Oncologie

1 988 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles gestantes subissent une restriction alimentaire quotidienne et des prélèvements de liquide amniotique et de lait sous anesthésie, et leurs portées sont soumises à des séparations maternelles, des contentions et des tests de locomotion, de choix alimentaire et d'interactions sociales. Le porteur décrit chaque animal comme "un objet d'étude" euthanasié après évaluation, et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne rendrait compte du développement cérébral étudié. Il avance que ces enrichissements odorants "pourraient améliorer le bien-être des animaux non-humains" en élevage, un bénéfice renvoyé au conditionnel.

Objectifs

La période périnatale permet la transmission au fœtus de signaux chimiques, comme par exemple les odeurs maternelles d’origine alimentaire. Plusieurs études se sont intéressées aux effets d’expériences olfactives précoces sur le comportement humain et animal (principalement rongeurs). Les effets sur la descendance varient selon les études et les individus et sont peu stables dans le temps. Peu d’études restreignent la période d'exposition olfactive à la période prénatale, alors que les expériences olfactives prénatales représentent une méthode non invasive, facile à mettre en oeuvre et prometteuse afin d'orienter différentes dimensions du comportement animal lors de phases critiques sur le plan émotionnel, comme la naissance et le sevrage: favoriser les transitions alimentaires, apaiser les individus dans certaines situations stressantes par le rappel de l’odeur, ou faciliter les interactions sociales. Enfin, les mécanismes reliant émotions et odeurs sont peu connus, ont été surtout étudiés dans des situations de renforcement négatif et sans prise en compte des effets liés au sexe. Une meilleure maitrise du contexte dans lequel l’odeur a été apprise, en particulier dans un contexte positif, pourrait favoriser des effets plus robustes. Notre objectif est de tester si le contexte émotionnel maternel participe à renforcer l’apprentissage du contexte odorant en associant odeur et renforcement sucré chez la mère et en évaluant son effet sur les comportements olfactifs, alimentaires et socio-émotionnels des descendants.

Bénéfices attendus

Ce projet apporte des connaissances fondamentales sur les mécanismes neuronaux par lesquels apprentissage olfactif et émotions sont liés pendant le développement fœtal et comment ce lien module durablement les réponses comportementales des descendants lors du rappel de l’odeur dans l’environnement pendant leur trajectoire de vie. L’utilisation d’enrichissements odorants pertinents sur le plan émotionnel, car associés au contexte fœtal, pourrait améliorer le bien-être animal en favorisant un état émotionnel positif lié au rappel de l’odeur dans des contextes d’élevage. Selon les résultats obtenus sur l’espèce modèle, une transposition à des animaux d’intérêt agronomique est envisageable, animaux pour lesquels des procédures stressantes sont imposées par les systèmes agricoles (rupture du lien mère-petit, piqures, traitements, opérations).

Procédures

Les femelles seront élévées en cage individuelle, soumises à une restriction alimentaire modérée pendant la gestation (5h/jour) et seront pesées pour suivi de gestation (3 fois/semaine) : n=148 femelles vigiles, gestation. Les prélèvements de liquide amniotique / lait seront réalisés sur souris anesthésiées : n=28, 1 fois. Une pesée des portées (équilibrées) couplée à une séparation maternelle sera réalisée: n= 1200 individus, 1 fois, 10-15 min. Certains surnuméraires seront isolés de leurs congénères le temps du test de locomotion (n=240, 1 fois, 3 min). Les autres seront placés à plusieurs en atmosphère enrichie ou pas en odorant (n=240, 1 fois, 90 min) Au sevrage, une procédure de contention sur animaux vigiles et isolés permettra la collecte des fécès émis naturellement (n=240, 1 fois, 20 min). Certains animaux seront aussi gardés en cage individuelle pour les tests de choix alimentaires (n=240, 1 fois, 4 jours) et d’interactions sociales (n=240, environ 2 semaines).

Impact sur les animaux

Les procédures impliquent une restriction alimentaire en temps (5h/j) mais pas en quantité totale. Une vie en cage individuelle est parfois nécessaire pour des mesures individuelles de consommation ou des mesures du comportement maternel (sans influence de congénères). Une injection (ocytocine + anesthésique) est réalisée pour les prélèvements de liquides maternels. Le test de motivation olfactif en post-natal nécessite une séparation à la mère pour motiver sa recherche. Certains tests comportementaux sont réalisés dans des environnements nouveaux (avec habituation dès que possible). Un stress de contention de courte durée est appliqué en condition odorisée ou non ; le but étant de déterminer si l’odeur connue peu apaisée les individus stressés.

Devenir

Chaque animal est un objet d’étude et sera donc euthanasié à l’issue de son évaluation. Les mères doivent avoir déjà élevé une portée et ne peuvent être odorisées qu’une seule fois pour éviter une accumulation de l’odorant dans les tissus pouvant induire un biais aux résultats. Afin d’étudier les comportements post-nataux et mécanismes associés à une exposition restreinte à la gestation, les souriceaux doivent être étudiés à l’état « naif », c’est-à-dire ne pas avoir été exposés à plus d’une procédure utilisant l’odorant. C’est pourquoi chaque animal ne peut pas passer par plusieurs procédures successives et doit être euthanasié après chacune pour identifier les mécanismes mis en jeu dans la ré-exposition à l’odeur à court et long terme.

Remplacement

Seules les approches sur animal vigile permettent de rendre compte de la complexité des mécanismes de contrôle des comportements alimentaires et socio-émotionnels. Aucune préparation in vitro ou modèle in silico ne prend en considération l’intégration à plusieurs niveaux du système nerveux central, de signaux centraux et périphériques, ni le contexte particulier du développement cérébral traité ici qui nécessite des interactions entre la mère et le fœtus.

Réduction

Nous avons choisi de travailler avec les souris CD1 connues pour être prolifiques et maternelles afin de minimiser le nombre de reproducteurs. De notre expérience antérieure sur ce modèle et de la littérature, une grande variabilité de réponses entre individus est constatée, ce qui nous conduit à maximiser le nombre d’individus par groupe et par expérience, afin de garantir l’utilisation de modèles linéaires mixtes comme tests statistiques permettant de tenir compte des effets aléatoires . Les effectifs des descendants ont été prévus pour des puissances statistiques calculées a priori. Pour optimiser le nombre d'animaux utilisés, nous commençons par une expérience pilote afin d’ajuster la durée d’odorisation, puis nous décomposerons l’effectif expérimental en plusieurs séries indépendantes. Les femelles primipares ne produiront qu’une seule portée, et les portées seront réduites à 10 petits pour standardiser au mieux les expériences maternelles. Nous veillerons à valoriser tous les individus surnuméraires, en les utilisant pour les mises au point méthodologiques (neurologie) ou pour le test de comportement motivationnel olfactif à la naissance. Tous les descendants des femelles des 4 groupes maternels seront considérés et valorisés, mâles et femelles. En fonction des données obtenues sur les 2 premières séries, nous procéderons à des répétitions expérimentales jusqu’à atteindre le nombre d’animaux nécessaires par groupe expérimental pour satisfaire les effectifs requis par les tests de puissance statistique. Nous réutilisons tous les descendants de la procédure 2a vers la procédure 3 et suivantes.

Raffinement

Les animaux (femelles gestantes et descendants) seront suivis pendant toutes les phases grâce à des pesées régulières. Leur milieu de vie sera enrichi et toutes les procédures seront précédées par une phase d’habituation ou de transition. Les animaux seront gardés 2 par 2 avant les fécondations et les procédures seront optimisées dans le temps afin de minimiser les temps de séparations mères-petits. Les animaux ne seront placés en cage individuelle que lorsque ce sera nécessaire (odorisation en fin de gestation, mesures individuelles de consommation). Malgré la vie en cage individuelle, les animaux seront plusieurs dans la même pièce en cages plexiglass transparentes ce qui autorise des communications sociales. Les cages seront enrichies avec de la sciure et des cubes en bois, ainsi que du materiau de nidification (« sizzlenest ») pour les femelles gestantes afin qu'elles construisent leur nid. Les restrictions alimentaires (5h en fin de cycle "jour") sont utilisées pour optimiser l’association entre prise alimentaire et récompense sucrée chez les mères et pour homogénéiser la motivation entre les descendants pour les tests de consommation/préférence. L'effet sur les animaux est supposé limité puisque la privation alimentaire survient pendant le cycle "jour" où les animaux ne consomment que 10% de leur ration quotidienne. De plus, d'après la littérature, elle ne devrait pas induire de baisse de consommation quotidienne, ni de perte de poids (les animaux s'adaptant rapidement à ce rythme). Dans les autres procédures, nous laisserons les animaux ad libitum. Afin d’éviter une réaction néophobique à l’aliment odorisé et un stress alimentaire, le nouvel aliment/biberon odorisé est proposé en choix avec l’aliment standard du 11ème au 13ème jour de gestation pour assurer une transition alimentaire visant à réduire le stress. Après la naissance, la litière sera changée progressivement et jamais juste après la naissance et nous profiterons des phases de soins aux animaux pour effectuer des tests de comportement maternel (procédure 2a). Quand le protocole impose une séparation maternelle, les petits d'une même portée sont maintenus ensemble pour réduire le stress, et sous une lampe chauffante, incubateur ou tapis chauffant pour leur confort thermique.

Choix des espèces

L’olfaction est un sens particulièrement développé chez les rongeurs et oriente bon nombre de leurs comportements. L'expérimentation sur la souris est facilitée par un contrôle des conditions d'odorisation, un intervalle intergénérationnel court, une fécondité élevée, les descendants sont manipulables dès la naissance. Les dispositifs comportementaux sont optimisés pour la souris. L'interprétation des résultats sera facilitée par les nombreuses données bibliographiques disponibles sur ses comportements murins qu’ils soient maternels, alimentaires ou sociaux, sa neuro-anatomie et sa physiologie. De plus, les expérimentateurs possèdent une expertise forte relative à l’étude du système olfactif sur plusieurs modèles d’odorisation périnatale dont la souris. Des mères primipares (10-15 semaines d’âge) seront utilisées pour effectuer un cycle de reproduction. Les souriceaux seront utilisés entre l’âge d’un jour et de 8 semaines, ce qui correspond à différentes transitions physiologiques d’importance (naissance, sevrage, et prépuberté), mais avant la maturité sexuelle pour éviter des biais liés au démarrage du cycle hormonal connu pour influencer les performances olfactives.

2 730 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont soumises à un régime gras jusqu'à atteindre 45 grammes, reçoivent des injections d'un agent neutralisant les macrophages, subissent des jeûnes, un gavage et des prélèvements de sang dont un prélèvement rétro-orbital, pour étudier le rôle des macrophages des îlots du pancréas dans l'obésité. Le porteur justifie des groupes de 60 souris par le faible nombre de macrophages récupérables par animal. Il indique avoir tenté l'étude in vitro sur îlots humains et de souris sans succès, et conclut qu'il est impossible de s'affranchir d'un organisme entier.

Objectifs

Les îlots de Langerhans sont des micro-organes dans le pancréas et sont indispensables à la régulation du glucose dans l’organisme. Lors d’une obésité induite par un régime riche en graisses, des cellules spécifiques des îlots doivent compenser la résistance à l’insuline qui s’installe avec la prise de poids en augmentant leur nombre ainsi que la quantité d’insuline qu’elles produisent. De la même façon d’autres cellules de l’îlot produisent des quantités anormales de glucagon. Le système immunitaire inné, et en particulier les macrophages, joue un rôle important dans la régulation du métabolisme. Des macrophages sont également retrouvés dans les îlots pancréatiques. Des premières études ont montré que l’absence de macrophages peut compromettre le nombre et le bon fonctionnement des cellules de l’îlot indispensables à la régulation du glucose dans l’organisme (via la production d’insuline ou de glucagon). Les mécanismes impliqués dans ce phénomène restent flous. De même, une différence dans la quantité de macrophage dans les îlots en fonction du sexe a été constatée mais reste inexplorée. Les mécanismes cellulaires et moléculaires permettant la régulation des macrophages vers un caractère pro-inflammatoire ou au contraire anti-inflammatoire des îlots ne sont pas connus à ce jour. Une sur-activation des macrophages dans les îlots pourraient influencer les cellules productrices d’insuline et pourraient promouvoir l’apparition d’un diabète. Nos travaux préliminaires ont permis d’identifier deux voies potentielles capables de réguler localement le caractère pro ou anti-inflammatoire des macrophages. Les objectifs principaux de ce projet sont donc de définir le rôle des macrophages dans la régulation des cellules présentes dans les îlots, y compris dans le cas d’une obésité, et de confirmer le rôle des voies précédemment identifiées.

Bénéfices attendus

Il est aujourd’hui admis que les macrophages jouent un rôle primordial dans la régulation métabolique notamment dans le tissu adipeux et le foie. Les macrophages résidant dans les îlots pancréatiques n’ont eux été décrits que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d’analyse font qu’ils restent encore largement ignorés. En effet, les macrophages représentent seulement 1% des cellules totales des îlots ce qui ne représente qu’environ 1200 macrophages par souris. Cela limite donc le type et le nombre d’expériences pouvant être effectuées sur les échantillons de chaque souris, or nous avons besoin des données provenant de trois grandes techniques, qui une fois combinées, nous permettrons de répondre à nos hypothèses. Malgré ces obstacles, notre laboratoire a acquis l’expertise nécessaire pour travailler sur ce tissu complexe. Ce projet représente donc une étape majeure dans la compréhension des macrophages résidant dans les îlots pancréatiques et de leur influence sur le métabolisme du glucose. Nous porterons notre attention sur le développement de l’obésité induite par un régime riche en graisses qui est une condition où les îlots sont très sollicités et sur l’impact du sexe qui n’a pas été étudié jusqu’ici. Notre projet s’attaque donc à déchiffrer les voies cellulaires et moléculaires encore inconnues qui seraient capables de garder les macrophages de l’îlot sous contrôle. Comprendre ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques qui permettraient de prévenir et/ou traiter l’inflammation pathologique observée lors de l’apparition d’un diabète. Selon les résultats obtenus, ces voies pourraient être testées dans de nouveaux modèles de souris diabétiques de type 2 ou de type 1 (auto-immun) dans un futur projet.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d'alimentation (régime standard ou régime riche en graisses) sur une durée d'une ou douze semaines. Les animaux peuvent également recevoir une ou quatre injections (fonction de la durée du régime) d'un agent permettant de neutraliser les macrophages spécifiquement dans les îlots pancréatiques (quelques secondes par injection). Des prélèvements sanguins seront effectués en fin de procédure de façon à contrôler la glycémie ou la sécrétion d'insuline (prélèvement répétés de petits volumes de quelques secondes: 6 prélèvements répartis sur 2h) pour nous permettre de déterminer si la souris contrôle correctement son métabolisme glucidique. Ces tests nécessitent une mise à jeun de 16h ainsi qu’un gavage (10 secondes) pour la glycémie et une mise à jeun de 6h ainsi qu’une injection d’insuline (quelques secondes) pour la sensibilité à l’insuline. En fin de protocole, afin de doser différents marqueurs, nous réaliserons un prélèvement dans une poche à proximité de l'œil présente chez les souris. Ce prélèvement (quelques secondes) nécessite une anesthésie gazeuse (2 à 3 minutes) et un anesthésique local sera apposé à la fin du prélèvement.

Impact sur les animaux

Aucun effet néfaste n’est connu pour les différents traitements d’agent neutralisant et les différents modèles de souris transgéniques. - Injection intrapéritonéale (IP) : douleur légère due à la piqure, le volume ou la solution injectée ne créeront pas d’effet dommageable sur l’animale. - Régime riche en graisse (HFD) : Pas d’effet dommageable pour les animaux suivis sur 1 semaine de traitement, les animaux suivis sur 12 semaines vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines (jusqu’à 45 grammes) et devenir un peu moins actifs. En fin de protocole : - Mise à jeun : Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. - Gavage : contention soutenue pour quelques secondes afin d’introduire correctement la sonde dans l’œsophage et jusqu’à l’estomac. Le volume et la solution administrés ne provoquerons pas d’effet dommageable sur l’animal. Il n’y a pas de risque d’irritation de l’œsophage car le geste n’est effectué qu’une seule fois. - Microcoupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. - Prélèvement rétro-orbital : gêne/douleur modérée au point de prélèvement. L’animal sera anesthésié au moment du prélèvement et recevra en complément un anesthésique local pour son réveil. L’animal ne subira donc aucun traumatisme dû au geste ou à la contention, la douleur éventuelle au point de prélèvement sera amoindrie après le réveil.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en œuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Afin de comprendre le rôle des macrophages des îlots en physiologie et dans le développement d’une obésité, nous avons choisi d’utiliser la stratégie de neutralisation des macrophages au niveau des îlots. Des études préliminaires nous ont permis d’orienter nos études sur seulement deux voies qui pourraient s’avérer jouer un rôle majeur dans les mécanismes du métabolisme du glucose et le rôle que pourraient y jouer les macrophages. Nous avons tenté de réaliser cette étude in vitro à partir d’échantillons humains. Malheureusement nous n’avons que rarement la possibilité d’étudier des îlots pancréatiques humains. De plus, ces îlots proviennent de donneurs cadavériques aux caractéristiques variables et passent plusieurs jours en culture avant réception, ce qui peut influencer le nombre, les caractéristiques ou la viabilité des cellules les îlots et leurs macrophages. Nous avons également tenté des réaliser cette étude in vitro à partir d’îlots de souris, la neutralisation des macrophages s’est révélée insuffisante. Ainsi, les modèles animaux vivants nous permettent d’étudier les îlots pancréatiques dans des conditions reproductibles et d’investiguer précisément le modèle de développement de l’obésité. De plus, les îlots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre les différents organes métaboliques, il est donc impossible de s’affranchir d’un organisme dans son ensemble.

Réduction

Pour chaque condition expérimentale, des groupes de 60 souris seront créés. Cela prend en compte la mortalité naturelle (10%) et surtout les limites techniques associées à l’isolement des îlots et à l’étude des macrophages des îlots, nous avons donc besoin de partir avec 20 animaux pour chacune des trois grandes techniques que nous souhaitons mettre en place (20x3=60). Comme décrit précédemment, de par le faible nombre d’îlots/macrophages que nous obtenons par animal (environ 200 îlots/souris), nous ne pouvons cumuler les différentes analyses à partir des échantillons d’une seule souris et nous devons donc prévoir un groupe (n=20) pour chaque type d’analyse. Ainsi, le nombre de souris utilisées reflète le nombre d’îlots/macrophages nécessaire pour le succès de notre projet. - Expression génique (100 îlots/condition) couplée aux tests fonctionnels (80 à 120 îlots/condition selon le test) - Cytométrie en flux (> 150 îlots/condition) - Histologie sur pancréas total (1 pancréas/souris) Pour répondre à nos questions de recherche, il est important de combiner ces différentes techniques qui apportent des informations complémentaires. Cependant, afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé des protocoles permettant l'évaluation de la tolérance au glucose et l’évaluation de la sensibilité à l’insuline sur un même animal avec une période de récupération entre chaque test. De plus, les souris seront utilisées pour plusieurs projets du laboratoire avec l’analyse d’autres organes tels que le tissu adipeux et le foie notamment.

Raffinement

Les animaux sont hébergés sur des portoirs ventilés et ont un accès libre et illimité à l'eau et la nourriture. Les conditions de température et d'humidité sont contrôlées et monitorées tous les jours pour qu'elles soient optimales pour les souris. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h), les souris étant des animaux nocturnes une période importante d'obscurité est indispensable à leur bien-être. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum, en effet la souris est un animal grégaire, la vie en groupe est un facteur important pour son bien-être. Si, pour des raisons de protocole, une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté. Pour s’assurer du confort des souris, elles bénéficieront de coton et de «maison» afin de les occuper et qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l'équipe professionnelle de zootechnie. Aucun effet néfaste n'est connu après l'injection des agents neutralisants ou sur les lignées transgéniques. Les souris sous régime riche en graisse vont prendre du poids et devenir un peu moins actives. Nous avons tout de même tenu à mettre en place, en plus de la surveillance journalière de la part des animaliers, un suivi hebdomadaire de la part de l'équipe scientifique avec prise en compte des critères (poids, aspects visuels et comportementaux) informatifs sur l'état de bien-être des animaux. Si, à l'aide de ces critères, un animal est jugé en mal-être, il sera sorti du protocole expérimental.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète, en effet les gènes impliqués dans l’obésité et le diabète (dont les gènes de l'inflammation chronique) jusqu’à présent identifiés sont très proches chez la souris et chez l’Homme. De plus la souris est un modèle permettant l'obtention relativement rapide du nombre d'individus suffisant et que nous sommes en capacité d'héberger dans des conditions (surface, température, luminosité) nécessaires à son bien-être. La souris est également un modèle pour lequel il existe beaucoup d’outils disponibles : modification du génome pour créer les meilleurs modèles d'études possible, méthodes d'analyses des tissus prélevés, etc. L'ensemble de ces critères font de la souris le modèle optimal pour répondre aux questions du présent projet. Nous avons choisi de commencer les études sur des souris qui ont entre 8 et 10 semaines. Cela correspond à la maturité sexuelle (stabilisation hormonale) et équivaut à l'entrée dans l'âge adulte chez l'Homme.

8 236 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des irradiations du corps entier, parfois létales et suivies d'une greffe, ainsi que des injections répétées d'un produit inflammatoire pendant un mois, pour étudier le vieillissement des cellules souches du sang et le risque de leucémie. Le porteur indique que l'irradiation létale peut provoquer des diarrhées et modifier la croissance des dents, et que les injections sont douloureuses. Il affirme que la fonction des cellules souches ne peut être testée qu'in vivo et met en avant des méthodes réduisant le nombre d'animaux.

Objectifs

Les cellules souches du sang s’auto-renouvellent et différencient pour donner l’ensemble des cellules du sang . Avec l’âge, la fonction des CSH est affectée et des mutations apparaissent. L’âge induit un contexte pré-leucémique dans les cellules souches du sang et un risque accru de développer des leucémies (cancers du sang). L’inflammation augmente avec l’âge et est un facteur important du développement de leucémies. Certaines mutations confèrent un avantage compétitif à la cellule mutée, donnant lieu à une production illimitée de cellules cancéreuses. Ces cellules mutées sont sélectionnées et s’amplifient en réponse à des stress tels que l’inflammation ou l’exposition à des rayonnments ionisants, prédisposant ainsi au développement leucémique. Le vieillissement, l’inflammation et les rayonnements ionisants, qui induisent un vieillissement prématuré, induisent des altérations de la disponibilité de l'ADN de la cellule. Notre projet a pour but de caractériser l’impact de l’âge, de l’inflammation et de l’exposition à des rayonnements ionisants dans les cellules souches du sang de souris normales ou présentant une perte de fonction de gènes importants.

Bénéfices attendus

D'un point de vue fondamental, comprendre comment l'état de protéines déterminant la conformation et la disponibilité de l'ADN cellulaire peut influencer l'identité et la fonction des cellules souches du sang est d'un intérêt majeur pour appréhender les pathologies liées au vieillissement, telles que certaines leucémies. Sur le plan clinique, la découverte de voies susceptibles d'être ciblées thérapeutiquement pour remédier au déclin du tissu régénrateur du sang pourrait conduire à de nouveaux moyens de prévenir ou traiter les leucémies, mais aussi différentes maladies chroniques liées au vieillissement.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont par lots différents: une Irradiation sub-létale corps entier (durée 3 minutes); des injections tous les 2 jours pendant 30 jours (durée 1 minute, anesthésie locale); une irradiation létale (durée 12 minutes) suivie d'une greffe par injection sous anesthésie générale (durée 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les injections répétées d'un produit inflammatoire peuvent induire une réponse inflammatoire localisée et douloureuse. L'irradiation léthale peut induire des diarrhées transitoires et des modification de la croissance des dents. Le injections simples induisent très peu de nuisances.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, à la fin de chaque procédure, nous prélèverons les cellules souchés hématopoïétiques pour réaliser des exériences de génomique, ou les cellules de la moelle osseuse pour analyser le pourcentage de cellules mutées dans la moelle par cytométrie.

Remplacement

L’hématopoïèse est le processus physiologique qui conduit à la formation de toutes les cellules du sang. C’est un processus qui met en action plusieurs cellules de la niche hématopoïétique, que l’on ne sait pas encore reproduire in vitro. Il ne peut par conséquent pas être totalement étudié in vitro. D’autre part, nous travaillons sur les cellules souches hématopoïétiques, qui différencient dès qu’elles sont mises en culture in vitro : à partir du moment où nous travaillons hors de l’organisme, ce ne sont plus les mêmes cellules. Finalement, si de nombreux marqueurs permettent la caractérisation phénotypique des celluels souches hématopoiétiques, leur caractérisation finale est fondée sur leur capacité unique de reconstituer l’hématopoïèse dans son ensemble dans un organisme vivant. Cette fonction ne peut être testée qu’in vivo.

Réduction

Nous limiterons au maximum le nombre de souris utilisées. Les nombres d’animaux nécessaires aux différents types d’expérimentation ont été estimés sur la base d’expériences préliminaires, l’objectif étant d’utiliser le nombre d’animaux le plus petit possible tout en étant suffisant pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Pour les analyses moléculaires, nous récupèrerons toutes les cellules souches possibles seront utilisées. Pour le séquençage d'acide ribonucléique, nous avons récemment développé des préparations de librairies à partir de petites quantités de matériel. Cette méthodologie, utilisée maintenant en routine au laboratoire, est très importante pour augmenter le nombre d’échantillons exploitables et donc réduire le nombre de souris nécessaires. Une technologie récente, développée au laboratoire cette année, nous permet aussi de faire les analyses épigénétiques sur les cellules issues d'une seule souris quand il en fallait 10 fois plus auparavant. Les expériences de transplantations ne seront réalisées que pour confirmer un effet sur la fonctionnalité des cellules préalablement observée sur des tests in vitro. Les cellules transplantées seront des pools issus de plusieurs souris pour limiter la variabilité inter-individu des souris donneuses.Parmi les souris nées dans les élevages de souris transgéniques les souris non mutées seront aussi utilisées, comme témoins, évitant d'utiliser des souris spécifiques pour cela. Nous utiliserons des tests statistiques pour tester l’effet de plusieurs conditions en parallèle. Concernant les expériences à grande échelle sur génome entier, les analyses statistiques seront faites par des bioinformaticiens.

Raffinement

Les injections seront faites sous anesthésie locale ou générale . Une observation des animaux sera réalisée quotidiennement, afin de s’assurer que l’animal ne présente pas de complications. Afin de favoriser le bien-être des animaux, l’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. Un enrichissement environnemental du milieu (sizzlenests, tunnels, maisons) sera mis en place dans chaque cage. Les animaux seront observés quotidiennement lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi en tout temps. Un complément alimentaire énergétique et appétent sera ajouté dans les cages après transplantation ou en cas de diminution de la prise alimentaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour étudier l’hématopoïèse et la leucémogénèse. Les souris possèdent un système physiologique proche de celui de l’homme. Les souches des animaux sont bien caractérisées génétiquement ce qui permet d’effectuer des transplantations de cellules souches en palliant les problèmes liés au rejet de greffe. De plus, cette espèce permet le développement rapide d’animaux transgéniques qui sont nécessaires pour étudier les rôles de gènes/protéines dans l’hématopoïèse normale et le développement de pathologies en présence d’un système immunitaire compétent. Enfin, Il s’agit d’espèces faciles à élever qui permettent l’obtention relativement rapide de résultats du fait de leur temps de génération réduit. Nous utiliserons des souris de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte.