Oncologie

4 011 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de médicament et de cellules cancéreuses, une incision de la glande mammaire sous anesthésie, de nombreux prélèvements sanguins et jusqu'à sept séances d'imagerie, pour comparer des nanoparticules censées mieux cibler les tumeurs du sein HER2 positives. Le porteur reconnaît des nuisances tumorales, perte de poids et nécrose, et prévoit une mise à mort selon des points limites. Il qualifie la recherche de nouveaux traitements d'"indispensable" et renvoie les bénéfices pour les patientes, une toxicité réduite, au conditionnel.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer chez la femme en France, dont 10 à 20% sont HER2 positifs (protéine exprimée à la surface des cellules positives). Cependant, des résistances aux traitements proposés actuellement se développent, et la toxicité systémique (toxicité qui affecte l’ensemble de l’organisme) des traitements existants reste problématique. Il reste donc indispensable de chercher de nouveaux traitements contre le cancer du sein. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules associées à des nanoparticules ciblant HER2, réduisant les effets secondaires dans le traitement du cancer du sein. Nous espérons ainsi ouvrir de nouvelles pistes pour résoudre cette problématique de santé publique.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanoparticules dans l’arsenal thérapeutique actuel du cancer du sein. La comparaison des différentes nanoparticules ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanoparticules sur le ciblage de la tumeur, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanoparticules pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer du sein humain grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

- Un groupe de 700 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis 2 prélèvements sanguin à deux jours d’intervalle, sous anesthésie (durée : environ 30 secondes). Les souris subiront cette séquence d’une semaine sur 4 semaines (4 injections et 8 prélèvements au total). - Un groupe de 2100 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie terminale (sans réveil) (durée : 30 secondes). - Un groupe de 210 souris subira 2 injections de cellules cancéreuses (10 secondes chacunes) sur animal anesthésié, puis une injection du médicament (7 à 15 jours après) sur animal vigile d’une durée de 10 secondes ; puis sera observée à 7 temps différents par imagerie sous anesthésie (durée : 30 secondes) réparties sur 3 jours. - Un groupe de 1001 souris subira 1 incision sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes) suivie d’une injection de cellules cancéreuses dans la glande mamaire sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes), puis 10 à 20 jours plus tard, huit injections du médicament (10 secondes) sur animal vigile, et deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude (4 mois maximum), une injection de la luciférine (nécessaire à l’imagerie) sur animal vigile (durée 10 secondes) suivie de l’examen en imagerie (durée 1 min) sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de nuisances attendues sur les souris saines autre que la toxicité éventuelle de la molécule à haute dose (perte de poids, perte de poils). Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Les nuisances attendues pour l’incision du flanc sont des douleurs au niveau de la zone incisée. Les nuisances attendues pour les souris porteuses de tumeurs sont la nuisance due à la tumeur : perte de poids, nécrose, etc. Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Après injection intraveineuse, des irritations au point d’injections peuvent apparaître et seront surveillés.

Devenir

Les souris sont prélevées post-mortem pour des analyses ultérieures, elles seront donc toutes mises à mort. Les souris dont la pousse tumorale n'a pas prise seront mises à mort car elles ont étés injectées avec des cellules tumorales.

Remplacement

Nous avons préalablement réalisé des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. En effet, cette étude préclinique, visant à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanoparticules pour le traitement du cancer du sein nécessite obligatoirement l’utilisation d’animaux entiers pour déterminer la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique et leur efficacité.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible grâce au suivi par imagerie non invasive et non irradiante (croissance tumorale et biodistribution des formulations dans les modèles de souris porteuses du cancer du sein). Une étude préliminaire, avec un nombre restreint de groupes conditionnera la suite du projet, le nombre d’animaux annoncé est donc un nombre maximum.

Raffinement

Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Un analgésique sera localement appliqué sur les sites d’ouverture de la souris. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs sera mesurée tous les 3 jours. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la structure du bien-être animale.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La plupart des antécédents génomiques de la souris sont similaire à ceux de l’homme (env. 95%), ce qui rend les souris particulièrement utiles pour la recherche sur les maladies humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6-8 semaines, âge adulte de manière à avoir un poids corporel plutôt stable d’environ 20g.

200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'extraction de leur cerveau. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique d'une à trois heures pour l'implantation d'une barre en acier et une injection virale, avec des fibres optiques dans le cerveau pour 100 d'entre elles, puis un à cinq mois d'entraînement en réalité virtuelle, tête fixée, isolée en cage et maintenue par restriction hydrique à 85 % de son poids d'origine. Environ 180 subissent ensuite une craniotomie, et des électrodes leur sont insérées dans le cerveau, parfois chaque jour, pendant un à quinze jours d'enregistrement. Le but est d'observer comment le cerveau prépare plusieurs décisions à la fois pendant une recherche de nourriture ou d'eau, comportement que le porteur qualifie d'"éthologiquement intéressant". Il écarte la drosophile au motif que son circuit neuronal diffère de celui des mammifères, et conclut qu'il "s'avère donc nécessaire" de recourir à la souris.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'identifier les principes neuronaux et computationnels indispensables à la flexibilité comportementale. L’hypothèse centrale est que le cerveau peut imaginer et préparer plusieurs décisions simultanément pour pouvoir changer plus facilement de décisions lorsqu'une situation change. Nous combinerons des tâches comportementales réalisées en réalité virtuelle chez la souris avec des techniques innovantes d’électrophysiologie et de stimulation optique (optogénétique), et des modèles théoriques de décodage de l’activité neuronale. Cette approche nous permettra d’enregistrer et de manipuler simultanément des centaines de neurones dans un large réseau cortico-sous-cortical impliqué dans le contrôle volontaire de l’action durant la prise de décision. Nous choisirons d’étudier un comportement éthologiquement intéressant : le « foraging », qui consiste en la recherche de ressources en nourriture ou en eau.

Bénéfices attendus

Le projet produira une quantité sans précédente de données utiles à un large éventail d'études scientifiques. Ces données seront partagées avec la communauté scientifique après publication des résultats. Ces données seront donc réutilisables pour répondre à des questions scientifiques variées. Plus particulièrement, les résultats de ce projet pourront offrir une nouvelle approche de la flexibilité cognitive au cours de la prise de décision. Ce projet éclairera également les variations individuelles dans les processus décisionnels, ouvrant la voie pour mieux comprendre la diversité comportementale et ses dysfonctionnements cognitifs.

Procédures

(1) Implantation d’une barre en acier et de fibres optiques : cette phase expérimentale consiste en une procédure chirurgicale qui s’effectuera sur tous les animaux (N = 200) sous anesthésie générale. Durant la procédure, une injection virale sera réalisée à l’aide d’un nano-injecteur et des fibres optiques miniatures seront insérées dans le cerveau de certains animaux (N = 100) sur lesquels nous effectuerons des expériences de stimulations optiques. Ces chirurgies stéréotaxiques durent entre 1h et 3h pour chaque animal. (2) Entrainement : cette phase durera entre 1 mois et 5 mois en fonction de la performance de l’animal. Les animaux (N = 200) seront placés dans la plateforme expérimentale 5 jours par semaine pendant 20 à 60 min et pesés quotidiennement avant la séance. (3) Craniotomies : certains animaux entrainés (approximativement N = 180) subiront une seconde procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui permettra de réaliser de petites craniotomies. Cette intervention est rapide (20 à 30 min). (4) Enregistrement : l’animal sera placé dans sa plateforme expérimentale et une ou plusieurs électrodes seront lentement insérées jusqu’à leurs positions finales. Cette procédure pourra être répétée quotidiennement pendant plusieurs jours. Cette phase peut durer entre 1 et 15 jours en fonction des résultats. (5) Mise à mort : Tous les animaux (N = 200) seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets plus ou moins nuisibles à la santé des animaux peuvent être attendus. 1) Isolement : pour leur protection, les animaux devront être hébergés individuellement dans leur cage 2) Restriction hydrique : les animaux seront maintenus à 85% de leur poids originel 3) Interventions chirurgicales sous anesthésie : les conséquences de ces interventions sont parfois néfastes (hémorragie, infection, détresse respiratoire, douleurs post-opératoires) 4) Implants : potentielle gêne occasionnée par un corp étranger 5) Stress lié à la manipulation : les animaux seront manipulés durant les phases de tests 6) Restriction des mouvements : les animaux auront la tête fixée durant les périodes de tests

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure dans le but de procéder à l'extraction du cerveau à des fins histologiques.

Remplacement

Pour évaluer la complexité des comportements adaptatifs, comme proposé dans ce projet, il est fondamental d'utiliser un modèle animal approprié qui ne peut être facilement remplacé par des expériences in vitro ou des modèles informatiques. D’autre part, l'étude des bases neuronales de la prise de décision par l’enregistrement et la manipulation sélective de l’activité des neurones nécessitent des techniques invasives qui ne peuvent pas être réalisées chez des sujets humains sains et extrêmement rarement chez des sujets malades. Certaines espèces d'invertébrés, telles que la mouche des fruits (drosophile), pourrait sembler adaptées à l’étude du comportement de foraging et aux manipulations génétiques des systèmes cérébraux. Cependant, l'anatomie du circuit neuronal de la drosophile est considérablement différente de celle des mammifères. Ainsi, les résultats scientifiques obtenus chez ces espèces ne sont pas facilement généralisables aux questions abordées dans ce projet. En l'absence de méthode de remplacement possible, il s’avère donc nécessaire d'avoir recours au modèle animal murin dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour pouvoir obtenir des résultats statistiques fiables et significatifs. L'utilisation d'outils électrophysiologiques comportant des centaines de sites d'enregistrement réduira aussi considérablement le nombre de sessions d'enregistrement et d'animaux nécessaires pour obtenir des statistiques fiables. Par ailleurs, les données comportementales et neuronales seront extraites des mêmes individus pour réduire encore d’avantage le nombre d’animaux. D’après nos études précédentes, nous estimons que 45 souris par axe de recherche sont nécessaires, et le double pour l'axe de recherche necessitant un comparaison entre un groupe test et un groupe contrôle (soit 180 animaux au total). Etant donné la difficulté technique qu’implique la réalisation des enregistrements et la bonne performance des animaux dans la tâche, un pourcentage de perte de l’ordre de 10% ou plus est à prévoir, ce qui augmente l’estimation finale à 200 animaux pour les 5 ans.

Raffinement

Des méthodes de raffinement seront mises en place dans le but d’atténuer les nuisances provoquées par les procédures expérimentales. Le poids des animaux sera surveillé quotidiennement et la poursuite du protocole de restriction hydrique sera décidée en fonction du bien-être des animaux. L’eau naturelle ad-libitum sera remise à disposition pour assurer la récupération totale du poids si la perte de poids est supérieure à 20%. Afin de réduire le stress, les animaux seront habitués, par étapes, à la présence et aux interactions avec l’expérimentateur plusieurs jours avant le début des tests. L’angoisse éventuellement ressenti par l’animal due à la contention sera atténuée par une habituation renforcée positivement via des récompenses (eau sucrée).  Pour prévenir la douleur et les inflammations, nous administrerons à chaque chirurgie des médicaments aux propriétés antalgiques, antipyrétiques et anti-inflammatoires.En cas de sècheresse ou rougeur légère de la peau autour de l’implant, l’animal sera traité localement par une solution dermatologique. Dès l’apparition de comportements anormaux (ex : absence de toilettage, perte de plus de 20% du poids) ou autres signes de souffrance (évalués sur une grille d’évaluation de la douleur) survenant après l’implantation, l’animal recevra un traitement analgésique en sous cutané. Si des signes de souffrances persistent plus de 72h l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle animal le plus approprié pour ce projet et il n'existe pas d'alternative méthodologique. Tout d’abord, l'organisation du néocortex chez la souris comporte des similitudes avec d'autres espèces de mammifères, y compris les humains, et peut donc être utilisée pour révéler des principes généraux de prise de décision. Les souris peuvent aussi être entraînées à effectuer des tâches assez complexes dans des environnements expérimentaux contrôles. Les outils génétiques pour cibler et moduler des populations spécifiques de neurones sont également très bien développés chez la souris et relativement faciles à utiliser. Comme les souris ont un cerveau relativement petit, il est aussi possible d’enregistrer plusieurs régions cérébrales simultanément. Le fait que toutes ces procédures soient devenues l'état de l'art chez la souris facilitera et accélèrera donc grandement l'avancement du projet. Nous utiliserons de jeunes adultes au moment de l’implantation (âgées de 8 à 12 semaines). Il est important que les animaux soient relativement jeunes pour un apprentissage plus rapide et une meilleure performance dans la tâche. Cependant, les animaux doivent avoir terminé leur croissance pour éviter que la taille de la boite crânienne ne change au cours de l’expérience.

Un prélèvement de sang représentant, selon le résumé, "25% de leur volume corporel", fait sur des souris éveillées juste avant leur mise à mort : 960 souris mâles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Avant cela, les souris reçoivent, sauf un groupe témoin, une injection de cardiotoxine dans chaque tibia sous anesthésie pour provoquer une lésion musculaire, puis, pour les groupes traités, jusqu'à sept jours d'injections de glucocorticoïdes, afin d'étudier le rôle de ces hormones dans la régénération du muscle. La plupart appartiennent à la lignée LysM-Cre, et une seconde lignée, inductible, reçoit en plus cinq jours d'injections de tamoxifène pour invalider le récepteur des glucocorticoïdes. Le porteur écrit que ces procédures n'entraînent "généralement pas de souffrance", pour un protocole qui lèse un muscle et s'achève par une saignée sur souris éveillées puis une perfusion de fixateur dans le cœur.

Objectifs

Dans le cadre d’une blessure les glucocorticoïdes comme la cortisone peuvent être prescris pour leurs effets anti-inflammatoires efficaces mais dont la prise prolongée peut induire une perte de la masse musculaire. Les études sur les effets des glucocorticoïdes réalisées in vitro sur des cellules en culture montrent des résultats souvent contradictoires. Ainsi, malgré cette utilisation courante le mode d’action précis grâce auquel les glucocorticoïdes produisent leurs effets bénéfiques comme délétères sont encore mal connus. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la dégénérescence et la régénération musculaire via certain type de cellule immunitaire. Cette étude permettra aussi de mieux décrire, in vivo, le lien entre une partie du système immunitaire et les cellules souches du muscle. Enfin, grâce à ce projet nous espérons pouvoir identifier le meilleur moment pour administrer les traitements aux glucocorticoïdes en évitant les effets secondaires indésirables.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques de régénération musculaire. Ce projet permettra aussi de décrire les effets induits par des traitements aux glucocorticoïdes. Nous pourrons ainsi disséquer les conséquences d’un potentiel dysfonctionnement du système immunitaire sur les processus d’inflammation mais aussi les conséquences sur la réparation des fibres musculaires. En comprenant les cibles et le rôle précis des glucocorticoïdes des traitements pourront être développer pour cibler un type cellulaire en particulier et être administrés au moment adéquat.

Procédures

Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis principalement des injections de différents types ne nécessitant pas de contention de plus de 30 secondes. Une première vague d’injection de tamoxifène, permettant l’invalidation du récepteur des glucocorticoïdes, sera réalisée une fois par jour pendant 5 jours. Ensuite, l’induction de la lésion musculaire se fera sur des animaux endormis à l’aide d’un gaz à savoir l’isoflurane. Les animaux endormis recevront une injection unique de cardiotoxine dans chacun des tibias. Une fois l’animal endormi cette procédure dure environ 1,5 minute. Durant la régénération musculaire, les traitements par glucocorticoïdes seront réalisés grâce à une injection par jour sur une période allant de 1 à 7 jours maximum. L’injection unique d’une molécule, pour visualiser la prolifération cellulaire, sera réalisée par injection sur des animaux vigiles deux heures avant leur mise à mort. Le prélèvement de sang sera réalisé via l’artère temporo-mandibulaire sur des animaux vigiles juste avant leur mise à mort et représentera 25% de leur volume corporel. Enfin, pour l’anesthésie létale les animaux vigiles seront injectés avec un mélange de xylazine/kétamine afin de subir une chirurgie. Cette dernière consiste à réaliser une perfusion de paraformaldéhyde intracardiaque cœur afin que le système circulatoire permette au fixateur d’atteindre tous les organes. Cette technique permet de fixer et préserver les tissus de manière homogène.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant. En effet, 7 jours de traitement aux glucocorticoïdes ne provoquent normalement pas d’atrophie musculaire. Ainsi, nous n’attendons pas d’effets secondaires majeurs causés les molécules injectées. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

A l'issue de la procédure tous le animaux expérimetaux seront sacrifiés pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes et synthétiques (dexaméthasone) sur la régénération musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, lors de la régénération musculaire, les cellules du système immunitaire provenant de la circulation sanguine sont impliquées mais aussi d’autres facteurs comme les hormones. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un animal entier afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte (exemple : niveaux d’hormones circulantes). Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production d’un nombre assez important d’individu, contribuant à la production de résultats significatifs.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire sur la régénération musculaire ont mené à une bonne connaissance du modèle ainsi que des traitements à réalisés. Ainsi, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement et disposons de protocoles précis pour chaque expérimentation. Par ailleurs, les deux pattes des souris seront systématiquement utilisées afin de réduire de moitié le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Néanmoins, si l’un des animaux atteint un point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort par afin d'éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, après injection, les souris seront attentivement suivies. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …). De plus, le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’administration du composé induisant un dommage musculaire. Enfin, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement pouvant entrainer des effets secondaires délétères sur les animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront des mâles entre 10 et 15 semaines pour éviter les variations causées par la puberté. La régénération musculaire se faisant en plusieurs étapes, nous effectuerons une cinétique. Dans un premier temps, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la dégénérescence musculaire et l’inflammation en analysant les souris à 1, 3 et 5 jours après injection de la cardiotoxine. Puis, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la régénération musculaire et les mécanismes anti-inflammatoire en analysant les animaux à 7, 14, 28 et 60 jours après l’injection de la cardiotoxine. Un groupe d’animaux sera également analysé en l’absence de traitement à la cardiotoxine, constituant ainsi le jour 0. Pour la majorité des expérimentations nous utiliserons les souris de la lignée LysM-Cre, cette Recombinase Cre étant constitutive elle ne nécessite pas d’injection au tamoxifène. Néanmoins, si nous observons des phénotypes sur ces souris, nous voudrions exclure une cause développementale c’est pour cela qu’il nous sera indispensable d’utiliser une seconde lignée inductible LysM-CreERT2. Il est difficile à cette étape de prévoir à quel stade nous utiliserons ces souris car cela dépendra du phénotype des souris issues de la lignée LysM-Cre.

10 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau deux implants d'un biomatériau lors d'une chirurgie, avec un risque d'hématome, d'abcès et de douleurs à l'alimentation. Le porteur, en collaboration avec deux partenaires industriels, évalue la tolérance d'un film destiné à prévenir les fistules après ablation du larynx chez l'humain. Il indique que le dispositif n'a jamais été testé in vivo et qu'un modèle in silico n'est pas envisageable.

Objectifs

Le présent projet vise à développer un biomatériau innovant sous la forme d'un film double couche pour la prévention des fistules salivaires (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après une chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale). Cette chirurgie consiste en l'ablation du larynx, généralement pratiquée pour traiter un cancer. La fistule salivaire est une complication fréquente de cette chirurgie, et elle est associée à de fréquentes complications, un allongement de la durée d'hospitalisation, des chirurgies répétées, des dépenses de soins accrues, une qualité de vie moindre, voire un décès. Le projet est une collaboration entre un établissement de santé spécialisé en cancérologie, 2 laboratoires de recherche académique spécialisés dans les biomatériaux et 2 partenaires industriels. Ce projet s’appuie sur des résultats préliminaires concernant le design d'un biomatériau. Le projet présenté ici consiste à évaluer le biomatériau implanté sous la peau chez le petit animal (10 souris). L'objectif de ce projet est l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration).

Bénéfices attendus

Développement d'un biomatériau innovant permettant de diminuer le taux de fistule salivaire (fuite de salive par défaut de cicatrisation) après chirurgie du cou / de la gorge (laryngectomie totale) chez l'homme. De nombreux bénéfices secondaires sont attendus, comme une diminution du taux de fistule salivaire et des complications suscitées qui en découlent, et donc de la durée d'hospitalisation moyenne après laryngectomie totale.

Procédures

Une chirurgie sous anesthésie générale sera effectuée, consistant à effectuer une insertion du biomatériau sous la peau. Chirurgie durant 10 minutes environ.

Impact sur les animaux

Risque d'hématome, infection du site opératoire (abcès), douleurs à l'alimentation, impact sur le comportement et détérioration de l'état général.

Devenir

Mise à mort nécessaire car l'objectif primaire de l'étude concerne l'étude de la tolérance et l'intégration du biomatériau (bioadhésion et biointégration), requérant une analyse histologique (autopsie pour analyse de l'explant).

Remplacement

ll n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier la bioadhésion et la biocompatibilité de ce biomatériau nouveau dans une étude préalable sur modèle animal. Le dispositif médical n'a jamais été testé in vivo. Les analyses in vitro ont été réalisées dans un milieu non calcique seulement. Un modèle in silico n'est pas envisageable pour ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Des tests in vitro ont été réalisés au préalable afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. 10 animaux sont nécessaires pour atteindre l'objectif de l'étude selon un design établi au préalable. De plus, chaque animal sera porteur de deux implants, ce qui divise par deux le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur. Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès ad libitum à l'eau et à de l'alimentation. Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages contiendront 3 à 4 souris et seront de taille adaptée à la règlementation. Le change sera effectué 2 fois par mois. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car une analyse de l'intégration du biomatériau au microscope est nécessaire (autopsie pour analyse des explants).

Choix des espèces

Modèle animal simple, fiable et suffisamment robuste pour l'objectif de l'étude. Souris adultes d'au moins 5 semaines. Les souris seront utilisées à l'âge adulte car le taux d'hormone de croissance et les capacités de cicatrisation sont accrus chez les animaux en croissance. Des souris mâles seront utilisées. Aucune étude ne prouve de différence de capacité de cicatrisation chez la souris adulte en fonction du sexe, notre choix a donc été guidé par l'aspect logistique (éviter de mélanger les sexes en cage) et car les cancers de la tête et du cou touchent principalement les hommes.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe tumorale et des traitements par injection, certaines subissant une incision cutanée ou une laparotomie pour exposer un ganglion ou l'intestin à la lumière. Le porteur étudie la migration de lymphocytes régulateurs de l'intestin vers la tumeur pour comprendre la résistance à une immunothérapie. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire ces interactions immunologiques ex vivo, rendant l'animal vivant "indispensable".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier les mécanismes de résistance à une des pronicipaux types d'immunothérapie. Notre équipe et d’autres également on montré que le microbiote intestinal joue un rôle important dans la réponse du patient au blocage des points de contrôles immunitaires. Dans une étude récente, nous avons trouvé que le microbiote intestinal dicte l’efficacité thérapeutique du blocage des points de contrôles immunitaires en régulant la migration des lymphocytes T régulateurs (Tregs) de l’intestin à la tumeur et dans les ganglions drainant. En raison du rôle pivot du blocage de ce points de contrôle immunitaire dans les Tregs, nous supposons que la migration des Tregs dérivés de l’intestin pourrait dicter l’efficacité thérapeutique du blocage.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait révéler d’importants mécanismes médiant la résistance aux immunothérapies les plus couramment utilisées à l"heure actuelle, et des informations utiles afin de personnaliser les traitements ou encore de nouvelles cibles de traitement pour améliorer la prise en charge du patient.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections de cellules tumorales, pour greffe (une injection, durée 1 minute, anesthésie locale). Les souris auront également des traitements par injection sous anesthésie locale (3 traitements à , Jour 6, 9 et 12, durée 1 minute). Certaines souris subiront des incisions cutanées pour exposition d'un ganglions à la lumière (photoconversion, durée 5 minutes). Certaines subiront une laparotomie pour exposition des instestins à la lumière (photoconversion), durée maximale 15 minutes, sous anesthésie générale, ces souris seront sacrifiés 24h après l'intervention (prélèvements d'organes et de tissus).

Impact sur les animaux

Certains de ces protocoles incluent en plus d'une implantation tumorale, des actes chirurgicaux et des traitements à base d'immunothérapie. L'acte chirurgical entraînera soit une incision cutanée (douleur minime), soit une ouverture du péritoine et donc des douleurs abdominales. L'implatation tumorale ainsi que les traitements peuvent entraîner des pertes de poids (assez rare, car selon nos études précédentes, il n'y a pas eu de perte de poids notable).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de prélver divers organes pour analyses futures (qPCR, Cytométrie en flux, ELISA, Culturomique)

Remplacement

Il n'est pas possible de reproduire ou modéliser toutes les interactions immunologiques de manière ex vivo. L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable pour répondre à la question scientifique du projet. En revanche, nous avons utilisé les découvertes faites dans les publications précédentes pour optimiser au maximum le plan expérimental.

Réduction

Le nombre de souris par lot a été précisément déterminé par calcul de puissance et en tenant compte du taux de prise des greffes de tumeurs. Les témoins seront regroupés au maximum pour minimiser le nombre total d'animaux.

Raffinement

Pour toutes les procédures, des mesures spécifiques seront prises en compte pour ajuster les attentions portées aux souris selon leur condition : Les souris qui sont porteuses de tumeur seront suivies quotidiennement avec mesure de la taille tumorale et du poids 2 fois par semaine. Les souris ayant une tumeur et subissant une chirurgie feront l'objet d'une attention plus poussée. Une injection de d'antiinflmmatoire sera réalisée une fois la chirurgie finie et également 12h après. Les souris seront surveillées au réveil,puis quotidiennement pour vérifier l'état général et le bon maintien des clips (servant à fermer l'incision, dans le cas où les souris perdent du poids, nous mettrons du dietgel dans le cage. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Génétique proche de celle de l’Homme Les voies de signalisation immunologique des tumeurs sont comparables chez l’humain et la souris. La souris est le moèle de référence dans le domaine de la cancérologie . Le modèle Kaede proposé permettent le suivi des cellules immunitaires in vivo. Cela n'est pas possible chez l'homme (pour des raisons éthiques et techniques, le marquage in vivo des cellules immunitaires dans l'intestin humain, par exemple par des traceurs radioactifs, n'est pas justifiable sur le plan éthique). Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines développées sur un fond génétique C57BL/6 et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des différents traitements sur la réponse anti-tumorale. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines. A cet âge là, le système immunitaire est tout à fait fonctionnel et permet un suivi de plusieurs semaines sans que la souris ne soit trop vieillissante et que son système immunitaire soit en déclin.

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis trois injections de traitement par semaine pendant huit semaines, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse. Le porteur teste un pro-médicament censé cibler le métabolisme des cellules cancéreuses, les retombées thérapeutiques restant renvoyées à de futures approches. Sur le remplacement, il affirme qu'il est "absolument nécessaire" de recourir à un modèle in vivo, aucune méthode ne reconstituant selon lui la complexité du système immunitaire.

Objectifs

Les cellules tumorales sont souvent caractérisées par un niveau élevé des espèces réactives de l’oxygène mais aussi par des composants cellulaires déficients (mitochondries). C’est pourquoi les cibler simultanément représente une stratégie de traitement intéressante. Des expérimentations in vitro ont permis de déterminer qu’un agent ciblant les espèces réactives et les mitochondries a une action cytotoxique sur des lignées cancéreuses et induit la production d'espèces réactives mitochondriales. Nous souhaitions confirmer in vivo l’effet anti-tumoral de ce composé. L’analyse des tumeurs après traitement nous informera sur la capacité de cette molécule à stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses et donc à rétablir une immunosurveillance défaillante caractéristique des tumeurs. Si notre hypothèse est validée, nous testerons aussi l’effet de cet agent en présence d’une chimiothérapie immunogène et stimulant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

. Ce projet permettra de valider in vivo l’application thérapeutique d'une nouvelle classe de molécule en ouvrant ainsi des nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris recevront des injections de cellules tumorales une fois. Cette procédure durera en moyenne 5 min. Par la suite, les souris seront manipulées brièvement 1min à chaque fois pour mesurer la croissance tumorale. Tous les animaux recevront 3 injections de traitement sous anesthésie locale par semaine, pendant 8 semaines. L’injection prend 1 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements intra péritonéaux par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine. Ces différentes manipulations pouvant entrainer du stress chez l’animal. Les traitements chimiotherapeutiques peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris.

Devenir

Toutes les souris ayant reçu des cellules cancéreuses, elles seront euthanasiées en fin de procédure.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenus in vitro. Ce projet ayant pour objectif de tester si notre composé induit une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de d'une taille permettant une évaluation statistique solide des effets analysés. Le calcul de puissance nous a permis de calculer le nombre de souris nécessaires par groupe . Nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux témoins. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux,, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale ou locale selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Plusieurs justifications d’ordre scientifique, pratique et éthique sont à la base du choix de la souris comme modèle préclinique, notamment le fait que la souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale. Cela permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, suffisamment grand pour une mise en place des méthodologies envisagées relativement aisée et dont la génétique est la mieux connue. La souris est le modèle le plus utilisé dans notre centre de recherche, ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. De plus, la pratique expérimentale que nous avons acquise sur cette espèce est désormais confirmée. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

945 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant un mois, un rasage et des injections de cellules tumorales, avec un suivi de la croissance des tumeurs, avant la mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur indique que les lignées transgéniques développent dès trois semaines une tumeur de l'œil qui métastase à la peau, aux poumons et aux ganglions, avec une baisse de l'acuité visuelle. Il présente l'amélioration de la prise en charge des patients comme un bénéfice conditionnel.

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau à haute capacité métastatique responsable de nombreux décès chaque année. Ces dernières années, les nouvelles immunothérapies restaurant les fonctions protectrices du système immunitaire ont permis d'améliorer le pronostic vital des patients. Néanmoins 60% d’entre eux résistent à ces nouveaux traitements, d’où la nécessité d’identifier de nouveaux marqueurs pronostiques ou de résistance à l’immunothérapie. Du fait de ses propriétés pro-tumorales, notre protéine d'intérêt a émergé comme une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Nous nous intéréssons plus particulièrement à son rôle délétère sur le système immunitaire. Sachant qu'elle est principalement exprimée par des cellules immunitaires associées à un mauvais pronostic, nous émettons donc l’hypothèse qu’elle favorise leurs fonctions pro-tumorales. Nous souhaiterions déterminer le rôle spécifique de chacune des cellules exprimant l'enzyme dans le développement du mélanome.

Bénéfices attendus

Nous déterminerons comment notre enzyme affecte la fonction des cellules immunitaires dans le contexte du mélanome. Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d'action de l'enzyme afin, à terme, de mieux la cibler. En combinaison avec les immunothérapies actuelles, la prise en charge des patients atteints de mélanome métastatique sera donc améliorée.

Procédures

Gavage quotidien sur souris vigiles (5 minute/gavage/souris) pendant 1 mois soit 30 gavages/souris au total. Rasage sur souris vigiles (5 minutes/souris). Une injection sous cutanée d'1M de cellules tumorales sur souris vigiles (5 minutes/injection/souris). Une injection par voie intra-veineuse d'1M de cellules tumorales sur souris vigiles (6 minutes/injection/souris). Evaluation de la croissance tumorale 3 fois par semaine par mesure de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse sur souris vigiles.

Impact sur les animaux

Les lignées transgéniques présentent un phénotype dommageable : elles développent une tumeur primaire au niveau de l'oeil dès l'âge de trois semaines qui métastase rapidement au niveau de la peau, puis des poumons et des ganglions. Les principales nuisances attendues sont un trouble du comportement et une diminution de l'acuité visuelle de ces souris due au développpement de la tumeur primaire. Les souris transplantées peuvent présenter une tumeur ulcérée ainsi qu'un trouble du comportement. La transplantation intra-veineuse de cellules tumorales peut exceptionnellement induire une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale pour analyse de la composition immunitaire des différents organes prélevés (tumeur primaire, métastases, ganglions drainants et non drainants, rate, péritoine).

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro pour étudier les conséquences sur les fonctions de différentes cellules immunitaires. Des expériences de stimulation in vitro ont également été réalisées pour déterminer quelles sont les cellules qui expriment l'enzyme. Cependant, le recours à un modèle animal est indispensable car la complexité de la réponse immunitaire in vivo dans la tumeur et les organes lymphoïdes secondaires des vertébrés ne peut être reproduite par des méthodes alternatives in vitro ou ex vivo.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Ainsi, les expériences reposant sur le modèle de souris transgénique de mélanome spontané nécessitent 40 souris par groupe. Le modèle de transplantation de cellules tumorales présente l’avantage d’être fortement reproductible d’une souris à l’autre. Ainsi, les expériences de transplantation de mélanome nécessiteront des groupes de seulement 10 souris.

Raffinement

Nous avons défini des points limites adaptés aux différents modèles utilisés et au delà desquels les animaux seront mis à mort. Ainsi, l’état général des animaux sera suivi lors des changes par le personnel qualifié de l'animalerie (apparence physique, changement de comportement). Tout état anormal sera communiqué aux responsables de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie). De plus, les souris RET seront diagnostiquées une fois par semaine par les responsables de projet pour suivre l'évolution du mélanome. La tumeur sous-cutanée des souris transplantées sera mesurée trois fois par semaine afin de surveiller l'aspect et la croissance tumorale. Les animaux injectés par des cellules B16 en IV seront pesés à J0, J7 et J12. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale, de nombreuses voies étant conservées entre la souris et l'homme. De plus, les souris transgéniques développant une tumeur spontanée permettent de comparer la réponse immune à différents stades du développement du mélanome (à un stade précoce ou tardif de la maladie). Ce modèle est relevant cliniquement par rapport à la pathologie humaine et permettra d’étudier les cellules immunes au sein d’une tumeur qui vient de se développer, ce qui est éthiquement impossible à partir de mélanome primitif chez l’homme. Enfin la disponibilité de modèles transgéniques permet d'étudier finement le rôle de l'enzyme dans le contexte tumoral. Le modèle de transplantation des cellules de mélanome, largement utilisé, présente l’avantage d’être reproductible d’une souris à l’autre et ne requiert pas un grand nombre de souris par groupe. Les données obtenues dans ces trois modèles seront complémentaires. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte (>6 semaines) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.