Oncologie

2 475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris génétiquement modifiées pour reproduire des syndromes de surcroissance comme le syndrome de Protée reçoivent un gavage quotidien pendant deux mois, du tamoxifène puis des inhibiteurs, ainsi qu'une injection sous la peau, pour étudier ces maladies sans traitement connu. Le porteur décrit le gavage comme non traumatisant et surveille surtout le risque de fausse route, et prévoit d'arrêter le traitement quand une malformation atteint un demi-centimètre cube chez un animal témoin. Il affirme que les expériences in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des cultures cellulaires ou des méthodes in silico.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance en mosaïques sont causés par des mutations génétiques causant une croissance anormale des organes et/ou tissus. Nous nous intéressons ici au syndrome de Protée caractérisé par une hypercroissance asymétrique des tissus avec des anomalies vasculaires et lymphatiques mais aussi aux anomalies d’hypercroissance associées à des hypoglycémies. Pour ces 2 types de pathologies il n’existe aucun traitement. Notre objectif est de mettre en place des modèles de souris porteurs de ces mutations dans différents tissus de manière spécifique afin de comprendre les mécanismes moléculaires, cellulaires et endocrinologiques de ces pathologies. Nous explorerons également l’effet de différentes molécules permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements.

Procédures

Un traitement sera administré par gavage quotidien pour faire diminuer le volume des malformations. Le volume administré sera de 100ul. Celui-ci sera effectué par un technicien expérimenté. Le gavage sera réalisé chez des souris adultes. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Le gavage dure environ 15 secondes par animal. Les souris seront gavées pendant 2 mois. Un groupe de souris recevra une injection unique sous cutanée de 100ul. Cette injection sera effectuée par un technicien expérimenté

Impact sur les animaux

Gavage au tamoxifene pendant 5 jours pour induction de la Cre recombinase. Le tamoxifene à cette dose là ne donne pas de toxicité particulière. Gavage avec les inhibiteurs pharmacologique ou véhicule pour réduire le volume des hypertrophies. Le gavage n’entraine aucune nuisance particulière sauf une fausse route qui sera particulièrement surveillée. Les inhibiteurs pharmacologiques ne donnent pas de toxicité particulière aux doses utilisées. Le traitement sera interrompu lorsqu'une malformation chez une souris du groupe contrôle aura atteint le volume de 0.5cm3.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur les syndromes de surcroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu.

Réduction

La taille des groupes utilisés représente le minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Enfin, nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Par ailleurs, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Nous espérons ainsi identifier de nouveaux traitements médicamenteux qui pourraient améliorer les conditions de vie des patients porteurs de ces mutations génétiques et pour lesquels aucun traitement satisfaisant n'existe.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.

1 764 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une chirurgie crânienne de deux heures puis une injection d'anticorps dans le cerveau, d'autres reçoivent des injections répétées de psychotrope pour reproduire des symptômes de schizophrénie, à l'âge adulte ou dès la naissance, avant des tests comportementaux d'exploration et de réaction à des sons. Le porteur teste des anticorps issus de lamas censés cibler une protéine liée au glutamate, et renvoie les retombées pour les patients au conditionnel. Il affirme que le volet comportemental force le recours à la souris et conclut que le remplacement n'est pas possible.

Objectifs

La schizophrénie est une maladie psychiatrique hautement invalidante touchant environ 1% de la population. La recherche actuelle suggère que le glutamate, messager majeur dans le cerveau, est lié à la maladie quand il est trop concentré, mais les essais jusque là ont échoué à cause d'actions mal ciblées à l'origine d'effets secondaires. Une famille de protéines permet cependant de réduire les quantités de glutamate localement, ce qui diminue les risques d’effets secondaires. Nous avons montré que des petits anticorps provenant des lamas pouvaient réduire les symptômes de la maladie chez la souris en ciblant un type de protéine de cette famille. Dans cette étude, nous cherchons à observer les effets de nouveaux anticorps ciblant un autre type de protéines de cette famille, pour potentiellement trouver des résultats similaires par une autre voie. Pour ce faire, nous les testerons chez des souris modèles reproduisant différent symptômes puis enfin sur des souris modèles ne possédant plus la cible de nos anticorps, en contrôle.

Bénéfices attendus

L'utilisation des petites molécules thérapeutiques a historiquement été limitée à cause de leur manque de précision. Nos anticorps, eux, ciblent exclusivement leur cible, ce qui en fait des agents thérapeutiques prometteurs. De plus, cibler le système du glutamate permet de s’attaquer directement à la source de la maladie, plutôt que de se limiter au traitement supericiel de certains symptômes d’hallucinations et de délires tel que le font les traitements actuels. Adresser de manière complète le problème permettrait de réduire tous les symptômes, en particulier cognitifs et/ou de l’humeur, ce qui serait un immense pas en avant pour les patients et limiterait les interruptions de traitement.

Procédures

Dans un premier temps, l’activité de nos anticorps sera évaluée après injection dans le cerveau, ce qui nécessite d'une part une chirurgie crânienne d'une durée de deux heures par animal, et d'autre part une injection unique sur vingt minutes. Si nos anticorps parviennent à passer directement dans le cerveau depuis le sang, cette procédure pourra être remplacée par une injection simple en périphérie (moins de cinq minutes). En ce qui concerne nos modèles, ils se basent sur l’injection régulière (moins de cinq minutes) de psychotrope soit sur deux semaines (une fois par jour) à l’âge adulte soit sur une semaine (un jour sur deux) chez le nouveau-né. Les tests comportementaux seront non invasifs et non douloureux avec de l'exploration d'arène et des réactions aux stimuli sonores sur deux ou trois jours, pour un total de deux heures pour chaque test, soit six heures par animal pour réaliser tous les tests. Tous les animaux à la fin des expériences seront mis à mort par injection d’anesthésique suivie d’une perfusion pour fixer les tissus et récupérer le cerveau.

Impact sur les animaux

Cette étude utilisera des animaux non mutés ou ne possédant plus les protéines cibles. Ces déficiences n'induisent pas de douleurs chez l'animal. La chirurgie présente des risques de mort lors de l’anesthésie, ainsi que de gêne et de douleur suite à l’opération. Les modèles murins de schizophrénie seront mis en place par des injections répétées de psychotrope au stade adulte ou au stade nouveau-né. Outre la douleur des injections, ces modèles impliquent des difficultées de mobilité, de mémoire, et de sociabilisation (sans agressivité). D’après les données chez l'animal obtenues par nos collaborateurs, aucun signe de souffrance n’est attendu après unique injection d’un anticorps. Les anticorps qui seront évalués dans cette étude n'ont pas d'effets indésirables attendus après injection unique.

Devenir

Pour toutes les procédures, les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau pour des analyses sur les tissus.

Remplacement

Le remplacement de l’animal n’est pas possible pour cette étude. Les anticorps développés jusque-là ont une cible murine et, bien que leurs caractéristiques aient été décrites en laboratoire, les aspects les plus complexes (circulation dans le système, délai d’action, durée de l’effet) ne peuvent être reproduits. L'étude se concentre de plus sur un trouble psychique dont les mécanismes ne sont pas bien décrits, mais pour lesquels la littérature présente plusieurs modèles murins représentant bien différents symptômes de la maladie. L'aspect comportemental de ce projet, à l'heure actuelle, force l'utilisation de l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour l'étude a été déterminé afin de minimiser l'utilisation de l'animal tout en assurant la pertinence statistique des études réalisées par la suite, en prenant en compte des variabilités attendues car observées dans des travaux similaires et les risques de pertes liés à la chirurgie. Si, au cours du projet, les variabilités observées sont plus faibles, les groupes seront réduits en conséquence. Mâles et femelles seront utilisés, car les modèles murins de schizophrénie utilisés ne présentent pas de variabilité en fonction du sexe. Les nanobodies injectés auront déjà été sélectionnés pour leurs caractéristiques in vitro. Pour chaque étape, les nouveaux résultats permettront de réduire la sélection. Les mêmes animaux seront observés à travers différents tests comportementaux.

Raffinement

Cette étude utilisera des animaux non mutés ou ne possédant plus les protéines cibles. Ces déficiences n'induisent pas de douleurs chez l'animal. Tous les animaux suivront une période de cinq jours d’habituation à la manipulation et aux tests afin de réduire au maximum le stress lié au contact humain et à l’environnement d’étude. Des groupes d’animaux subiront des chirurgies et seront donc endormis profondément par l'utilisation d'anesthésiques appropriés et leur douleur sera traitée avec des anti-douleurs afin de minimiser la souffrance et la mortalité des animaux. Des mesures préventives aux impacts secondaires de la chirurgie (baisse de température, déshydratation, sécheresse des yeux) seront mises en place, avec une semaine de récupération sous surveillance quotidienne. Les résultats actuels ne permettent pas d’affirmer que nos anticorps entrent dans le cerveau d’eux même, mais une étude parallèle est prévue, et si l’injection directe est possible elle sera alors favorisée pour limiter la souffrance animale. Les injections de psychotropes, outre la douleur de la piqûre, induisent des déficits de mobilité et de mémoire qui seront surveillés en fonction de l'âge de l'animal pour identifier aussi tôt que possible toute souffrance non prévue par l'étude. Les données obtenues par nos précédents collaborateurs suite à un traitement aigu avec ces anticorps ne montrent pas de signe de souffrance supplémentaire à l’introduction de l’aiguille chez l’animal. Le comportement des animaux sera évalué via une grille de score de douleur à chaque étape pour intervenir au plus tôt en cas de signes de souffrance plus importants que prévus dans le cadre des manipulations. Un score élevé nous amènera a contacter la structure de bien être animal pour prendre la décision d'utiliser des anti-douleurs ou euthanasier l'animal.

Choix des espèces

Les anticorps produits jusque-là visent des cibles murines avec une forte spécificité et les modèles d'intérêt pour la schizophrénie sont particulièrement bien documentés chez la souris. Afin d’identifier rapidement les composés ayant un potentiel thérapeutique, nous avons décidé d’utiliser d'abord un modèle rapide pour évaluer un symptôme simple de la maladie. Les composés ayant montré une capacité à atténuer ce symptôme seront ensuite caractérisés plus en profondeur dans un modèle d’exposition précoce à un psychotrope. Ce modèle, impliquant une période d’expérimentation plus longue, se veut plus proche de la maladie. Les souches déficientes pour les cibles visées sont des contrôles essentiels pour confirmer que l’activité des anticorps est propre à leur action sur la cible. Ces souris ont déjà été étudiées, et ne montrent pas de souffrance par rapport aux souris non mutées.

40 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras pendant environ 90 jours, elles reçoivent des antibiotiques puis l'application quotidienne d'une bactérie sur la langue, avec des tests de préférence alimentaire et un prélèvement de sang intracardiaque terminal. L'objectif est d'étudier le rôle du microbiote buccal sur le goût du gras et l'obésité, en vue d'applications en alimentation vétérinaire et humaine. Le porteur affirme que les relations entre organes nécessitent l'utilisation d'animaux, malgré des tests in vitro déjà menés sur des cellules gustatives.

Objectifs

Contrairement aux nombreuses études concernant le microbiote intestinal, très peu d'études ont exploré le microbiote oral et sa relation avec la prise de poids. Les seules études disponibles démontrent chez l’homme comme chez la souris que les bactéries du microbiote buccal peuvent induire l’obésité. Nous avons observé, par Séquençage métagénomique du gène codant pour l’ARN 16S bactérien qu’il existe une dysbiose (augmentation du rapport Firmicutes/Bacteroidetes) ainsi qu’une diminution de la diversité du microbiome oral chez les souris rendues obèses avec un régime hypercalorique contenant 32% huile de palme) en comparaison aux souris sous régime standard. L’analyse du phylum et du genre a démontré qu’une espèce bactérienne (bactérie A) appartenant au genre Streptococcus est plus abondante dans le microbiome oral des souris obèses. Cette bactérie (commensale) abondamment présente dans la flore intestinale murine est non pathogène de classe 1 et ne présente aucun risque pour l’homme. Pour des raisons de confidentialité on ne divulguera pas son nom et on l’appellera bactérie A. L'obésité résulte d’une surconsommation d’aliments caloriques due à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. Chaque bourgeon du goût est constitué par un amas de cellules gustatives. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors, TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Les récepteurs CD36 et GPR120 (et aussi GPR40) sont impliqués dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Dans ce contexte, nous souhaitons mettre en évidence le rôle de la bactérie A au niveau oral sur le comportement alimentaire, la perception gustative lipidique et l’induction de l’obésité. Le but de cette étude est de : 1- Evaluer l’effet de l’application orale de la bactérie A sur le comportement alimentaire en évaluant la préférence lipidique par test double choix et test de licking chez des souris obèses et contrôles non obèses 2- Évaluer l’effet de l’application orale da la bactérie A sur l’évolution du poids corporel et la glycémie chez des souris obèses et contrôles non obèses

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence le rôle du microbiote oral, et particulièrement la bactérie A, sur le comportement alimentaire et l’induction de l’obésité. Si cette étude fonctionne, elle serait intéressante, à terme, dans un contexte d’alimentation vétérinaire mais aussi dans un contexte d’alimentation humaine.

Procédures

L’ensemble des souris subira : - Mise sous régime (obésogène ou standard) toute la durée de l’étude (environ 90 jours) - Pesée tous les 3 ou 4 jours, toute la durée de l’étude - 10 jours de traitements antibiotiques dans l’eau de boisson - Application orale de la bactérie A chez les souris vigiles. Application quotidienne sur la langue, pendant 3 semaines ; technique de non invasive chaque application dure moins de 30 secondes - Mesure de glycémie (3 mesures) au début de l’expérience (temps 0), puis avant le traitement aux antibiotiques et au point final avant la mise à mort lors du test de tolérance orale du glucose (OGTT). Prélèvement d’une goutte de sang sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Un seul test OGTT : Les souris seront soumises à un test de tolérance au glucose (OGTT) nécessitant un gavage au glucose (quelques secondes le temps de la contention) et 5 prélèvements sanguins de faible volume seront réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Quatre Tests de double choix et quatre tests de licking pour chaque souris. Ces tests nécessitent une individualisation cinq jours avant le début des tests ainsi qu’une mise à jeun hydrique 6h avant chaque test. La durée est de 12 h pour le test de double choix et 5 minutes pour le test de licking. - Un seul test OGTT : Les souris seront soumises à un test de tolérance au glucose (OGTT)nécessitant un gavage au glucose (quelques secondes le temps de la contention) et 5 prélèvements sanguins de faible volume seront réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Un prélèvement sanguin : À la fin de l’étude, un prélèvement sanguin de 0,5 ml en intra-cardiaque sera réalisé sur souris anesthésié avec l’isoflurane (3 %) - Prélèvement d’organes : Les organes seront prélevés, après mise à mort

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact sur les souris puisqu’on induit une obésité ce qui implique un certain inconfort et de potentielles complications liées à l’obésité. Aussi, on supprime le microbiote endogène de la souris par traitement antibiotique. Le traitement aux antibiotiques peut également induire des troubles digestifs et par conséquent impacter la prise alimentaire et induire des diarrhées. De même, les animaux peuvent subir un stress, dû aux manipulations répétées pour appliquer sur la langue la bactérie A, ou suite aux prélèvements sanguins (lors de mesure de la glycémie pendant l’expérimentation et lors du test d’OGTT) ou encore des suites d’individualisation (pour les tests double-choix et licking).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes..

Remplacement

Les études physiologiques et les relation inter-organes nécessitent l’utilisation d’animaux. De plus, nous avons déjà étudié, in vitro, sur une lignée de cellules gustatives murines les mécanismes moléculaires d’action de la Bactérie A immortalisée ainsi que de la paroi de la bactérie A. Les tests effectués in vitro n’ont montré aucun effet toxique.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires, in vitro, nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation la taille des groupes minimale est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans les conditions habituelles de l’animalerie et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo en cellulose et sizzle pad). Si les animaux observés quotidiennement et si un signe clinique fait apparaitre un mal-être ou une douleur chez les animaux, ils seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane (3%).

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles de 8 semaines seront mises sous régime obésogène pour maitriser l’induction de l’obésité.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de lipopolysaccharides provoquant un choc septique, avec fièvre, confusion et apathie, avant un prélèvement de sang intracardiaque terminal. Le porteur indique qu'aucune couverture analgésique n'est mise en place, car elle modifierait le taux de cytokines mesuré. L'objectif est de mettre au point un modèle d'inflammation pour tester des candidats médicaments anti-inflammatoires.

Objectifs

Le but de ce projet est de mettre au point un modèle de choc septique au LPS (lipopolysaccharides) afin de mettre en évidence une activité anti-inflammatoire de molécules testés au moyen d’analyses de différentes cytokines (TNFalpha, IL-10).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettrait de mettre au point un modèle d’inflammation au LPS chez le rat avec pour but de déterminer le potentiel anti-inflammatoire d’une molécule spécifique par le biais de dosages de cytokines anti-inflammatoires.

Procédures

Les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p., aiguille 26G ou 25G; 10mL.kg, 5 secondes) de LPS. Puis ils seront anesthésiés (3 minutes) pour le prélèvement de sang (1 minute) puis euthanasiés. Dans les cas où nous testerons la référence anti-inflammatoire, les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p., aiguille 26G ou 25G; 10mL.kg, 5 secondes) en plus de l’injection de LPS.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p.; 10mL.kg, 5 secondes) de LPS. Lors du choc septique, les animaux seront fébriles (augmentation de la température corporelle), ils peuvent montrer des signes de confusions et d’apathie. Les animaux seront suivis (observation de 30 secondes) toutes les heures afin de surveiller leur état jusqu’au prélèvement. Puis ils seront anesthésiés (3 minutes) pour le prélèvement de sang (1 minute) puis euthanasiés. Dans les cas où nous testerons des références anti-inflammatoires, les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p.; 10mL.kg, 5 secondes) en plus de l’injection de LPS.

Devenir

Une grande quantité de sang doit être prélevée sur les animaux, il est donc indispensable qu’ils soient mis à mort après le prélèvement intracardiaque.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments anti-inflammatoires. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur l’inflammation, mais sans observation des potentiels effets secondaires. L’étude de potentiels traitements anti-inflammatoires doit donc être conduite dans un modèle restituant à la fois la composante comportementale et physiologique. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est basé sur les données publiées dans des articles réalisant le même modèle et les mêmes analyses. Cette estimation théorique sera confirmée lors des stades initiaux de développement du modèle (dès que l’approbation du projet permettra le début des expérimentations et la génération de données) par la réalisation d’une analyse statistique par la méthode des tirages aléatoires et d’un calcul de puissance via BiostaTGV. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat).

Raffinement

Dans le domaine de la pharmacologie préclinique, l’induction des modèles entraîne potentiellement l’apparition de symptômes douloureux et l’objectif des études réalisées ne permet pas la mise en place de dispositions spécifiques (e.g. couverture analgésique) aux risques d’impacter le niveau de cytokines. Le choix d’un modèle aigue (environ 4h) constitue un raffinement par rapport aux modèles chroniques qui augmentent la durée pendant laquelle les animaux sont exposés à des nuisances.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein d’ANS Biotech. Le rat a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) large caractérisation de ce modèle dans la littérature ; b) existence de cytokines identiques et mécanismes biologiques communs. Le jour de l’induction, les rats seront âgés de 6 semaines (Adolescent, jeune adulte) et pèseront entre 200 et 300 g. Ce stade est défini en suivant les caractéristiques décrites dans la littérature.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sous la peau puis des injections intraveineuses de molécules-vecteurs, la mise à mort se faisant par dislocation cervicale pour collecter sang et organes. Le porteur cite comme effets possibles des chocs anaphylactiques et des détresses cardio-respiratoires. Il affirme qu'aucune alternative ne donne accès aux fonctions physiologiques des mammifères et conclut que le développement de ces vecteurs ne peut se faire qu'in vivo.

Objectifs

Le cancer est encore aujourd’hui une des causes majeures de mortalité dans le monde et pour lequel les besoins médicaux actuels restent très insatisfaits, avec certains cancers nécessitant de nouvelles approches thérapeutiques. Ainsi, les cancers du pancréas, les cancers des poumons et de la prostate (ainsi que leurs métastastases) sont des exemples d’enjeux de santé publique. Ces dernières années, les recherches privées et publiques ont augmenté leurs efforts, suscitant de grands espoirs pour les patients malades et leurs familles. Cette demande de projet s’inscrit dans cette dynamique, avec pour objectif d’améliorer les perspectives thérapeutiques. Ce projet innovant a pour objectif d’évaluer si des molécules conjugués à des vecteurs (V-molécule) ciblants les récepteurs aux lipoprotéines LDL (LDLR) ou à la Transferine (TfR) permettent d’observer un effet clinique (thérapeutique, de distribution, d'extinction de gènes...) sur des modèles de tumeurs humaines implantées sur le modèle de souris. L’objectif principal de ce projet sera donc de développer, tester et optimiser nos molécules-vecteurs (V-molécule) pour améliorer la délivrance d’agents thérapeutiques au niveau des tumeurs. Par ces approches systémiques nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments. Les statines sont le traitement de référence pour soigner l’excès de cholestérol, ou plus exactement le LDL-cholestérol (lipoprotéine de faible densité), il s’agit d’un des médicaments les plus couramment utilisés dans le monde. Cette inhibition stimule secondairement l’expression des récepteurs aux LDL, permettant leur entrée dans la cellule cible. Il est fort probable que certains patients traités pour des cancers prennent des traitements à base de statine. Il est donc très important d’étudier l’effet de la prise de statine dans nos modèles tumoraux afin de voir leur effet sur l’expression du récepteur au LDL dans les tumeurs et autres tissus.

Bénéfices attendus

En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos V-molécules et les faibles quantités administrées, ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules Vecteurs (V-molécules) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les implantations des cellules tumorales se font en sous-cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié (anesthésie gazeuse isoflurane). Cet acte chirurgical sera effectué une seule fois par souris et cela prend environ 1 minute. Les injections des "V-molécules" : les souris recevront une injection IV (veine caudale) de V-molécule et de molécule controle. Les animaux sont endormis pour injecter les molécules en solution isotonique stérile. Il y a l'injection d'une molécule par animal et cela prend environ 2 min.

Impact sur les animaux

Dans ce projet nous proposons d’étudier la biodistribution de nos V-molécules sur des temps d’incubation relativement courts. Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous cutanées, les injections en IV des composés V-molécules, ainsi que le développement de la tumeur chez l’animal en tant que pathologie. Les composés pharmacologiques peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des modifications et des troubles comportementaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de collecter le sang et les organes qui seront utilisés pour faire des analyses complémentaires.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos V-molécules ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des conjugués développés. L'utilisation de rongeurs impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations et cahier des charges.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur des groupes de n=15 (V-molecule et molecule controle), à raison de 120 souris par an, réparties sur 4 études de 30 individus, sera suffisant pour appréhender un effet de nos molécules sur la croissance tumorale. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Ce nombre d'animaux pour ces procédure nécessaire à l'obtention d'une significativité statistique (réduction, règle des 3Rs) a été défini en déterminant: -le test statistique : T-test (2 groupes), -l'effet biologique et la dispersion escomptées, cette estimation a été faite d'après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société, -le risque alpha.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien et vétérinaire pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont déplacées dans une pièce cyclée, insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale + chirurgie) réalisera les implantations sous-cutanées de cellules tumorales. Une observation quotidienne des animaux (poids, douleurs, souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs et des antalgiques sont prévus en cas de nécessité. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie (anesthésie gazeuse isoflurane) ou au cours du developpement tumoral constituera le point limite de l'expérience. Un enrichissement materiel (twists, cocon ou nid) de l'environnement des animaux est mis en place dans toutes les cages afin qu'ils expriment un répertoire diversifié de comportements normaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs d'un seul fournisseur extérieur.

Choix des espèces

- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique (NU(NCr)-Foxn1nu ) comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides en sous-cutanée (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection de la V-molécule) en fonction de la taille des tumeurs.

20 rats, 10 mâles et 10 femelles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit sous anesthésie un prélèvement de peau sur toute l'épaisseur du dos puis une greffe de substitut cutané, avec des changements de pansement deux fois par semaine et un hébergement en cage individuelle. L'objectif est de transposer chez le rat un modèle déjà mené chez la souris, pour préparer des études destinées à des substituts cutanés pour grands brûlés et ulcères diabétiques. Le porteur affirme que le remplacement par des modèles in vitro ou ex vivo n'est pas envisageable pour caractériser la greffe sur un temps prolongé.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de transposer un modèle de greffe classiquement utilisé chez la souris chez le rat et d’évaluer la fonctionnalité d’un substitut cutané précédemment évalué chez la souris , afin d’envisager d’utiliser par la suite ce modèle de rat greffé pour la réalisation d’études de biodistribution et de tumorigénicité. Ces études sont requises selon les exigences techniques relatives aux produits pharmaceutiques à usage humain et les lignes directrices de l’Agence Européenne du Médicament pour les médicaments à base de cellules souches. Le substitut cutané sera greffé après induction d’une plaie cutanée chez le rat. Cela nous permettra de comparer les résultats obtenus chez des rats mâles et femelles et également de comparer ces résultats avec ceux obtenus lors des études effectuées chez la souris avec un substitut cutané identique. Des analyses identiques à celles effectuées au cours des études menées chez la souris permettront de caractériser la fonctionnalité du substitut cutané évalué et de valider ou non le modèle de greffe chez le rat . Cette étude de faisabilité permettra également la réalisation du prélèvement d’organes et de leur analyse en vue de la préparation des études de biodistribution qui devront être menées à la suite. L’ensemble des résultats obtenus lors de cette étude chez le rat et de ceux obtenus lors des études menées chez la souris permettront de sécuriser la production des unités thérapeutiques de substituts cutanés qui seront utilisées chez les patients souffrant de brûlures sur une grande partie du corps ou de plaies chroniques ne cicatrisant pas ou très difficilement comme les ulcères du pied chez les personnes diabétiques.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée et subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. Les substituts cutanés sont envisagés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique, ulcères veineux… Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies. Les données générées par cette étude chez le rat et celles obtenues par ailleurs chez la souris permettront de sécuriser la production des unités thérapeutiques qui seront utilisées chez les patients.

Procédures

Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour la réalisation de la greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau sur toute l’épaisseur de celle-ci sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates. Un traitement analgésique des rats greffés sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes cutanées seront protégées par la mise en place d’un pansement au-dessus du substitut cutané, d’un morceau de compresse stérile par-dessus, d’un pansement de couverture pour protéger la greffe et enfin de 2 bandes de sparadrap pour maintenir le tout en place. Les greffes cutanées seront observées régulièrement tout au long de l’expérimentation lors de chaque change de pansement effectué, 2 fois par sermaine. Un suivi quotidien des rats greffés sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats greffés en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les pansements et surtout le greffon cutané.

Impact sur les animaux

L'induction d'une plaie cutanée avant la réalisation de la greffe cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture analgésique pré- et post-opératoire. Les changes de pansements, effectués 2 fois par semaine, n’induiront pas de nuisance pour les rats, ceux-ci étant placés sous anesthésie gazeuse au préalable. L’hébergement en cage individuelle des rats greffés, nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les pansements et surtout le greffon cutané, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères.

Devenir

Procédure expérimentale 1 = Induction d’une plaie cutanée, greffe de substitut cutané et suivi de la greffe cutanée et des animaux : les 20 rats greffés, 10 mâles et 10 femelles, seront mis à mort à 2 temps différents après réalisation de la greffe cutanée, 2 semaines et 1 mois après, avec 5 rats par temps de prélèvement pour chacun des 2 sexes, pour réaliser un ensemble d’analyses.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes effectuées chez la souris et selon les recommandations des autorités de régulation sur les médicaments à base de cellules souches. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, lors de chaque change de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés , ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des briques de bois seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies chroniques à traiter chez l’Homme. Son utilisation est décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des rats âgés de 7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de rats décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

1 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des immunomodulateurs par voies intrapéritonéale et orale, pour tester une molécule associée à la radiothérapie contre le cancer du côlon et le mélanome. Le porteur décrit les atteintes très brièvement, la tumeur et le traitement pouvant "affaiblir la souris", sans détailler les points limites. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le micro-environnement tumoral et conclut que le projet doit être mené sur un organisme disposant d'un système immunitaire.

Objectifs

L’efficacité des immunothérapies ciblant l’axe PD-1/PD-L1, est très prometteuse, mais il semblerait que, dans certaines situations, ce traitement ne soit pas suffisant pour complètement activer la réponse immunitaire antitumorale. Dans ces cas, l’association de ce traitement avec notre molécule d’intérêt pourrait présenter une activité synergique bénéfique in vivo. De plus, l’efficacité accrue des traitements combinés radiothérapie/immunothérapie en comparaison avec les monothérapies est un des axes les plus prometteurs en ce qui concerne la lutte contre le cancer du colon et du mélanome.

Bénéfices attendus

L'ajout de la molécule (ACB1801) dont l’activité semble augmenter l’activité de protéines impliquées dans la présentation d’antigène in vitro, semble améliorer la réponse aux monothérapies ciblant PD-1 dans des modèles in vivo. Nous souhaitons donc combiner ces traitements avec la radiothérapie, afin d’améliorer l’efficacité de ces thérapies dans le cadre du cancer du colon et du mélanome. Déterminer si il y a une toxicité de la triple combinaison sur l'animal afin d'éviter les effets seconduires chez le patient.

Procédures

Les seules interventions prévues sont l'injection de cellules tumorales en sous cutané ainsi que l'injection en intrapéritonéal et par administration orale des immunomodulateurs pour les deux procédures.

Impact sur les animaux

Le traitement ainsi que la façon dont pousse la tumeur peuvent, dans certains cas, affaiblir la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés du fait des greffes qu'ils ont eues et pour effectuer des prélèvements d'organes en vue d'analyses sur certains d'entre eux.

Remplacement

Le recours à des modèles animaux nous permettra d’étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et qui permet donc l’interaction des cellules tumorales avec le stroma (dont les cellules immunitaires sous dépendance de médiateurs type cytokines ou cellules provenant du reste de l'organisme). Cela est indispensable dans le contexte de la radiothérapie (par exemple: effet «bystander» de l’irradiation i.e. effets que les cellules irradiées pourraient exercer sur des cellules non irradiées à proximité ou à distance par exemple). Il n’existe pas de modèle in vitro permettant une telle étude. Le projet nécessite donc d’être mené sur un organisme vivant disposant d’un système immunitaire.

Réduction

Nous avons choisi d'utiliser les modèles du cancer du colon et des mélanomes pour lesquels il y a beaucoup de données dans la littérature ainsi que dans notre laboratoire concernant la réponse à la radiothérapie et l'immunothérapie. Ceci nous permettra de réduire les conditions expérimentales (dose d'irradiation et d'immunomodulateurs) et donc le nombre d'animaux nécessaires pour tester nos hypothèses. De plus nous nous sommes basés sur des analyses statistiques pour déterminer le nombre nécessaire d'animaux.

Raffinement

Le développement de la tumeur sera suivi par la mesure du volume tumoral et les souris seront pesées très régulièrement. Un suivi quotidien de signes éventuels de souffrance sera effectué. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les procédures seront effectuées sous anesthésie locale ou générale. En cas de besoin, une analgésie sera utilisée. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Leur environnement sera enrichi (sizzlenests, maisons en cartons).

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. Les souris C57BL/6 et Balb/C ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, un âge où la souris est suffisamment développée (jeune adulte).

384 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une alimentation contaminée par la mycotoxine déoxynivalénol et du fer héminique, avec pour certains une injection cancérigène d'azoxyméthane et des séjours de 24 heures en cage à métabolisme, avant d'être tués pour prélèvement d'organes. Le projet étudie l'effet combiné de ces contaminants alimentaires sur le cancer colorectal. Le porteur affirme qu'une étude in vitro ne rend pas compte de la complexité de l'organisme entier.

Objectifs

Les mycotoxines sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine déoxynivalénol (DON) se retrouve dans près de 50 % des céréales et les concentrations augmentent avec le changement climatique. Aujourd’hui, environ 80 % des individus sont exposés au DON, à des niveaux proches ou supérieurs à la Dose Journalière Tolérable. Nous faisons l’hypothèse que dans des conditions réalistes de multi-exposition, le DON exacerbe le potentiel toxique du fer héminique présent en grande concentration dans la viande rouge et la charcuterie et qui est associé au développement de plusieurs maladies chroniques, dont le cancer colorectal. Les objectifs de ce projet sont d'étudier et caractériser in vivo les effets “cocktails” du DON avec du fer héminique sur la génotoxicité au niveau des cellules épithéliales intestinales et sur l'initiation et la promotion de la carcinogenèse colorectale. L’hypothèse d’un effet exacerbateur de ce mélange auquel nous sommes exposés nécessite une évaluation toxicologique chez l’animal avec pour objectif de répondre à une question de santé publique.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, nous étudierons in vivo chez le rat l’effet d’une exposition à moyen (28 jours) et long terme (100 jours) au mélange DON/fer héminique. Ce projet permettra de mieux appréhender les questions de multi expositions liées à l’exposome chimique alimentaire auquel la population humaine est quotidiennement exposée. Les données expérimentales découlant des différentes procédures apporteront des réponses en terme de toxicité et génotoxicité de ce mélange dans un contexte d'exposition réaliste au DON et au fer héminique via l'alimentation. Cela permettra de répondre à une question de santé publique quant aux effets des co-expositions sur la santé digestive et le développement du cancer colorectal. Nous étudierons si l’exposition combinée aux différents cocktails impacte les marqueurs de génotoxicité dans les cellules épithéliales intestinales et coliques. D’autres marqueurs d’atteintes tissulaires (perméabilité intestinale, scores microscopiques, apoptose, prolifération cellulaire, …) d’inflammation (dosage de cytokines, activité myéloperoxydase…), et des marqueurs en lien avec la consommation de fer héminique et de DON dans les urines et les eaux fécales seront également mesurés. Les résultats attendus du projet sont importants sur le plan de la santé publique car les consommateurs sont exposés de façon chronique à ces contaminants en mélange. Si l'hypothèse d'une exacerbation de leurs effets individuels lorsqu'ils sont en mélange est confirmée, les données produites dans ce projet pourront être prises en compte dans les évaluations du risque d'exposition chez l'homme.

Procédures

L’objectif de ce projet porte sur des études nutritionnelles à moyen (28 jours) et long terme (100 jours). Les animaux sont hébergés par groupe de 3. Les féces seront prélevés à 2 reprises pour les procédures 1 et 2, en début et fin d'expérimentation. Pour les procédures 3 et 4, les féces seront prélevés à 3 reprises, en début, milieu et fin de procédure. Lors de l’injection d’azoxyméthane en intra-péritonéal, la solution est tamponnée pour éviter une douleur au point d’injection et dure moins d'une minute. Cette injection sera unique au cours de la procédure n°4. Dans les procédures 1 et 2, les animaux subissent un passage en cage à métabolisme pendant 24 h. Dans les procédures 3 et 4, les animaux subissent 3 passages en cage à métabolisme pendant 24 h. Préalablement une période d’adaptation de 3 h sera réalisée la veille du premier passage afin de diminuer le stress de l’animal. La mycotoxine déoxynivalénol ayant un pouvoir anorexigène, une perte de poids peut être observée à la dose de 10 mg/kg chez le rat. Les animaux seront pesés de manière bi-hebdomadaire et si une perte de poids supérieure à 15% est observée, l'animal sera alors sorti du protocole expérimental et euthanasié.

Impact sur les animaux

L’objectif de ce projet porte sur des études nutritionnelles à moyen (28 jours) et long terme (100 jours). Un suivi du bien-être animal sera effectué chaque jour et si l’un d’entre eux présente des signes de souffrance il sera examiné par le vétérinaire référent. Le prélèvement de féces sur animaux vigiles n'induit a priori pas de douleur. Cependant, un léger stress peut être provoqué par la préhension de l'animal avant le prélèvement. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur en charge de la procédure sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress. Pour les différentes procédures, les animaux sont gardés en cage à métabolisme individuelle pendant 24h. 3 heures seront nécessaires à l'habituation et adaptation des animaux avant une période de 24 heures nécessaire pour pouvoir récupérer les urines et fèces bien séparées. Pour limiter le stress d'isolement lors des passages en cages à métabolisme, chaque rat en cage à métabolisme pourra avoir un lien visuel avec au moins deux de ces congénères. Pour l'injection en intrapéritonéal de l'AOM, une douleur au point d'injection peut être engendrée, elle sera limitée par le fait que la solution est tamponnée avant l'injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation et des organes prélevés post-mortem pour analyses.

Remplacement

Une étude in vitro sur des cellules épithéliales intestinales montre des résultats quant aux effets du mélange DON-fer héminique sur plusieurs mécanismes cellulaires. Cependant les effets du mélange sur un seul type cellulaire ne permet pas d'appréhender la complexité d'un organisme dans sa totalité. Ainsi, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de la co-exposition mycotoxines/ fer héminique seul ou en mélange, de manière sub-chronique ou chronique sur la physiologie et santé du rat fisher 344 telles que, par exemple, l'observation d'une perte plus ou moins importante de poids ou une augmentation des atteintes dans l'intestin (inflammation et atteintes tissulaires). Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité de l'épithélium colique ainsi que les interactions entre les différents composés sur la physiologie intestinale et leurs rôles dans l'inflammation et l'appration de dommages à l'ADN dans l'épithélium.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Pour ces études nutritionnelles, nos travaux montrent qu'un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour suivre les modulations de la prise de poids et de la perméabilité intestinales. Afin d'obtenir des résultats interprétables et statistiquement relevants, nous prévoyons un nombre similaire d'animaux par groupe dans ce projet.

Raffinement

Les rats étant des animaux sociables, ils seront hébergés par 3 dans des cages transparentes afin de permettre le contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Le prélèvement de fèces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur. Cependant, pour diminuer le stress provoqué par la préhension des animaux avant le prélèvement, une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'étude. Un enrichissement sous forme d’un abri en inox sera mis à disposition des animaux Y compris lors de l'hébergement en cages à métabolisme. L'utilisation de cages à métabolisme est justifiée par la nécessité de récupérer des fèces et urines séparées. Les rats y séjourneront 3 jours au total après avoir y été habitués pendant 2 demi-journées. Le suivi de leur bien-être sera renforcé pendant cette période avec plusieurs visites fois par jour. L’utilisation d’une grille de suivi individuel permettra de repérer les signes de stress ou de souffrance (poil hérissé, perte de poids supérieure à 15%, prostration, comportement alimentaire perturbé…). Si l'expérimentateur juge que l'état de l'animal se détériore au-delà d'un point limite, la procédure s'arrêtera.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l'étude de la relation entre l'alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi sur l’utilisation de modèles animaux. La lignée de rats F344 est un modèle largement utilisé pour étudier la modulation des biomarqueurs urinaires, fécaux et coliques associés à l'exposition au fer héminique. Dans cette étude, le choix d’utiliser des rats mâles a été fait pour éviter de possibles interactions avec le cycle hormonal chez la femelle notamment sur la réponse immunitaire inflammatoire. Les rats âgés de 4 à 8 semaines sont adultes et leur système digestif est pleinement fonctionnel. Les études précédentes portant sur l’exposition au fer héminique ou au DON ont été faites dans des conditions similaires.