Oncologie

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries douze semaines avec un régime gras à l'huile de palme, elles subissent des prélèvements sanguins répétés, des gavages et des périodes de jeûne, pour étudier le rôle d'une protéine intestinale dans l'obésité. Le porteur indique que le régime vise à induire l'obésité et que l'isolement, le gavage et les injections peuvent provoquer stress et gêne. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" pour une approche intégrée de plusieurs organes.

Objectifs

L’excès de lipides alimentaires est associé à l’obésité via un excès d’apport énergétique et une élévation de l’endotoxémie. Le récepteur membrannaire CD36 (cluster of differentiation) semble impliqué dans le transport de ces toxines du microbiote intestinal. Dans un précédent projet, nous avons étudié l’impact d’un régime riche en acides gras insaturés. L’objectif de ce projet sera donc d’évaluer la contribution du CD36 intestinal dans la mise en place de l’obésité induite par un régime riche en acides gras saturés. En effet le CD36 pourrait constituer une cible thérapeutique dans le traitement des pathologies associés à un excès de lipides. Pour ce faire nous utiliserons des souris n’ayant plus de CD36 dans l’intestin, comparées à des souris contrôles. 96 souris contrôles et 96 souris déficientes en CD36 seront nourries soit avec un régime classique soit avec un régime hyperlipidique enrichi en huile de palme durant 12 semaines (temps nécessaire pour observer des effets). Afin d’étudier les variations liées au sexe l’intégralité de ce projet sera réalisée avec des animaux mâles et des animaux femelles. 192 animaux au total seront donc utilisés.

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle la dépense énergétique en régime normo- et hyper-lipidique riche en acides gras saturés ? 2. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle les capacités d’absorption intestinale des lipides alimentaires et l’adaptation intestinale à un régime hyperlipidique riche en acides gras saturés ? 3. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle l’endotoxémie et l’écologie du microbiote intestinal en régimes normo- et hyperlipidique riche en acides gras saturés? 4. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle l’effet obésogène de l’exces de lipides alimentaires saturés ? En fonction des résultats obtenus dans ce projet, CD36 pourrait constituer une cible thérapeutique en cas de surconsommation de lipides alimentaire.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire spécifique (standard ou obésogène) et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire, ainsi qu’un suivi de masse grasse et masse maigre par EchoMRI (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 2 à 3 minutes) en semaine 0, 2, 4 et 12. La procédure 1 est appliquée à la moitié de l’effectif pour laquelle des mesures de prise alimentaire et de récolte des feces dans la cage seront réalisées, en semaine 0 et 11. Des prélèvements sanguins seront également réalisés en semaine -2, -1, 6, 7 et 9. La procédure 2 est appliquée à l’autre moitié de l’effectif où une mesure de la dépense énergétique est réalisée en semaine 7. Cette mesure est indolore et non invasive et s’effectue dans des cages spécifiques de mesure. Des prélèvements sanguins seront également réalisés en semaine 0 et 5. A l’issue du régime en semaine 12, l’ensemble de l’effectif subira un dernier prélèvement sanguin sous anesthésie générale, puis sera euthanasié pour réaliser des prélèvements d’organes.

Impact sur les animaux

Le régime hyperlipidique est utilisé pour induire l'obésité chez les animaux. Des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids pourraient être attendues. Toutefois, elles ne sont jamais observées après 3 mois de régime. Le projet requiert d’individualiser les souris sur de courtes durées, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Un enrichissement supplémentaire sera proposé dans leurs cages d'hébergement afin de compenser cet effet indésirable. Le gavage gastrique peut entraîner un certain stress, des irritations ou une gène de courte durée. L'echoMRI est une technique non invasive, qui recquiert une contention courte inférieure à 2 minutes. La mesure de la dépense énergétique est indolore et non invasive. Cependant, elle nécessite une individualisation en cage spécifique, qui peut induire un stress sur 5 jours. Le sprelèvements sanguins à la queue des souris nécessite une contention légère et ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement sanguin en intracardiaque final est réalisé sous anésthésie, et ne dure pas plus de 30 secondes. Les souris subiront une mise à jeun de 12 heures. Pour les injections en IP (intrapéritonéale, au niveau de la cavité abdominale) et en IV (intraveineuse), il peut y avoir une douleur au point d'injection. Les produits injectés sont indolores (insuline) et à de faibles volumes.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie selon le planning prévu par l’étude afin de réaliser des prélèvements d'organes.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : • Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétriques (ANOVA), sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides • Les 2 procédures se clôturent par un test du charge lipidique identique, ce qui permet en cumulant les effectifs des deux procédures d'atteindre de nombre requis d'individus pour une analyse statistique correcte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement (carrés de coton, tunnels en polycarbonates…) de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées, en surveillant le maintien de la température corporelle grâce à une table chauffante spécifique. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis (signes généraux de souffrance, perte de poids supérieure à 20% en 7 jours). En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.

12 chèvres laitières vont être utilisées, gardées vivantes à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont placées dans des enceintes de mesure du méthane qui les isolent et les exposent au bruit de turbines, pour mettre au point un dispositif de quantification des émissions. Le porteur indique que ce séjour peut provoquer angoisse, état dépressif, vocalisations et perte de poids transitoire, et retire de l'expérience tout animal en détresse au-delà de vingt-quatre heures. Il affirme que l'utilisation des chèvres est "essentielle et irremplaçable".

Objectifs

Chez les ruminants, les principales réponses à des pratiques d'alimentation sont liées à l’action d’une population microbienne au niveau du rumen. Ce microbiote est responsable de la fermentation des aliments dont les produits principaux sont les acides gras volatils (AGV), le gaz carbonique et le méthane. La durabilité de la production des filières de ruminants est fortement dépendante de la fermentation ruminale des aliments ingérés et de la réduction des émissions de méthane entérique. La fermentation ruminale et la production de méthane sont des processus dynamiques médiés par des interactions entre l'animal, son microbiote ruminal et l'alimentation. Ces interactions contribuent à faire varier des caractères comme la longévité, l’efficience alimentaire et la résilience, sur lesquels les animaux peuvent être phénotypés, comme c’est le cas actuellement Ce projet a comme objectif de mettre au point un dispositif expérimental pour la quantification de la dynamique de l’émission de méthane chez la chèvre. Cette phase est cruciale pour les futurs projets autour de développement des modèles mathématiques pour représenter l’interaction entre production de méthane, efficience et capacité adaptative.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de rendre opérationnel un dispositif pour la quantification de la production de méthane chez la chèvre. Le projet permettra d’identifier les paramètres environementaux au delà desquels les points limites pour les animaux seront atteints et les conditions expérimentales optimales à prendre en compte pour les futurs projets de l'installation expérimentale autour de l’émission de méthane et son lien avec des phénotypes d’intérêt.

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucune intervention, hormis celles classiques d’un élevage laitier (traite)

Impact sur les animaux

Le séjour dans les enceintes pourraient entraîner des états d’angoisse et de détresse en raison de l’isolement des animaux et des valeurs limites des paramètres environementaux (température, humidité). Ce stress est réduit par l’enrichissement du milieu (brosse, chaînes) à l’intérieur des enceintes, la présence de parois transparentes (qui permettent la visibilité avec leur congénères) et par la présence humaine pendant la phase d’habituation. Néanmoins, le séjour dans les enceintes pourrait conduire certains animaux à un état dépressif, à vocaliser et à diminuer leur ingestion, ceci conduisant à une perte de poids transitoire. L’expérimentation pourrait avoir un impact sur l’activité de l’animal (excrétions excessives, agitation ou immobilisation). Un animal qui manifeste des signes de détresse au-delà de 24 heures sera sorti de l’expérimentation.

Devenir

La procédure de mesure de méthane est une procédure modérée qui n’implique aucune mesure invasive sur les animaux. Les animaux sont gardés en vie à l'issue de l'expérimentation.

Remplacement

Le projet a comme objectif la mise au point d’un dispositif pour quantifier la production de méthane par le système digestif de la chèvre. L’utilisation des animaux est donc essentielle et irremplaçable.

Réduction

Nous allons utiliser 12 animaux maximum. Le nombre des enceintes est 4. Le test se fera en 2 temps . Nous considérons 2 animaux de plus par essai en prévoyant le remplacement des animaux stressés.

Raffinement

Le dispositif comprend des éléments aversifs pour les animaux comme l’isolement et l’exposition au bruit produit par des turbines d’extraction. Pour réduire les nuisances sur le bien-être animal de ces éléments aversifs, une phase d’habituation sera mise en place pour minimiser le stress dans les enceintes. Dans cette phase d’habituation, les animaux seront exposés aux éléments aversifs de manière graduelle l’un après l’autre. En premier, les animaux seront exposés graduellement à l’isolement. Le bruit des turbines sera intégré dans l’environnement ultérieurement. Du matériel isolant sera utilisé dans l’armoire du système d’extraction pour réduire le bruit produit par les turbines. Les enceintes sont équipées d’un matelas qui laisse passer l’urine pour améliorer le confort de l’animal. Des brosses et des petites chaines seront installées comme enrichissement. La présence de parois transparentes (qui permettent la visibilité avec leurs congénères) et la présence humaine pendant la phase d’habituation réduiront le stress. Les signes d’inconfort des animaux (vocalisations, agitation, tremblement, abattement, excrétions excessives) seront observés pendant toute la durée du protocole d’habituation de la façon suivante : Phase d'habituation J1 permanente, J2 toutes les 15 mn pendant 4 h, J3 et 4 toutes les 30 mn avec des temps de présence de 15 mn, J5 toutes les 2 heures sur 5 heures. Phase de mesures: temps de présence 1h matin et soir avec surveillance régulière en journée des animaux et du dispositif. Comme points limites, nous considérons excrétions excessives, agitation ou immobilisation au-delà de 24 heures. Un animal qui manifeste des signes de détresse au-delà de ces 24 heures sera sorti de l’expérimentation.

Choix des espèces

Ce projet s’intègre dans le programme de recherche de l’equipe. Il utilisera l’animal modèle de l’unité : la chèvre laitière Chèvres en lactation

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un cancer de l'estomac, elles reçoivent neuf injections de chimiothérapie en trois semaines, pour tester le rôle du gène SCRIB dans la maladie. Le porteur indique que la tumeur et les injections peuvent provoquer inflammation, déshydratation, douleur et perte de poids. Il affirme que le modèle animal est "indispensable" et que la souris est le "seul modèle" où la mutation étudiée est possible.

Objectifs

Le but de ce projet est de créer et étudier une nouvelle lignée de souris mutante pour le gène SCRIB qui semble impliqué dans les cancers gastriques (estomac). En effet, lorsque que ce gène ne fonctionne pas correctement (en étant modifié), le cancer a plus de chance de se déclarer. Une version mutée de ce gène SCRIB est trouvée chez des patients atteints de cancers gastriques. Ces souris mutantes qui déclareraient des cancers gastriques nous permettrait de tester l’efficacité des traitements chimio-thérapeutiques sur ces cancers.

Bénéfices attendus

Les cancers gastriques sont la 5ème cause de mortalité par cancer dans le monde, avec plus de 1 millions de nouveaux cas par an. Ces cancers se caractérisent par une forte agressivité avec une survie à 5 ans de moins de 25%. Les raisons de cette mortalité élevée sont multiples et peuvent s’expliquer notamment par un diagnostic tardif. Une meilleure connaissance des mécanismes liés au cancer nous permettrait d’améliorer les diagnostics et les traitements. A terme, le gène étudié ici pourrait être utilisé à l’avenir comme cible thérapeutiques si les traitements s’avèrent efficaces dans ce projet.

Procédures

Les souris engagées dans ce projet sont porteuses de mutations qui induisent un cancer gastrique. Elles auront donc des tumeurs qui se développeront au niveau de l'estomac. Afin d'évaluer l'efficacité de 4 chimiothérapies, les souris recevront ces traitements par injection, 9 au total sur une durée de 3 semaines. Chaque injection prend quelques dizaines de secondes pour être réalisée et peut entraîner du stress et de l'inconfort chez l'animal. L'impact des anticancéreux sur ce modèle réalisé n'est pas connu actuellement.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées dans ce projet développeront des tumeurs au cours du temps. De plus, les souris subiront toutes 9 injections en IP en 3 semaines. Les souris pourront présenter de l’inflammation de la déshydratation et une douleur transitoire suite aux injections ainsi qu’une perte de poids et d’appétit dues au développement de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. En effet, le but, en plus d'observer les animaux et d'évaluer l'efficacité des traitements, est de mener ensuite des analyses sur plusieurs de leurs tissus (tumeurs et organes).

Remplacement

Au laboratoire, des travaux in vitro encourageants démontrent que la dérégulation de SCRIB, notamment sa perte de fonction, favorise la prolifération cellulaire des cellules de cancer gastriques et diminue l’adhésion cellulaire. L’utilisation d’un modèle animal est maintenant indispensable pour identifier le rôle de SCRIB au niveau d’un organisme et ainsi définir le potentiel statut de SCRIB en tant que gène suppresseur de tumeur. La souris est à ce jour le seul modèle où la mutation sur notre gène d’intérêt est possible.

Réduction

Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées et disposeront d’un enrichissement adapté (tunnels, maisonnettes, carrés de coton pour la fabrication de nid). Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les injections seront réalisées par des personnels compétents. Un suivi régulier comprenant l’observation des critères définis (point d’injection, poids et état de maigreur, état général) sera effectué. Les effets secondaires de la chimiothérapie chez la souris peuvent se traduire par de la diarrhée. Aux doses décrites dans ce projet, le risque est extrêmement faible. Si toutefois des diarrhées apparaissaient, nous mettrons en place un suivi déshydratation (pli de peau) associé à un suivi de poids tous les jours et du gel nutritif sera mis au fond de la cage. Des points limites ont été établis permettant de détecter le plus précocement possible tout signe de souffrance ou de douleur et ainsi de soustraire l’animal de la procédure rapidement si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est utilisée comme organisme modèle. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. Les animaux utilisés dans ce projet sont génétiquement modifiés et ces lignées sont disponible chez la souris. C’est un modèle de référence dans le domaine de la cancérologie et nous possédons les lignées d’intérêt. Enfin, fort de notre expérience sur ce modèle dans des projets antérieurs, nous choisissons de rester sur le modèle murin. La première partie du projet consiste à évaluer les cancers sur les souris mutantes pendant 12 mois. Les souris seront suivies de la naissance jusqu’à maximum l’âge d’un an. Pour la deuxième partie du projet, l’efficacité des traitements sera tester par chimiothérapie à l’âge adulte. Ainsi, les traitements commenceront entre 6 et 12 semaines.

13 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules ou de fragments tumoraux en sous-cutané, puis des administrations répétées de substances, pour tester l'efficacité d'anticancéreux pour le compte de clients industriels ou de laboratoires. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer perte de poids, hypothermie, épanchement abdominal et difficultés respiratoires. Il décrit une activité de prestation commerciale et affirme que ce modèle ne peut "pas être remplacé" par des méthodes in vitro.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé publique majeure et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles animaux de cancer humain et murin demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments et la compréhension des mécanismes de résistance. Le modèle d’injection de cellules en sous-cutané, dit hétérotopique, permet d’examiner de larges cohortes de tumeurs dont la croissance et la réponse aux médicaments peuvent facilement être évaluées grâce à un suivi cinétique de la croissance tumorale par des mesures au pied à coulisse. Bien que la greffe de cellules ou de tissu cancéreux n’est pas réalisée dans l’organe d’origine dont est issue la tumeur, ce type de modèle a pu montrer un caractère prédictif satisfaisant afin d’identifier des molécules à activité thérapeutique pour la clinique humaine, qui en fait un modèle standard de la recherche en oncologie. La procédure décrite dans ce projet correspond à la création de différents modèles de tumeurs chez le rongeur (souris ou rat). L’objectif est d’administrer des cellules tumorales issues de différents types de tumeurs et de mesurer différents critères (taille de la tumeur, survie...) afin d’évaluer l'efficacité ou la toxicité de molécules aux propriétés anticancéreuses décrites ou potentielles. La création de ce type de modèle dans ce projet ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Bénéfices attendus

Le projet consistera à développer des modèles de tumeur chez le rongeur pour les différentes indications en oncologie, qui permettra de tester l'efficacité d'anticancéreux pour des clients du secteur industriel privé ou des laboratoires de recherche publique ou dans un contexte de recherche interne. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux pour des procédures de test dans un autre laboratoire dans le cas de collaboration. Dans ces buts, la procédure consistera à injecter des lignées cellulaires humaines (xénogreffes) ou murines (allogreffes), des cellules primaires obtenues à partir biopsies de patients ou d’explants tissulaires en sous cutané chez des animaux immunocompétents (souris ou rats), immunodéprimés (souris ou rats), transgéniques ou humanisés dépendant du modèle. Un suivi de la croissance du volume tumoral sera réalisé avec un pied à coulisse ou d’autres modalités d’imagerie par bioluminescence ou fluorescence (utilisant des cellules reportrices adaptées à ce type de modalité) mais aussi par rayons X ou échographie. De plus, le poids et l'état général des animaux seront suivis au cours du temps. Cependant les modèles de mélanome, aussi injectés en sous cutanés, ne seront pas considérés dans ce projet car induisent la formation de métastases agressives. Les animaux présentant une immunodéficience nécessitant un cloisonnement ou certains animaux transgéniques seront hébergés en condition Biosafety level 2 (BSL2) afin de maintenir leur statut Specific and Opportunistic Pathogen Free (SOPF) et éviter toutes contaminations chez ces animaux plus sensibles.

Procédures

Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 à 10 min pendant laquelle ils seront tatoués dans la pulpe de leurs doigts en utilisant une aiguille imbibée d’encre de tatouage pour animaux. Toujours sous anesthésie, les animaux subiront une injection rapide (

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables inhérents au développement tumoral pourront apparaître pendant une étude. - Une perte de poids corporel - Un comportement amorphe marqué pendant les périodes de vigilance. - Une hypothermie persistante - Une distension anormale de l’abdomen pouvant être le signe d’un épanchement - Des problèmes de respiration pour l’animal - Une incapacité de se nourrir ou boire L’ensemble de ces symptômes sera monitoré pendant l’étude afin d’appliquer des mesures pouvant amener à l'euthanasie de l’animal avant la fin de l’étude pour raison éthique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs et ne permettent pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.

Réduction

Des analyses in-vitro pourront être réaliser en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, …), permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères.... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclue une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie si nécessaire.

Choix des espèces

Les tumeurs présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale, une prolifération et des métastases des cellules. Des études de ces aberrations et la compréhension de leur contribution à la physiopathologie du cancer sont nécessaires pour améliorer le diagnostic et la thérapie. Aujourd’hui encore, les rongeurs rats et souris demeurent essentiel à étudier les tumeurs in vivo et à comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. Tous les animaux utilisés seront utilisés à partir de 5 semaines développement que ce soit des rats ou des souris.

300 truites sauvages vont être capturées et relâchées après marquage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après anesthésie, chaque poisson reçoit un transpondeur implanté par incision ventrale, avec un maintien hors de l'eau de trente secondes à une minute, pour évaluer le franchissement d'une passe à poissons récemment aménagée. Le porteur indique que la capture et le marquage induisent un stress et décrit une cicatrisation qu'il juge généralement bonne. Il affirme que cette étude comportementale ne peut se faire que sur des individus vivants relâchés dans leur milieu naturel.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce à la technologie RFID (Radio Frequency Identification) la franchissabilité par les poissons d’un ouvrage de franchissement (passe à poissons) récemment réalisé pour rétablir la continuité écologique dans un cours d'eau jurassien. Un seuil constituait un obstacle à la montaison des truites au niveau de la tête du bassin versant, connu pour proposer historiquement des habitats piscicoles de qualité. Le gestionnaire local a décidé d’équiper ce seuil d’une passe à ralentisseurs plans afin de rétablir la montaison des truites et autres espèces accompagnatrices. En 2022, cette passe a été réalisée et doit maintenant faire l’objet d’une étude de franchissabilité piscicole par RFID.

Bénéfices attendus

Les projets permettront de mettre en lumière la « transparence » de l’ouvrage à la migration des truites, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à cette espèce de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 300 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire de l’espèce considérée, dans le cas présent la truite de rivière. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval de l’ouvrage étudié. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 120 mm à l’aide de tags de 23 mm). Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par E. Meunier, vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués, à l’aide de PIT tags 23 mm. Cette taille minimale assure un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

2 000 poissons sauvages, truites, chabots et blageons, vont être capturés et relâchés après marquage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après anesthésie, 1 950 individus reçoivent un transpondeur implanté par incision ventrale et 50 truites une seconde incision de deux centimètres pour un émetteur radio suturé, afin d'évaluer le franchissement de deux passes à poissons. Le porteur indique que la capture et le marquage induisent un stress et évoque une mortalité post-opératoire qu'il estime très faible. Il affirme que l'étude comportementale in situ ne peut se faire que sur des individus vivants dans leur milieu naturel.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce aux technologies RFID (Radio Frequency IDentification) et radiotélémétrie, la franchissabilité de 2 aménagements réalisés au niveau de 2 seuils infranchissables (ponts routiers) pour rétablir la continuité écologique un grand cours d'eau alpin. Sur ce cours d'eau, de nombreuses améliorations ont été réalisées ces dernières années, notamment sur la continuité écologique : les deux seuils visés ont été aménagés pour le franchissement piscicole il y a 9 ans. Ces aménagements permettent une circulation (montaison et dévalaison) a priori facilitée qu’il convient de vérifier en combinant deux technologies au regard du gabarit du cours d’eau : la RFID et la radiotélémétrie. La radiotélémétrie est utilisée en complément de la RFID car cette technologie permet d'envoyer un signal à longue portée (100-200m), permettant de travailler dans des grands milieux et de caractériser des comportements / franchissements au niveau de voies de passages qu'on ne peut pas équiper par RFID.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en lumière la « transparence » des deux seuils éuipés de passes à poissons à la migration des espèces cibles, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1'950 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau. Pour 50 individus, un double-marquage sera réalisé et un émetteur radio sera implanté manuellement en plus du PIT tag, impliquant une incision ventrale de 2 cm, qui sera suturée. La procédure durera au total 2 à 3 minutes, pendant lesquelles les individus seront maintenus sous sédation dans un bain d’anesthésiant

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux.

Devenir

Remise à l'eau après marquage

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière, le chabot et le blageon. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval des ouvrages étudiés. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité des ouvrages. Ils ont été adaptés au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Pour la RFID : Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 80mm ; 23 mm au-dessus. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Pour la radiotélémétrie : après anesthésie, les poissons seront placés dans un bac rectangulaire de 10L contenant une concentration plus légère de benzocaïne (30 mg/L) pour maintenir les conditions d’anesthésie sur toute la durée de l’opération. Seule la tête sera maintenue dans l’eau et une canule introduite dans la bouche et reliée à une pompe d’aquarium pour assurer une irrigation permanente des branchies. Un champ stérile sera placé sur l’animal, la zone d’incision sera nettoyée à la vétidine, et un scalpel stérile sera utilisé. L’opérateur portera des gants stériles. Tout le matériel chirurgical sera désinfecté au steranios, ainsi que l’émetteur, puis rincés à l’eau purifiée. La taille de l’émetteur F1170 sera adapté et toujours < 2% du poids de l’animal (Annexe 1). Pour la suture, une aiguille pointe ronde diamant, 3/8 cercle 26mm, sera utilisée avec un fil monofilament résorbable Monosyn en glyconate. La pommade iodée sera ensuite appliquée. Le réveil sera contrôlé dans un bac oxygéné et refroidi, avant transfert dans un vivier placé dans la rivière.

Choix des espèces

L’espèce cible principale est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. En complément, le blageon (Telestes souffia), petit cyprinidé rhéophile, sera étudié car jugé caractéristiques du secteur d’étude. Enfin, une petite espèce d’accompagnement de la truite, le chabot (Cottus gobio), sera également intégrée dans le suivi en raison de son abondance sur certains secteurs et de sa faible capacité de nage et de migration. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués à l’aide de PIT tags 23 mm. 50 truites adultes de plus de 200g, soit environ 25 cm, seront également marquées à l’aide d’un émetteur radio (double marquage). Pour les blageons et chabots, les stades sub-adultes et adultes seront visés, avec une longueur minimale de 80 mm. Ces individus seront marqués par PIT tag de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une greffe chirurgicale de cellules tumorales dans les poumons, puis reçoit dix-huit injections intrapéritonéales et plusieurs anesthésies, pour tester le repositionnement d'un médicament de cardiologie contre le cancer du poumon. Le porteur indique que la tumeur pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires et une perte de poids. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et qualifie le modèle murin d'"indispensable", les retombées pour les patients restant renvoyées à un éventuel repositionnement futur.

Objectifs

Le cancer du poumon est aujourd'hui la première cause de décès en France et dans le monde. Nos travaux ont montré que les tumeurs pulmonaires humaines présentent des voies métaboliques remaniées, permettant d’établir une nouvelle approche thérapeutique que nous proposons d’évaluer au stade préclinique. 50% des cancers du poumon produisent leur énergie à partir des lipides. L’inhibition de l’enzyme impliquée entraîne une forte inhibition de la croissance tumorale in vitro et in vivo. De plus, un médicament utilisé en cardiologie bloque cet enzyme et entraîne l’inhibition de la croissance tumorale. Afin de progresser vers le repositionnement de cette molécule dans le traitement ciblé du cancer du poumon nous devons apporter une preuve de concept in vivo et établir une preuve de mécanisme in vivo. Pour cela, un modèle murin de tumeur du poumon est indispensable.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'obtenir une preuve de concept dans le repositionnement d'une drogue, avec autorisation de mise sur le marché, dans le traitement du cancer du poumon.

Procédures

1_ Chaque animal subira une fois une procédure chirurgicale afin de greffer les cellules tumorales dans les poumons. L'animal sera anesthésié par de l'isoflurane pendant une très courte durée (

Impact sur les animaux

Les souris vont développer un cancer intra-pulmonaire, ce qui peut entrainer des difficultés respiratoires. Les injections quotidiennes en IP peuvent causer des irritations au niveau du site d'injection. La présence de la tumeur peut entrainer une perte de poids chez l'animal.

Devenir

A l'issue des 21 jours de suivi, tous les animaux sont euthanasiés, et les tumeurs, ganglions lymphatiques et rates sont prélévés.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologie observée chez l'Homme, peut apporter la réponse du système immunitaire. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo, qui ne reconstituent pas la complexité du système immunitaire.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots est de 10. Les expériences seront répétées à deux reprises. Un premier test statistique nous permettra de vérifier les différences significatives entre les groupes d’animaux. Il sera ensuite suivi d’un test de comparaisons multiples.

Raffinement

1.Hébergement: les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Anesthésie et Analgésie : durant la chirurgie, les animaux sont placés sous anesthésie et reçoivent des injections d’analgésique afin de limiter les douleurs et leurs stress lors de la procédure. 5. Points limites : Des points limites adaptés ont été définis afin de mettre fin à l’expérience si un animal dépasse ce seuil fixé.

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris. Ces souris sont utilisées dans la recherche sur le cancer du poumon en raison de leur capacité à développer le processus étudié (cancer du poumon) induit par les lignées tumorales pulmonaires. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'inoculation de cellules.

150 perches communes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 femelles tuées pour prélever leurs gonades, les autres gardées vivantes après cannulation ou stimulation manuelle de la ponte. Sur dix mois, elles sont anesthésiées pour un sexage par échographie, une puce leur est injectée, et huit prélèvements sont réalisés. Le projet cherche à savoir si la méthylation de l'ADN existe pendant l'ovogenèse de cette espèce, préalable annoncé à de futures études. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" cette expérimentation par des cellules en culture.

Objectifs

La reprogrammation de la méthylation de l’ADN pendant l’ovogenèse permet des réorganisations chromosomiques qui peuvent influencer l’expression des gènes dans la génération suivante. Ces modifications, souvent irréversibles, peuvent induire des modifications physiologiques, morphologiques ou biologiques et potentiellement conférer des avantages aux descendants qui deviennent alors des caractères héréditaires. Il est donc admis que ce mécanisme est un moteur de l’évolution. Chez les poissons, certaines espèces déclenchent cette reprogrammation et d’autres non. Dans ce dernier cas, les mécanismes adaptatifs ne sont pas encore compris mais semblent impliquer d’autres voies qui intégreraient à chaque génération les modifications épigénétiques et leurs conséquences sur l’expression génique. La compréhension des liens entre des modifications environnementales et les mécanismes évolutifs des espèces représente un enjeu important de nos connaissances, particulièrement pour des espèces très sensibles aux variations de leur environnement tels que les poissons. Les résultats obtenus à l’aide de diverses méthodes de biologie moléculaire nous permettront de mieux comprendre les mécanismes qui sont déclenchés dans des ovocytes à chaque étape de l’ovogenèse. Ainsi il nous sera possible de répondre à l’objectif principal de ce projet qui est de déterminer si la reprogrammation de la méthylation de l’ADN existe chez la perche commune et s’il existe un lien avec la dynamique d’expression des gènes pendant l’ovogenèse. Ce travail représente un préalable nécessaire à des études plus précises sur l’effet de variations de certains paramètres environnementaux sur le succès de reproduction chez la perche commune.

Bénéfices attendus

Les poissons sont très sensibles aux variations de leur environnement et ces dernières contrôlent plusieurs fonctions biologiques parmi lesquelles la reproduction. Ainsi, l’ovogenèse de la perche est contrôlée par des variations saisonnières de température et photopériode. D’autres paramètres environnementaux peuvent moduler la progression de ce processus. Par conséquent, il existe un lien avéré entre l’environnement et la reproduction ce qui pourrait, théoriquement, modifier les processus moléculaires impliqués dans l’adaptation des espèces aux variations de leur milieu de vie. Parmi ces processus, la méthylation de l’ADN est connue chez les mammifères mais ne semble pas exister chez toutes les espèces de poisson. Il s’agit ici de déterminer si ce processus existe pendant l’ovogenèse de la perche. Cela nous permettra, à l’avenir, d’étudier comment certains paramètres environnementaux ciblés influencent ces processus évolutifs. Cette étude constitue donc un préalable scientifique indispensable pour ouvrir ce nouveau champ d’investigation.

Procédures

Il y aura 5 expérimentations effectuées or de l’eau mises en place dans ce travail. Au début du cycle de reproduction, l’ensemble des 150 animaux seront anesthésiés avant d’être sexés par échographie (procédure 1, 2 et 3) car il n’y a pas de signe distinctif extérieur chez cette espèce (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Puis une puce électronique leur sera injectée pour nous permettre d’avoir un suivi personnalisé (procédures 1, 2 et 3) (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Ils seront alors répartis de manière homogène dans 2 bassins. L’ovogenèse sera induite en contrôlant les variations de température et de photopériode dans chaque bassin. Huit prélèvements réguliers seront effectués pendant les 10 mois d’ovogenèse. Au cours de chaque prélèvements 6 femelles (48 femelles en tout) seront anesthésiées pour effectuer une prise de sang (procédure 1) pour analyser des taux hormonaux (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Elles seront mises à mort pour effectuer une analyse approfondie des gonades par échographie et des prélèvements de gonades pour un suivi histologique classique. Un mois avant le début de la saison de ponte, toutes les femelles restantes (52 femelles) seront anesthésiées avant d’introduire une canule dans l’orifice urogénital (procédure 2) (Durée la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson) pour prélever quelques ovocytes. Ces derniers seront observés pour évaluer leur progression dans les phases finales de maturation. Ceci nous permettra de trier les femelles en fonction de cet avancement. Les femelles au même stade pondront en même temps, nous permettant de réduire le stress des animaux lors de la saison de ponte. Enfin, à cette dernière étape, les femelles prêtes à pondre (reconnaissable par l’observation d’une cloque sur l’orifice uro-génitale) seront stimulées manuellement pour déclencher la ponte (procédure 2) (Durée de l’intervention entre le moment de la capture et le retour dans le bassin de réveil : moins de 5 minutes par poisson). De la même manière, les mâles spermiants seront stimulés par pression abdominale pour collecter le sperme (procédure 3) (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil :

Impact sur les animaux

Trois manipulations (injection d’une puce électronique (procédure 1, 2, et 3), prise de sang (procédure 1) et cannulation (procédure 2)) impliquent l’injection d’une aiguille ou d’une canule chez l’animal. Elles pourraient induire des nuisances comme une douleur ou des infections. Pour y pallier, les animaux seront systématiquement anesthésiés pour éviter la douleur. Concernant les risques d’infection, le matériel utilisé est stérile ou désinfecté et une observation renforcée des animaux sera effectuée pendant la semaine qui suit les expérimentations. Si nécessaire un protocole de traitement sera mis en place.

Devenir

Seule la procédure 1 (prise de sang) sera suivie d’une mise à mort des animaux car les gonades devront être prélevées pour effectuer des analyses moléculaires et histologiques. Concernant les 2 autres procédures, les animaux seront gardés en vie après chaque expérience pour nous permettre de continuer la progression de l’étude

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer cette expérimentation animale qui a pour but de mettre en évidence des régulations moléculaires dans des ovocytes au cours de l’ovogenèse. Ces régulations si elles existent, dépendent certainement des variations de signaux moléculaires et/ou cellulaires (hormones, signaux nerveux etc…) jusqu’ici inconnus. Il n’est donc pas possible d’effectuer ce travail dans des cellules en culture qui ne permettraient pas de reproduire l’ensemble de ces signaux extracellulaires.

Réduction

Nous avons décidé de faire plusieurs expériences indépendantes (étude de la reprogrammation de la méthylation de l’ADN et analyse de la progression de l’ovogenèse par échographie) car ces dernières nécessitent les mêmes contrôles (histologie, taux hormonaux…) mais n’interfèrent pas en termes de prélèvement d’organes. Nous avons donc regroupé 2 expériences pour réduire le nombre d’animaux utilisé. D’autre part, la mise en point récente d’une méthode de sexage des perches par échographie, nous permet maintenant de focaliser nos études avec un nombre de femelles et mâles plus adapté à nos besoins au départ. En effet, par le passé nous devions équilibrer le sexe-ratio pour nous assurer d’avoir le bon nombre de femelles pour toute l’expérience. Grâce au système d’identification par puce et au sexage préalable par échographie, nous pouvons réduire le nombre de mâles utilisés et donc réduire le nombre total d’animaux étudiés. En effet, cette opération permet de réduire le nombre de mâles utilisés de moitié par rapport à nos expérimentations précédentes.

Raffinement

Les étapes de puçage, de sexage, de cannulation ou de prise de sang peuvent engendrer soit un stress du fait d’une manipulation prolongée hors de l’eau (cannulation ou sexage) ou d’une douleur correspondant à l’introduction d’une aiguille (puçage et prise de sang). De ce fait les animaux seront préalablement anesthésiés pour éviter le stress des animaux. Les étapes de prélèvement de sperme ou de stripping (stimulation des pontes ou de la collecte du sperme) sont rapides (inférieur à 2 minutes) et seuls les animaux spermiants ou ayant ovulés seront stimulés. Cette stimulation correspond à une légère pression sur l’abdomen des poissons qui déclenche la ponte ou la libération de sperme. Une fois enclenchés ces processus ne nécessitent pas de pression abdominale prolongée et la récolte se fait rapidement. Si ces étapes risquent de stresser les animaux du fait de la pêche et de la vérification quotidienne des femelles, la rapidité de la procédure nous permet de ne pas les anesthésier. Pour éviter les stress répétés, nous avons décidé de regrouper les femelles en fonction de leur stade de maturation ovocytaire lors d’une évaluation globale un mois avant le début de la saison de ponte. Ceci nous permet de concentrer les pêches de poissons dans un bassin à quelques jours (4-5 j/par bassin) ce qui diminue le stress des poissons dans chaque bassin tout en nous permettant une meilleure efficacité dans notre gestion de la saison de pontes. Les mâles seront également isolés dans un bassin pour éviter qu’ils soient trop stressés. Chaque mâle sera stimulé au maximum 3 jours de suite puis isolés du groupe pour récupérer et éviter le stress répété.

Choix des espèces

La perche commune est une espèce groupe synchrone pour laquelle tous les ovocytes se développent simultanément, il sera plus facile de déterminer si cette synchronicité existe également à l’échelle moléculaire. D’autre part, cette espèce pond ses œufs enrobés dans une gangue. Cette caractéristique présente l’avantage de nous permettre de déterminer si les éventuelles variations des régulations étudiées peuvent être en lien avec la localisation des ovocytes dans l’ovaire jusqu’à la ponte. En d’autres termes nous voulons savoir si le microenvironnement des cellules influence ces régulations dans un ovocyte donné. La ponte d’un ruban d’œufs nous permet en fin de cycle de déterminer la localisation antéro-postérieure des ovules dans la gonade et donc pouvoir suivre cette évolution tout au long du cycle de reproduction. Les animaux utilisés seront des adultes matures et primipares. Nous choisissons de travailler avec des animaux primipares car ils sont plus jeunes et proviennent le plus souvent d’un même groupe d’animaux ayant été élevés en même temps dans les mêmes conditions. Au contraire, des animaux ayant déjà pondus pourraient provenir de lots différents. Nous réduisons ainsi le risque que les animaux aient des histoires différentes ce qui pourrait éventuellement affecter le processus épigénétique étudié et donc augmenter les variations individuelles qui pourraient interférer avec nos résultats. Nous pensons que le travail avec des primipares nous permettra de diminuer cette variabilité individuelle sans pour autant l’éviter complètement.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime riche en graisse induisant l'obésité, isolées en cage individuelle pour la calorimétrie, puis testées pour la tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins avant la mise à mort. Le projet étudie le rôle d'une enzyme dans les troubles métaboliques liés à l'obésité, applications thérapeutiques annoncées au conditionnel. Le porteur affirme qu'il faut étudier ces mécanismes "dans un organisme vivant" et qu'"aucune méthode alternative" n'existe.

Objectifs

L’obésité́ et le diabète de type 2 sont des problèmes majeurs de santé publique. Au cours des dernières décennies, de nombreuses études ont montré́ que les cellules immunitaires dans le tissu adipeux viscéral (TAV) des patients obèses sont responsables d’une inflammation chronique. Celle-ci serait largement impliquée dans le développement des désordres métaboliques et cardio-vasculaires compliquant l’obésité́. En particulier, la transformation de cellules immunitaire anti-inflammatoires, abondants dans la TAV maigre, en cellules immunitaires pro-inflammatoires dans le TAV obèse, conduirait à la production de médiateurs de l’inflammation et jouerait un rôle majeur dans cette inflammation chronique. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsable de cette inflammation sont encore méconnus. Les identifier permettrait de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre les syndromes métaboliques et l’obésité́. Nous avons observé́ que la déficience en une enzyme impliqué dans la dégradation de l’ADN libéré́ par les cellules mortes rend les souris plus susceptibles au développement du syndrome métabolique induit par l’obésité́. L’absence de cette enzyme augmente la capacité́ de l’ADN libéré́ par les cellules mortes, qui s’accumule au cours de l’obésité́, à activer les réponses inflammatoires causant le syndrome métabolique. Notre objectif est d’évaluer le métabolisme énergétique des souris déficientes en cette enzyme.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mettre en évidence comment la DNase1L3 contribue aux troubles métaboliques induits par l’obésité. Ainsi notre projet pourra conduire aux développements de nouvelles approches thérapeutique basées sur la supplémentation en DNase1L3 afin de limiter l’inflammation chronique induite par l’obésité mais aussi aux troubles métaboliques induite par celle-ci.

Procédures

Déroulement de la procédure : • Acclimatation/habituation (semaine 1) • 1ère séance de calorimétrie (semaine 2-4) • 1ère analyse de la composition corporelle (semaine 4, l’analyse dure environ 3 min par souris) • Exposition au régime riche en graisse (semaine 4-14) • 2ème séance de calorimétrie (semaine 15-16) • 2ème analyse de la composition corporelle (semaine 15) • Test de tolérance au glucose (semaine 16) • Test de tolérance à l’insuline (semaine 17) Nous réaliserons un seul test de tolérance au glucose et un seul test de tolérance à l’insuline. Pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, nous réalisons des prélèvements sanguins au niveau de la queue des souris. Le volume de sang nécessaire est limité (inférieur à 1% du volume sanguin total). Un délai d’une semaine minimum est respecté entre chaque test.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte. Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal et réaliser les mesures de calorimetrie indirecte. Afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Afin de réduire au maximum le stress ressenti par les animaux nous réalisons une période d’habituation de 2 semaines des animaux aux expérimentateurs. De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement ou de façon hebdomadaire (période d’induction de l’obésité), nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale. Les souris exposées au régime riche en graisse peuvent développer des dermatites, bien que cela soit très rares chez la souche de souris utilisée dans cette étude.

Devenir

Toutes les souris utilisées dans ce projet seront mises à mort à la fin de l'expérience pour récupérer du sang et des tissus afin de réaliser des études biochimiques et moléculaires complémentaires.

Remplacement

Le but de ce projet de physiologie intégrée est de comprendre les bases biologiques de la régulation de la balance énergétique et les mécanismes physiopathologiques menant aux désordres métaboliques, en particulier l’obésité. Dans ce contexte, de nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent, non seulement entre elles, mais aussi avec les organes périphériques (foie, muscles, tissu adipeux…). Il est donc nécessaire d’étudier ces phénomènes dans un organisme vivant. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive permettant de répondre à ce type de question par un remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquements (21 animaux par groupe).

Raffinement

1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 9 semaines. Ils seront manipulés pendant 2 semaines. Cette habituation, permettra de diminuer le stress des animaux en réponse aux expérimentateurs. 2) L’évaluation de la prise alimentaire et des paramètres de calorimétrie indirecte nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement se compose de frisure de papier kraft et de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et d’un tunnel en carton pour se cacher et réaliser le transfert et la manipulation des animaux. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, les attitudes, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant) et de décider si l'animal peut être maintenu dans l'étude ou s'il doit être mis à mort afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et de la balance énergétique fait de la souris un bon modèle prédictif. Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte, âge qui correspond à un stade où les circuits neuronaux contrôlant la prise alimentaire sont matures.