niveau hypothalamique responsables des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l'obésité et au diabète. À cette fin, nous avons choisi d'utiliser l'espèce Mus musculus modèles de souris sauvage C57BL/6, en tant que contrôle, et des souris transgéniques knock-out pour plusieurs protéines ainsi que des souris présentant une mutation spontanée du récepteur de la leptine, les souris db/db. L’étude comparative de l’effet du régime riche en graisse dans ces modèles de souris permettra de relier directement le processus inflammatoire avec le développement de l’obésité et le diabète. L'utilisation de ces modèles animaux est une condition nécessaire à l'avancement de la recherche à la suite d’études déjà réalisées in vitro dans le laboratoire avec des échantillons de patients et différents types de cellules. Les souris seront utilisées à l’âge de 6-8 semaines, pour lequel les animaux sont considérés comme adultes et peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie stéréotaxique pour implanter une minipompe diffusant des inhibiteurs dans le cerveau, puis des tests répétés de tolérance au glucose et à l'insuline, pour étudier un lien entre diabète et marqueurs de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que l'isolement en cage individuelle peut induire un stress chronique et que tous les rats sont mis à mort au bout de cinq semaines pour des études post-mortem. Il affirme que l'étude d'un organisme vivant "dans son intégralité" est "indispensable" et que des approches in vitro ne renseigneraient que sur les cibles moléculaires.

Objectifs

Le diabète de type 2 (DT2) est associé à la maladie d’Alzheimer (MA). Réciproquement, le DT2 est fréquent chez les patients atteints de la MA. Des marqueurs moléculaires associés à la MA sont présents chez le rat Goto-Kakizaki (GK) spontanément diabétique. La surexpression de ces marqueurs est associée à la MA et au diabète. L’objectif de notre projet sera de rechercher si l’inhibition de ces marqueurs, directement au niveau du cerveau, peut améliorer l’état diabétique du rat GK. Pour cela, nous allons administrer des inhibiteurs de ces marqueurs pendant 14 jours, dans le cerveau de rats diabétiques (GK) et contrôles Wistar (W) de 3 mois. Cette étude nécessitera au total 96 rats mâles et 96 rats femelles et sera réalisée sur une durée de 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mettre en avant le rôle de ces marqueurs dans le cerveau sur la régulation du métabolisme du glucose et son implication dans le diabète du rat GK. La modulation de ces cibles moléculaires pourrait ouvrir la voie à un traitement du diabète.

Procédures

Les 192 animaux subiront une procédure chirurgicale, par stéréotaxie, pour l'implantation de la canule équipant la minipompe osmotique. Cette chirurgie dure 60 minutes. Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux dans le cadre de tests métaboliques de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline et lors du suivi de la glycémie. Chacun de ces tests dure 2h. Pour le test de tolérance au glucose, des prélèvements de sang de 30 microlitres aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes sont réalisés afin de mesurer la glycémie et l'insulinémie. Pour le test de tolérance à l'insuline, une goutte de sang (10 microlitres) sera prélevée pour lecture de la glycémie sur lecteur Accuchek aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes. Les 2 tests seront séparés de 2 jours pour permettre la récupération.

Impact sur les animaux

L’isolement des animaux en cage individuelle après l'implantation de la minipompe reliée à une canule dans le cerveau pourrait induire un état d’anxiété tel qu’un stress chronique qui pourrait se manifester par une modification de la réactivité comportementale des rats. La pose de la minipompe entraîne une gêne et une possible douleur pour l'animal. L'injection en intrapéritonéal dans le cadre des tests métaboliques de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline est à l'origine d'une petite douleur liée à la piqûre. Une éventuelle hypoglycémie peut arriver dans le cadre du test de tolérance à l'insuline, mais cela est très rare chez le rat.

Devenir

A l’issue de notre procédure, au bout des 5 semaines, tous les animaux seront mis à mort pour des études post-mortem.

Remplacement

Le métabolisme glucidique dont nous cherchons à mettre en évidence la régulation suite à la modulation de cibles dans le cerveau nous conduit à devoir travailler sur un organisme vivant dans son intégralité. Des approches in silico et in vitro, notamment sur des neurones en culture, ou ex vivo, sur une structure cérébrale spécifique isolée telle que l’hypothalamus, nous permettraient uniquement de mettre en évidence la modulation de nos cibles d’intérêt (DYRK1A et GSK3β) par les traitements pharmacologiques (EMD92 et LiCl respectivement), mais pas d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme aux traitements suite au dialogue entre le cerveau et les tissus périphériques. Ainsi pour atteindre les objectifs spécifiques de notre projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum grâce à l’utilisation de tests statistiques paramétriques et non paramétriques montrant au mieux la différence entre les groupes, et il permet de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse au traitement.

Raffinement

Afin de réduire au mieux l’apparition d’une éventuelle douleur, angoisse et stress chez les animaux nous prendrons toutes les précautions nécessaires (recours à l’analgésie, l’anesthésie, maintien de l’enrichissement (morceau de bois et sopalin), habituation, récupération). Pendant la chirurgie, la respiration, l'obstruction des voies respiratoires, le pouls et la température corporelle seront surveillés. Une injection en sous cutané d'anesthésique local, sera effectuée 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la chirugie, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Des points limites adaptés d’évaluation de la douleur et des critères d'arrêt de souffrance seront déterminés. Pour les rats diabétiques GK une litière adaptée sera mise dans les cages et renouvelée 2 fois par semaine pour éviter l'inconfort des animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Enfin le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète dans l'équipe est le rat. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes de 3 mois. A cet âge, le diabète s’est bien développé et stabilisé chez les rats GK.

8 cochons miniatures vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants pour être réutilisés dans un autre projet. Chaque animal subit une chirurgie abdominale de trois heures pour la pose de cathéters, puis trois séances de prélèvements sanguins de sept heures après ingestion d'une farine d'insectes, pour mesurer la vitesse de digestion d'un ingrédient protéique destiné à l'alimentation humaine. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des douleurs abdominales dans les jours suivants, et fixe un point limite de mise à mort en cas de perte de poids supérieure à 20 %. Il affirme que la biodisponibilité des nutriments "ne peut pas" être reproduite in vitro et présente le miniporc comme un modèle proche de l'appareil digestif humain.

Objectifs

Cette étude entre dans le cadre de la caractérisation de la qualité nutritionnelle d’un nouvel ingrédient protéique obtenu à partir d’insectes comestibles. Ce nouvel ingrédient est destiné à la consommation humaine. Au-delà de la composition en acides aminés indispensables et de la digestibilité dans l’intestin grêle, la qualité nutritionnelle d’une protéine dépend de la vitesse à laquelle elle est digérée, paramètre qui va influencer l’efficacité d’utilisation métabolique des acides aminés qui la compose. Ce projet a pour objectif d’évaluer la vitesse de digestion des protéines du nouvel ingrédient à base d’insecte en suivant l’évolution de la concentration en acides aminés dans le sang, suite à un repas test contenant cet ingrédient protéique, chez le miniporc.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cibler un ensemble de produits alimentaires dans lesquels, la farine pourra être introduite et ceci pour répondre à des besoins spécifiques. Elle va également nous permettre de préconiser la temporalité de la consommation de ce produit. En effet, l’ingrédient à tester ne répondra pas de la même manière, selon certaines conditions physiologiques et selon la cinétique d’absorption. Les résultats de cette étude permettront d’envisager les prochaines investigations pour compléter la caractérisation de l’ingrédient. Eventuellement, imaginer une étude sur modèle in vivo dans l’objectif d’étudier ses effets à plus long terme sur une situation physiologique ou physiopathologique précise. La notion de qualité protéique est aujourd’hui très recherchée par le particulier et notamment chez le sportif. Aussi on accorde également de l’importance à la qualité des protéines dans d’autres conditions, comme le vieillissement, la dénutrition, en post chirurgies lourdes. Cette première étude d’analyse de la qualité des protéines permettra de préciser les futures investigations concernant cet ingrédient.

Procédures

Chaque animal subira une seule demi-journée (3h) d’intervention chirurgicale (1h de préparation pré-opératoire, et 2 h entre l’incision cutanée et le réveil de l’animal). Une période de récupération de 15 jours est laissée pour chaque animal, entre la chirurgie et la première journée de prélèvements. Chaque animal participera au final à 3 cinétiques post-prandiales d’une durée de 7h suivie d’une période de récupération de 7 jours entre chaque cinétique. Lors d’une journée de prélèvement, les animaux recevront le matin comme seul aliment une des modalités à tester (TM, TMB ou WB). Des prélèvements de sang seront réalisés simultanément dans les 2 cathéters avant et après le repas selon la cinétique suivante : -0,5h, 0, 0,25h, 0, 5h, 1h, 1h30, 2h, 3h, 5h et 7h, soit au total 10 prélèvements sanguins en simultanés sur chaque vaisseau pour chaque animal. Pour chacune des journées de prélèvements, 2.7 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter selon la cinétique suivante : -0,5h, 0, 0,25h, 0, 5h, 1h, 1h30, 2h, 3h, 5h et 7h après le repas. Ce qui représente un volume total de 54 ml par cinétique (2.7 mL x 2 cathéters x 10 temps), ce qui est acceptable pour des animaux de plus de 35 kg.

Impact sur les animaux

Des douleurs abdominales peuvent être ressenties par l’animal suite à l’intervention chirurgicale. Elles peuvent se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures.

Devenir

Tout les animaux seront gardés en vie dans l'objectif d'être réutilisés pour un autre projet de recherche faisant l'objet d'une autre demande d'autorisation de projet.

Remplacement

La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro. Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.

Réduction

L'effectif prévu dans le schéma expérimental (6 animaux inclus dans le schéma expérimental) est réduit à son minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré (apparition des acides aminés dans le sang), estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Cette variabilité est liée non seulement de la variabilité interindividuelle des animaux, mais aussi à la qualité des prélèvements effectuées et à la précision des données obtenues par l’analyse biochimique. Ces aspects sont parfaitement maitrisés par les expérimentateurs du projet qui ont une longue expérience dans le domaine. Le fait d’utiliser un schéma expérimental en carré latin permet de diminuer significativement le nombre d’animaux utilisés (chaque animal étant son propre témoin). Après analyse de la fonction de répartition de la loi de Chi2, un nombre minimal de 6 animaux par conditions expérimentales est nécessaire pour obtenir une différence significative à 5% entre les lots sur le critère principal (biodisponibilité du fructose). 2 mini-porcs supplémentaires sont également prévus pour faire face aux aléas (mauvaise récupération chirurgicale des mini-porcs, perte précoce de perméabilité des cathéters, ...). L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Les animaux recevront pendant 6 jours un traitement analgésique et spamolytique, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle.

Raffinement

Les douleurs potentielles que pourraient ressentir les animaux pendant l’expérimentation sont liées à l’acte chirurgical. Celui-ci est réalisé sous anesthésie gazeuse, avec l’injection d’un dérivé morphinique avant l’incision cutanée, toutes les précautions sont ainsi prises pour éviter la douleur pendant le temps opératoire. Celle-ci peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération. Afin de la prévenir et de la limiter au maximum, les animaux reçoivent un traitement antalgique systématique à base d’AINS. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, nous discuterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et interagir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.

Choix des espèces

Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments. Ces animaux sont utilisés dans la très grande majorité des études réalisées auparavant dans notre équipe de recherche, ce qui facilite la comparaison des données issues des diverses expérimentations réalisées. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'intervention.

1 785 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur de prostate sous la peau puis des injections répétées pendant quatre à six semaines, pour tester des nanoformulations à base de carbone ciblant le métabolisme des cellules cancéreuses. Le porteur indique que la greffe peut provoquer une douleur au site d'incision, une infection et une inflammation, et que toutes les souris sont mises à mort pour collecter des tissus. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement "pertinente" n'existe et qualifie la xénogreffe d'"indispensable", les retombées cliniques étant renvoyées au potentiel.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) représente 1 276 000 nouveaux cas et 360 000 décès dans le monde par an (57 000 cas, 9 000 décès en France). Il est dépisté par mesure du PSA (Antigène Spécifique de la Prostate) et toucher rectal. Aux stades localisés, des traitements curatifs existent : la chirurgie, la radiothérapie et la Curiethérapie, et des ultrasons. Au stade métastatique, l’hormonothérapie est le traitement de 1ère ligne, avec cependant une problématique de taille, l’échappement hormonal, qui fait que le cancer reprend son développement. Il s’agit d’un cancer complexe et hétérogène pour un même patient et entre les patients, et impliquant de multiples processus moléculaires permettant aux cellules tumorales d’échapper à la mort, rendant les traitements difficiles. Pour améliorer la survie des patients de nouvelles avancées sont nécessaires, tant pour le diagnostic que pour le traitement de la maladie. Dans ce projet ciblé sur le cancer de la prostate, nous allons développer des molécules chimiques innovantes qui permettent de combiner de la chimiothérapie et de la thérapie génique qui permet d’éteindre un gène d’intérêt important pour le développement tumoral.

Bénéfices attendus

Notre projet va optimiser au niveau préclinique l’utilisation de nanoformulations à base de carbone pour un double ciblage cellulaire du métabolisme. Les retombées de notre projet ont des implications potentielles très importantes pour la clinique. Nos résultats permettront ainsi d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement du cancer de la prostate. Du fait que les patients deviennent résistants aux thérapies anti-tumorales classiques dans ce cancer, il y a un besoin urgent de découvrir, de développer et valoriser de nouvelles alternatives thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients aux stades avancés de la maladie. Récemment, de nouvelles opportunités ont émanées de laboratoires de recherche travaillant sur des composés ciblant le métabolisme cellulaire et l’apport en oxygène des cellules tumorales. Nos résultats antérieurs supportent largement notre hypothèse et valident le rationnel de ce projet. Ainsi, nous pourrons apporter de nouveaux outils pour cibler le métabolisme des cellules cancéreuses grâce à ces propriétés uniques des nanoformulations à base de carbone.

Procédures

Les animaux recevront un implant tumoral sous-cutané au cours d’une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. La chirurgie durera 5 minutes. Le volume tumoral sera suivi par mesure hebdomadaire à l’aide d’un pied à coulisse électronique. Ils recevront des injections sous anesthésie générale répétées sur 4 à 6 semaines, à raison de 2 injections par semaine durant environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

Comme il s’agit de greffer des petits morceaux de tissus tumoraux, il est possible qu’il y ait une douleur au site d’incision, et une infection au point de suture. Une inflammation au site d’injection est aussi possible.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expérimentations afin de collecter un maximum de tissus afin de procéder à des analyses complémentaires et soulager les douleurs éventuelles.

Remplacement

Le cancer de la prostate, comme beaucoup de cancer, se caractérise par une grande variabilité cytogénétique entre les individus et hétérogénéité au sein même de la tumeur. La réalisation d'études précliniques fiables nécessite l'utilisation de modèles reproduisant fidèlement ces caractéristiques des tumeurs humaines. Or, les modèles d'étude se basant sur les lignées cancéreuses clonales ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. De même, pour les systèmes de culture 3D en cours de développement qui ne permettent pas encore d’obtenir des résultats projetables à l’homme. Par conséquent, aucune méthode de remplacement pertinente n'existe à ce jour. Il est donc indispensable d’utiliser le modèle de xénogreffe de tumeur de patients, seul capable de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les différentes étapes du projet, notamment en réduisant le nombre de réimplantation lors de la stabilisation des modèles de xénogreffe et en réalisant des études pilotes pour valider les voies d’administration des traitements. Le nombre d’animaux a été calculé statistiquement (calcul de puissance) afin d’être réduit à son minimum tout en permettant d’atteindre les objectifs du projet. Dès que les objectifs seront atteints, ou en absence d’effet des traitements, aucun animal supplémentaire ne sera inclus permettant de réduire encore les effectifs.

Raffinement

Le raffinement sera assuré par un enrichissement des cages pour le confort des animaux (des bâtons à ronger pour limiter les querelles ; des carrés de coton pour une nidification ; des igloos, permettant le jeu et le repos). Les souris seront nourries et hébergées en groupe ; elles ne seront séparées qu'en cas de comportement agressif avec induction de plaies. Nous diminuerons la douleur et l'angoisse liées à la xénogreffe en opérant sous anesthésie générale, avec une anesthésie locale au site d’implantation, et en appliquant une analgésie péri- et post-opératoire. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. De plus, nous avons établi des points limite qui mettront fin à l’expérimentation en cas de souffrance et d’inconfort des animaux.

Choix des espèces

Les pathologies cancéreuses en général se caractérisent par une grande variabilité cytogénétique (variation de l’ADN des cellules tumorales) entre les individus et sont généralement hétérogènes au sein même de la tumeur. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales qui ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. Par ailleurs, les modèles expérimentaux in vitro ne prennent pas en compte le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. Ainsi, malgré le développement de cultures 3D dont la mise en place reste difficile, les modèles animaux s'avèrent donc indispensables pour la recherche translationnelle en oncologie. Le modèle expérimental décrit dans ce projet nécessite l'utilisation d'animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d'un tissu étranger. Les greffes seront réalisées sur des souris jeunes âgées de 5 à 6 semaines afin d’avoir un système immunitaire encore très peu mature, permettant d’assurer une prise de greffe optimale.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'un anticorps, des injections rétro-orbitaires sous anesthésie, subissent pour certaines une néphrectomie ou la pose de pastilles induisant une hypertension, et passent en cage métabolique, avant d'être tuées pour analyser les reins. Le porteur décrit une douleur minime aux injections intrapéritonéales et les conséquences physiologiques de l'insuffisance rénale et de l'hypertension induites. Il affirme que les analyses in vitro et in silico ne conviennent pas à l'étude des maladies glomérulaires, testée ici avant un éventuel usage chez l'humain.

Objectifs

Les glomérulopathies sont un groupe de maladies touchant le glomérule. Le glomérule fait partie du rein et est à la base de la filtration du sang et de la production de l'urine. Les glomérulopathies conduisent donc rapidement à l'insuffisance rénale. Un type de cellule du glomérule, les cellules épithéliales pariétales (CEP), joue un rôle majeur dans ces glomérulopathies. En effet, l'activation des CEP est à l'origine des lésions du glomérule qu'on retrouve dans les glomérulopathies. Nous avons à disposition un anticorps bloquant l’activation de ces CEP. Nous voulons tester cet anticorps dans des modèles murins de glomérulopathies afin d’évaluer sa capacité à prévenir l’apparition de l’insuffisance rénale avant une éventuelle utilisation comme médicament chez l'humain.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra mettre en évidence l'efficacité d'un nouveau traitement dans deux types de glomérulopathies qui sont deux causes majeures d'insuffisance rénale terminale. Il permettra également de mieux appréhender les mécanismes physiopathologiques de ces glomérulopathies et notamment le rôle des CEP dans celles-ci.

Procédures

104 souris de la procédure "efficacité de l'anticorps anti-claudin 1 humaine dans un modèle de glomérulonéphrite proliférative extra-capillaire, le modèle NTS" subiront une injection de l'anticorps d'interêt ou de son contrôle en intra périntonéale deux fois par semaine pendant 2 ou 3 semaines en fonction de la procédure, ces injections seront effectués sur animaux vigiles. Ces injections intra péritonéales durent une minute. Ces 104 mêmes souris subiront trois injections en rétro-orbitaire de NTS 3 jours de suite aprés anésthésie à l'isoflurane, cette injection dure 30 secondes. Ces souris seront également mises en cages metaboliques une fois par semaine pour une durée maximale de 14 heures et enfin subiront un prélévement de sang en intracardiaque sous anésthesie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine, qui dure 2 minutes. Ces 104 souris de la P1 subiront une mise à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isofurane. Pour ces 104 souris, cela fait au total 5 différents types d'intervention. 58 souris de la procédure "efficacité de l'anticorps anti claudin 1 humaine dans un modèle d'HSF, le modèle DOCA salt" subiront une uni-néphrectomie et la mise en place de pellet doca salt sous anesthésie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine, cette intervention dure 25 minutes. Ces 58 souris subiront une injection de l'anticorps anticlaudin 1 humaine ou de son isotype en intra périntonéale deux fois par semaine pendant 58 jours, ces injections seront effectués sur animaux vigiles. Ces injections intra péritonéales durent une minute. Ces mêmes 58 souris seront mises en cages metaboliques une fois par semaine pour une durée maximale de 14 heures pendant 6 semaines et subiront un prélévement de sang en intracardiaque sous anésthesie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine. Ce prélèvement dure deux minutes. Enfin, ces 58 souris subiront une mise à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isofurane. Pour ces 58 souris, cela fait au total 5 différents types d'intervention.

Impact sur les animaux

Les souris subiront le stress d'être isolées pendant le passage en cage métabolique. Elles subiront une douleur minine lors des injections intra péritonéales. Lors des procédures plus invasives comme les injections rétro orbitaires, la néphrectomie ou la mise en place des pellets DOCA, elles seront anesthésiées à l'isoflurane et analgésiées. Enfin, elles subiront les conséquences physiologiques de l'insuffisance rénale et de l'hypertension artérielle induites par les modèles expérimentaux

Devenir

Etant donné que les reins de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.

Remplacement

le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concerne l'étude des maladies glomérulaires car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu. Des tests in vitro ont été réalisés afin de sélectionner les clones d'anticorps, ces tests ont permis de mettre en évidence leur spécificité et leur efficacité d'anticorps bloquant.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait avec un risque alpha de 5%, une puissance de 95%, une moyenne du groupe contrôle de 12, une moyenne pertinamment différente attendue de 8 dans le groupe traité, une déviation standard de 4 et un ajustement de 10%; ce qui donnait 26 animaux par groupe requis. 3 animaux de plus sont prévus pour pallier les risques du modèle expérimental (mortalité liée à la chirurgie odans le modèle DOCA salt).

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises: 1)Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bi-hebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse + buprénorphine . 3)Les procédures invasives tel que les injections retro-orbitaires seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et les souris recevront un traitement analgésiques qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel. 5) une double litière sera mise en place pour pallier à la production excessive d'urine par les souris du modèle DOCA salt, et les cages seront changées 3 fois par semaine.

Choix des espèces

Les mécanismes des maladies du rein sont similaires chez l'homme et la souris et ce sont dans les maladies du rein qu'il existe un interet à bloquer l'activation des cellules appelées CEP et donc à utiliser l'anticorps anti claudin 1. Les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 à 6 mois car il faut des adultes au système immunitaire mature (>2 mois) et suffisamment jeunes pour ne pas observer des maladies du rein liées au vieillissement.