Oncologie

405 poussins vont être utilisés, tous tués entre le 6e et le 34e jour pour prélever leurs caeca, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par voie orale une souche de Salmonella puis un probiotique administré jusqu'à quinze fois sur 34 jours, pour tester une stratégie de réduction de la contamination dans la filière du poulet de chair. Le porteur indique que l'infection reste souvent asymptomatique mais que les inoculations répétées peuvent stresser les animaux. Il présente le projet comme une réponse aux attentes des industriels de l'alimentation animale et qualifie la validation in vivo de "nécessaire" après les essais in vitro.

Objectifs

La salmonellose, représente la deuxième cause d’infection humaine d’origine alimentaire en Europe. Cette infection, est une maladie qui peut être transmise à l’Homme tout au long de la chaine alimentaire, mais plus généralement par le biais d'aliments d'origine animale contaminés. Les salmonelloses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. L’objectif principal de ce projet est de réduire la présence de Salmonella, prédominante dans cette filière par l’ajout d’un probiotique comme source de molécules bioactives. Par ailleurs, au cours d’un précédent travail, l’inhibition du passage de la barrière intestinale de différents sérotypes de Salmonella (S. Typhimurium, S. Senftenberg), a été mis en évidence in vitro. Cet essai permettra de valider les effets bénéfiques obtenus in vitro, en vérifiant en animalerie expérimentale l’effet inhibiteur sur Salmonella de B. fragilis. La réduction du portage de Salmonella sera mesurée au niveau intestinal, au sein des caeca, de sa diffusion dans le sang et par la réponse immunitaire. L’impact de B. fragilis sur le microbiote digestif en présence de Salmonella sera également considéré. Développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage permettra de réduire la charge qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des industriels de l’alimentation animale et des différents acteurs de la filière avicole dont la priorité est d’assurer l’innocuité de leurs produits auprès des consommateurs.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra de valider les effets bénéfiques du probiotique B. fragilis observés in vitro sur la colonisation de Salmonella. Ces données sont nécessaires pour l’acquisition de connaissance, et pour le développement d’une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage. Cela permettrait de limiter à terme, l’usage d’antibiotiques en cas de salmonelloses animales, de réduire la charge bactérienne qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des industriels de l’alimentation animale et des différents acteurs de la filière avicole dont la priorité est d’assurer l’innocuité de leurs produits auprès des consommateurs. Par ailleurs, cette étude nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo dans l'objectif de réduire le recours à l’expérimentation animale lors de futures études.

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation par voie orale de Salmonella spp. et du probiotique B. fragilis. Les prélèvements de caeca et de sang auront lieu après mises à mort des animaux (J6, J13, J20, J27 et J34). Dès la mise en place (J0), 400 poussins tout venant de 1 jour de l’espèce Gallus gallus de souche commerciale de chair (type ROSS PM3), seront inoculés par voie orale avec 100 µL de B. fragilis pour le Lot 1, Lot 4 et Lot 7, et 100 µL de Tryptone Sel pour le Lot 2, Lot 3, Lot 5, Lot 6 et Lot 8. L’inoculation par voie orale, à la pipette, (d’une durée maximale d’une minute par animal) sera réalisée au maximum tous les 2 jours (hors week-end) sur une période de 34 jours, pour un maximum de 15 inoculations. A J0, il y aura aussi une mise à mort de 5 poussins pour prélèvements de vésicules vitellines afin de vérifier le statut indemne des animaux en Salmonella. Le lendemain de la mise en place (à J1), tous les animaux seront pesés et les poussins inoculés recevront 100 µL de la suspension de Salmonella adequate (S. Typhimurium ou S. Senftenberg) par voie orale à la pipette, à une dose de 10^5 UFC/ml (Lot 3, Lot 4, Lot 5, Lot 6, Lot 7 et Lot 8) et 100 µL de Tryptone Sel pour le Lot 1 et Lot 2. A partir de J2 jusqu’au J20 le Lot 1, Lot 4 et Lot 7 recevrons 100 µL de B. fragilis tous les deux jours, tandis que le Lot 2, Lot 3, Lot 5, Lot 6 et Lot 8 recevront 100 µL de Tryptone Sel. A J20 le Lot 1, Lot 2, Lot 4, Lot 5, Lot 7 et Lot 8 recevrons 100 µL de B. fragilis tous les deux jours, tandis que les Lot 3 et Lot 6 recevront 100 µL de Tryptone Sel.

Impact sur les animaux

Les infections à Salmonella chez les volailles passent généralement inaperçues. Principalement asymptomatiques, elles peuvent provoquer parfois une réduction des performances de ponte chez les poules, une perte d’appétit, de la prostration et des diarrhées liquides. Les salmonelles se multiplient dans le tube digestif des oiseaux et peuvent être excrétées en grande quantité dans les déjections. Toutefois, les souches de S. Typhimurium et S. Senftenberg utilisées dans cette étude ont déjà fait l’objet d’essais in vivo et aucun effet indésirable n’a été observé. Il n’est pas attendu d’effet indésirable tout au long de cet essai. La souche de B. fragilis utilisée est considéré comme un probiotique. Toutefois, l’apport d’une solution de probiotiques ou de tryptone sel, par voie orale, tous les 2 jours peut conduire à une situation de stress pour les poulets de chair.

Devenir

Les prélèvements de caeca nécessitent la mise à mort des animaux.

Remplacement

La volaille et notamment le poulet de chair représente une source importante de salmonellose pour l’Homme. Ainsi, il est nécessaire de contribuer au développement d’un moyen de lutte contre Salmonella dans la filière avicole afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Salmonella. Des essais préliminaires, réalisés in vitro sur des cellules humaines, montrent un effet bénéfique de B. fragilis en inhibant le passage de Salmonella au travers de la muqueuse intestinale. Toutefois, ces essais ont été réalisés en présence de cellules humaines en absence de lignée cellulaire intestinale de poulet disponible. Il est par conséquent necessaire de valider ses résultats lors d’un essai sur le poulet de chair. Cette validation nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo afin de réduire par la suite le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. En raison de la variabilité interindividuelle importante des niveaux de colonisation par les bactéries étudiées et de la variabilité du microbiote au cours du temps, il a été déterminé qu’un minimum de 10 animaux par groupe (8) était nécessaire pour chaque temps donné (5) afin d’assurer la robustesse des tests statistiques. Ainsi, 405 animaux seront nécessaires à cette étude (5 animaux seront utilisés au début de l’étude pour vérifier l’absence de contamination par Salmonella et 400 pour observer l'effet de B. Fragilis sur la contamination par Salmonella).

Raffinement

L’inoculation des bactéries à la pipette par voie orale et les pesées seront réalisées par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Bien qu'aucun effet indésirable ne soit attendu au cours de cet essai, les animaux seront observés quotidiennement. Le raffinement des conditions d’hébergement vise à assurer l’inconfort des animaux. Les paramètres d’ambiance utilisés en animaleries sont ceux préconisés pour les élevages de poulets de chair. Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol sur une litière composée de copeaux de bois (qui servira d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). De plus, des alvéoles en carton seront disposés sur les copeaux de bois avec de l’aliment et des cartons seront apposés sous les mangeoires afin de stimuler les poussins à s’alimenter dans leurs premières heures de vie. Tout au long de l'essai, les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment spécifique à leur âge et leur espèce.

Choix des espèces

Les salmonelloses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. Ce projet à pour pbjectif de développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage afin de réduire la charge qui arrive sur la chaine alimentaire. Par conséquent, le poulet de chair est l’espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 34 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation). Le but est de suivre l’effet de l’ajout du probiotique B. fragilis sur la colonisation de Salmonella, la modulation du microbiote et l’influence sur des marqueurs de l’immunité.

600 anguilles vont être utilisées puis relâchées près de leur lieu de capture, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturées par pêche électrique, elles reçoivent sous anesthésie une puce RFID implantée chirurgicalement, pour suivre leur comportement migratoire. Le porteur indique que la pêche électrique peut provoquer des blessures spinales et une gêne cardiorespiratoire, et le marquage un saignement et une douleur post-opératoires brefs. Il justifie l'étude par la protection d'une espèce en "danger critique d'extinction", dont la migration reste mal connue.

Objectifs

L'approche RFID vise à étudier le comportement migratoire des anguilles (Anguilla anguilla) de Méditerranée. L'objectif est d'identifer les facteurs environnementaux qui stimulent cette migration, ainsi que le périodes clefs où elle est susceptible de survenir. Ces connaissances permettront de prendre des mesures de gestions plus efficaces pour protéger cette espèce en "Danger critique d'extinction".

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance du comportement de migration permettra de mieux identifer les périodes clefs où elle survient, et quels sont les paramètres qui la déclenchent. Une mortalité importante des futurs géniteurs de cette espèce est observée lors de cette migration, en particulier lors du passage par les turbines d'ouvrages hydroélectiques. L'identification de périodes clefs de migration permettra donc aux exploitants d'adapter efficacement leur gestion en période critique de migration.

Procédures

Capture par pêche électrique de tous les individus (environ 20-30 minutes), puis sédation/anesthésie profonde (5-10 minutes), puis Intervention chirurgicale avec implantation d'une puce RFID 23 mm (environ 1 minute), suivi d’un réveil et de la remise en contact avec les congénères dans un bac de stabulation (environ 1h30 en observation).

Impact sur les animaux

Nuisances induites classiquement par la pêche électrique sur les espèces piscicoles : blessures spinales / infleunce sur le rythme cardique et respiratoire / stress et changement de comportement. Nuisance induite par l'anesthésie et la biométrie : stress des individus Nuisance induite par le marquage : saignement léger lors de l'incision, stress et douleur/gêne post-opératoire de courte durée (le poisson retrouve très rapidement un comportement de nage normal).

Devenir

Toutes les anguilles capturées sont relachées dans le milieu naturel, à proximité immédiate de leur lieu de capture.

Remplacement

L'étude vise à étudier le comportement d'individus sauvage dans leur milieu naturel. De plus, l'Anguille est le seul migrateur amphihalin à se reproduire en mer. Il n'est donc pas possible de remplacer cette espèce par une autre ou de trouver un substitut.

Réduction

Le marquage a été à un total de 600 individus sur la durée du projet. Cette approche permet de limiter l'impact sur le milieu, tout en assurant un nombre d'individus suffisant pour que les résultats soient exploitables sur le plan scientifique.

Raffinement

Avant et après le marquage, de l'enrichissement est proposé aux animaux pour limiter leur stress durant leur stabulation (blocs pour se cacher, recouvrement des bacs pour un maintien dans l'obscurité).

Choix des espèces

L'anguille européenne est un migrateur amphihalin dont les modalités de reproduction sont mal connues. En Méditerranée, le déclenchement du comportement migratoire de cette espèce vers son aire de reproduction est mal connu. Les anguilles marquées sont des "anguilles jaunes" (stades FI, FII), des anguilles jaunes en cours de métamorphose (stades FIII, FIV), et des anguilles argentées (Stades FV (femelles) / MD (mâles)) Tous ces stades sont des morphotypes plus ou moins agés, qui appartiennet à la même espèce : Anguilla anguilla.

90 mulets sauvages, de deux espèces, vont être utilisés puis relâchés sur leur lieu de capture, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pêchés en milieu naturel, ils sont marqués d'une puce sous anesthésie puis soumis à des tests de nage en courant, de prise de risque face à un prédateur et d'exploration en labyrinthe. Le porteur indique que les manipulations peuvent entraîner une perte d'écailles et un risque d'infection, limités par l'anesthésie. Il justifie le recours à l'animal par l'étude du comportement d'individus sauvages, qu'aucun modèle ne pourrait selon lui prédire.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de comprendre comment la variabilité comportementale individuelle impacte la structure de groupe, qu’elle corresponde à une agrégation c’est à-dire un regroupement d’individus sans organisation de nage précise ou à un banc qui correspond à un groupe hautement polarisé, chez les mulets. Les différentes espèces de mulets métropolitaines se répartissent largement sur les espaces côtiers, habitats les plus propices à leur régime alimentaire de type limnivore (se nourrissant à partir de matières organiques présentes dans la vase). Ce sont les dernières espèces migratrices de l’eau salée à l’eau douce à l’instar du saumon atlantique, de l’anguille européenne, des aloses et des lamproies, dont le statut de conservation n’est pas encore dégradé. Une meilleure compréhension de leurs stratégies de déplacement apparaît particulièrement pertinente pour expliquer leur résilience. L’objectif de cette étude est donc basé sur l’existence d’une variabilité dans la structure de groupe chez deux espèces proches Chelon ramada (mulet porc) et Chelon labrosus (mulet lippu) pouvant se déplacer en groupe mono- et plurispécifiques. Après avoir étudié les capacités métaboliques de ces deux espèces lors de notre expérimentation précédente, cette nouvelle étude aura pour but de poursuivre l’exploration des mécanismes proximaux pouvant expliquer ces structures de groupe différentes : la variabilité comportementale interindividuelle. L’expérimentation se fera sur des poissons issus du milieu naturel et durera trois mois. A l’issu de l’expérimentation les poissons seront relâchés sur le lieu de capture. A l’heure actuelle, le Chelon ramada est intégré dans les plans d’actions de gestion des poissons migrateurs en raison du manque de connaissances biologiques et écologique de cette espèce. Ce projet apportera des informations essentielles sur la biologie de ces deux espèces afin de prévenir une baisse future des stocks déjà observable à l’heure actuelle chez toutes les autres espèces migratrices.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettrait d’obtenir pour la première fois des données sur l’impact de la variabilité comportementale interindividuelle sur la structure de groupe chez les juvéniles de mulets. Fort de notre précédente expérimentation, nous savons que la structure de groupe entre Chelon ramada et Chelon labrosus est différente et par conséquent nous pourrons caractériser le niveau d’implication de la personnalité dans les différentes réponses comportementales observées à l’échelle du groupe. Très longtemps négligée, car difficile à étudier, la variabilité interindividuelle est au cœur de la structure d’un groupe. En effet, nous pourrions prédire qu’une agrégation laisserait davantage les personnalités individuelles s’exprimer tandis que le banc amènerait à une décision collective. De plus, une perturbation extérieure telle que la présence d’un prédateur pourrait modifier la structure de groupe. Par conséquent, ces résultats ouvriraient de nouvelles perspectives d’étude afin d’aller plus loin dans la compréhension de la biologie de ces deux espèces de mulets et de l’étendre à d’autres espèces migratrices particulièrement menacées.

Procédures

Les poissons seront pêchés au verveux (filet pliant en forme de longue nasse en entonnoir posé sur le fond) ou à la seine (filet encerclant et trainant à la surface) en milieu naturel puis transportés dans des viviers de 500 L contenant l’eau du milieu naturel et oxygénée à l’aide d’un bulleur jusqu’à l’animalerie. A leur arrivée, une acclimatation par remplacement progressif de l’eau (500 L en 2h) du milieu naturel par l’eau des bassins sera effectué. Une fois acclimaté, les poissons seront installés dans les bassins. Les poissons seront marqués une fois avec une puce permettant l’identification individuelle à l’aide d’un lecteur. Chaque mois pendant trois mois, les poissons seront pêchés à l’aide d’une épuisette à fine maille afin de réaliser des contrôles de croissance. Le marquage et le contrôle de croissance nécessitant une sortie de l’eau, les poissons seront anesthésiés dans un bain de sédatif. Les poissons seront soumis à une procédure consistant à quatre tests. Ils passeront tout d’abord dans un canal avec du courant par groupe de dix poissons afin de mesurer la structure de chaque groupe pendant 10 minutes, puis ils seront confrontés à un test de prise de risque où les poissons par groupe de dix seront placés dans une boîte noire puis il leur sera laissé la possibilité de sortir dans une zone lumineuse pendant 15 minutes en présence ou non d’un prédateur (bar, Dicentrarchus labrax) et enfin chaque poisson, individuellement sera passé dans un labyrinthe pendant 15 minutes afin de mesurer ses capacités exploratoires et son audace. Enfin, en fin d’expérimentation, les poissons seront relâchés en milieu naturel. Ils seront donc pêchés des bassins, placés dans des viviers de 500 L, amenés sur sites, acclimatés à l’eau du milieu naturel (remplacement de 500 L en 2h) puis libérés dans le milieu.

Impact sur les animaux

Lors de la pêche et du transport des animaux, la phase critique correspond au changement de milieu (du milieu naturel vers les bassins) dû aux modifications des paramètres physico-chimiques de l’eau. Pour éviter ces problèmes, d’après les expérimentations précédentes sur ces espèces dans notre laboratoire, une acclimatation avec un remplacement progressif de l’eau permet une habituation douce et ainsi d’avoir 100 % de survie. Le transport ne pose aucun problème, aucune mortalité n’a été observée chez ces deux espèces. Fort de nos expérimentations précédentes sur ces deux espèces, nous ne prévoyons aucun problème une fois les animaux mis en élevage dans l’animalerie. Toutefois, il est envisageable qu’un individu refuse de s’alimenter entrainant une perte de poids. Les mulets étant des individus vivant dans des zones turbides, la mise à disposition de refuges dans les bacs limitera le stress et les comportements anormaux (fuites rapides à l’approche d’une personne). Concernant le marquage individuel, nous avons 100 % de réussite, n’entrainant aucune infection ni aucune mort. Enfin, nous pouvons envisager que certains individus puissent développer une maladie due à la perte d’écailles liée aux manipulations. Afin de limiter la perte d’écailles les poissons sont toujours manipulés à l’aide d’une épuisette à fine maille et pour des manipulations plus invasives, comme les contrôles de croissance nécessitant une sortie de l’eau, les poissons sont anesthésiés. D’après notre expérience, l’anesthésie permet de limiter la perte d’écailles et donc d’éviter les infections.

Devenir

Tous les animaux seront remis en liberté avec une acclimatation progressive à l’eau du milieu naturelle. Le suivi après la relâche ne sera pas possible car très rapidement les poissons plongent en profondeur et donc ne sont plus visibles en surface.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant d’étudier le comportement d’une espèce de Téléostéens il n’est pas possible de remplacer les animaux prévus pour cette expérimentation. Il est donc nécessaire de recourir à des animaux. De plus, il est impossible de modéliser ce comportement car c’est un comportement individuel sur une question qui n’a jamais été posée et par conséquent aucun modèle ne pourra permettre de prédire ce qu’il va se passer.

Réduction

90 mulets porc et lippu (45 Chelon ramada et 45 Chelon labrosus) pour pouvoir tester 9 groupes composés d’espèces (mono- ou plurispécifique) différentes : 3 x (5 Chelon ramada + 5 Chelon labrosus) ; 3 x (10 Chelon labrosus) ; 3 x (10 Chelon ramada). Un groupe est composé de 10 poissons. Le nombre de poissons testés est le minimum pour obtenir des statistiques viables (modèle linéaire réalisé sur le logiciel R permettant d’étudier les interactions statistiques sur le comportement des individus testés) concernant la structure du groupe ainsi que de la composition mono- ou pluri- spécifique. Des tests de puissance préliminaires ont été réalisés permettant de démontrer que l’effectif (n = 90) permettra d’obtenir une réponse précise sur les questions posées dans ce projet. Les triplicats permettent de rendre compte de la variabilité interindividuelle existante au sein des groupes tout en obtenant une moyenne au plus proche de la réalité.

Raffinement

Les mulets étant des individus vivant dans des zones turbides, la mise à disposition de refuges dans les bacs limitera le stress et les comportements anormaux (fuites rapides à l’approche d’une personne). La distribution de la nourriture par un distributeur d’aliment automatique permet d’éviter le stress des poissons lié à la présence d’une personne au-dessus du bassin pendant la prise alimentaire. Chaque jour, une personne sera en charge de vérifier le comportement des poissons (en dehors des périodes de nourrissage). La qualité de l’eau, c’est-à-dire les paramètres physico-chimique (température, salinité, oxygène, nitrite, ammonium, nitrate) seront mesurés une fois par semaine. En cas de mauvaise qualité d’eau (par exemple une concentration de nitrites supérieure à 0,02 mg /L), un changement d’eau sera effectué puis une mesure deux jours après sera reprise pour s’assurer que les poissons sont dans un environnement stable. Le transport de la zone d’élevage à la zone expérimentale (canal hydrodynamique et labyrinthe) sera effectué dans des bacs couverts permettant de placer les individus dans le noir limitant le stress de ces poissons lors du transport. Par ailleurs, entre chaque procédure, une phase de repos (une semaine) sera mise en place. Enfin, l’anesthésie dans un bain de sédatif lors du marquage et des mesures de croissance permettra de limiter tout stress et a montré précédemment, après le réveil, qu’il n’y a aucun comportement de nage anormal et que les individus ont un comportement normal 15 minutes après et un retour à l’alimentation 24h après.

Choix des espèces

Les deux espèces choisies sont : le mulet porc, Chelon ramada et le mulet lippu Chelon labrosus à des stades de juvéniles. Les différentes espèces de mulets métropolitaines se répartissent largement sur les espaces côtiers, habitats les plus propices à leur régime alimentaire de type limnivore. Ce sont les dernières espèces migratrices de l’eau salée vers l’eau douce à l’instar du saumon atlantique, de l’anguille européenne, des aloses et des lamproies, dont le statut de conservation n’est pas encore dégradé. Une meilleure compréhension de leurs stratégies de déplacement apparaît particulièrement pertinente pour expliquer leur résilience. Plusieurs espèces de mulets sont intégrées dans les plans d’actions de gestion des poissons migrateurs en raison du manque de connaissances biologiques et écologique de ces espèces. Ce projet vise à enrichir les connaissances de ces deux espèces et particulièrement l’impact du comportement individuel sur la formation de groupe, présent lors de la migration mer-estuaire. Les mulets utilisés dans cette expérimentation seront des juvéniles. Les mulets sont des espèces à l’âge adulte qui sont très stressées par les manipulations et qui ont besoin d’un espace suffisant pour pouvoir exprimer un répertoire comportemental dit normal. Nous sommes limités en termes d’espace avec les bassins à la station. Le comportement de groupe se met en place très tôt chez ces deux espèces. Il est donc possible de faire cette expérimentation sur des juvéniles. D’un point de vue scientifique et pratique (en termes de manipulation), les juvéniles de mulets apparaissent donc comme le modèle biologique idéal pour répondre aux questions posées.

Les 225 souris utilisées sont des souris NSG, immunodéficientes, qui tolèrent la greffe de cellules humaines. Elles reçoivent par la veine de la queue, éveillées, des cellules cancéreuses stimulées ou non par des vésicules issues de cellules métastatiques, puis passent jusqu'à 20 séances d'imagerie par bioluminescence d'environ 20 minutes. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, les souris pouvant développer tumeurs et micrométastases, et toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour l'analyse post-mortem de leurs organes. Les tests in vitro menés en amont montrent déjà, selon le porteur, le rôle de ces vésicules dans le potentiel métastatique des cellules de cancer du sein, et il conclut : "Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal."

Objectifs

Les métastases sont responsables de 90% des causes de décès lié au cancer selon l’OMS, et représente un problème majeur de santé publique. En effet, le mécanisme de formation des métastases est très complexe et il n’existe actuellement aucun traitement. La compréhension du mécanisme de formation des métastases constitue donc un enjeu majeur pour identifier de nouvelles cibles et axes thérapeutiques. L’objectif de ce projet vise à comprendre l’impact de vésicules extracellulaires produites par des cellules agressives métastatiques sur la capacité à former des métastases de cellules moins invasives (qui potentialiseraient le pouvoir métastatique des cellules moins invasives). Ce projet implique l’injection de cellules cancéreuses chez la souris afin de pouvoir suivre la formation de micrométastases en réponse à la stimulation aux vésicules extracellulaires ou non. Nous avons montré un effet significatif de ces vésicules extracellulaires sur l’augmentation des capacités invasives in vitro. La présence de ces vésicules dans un modèle in vitro 3D a également été confirmée. Les expériences in vivo nous permettrons de tenir compte de l’environnement complexe de la tumeur intégrée dans un organisme entier. Seules les expériences in vivo nous permettront de valider notre hypothèse.

Bénéfices attendus

A la fin du projet, ces résultats nous permettront de valider que ces vésicules sont impliquées dans la formation de métastases. A des fins thérapeutiques, ces vésicules pourront par la suite être ciblées par des traitements visant à réduire la formation de métastases aujourd’hui largement responsable de la gravité des cancers et des rechutes. Grâce à cette étude, nous pourrons apporter des bénéfices sur la meilleure compréhension des cellules à former des métastases mais aussi une nouvelle cible thérapeutique pour espérer mieux soigner les patients à terme.

Procédures

Greffe par voie caudale sur animaux vigiles (une fois par procédure, moins de 5 minutes) Imagerie par bioluminescence ( 1 à 2 fois par semaine ou tous les 15 jours en fonction de la procédure et en fonction du développement tumoral obtenu soit au plus 20 fois -durée de la séance d'imagerie : environ 20 minutes)

Impact sur les animaux

Les souris pourront développer des tumeurs et des micrométastases. Des points limites suffisament précoces ont été établis pour limiter ces nuisances au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser l'analyse post-mortem des différents organes qui présenteront des micrométastases.

Remplacement

Tous les tests cellulaires in vitro réalisés en amont de cette étude montrent le rôle important de ces vésicules dans la tumorigénicité des cellules de cancer du sein et notamment dans le potentiel métastatique. Cependant, les tumeurs sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal.

Réduction

Une expérience pilote nous permettra de déterminer le nombre nécessaire et suffisant à la greffe tumorale. Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. La croissance tumorale sera suivie de manière longitudinale tout au long de l'expérience notamment grâce l’expression de la luciférase dans nos cellules, système très sensible qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter lots avec 50% d’écart type intra lot est de 10, les expériences seront réalisées en duplicat et des tests statistiques seront effectués.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, mesure hebdomadaire du poids des souris et du volume tumoral, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt). Les cellules greffées exprimeront la luciférase ce qui permettra de détecter l’apparition de cellules tumorales très précocement permettant ainsi d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide.

Choix des espèces

Nous avons choisi de réaliser nos expériences sur des souris immunodéficientes, en particulier sur des souris NSG, qui permettent la greffe de cellules humaines Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une laparotomie d'environ deux heures sous anesthésie, des injections d'antibiotique et une inoculation d'Enterococcus faecalis, avant d'être tué pour prélèvements. Le porteur indique que les douleurs post-opératoires constituent l'effet indésirable majeur et prévoit une analgésie associée. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne peut remplacer ce modèle intégrant le dialogue entre microbiote, organisme et pathogène.

Objectifs

Le microbiote intestinal forme un écosystème en équilibre composé de plusieurs milliards de bactéries représentant des milliers d’espèces. Si son effet bénéfique en santé humaine a été démontrée, il est également considéré comme un réservoir de pathogènes opportunistes souvent résistants aux antibiotiques. Par exemple, les entérocoques sont des bactéries inoffensives du tractus digestif de l'homme et des animaux. Bien qu’habituellement inoffensives chez l'homme en bonne santé, certaines souches de Enterococcus faecalis en particulier celles résistantes à la vancomycine sont à l'origine d'infections opportunistes chez des patients fragilisés. Nous cherchons à comprendre les mécanismes qui permettent à E. faecalis de proliférer au niveau intestinal et de disséminer dans l’organisme après avoir franchi la barrière intestinale. L’ensemble de ces recherches vise à générer des connaissances pour développer de nouvelles stratégies pour contrôler les agents pathogènes multi-résistants. E. faecalis est une bactérie qui possède autour d’elle une enveloppe constituée d'une membrane et d'une épaisse paroi. Le peptidoglycane (PG) est un composant majeur de cette paroi bactérienne. Le métabolisme du PG joue un rôle crucial dans la structure et la forme de la cellule bactérienne, et la résistance aux antibiotiques et aux anti-microbiens. La formation du PG et son renouvellement au cours de la vie de la bactérie nécessite des enzymes spécifiques c’est-à-dire des protéines dont le rôle est de réaliser des réactions chimiques assurant la synthèse et le recyclage du PG. L’objet de cette demande vise à comparer la susceptibilité de E. faecalis à des antibiotiques ciblant la paroi au moment de sa prolifération intestinale. Afin de comprendre les mécanismes de résistance aux antibiotiques, plusieurs souches de E. faecalis seront testées en fonction de leur capacité à synthétiser ou recycler leur paroi. Enfin, nous testerons si la présence d’un autre type d’anti-microbien dirigé contre E. faecalis peut augmenter l’effet des antibiotiques. Ces travaux permettront de mieux comprendre la sensibilité de E. faecalis aux agents anti-microbiens qui ciblent le PG et les mécanismes de résistance qui y sont associés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettta de produire de nouvelles connaissances fondamentales sur une voie métabolique essentielle et partagée par plusieurs espèces bactériennes dont des espèces pathogènes. Les résultats générés permettront d'améliorer notre compréhension globale de la synthèse de la paroi bactérienne, une cible courante des antibiotiques que nous consommons et pour lequels des résistances apparaissent au cours du temps. Nous apporterons de nouveaux éléments pour le développement de stratégies antibactériennes innovantes, comme celles visant à potentialiser l’action d’un antibiotique par une autre molécule présentant une activité anti microbienne comme les bactériocines. Ceci est d’un intérêt majeur dans la mesure où les médicaments ciblant la biogénèse des parois bactériennes sont parmi les antibiotiques les plus efficaces. Ce projet représente donc un fort potentiel pour leur exploitation ultérieure dans des stratégies antibactériennes, telles que le ciblage des enzymes impliquées dans la synthèse et le recyclage de l’enveloppe des bactéries.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à environ 2h de chirurgie et à 24h de soins post-opératoires. Ils seronts mis à jeun la nuit précédent l’intervention chirurgicale. Ces interventions nécessiteront de réaliser sur le même animal et sur tous les animaux mentionnés dans la demande : - Des Injections sur animaux vigiles o 3 fois un antibiotique, 1 fois par jour, 3 jours consécutifs o 1 fois un analgésique le jour de la chirurgie avant l’anesthésie o 1 fois pour l’anesthésie généréale o 1 fois un analgésique en fin de journée pour prévenir les douleurs post-opératoires o 1 fois d’une solution saline pour la réhydradation - Une Laparotomie sous anesthésie générale pendant 2h

Impact sur les animaux

L’inoculation par E. faecalis ne sera pas à l’origine de symptômes sévères car nous utiliserons des doses faibles de E. faecalis bien tolérés par les souris. L’absence d’effets indésirables sera néanmoins contrôlée au cours de l’expérience. Le poids, le poil ébouriffé (ou hérissé), les yeux clos, la léthargie et le dos courbé seront surveillés comme des indicateurs d’effets indésirables. L’utilisation d’un antibiotique pendant 3 jours pourra générer un inconfort digestif qui disparaitra après l’arrêt du traitement. Les effets indésirables de l’anesthésie sont l’hypothermie et l’abolition des reflexes comme pour avaler ou cligner des yeux. Les effets indésirables majeurs sont les douleurs post-opératoires. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et avec une analgésie associée pour limiter les douleurs et souffrances pré et postopératoires.

Devenir

Les souris seront mises à mort à l’issue des protocoles pour des prélèvements d’échantillons en raison de leur infection par un agent pathogène.

Remplacement

Les approches expérimentales chez la souris permettent d’intégrer la complexité des interactions entre le microbiote intestinal, l’organisme et le pathogène. A ce jour, aucune approche in vitro n’est disponible pour remplacer ce type de modèle et « mimer » ces interactions complexes. En effet, les approches in vitro bien que complémentaires ne peuvent pas remplacer un modèle intégrant des interactions in vivo. L’utilisation d’animaux vivants est par conséquent un outil essentiel à la caractérisation des mécanismes pour la découverte de nouveaux antimicrobiens.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux euthanasiés nous porterons une attention particulière à la reproductibilité des expériences. Nous réaliserons des expériences préliminaires pour déterminer les concentrations optimales des molécules d’intérêt. Nous veillerons également à diminuer le nombre de groupes contrôles en comparant plusieurs mutants pour une seule souche sauvage. Pour calculer le nombre d’individus à utiliser par groupe, nous avons estimé sur la base de nos précédents travaux que le nombre total d’animaux par groupe nécessaire est égale à 15 pour obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées en petit nombre, ne seront pas soumises à de longues périodes de jeûne pendant la durée de l’expérience. Une évaluation préopératoire pour contrôler le bon état général de l’animal sera réalisée avant la chirurgie. Seuls les animaux en parfait état de santé seront utilisés. Une prémédication avec un dérivé morphinique sera effectuée pour réduire le stress des animaux, faciliter leur contention et potentialer l’effet des anesthésiques. Les 4 qualités requises pour une anesthésie générale (narcose, analgésie, myorelaxation et sécurité) seront respectées. Un anesthésique local sera utilisé au site d’incision pendant la chirurgie et un anti-inflammatoire sera utilisé pour prévenir les douleurs post-opératoires pendant la nuit. Une solution saline sera aussi utilisée pendant le temps de la chirurgie pour prévenir l’assèchement des tissus. Pour palier les effets négatifs de l’anesthésie : i) les souris seront maintenues sur un matelas chauffant ii) leurs yeux seront protégés de la dessiccation par l’application d’une compresse imbibée d’eau, iii) un fluide de remplacement sera injecté pour palier les pertes de fluide pendant l’intervention, iv) un environnement calme et un approvisionnement en nourriture molle sera proposé pendant les 24h qui suivront la procédure chirurgicale. Un matelas chauffant sera aussi utilisé pour lutter contre l’hypothermie pendant la phase de réveil. Pour la surveillance post-opératoire, un personne responsable bien-être veillera à ce que toutes les souris se réveillent. L’aire de réveil sera confortable dans une zone calme et sombre. Puis les souris réveillées seront remises au fur et à mesure dans leur cage d’origine sur une litière propre. Le milieu sera enrichi avec des « maisons » en carton et du sopalin. Enfin, pour prévenir les douleurs post-opératoires, les animaux seront médicamentés avec un anti-inflammatoire non stéroidien sous réserve de l’absence d’interaction potentielle avec l’infection par E. faecalis.

Choix des espèces

Le modèle murin présente, en plus de qualités propres en terme d'expérimentation, plusieurs avantages pour l’étude des infections par des bactéries pathogènes car les pathologies sont similaires à celles que l’on peut observer chez l’homme. E. faecalis est capable de coloniser le tractus gastro-intestinal des souris, de proliférer et de disséminer via la circulation sanguine à la suite d’une dysbiose post-antibiotique comme cela est observé chez l’homme. Notre organisme modèle est un pathogène opportuniste issu du microbiote intestinal. Des modulations du microbiote intestinal des souris femelles peuvent se produire au cours de leur cycle menstruel. Afin de limiter ce facteur potentiel de variation, nous utiliserons des souris mâles pour les expérimentations. Dans cette étude conformément à nos travaux antérieurs, des souris « jeunes adultes mâles » âgées au minimum de 8-10 semaines seront donc utilisées. Leur poids devra être supérieur ou égal à 18 g.

5 940 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie sert à créer des lignées génétiquement modifiées, l'autre subit des variations rapides de température, de salinité, de pH ou d'oxygène, ou la destruction de neurones par un antibiotique. Le porteur indique que ces modifications peuvent altérer la croissance ou la reproduction, et que les reproducteurs sont tués à deux ans quand leurs capacités déclinent. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité d'étudier un "organisme entier", ce système caudal n'ayant selon lui pas d'équivalent chez les mammifères.

Objectifs

Notre projet est d’étudier les fonctions d’un organe neuroendocrinien situé dans la queue du poisson et appelé système neurosécréteur caudal. Ce système est formé de neurones situés à l’extrémité caudale de la moelle épinière des poissons. Ces cellules produisent différentes hormones qui sont libérées dans la circulation sanguine. Sans doute parce que ce système ne semble pas avoir d’équivalent chez les mammifères, ses fonctions restent très peu connues. Les quelques études disponibles suggèrent une implication dans l’adaptation des poissons aux variations de certains paramètres de leur environnement (température de l’eau, salinité, pH, niveau d’oxygène dissous). Pour notre projet, nous allons utiliser l’organisme modèle poisson-zèbre (Danio rerio). Nos objectifs sont de : 1) Décrire précisément comment ce système est organisé et se met en place au cours du développement du poisson. 2) Déterminer précisément les fonctions de ce système. En particulier, nous allons chercher à identifier quelles hormones sont produites par ce système lorsque le poisson fait face à des variations de son environnement. Puis, nous testerons l’importance de ces hormones dans la réponse physiologique du poisson à ces variations de l’environnement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre le développement et les fonctions du système neurosécréteur caudal, un organe peu connu des poissons. Les quelques données disponibles suggèrent que cet organe est impliqué dans l’adaptation physiologique des poissons aux variations de leur environnement. Les poissons représentent non seulement une part importante de la diversité des vertébrés mais aussi un élément essentiel pour la biodiversité des écosystèmes aquatiques ainsi qu’une source de nourriture importante pour l’humanité. Les changements climatiques liés à l’activité humaine vont impacter particulièrement les environnements aquatiques en affectant notamment la salinité, le pH, l’oxygène et la température et vont impacter l’ensemble des composantes de ces écosystèmes, en particulier les poissons. Nous pensons que mieux comprendre la physiologie de ces animaux, notamment leurs mécanismes d’adaptation à des variations environnementales, sera utile pour comprendre et anticiper l’influence de ces bouleversements climatiques sur ces animaux. Ceci devrait avoir des implications pour définir les stratégies pour la préservation de ces animaux et de ces écosystèmes ainsi que pour l’élevage et l’aquaculture.

Procédures

Quatre types d’interventions sont utilisés dans ce projet : 1. Création de lignée d’animaux génétiquement modifiés. Des œufs sont obtenus par accouplement naturel de poisson-zèbre reproducteurs élevés et maintenus au laboratoire dans une animalerie confinée et agrémentée. Ces œufs sont injectés à l’aide d’une micro-aiguille contenant les éléments permettant l’ajout d’un gène ou l’introduction d’une mutation inactivant un gène). Les animaux issus de ces œufs sont élevés et utilisés comme reproducteurs. 2. Production d’animaux dépourvus de certaines hormones ou du récepteur à ces hormones. Des reproducteurs génétiquement modifiés sont utilisés pour produire des poisson-zèbre dont le gène permettant la production d’une hormone d’intérêt, ou son récepteur, est inactivé et qui sont donc incapables de les produire. 3. Des expériences consistant à faire subir à des poissons des variations d’un paramètre de l’eau (température, salinité, pH ou niveau d’oxygène dissous). Ces variations sont contenues dans des gammes que l’animal peut rencontrer dans son environnement naturel et durent de quelques heures à quelques jours. 4. Suppressions neurones du système neurosécréteur caudal. Des poissons génétiquement modifiés, dont les neurones du système neurosécréteur caudal sont sensibles à un antibiotique, sont traités avec cet antibiotique ce qui entraîne la mort de ces cellules.

Impact sur les animaux

- La création de lignée OGM est généralement sans effet car les modifications du génomes obtenues sont maintenu à l’état hétérozygote (un seul des deux chromosomes parentaux est affecté). Néanmoins, elle est susceptible d’entraîner des malformations congénitales non souhaitées. De telles malformations sont détectées dès les stades embryonnaires et seuls des animaux ne présentant pas de malformation sont mis en élevage. - Les expériences de variations rapides des paramètres de l’eau sont susceptibles d’entraîner un stress ponctuel des animaux, mais ces variations étant contenues dans des gammes proches de celles pouvant être rencontrées dans le milieu naturel, les stress induits devraient être modérés. - L’inactivation des gènes codant pour les hormones produites par les neurones du système neurosécréteur caudal ou de leurs récepteurs, et la suppression de ces cellules, pourraient entraîner des modifications de la physiologie des animaux engendrant une modification de leur croissance ou de leur capacité à se reproduire. Cela devrait également impacter leurs capacités à s’adapter à des variations des paramètres de l’eau, et pourrait entraîner des stress plus forts ou prolongés lors des challenges.

Devenir

Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Ces animaux sont euthanasiés à 2 ans, car à cet âge les capacités de reproduction diminuent fortement. Dans le cadre des challenges et de la production d’animaux dépourvus de SNSC ou de certaines hormones et récepteurs, les animaux sont euthanasiés à l’issu du challenge pour pouvoir prélever les différents tissus qui feront l’objet d’analyses histologique et moléculaire.

Remplacement

Les processus développementaux et physiologiques tel que ceux étudiés dans ce projet sont complexes et impliquent des interactions entre différents organes et parties du corps. Pour étudier ces processus, il est nécessaire de recourir à des organismes entiers. Des alternatives ont été envisagées, notamment la culture in vitro des neurones du système neurosécréteur caudal étudiés. Néanmoins, l’objectif de ce projet et de pouvoir étudier les fonctions des hormones produites par ces neurones sur l’organisme ce qui n’est pas possible avec les alternatives envisagées.

Réduction

Une partie des animaux utilisés dans ce projet permettra la création de lignées génétiquement modifiées et l’autre partie subira des challenges (variations rapides des paramètres de l’eau) afin de déterminer le rôle du système neurosécréteur caudal et des hormones qu’il produit. Le nombre d’animaux envisagé pour la création des lignées génétiquement modifiées est basé sur notre expérience de ce type d’approche. L’optimisation des protocoles nous permet d’utiliser le moins d’animaux possible. En particulier l’utilisation d’un marqueur visible nous permet de sélectionner les œufs porteurs d’un transgène d’intérêt. Pour notre projet, 16 lignées génétiquement modifiés seront nécessaires. Pour chacune, 50 animaux seront utilisés. Ce nombre est nécessaire et suffisant pour garantir l’obtention des lignées souhaitées. Pour les expériences de variations des paramètres de l’eau, 10 animaux seront utilisés pour chaque paramètre de l’eau étudié (4 paramètres en tout), à 3 valeurs différentes, pendant 3 durées différentes et à 3 stades différents. Ces expériences seront réalisées sur des animaux sauvages (non génétiquement modifiés) et des animaux génétiquement modifiés. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour pouvoir prélever les tissus d’intérêt afin de réaliser des analyses moléculaire ou histologique. Notre expérience de ce type d’analyse montre qu’un nombre de 10 animaux par condition est nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats qui soient statistiquement significatifs. Pour chaque expérience de variations des paramètres de l’eau, des contrôles adaptés ont été prévus et les données obtenues seront analysées à l’aide de tests statistiques adaptés. De plus, pour chaque animal euthanasié, différents tissus seront prélevés et les échantillons seront conservés afin de pouvoir être utilisés pour différentes analyses sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. D’une façon générale, ce projet a été conçu et organisé de façon à pouvoir, à chaque étape, sélectionner rigoureusement les lignées à produire et les expériences à mettre en œuvre afin de répondre à nos objectifs. Le nombre de lignées et d’expériences prévus, et donc le nombre d’animaux, ont été optimisés afin de répondre au mieux aux objectifs de ce projet, notamment en termes de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans une animalerie confinée et agrémentée, dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Les embryons et larves sont maintenus dans un milieu d’élevage et les adultes dans de l’eau dont les paramètres sont surveillés très régulièrement. Les animaux sont nourris avec de la nourriture sèche pour assurer une croissance optimale ainsi que de la nourriture vivante (larves d’artémia, rotifères) pour permettre un enrichissement du milieu et sont maintenus à une densité adaptée, y compris pendant les expériences de variations des paramètres de l’eau, afin d’éviter tout stress dû à une surpopulation ou un isolement. Pour la création des lignées génétiquement modifiées la sélection des embryons concernés se fait sans avoir recours à des biopsies. De plus, l’observation attentive de ces embryons permet de n’élever que des animaux dépourvus de malformation. Dans le cadre des expériences de variations des paramètres de l’eau et de la production d’animaux dépourvus de système neurosécréteur caudal ou de certaines hormones, les animaux font l’objet d’un suivi particulier (horaire ou quotidien) par du personnel formé afin de surveiller l’éventuelle apparition d’un trouble locomoteur ou comportemental. Des points limites, définis à l’avance, permettent d’interrompre l’expérience de variations des paramètres de l’eau si nécessaire.

Choix des espèces

L’étude dynamique des processus développementaux et physiologiques n’a de sens qu’à l’échelle d’un organisme entier. Ces processus ne peuvent être reproduits totalement in vitro et nécessitent de recourir à des organismes modèles animaux. Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude génétique. Sa relative facilitée d’élevage, son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités d’édition du génome (production de lignées génétiquement modifiées porteuses d’un transgène ou d’une mutation d’intérêt) en font un modèle de choix pour la recherche. Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Les animaux sont donc utilisés de la fécondation jusqu'à l'âge adulte. Les études physiologiques sur les animaux dépourvus de système neurosécréteur caudal ou de certaines hormones seront réalisées sur de jeunes larves (2 semaines), des juvéniles (8-10 semaines) et des adultes (4-6 mois) afin d’en tester l’impact en fonction de l’âge des animaux.

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de cancer colorectal, puis des traitements répétés par voie orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale pendant plusieurs semaines. Le porteur indique que les tumeurs peuvent s'accompagner d'infections cutanées, de plaies ou de nécroses, et prévoit un score clinique déclenchant soulagement ou mise à mort. Il utilise des souris immunodéprimées et affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" au modèle animal pour reproduire le dialogue entre tumeur et environnement.

Objectifs

Le cancer colorectal figure au troisième rang des cancers les plus diagnostiqués dans le monde. Il représente la quatrième cause de décès dont l’incidence continue à augmenter. Malgré l’ampleur de cette pathologie les origines moléculaires de cette maladie restent encore mal comprises. En conséquence, un grand nombre de patients ne peuvent être efficacement soignés. Au cours de la progression tumorale, les cellules cancéreuses acquièrent des propriétés spécifiques, dont la capacité à envahir les tissus environnants pour métastaser vers des sites distants. L’acquisition de ces propriétés malignes reflète des perturbations dans les voies de signalisation cellulaires qui contrôlent la prolifération, la motilité et à la survie cellulaire. Notre recherche vise à comprendre comment la dérégulation de ces voies de siganlisation conduit à l’agressivité des cancers et à découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques asociées. Les modèles souris de greffes sous-cutanées de cellules de cancer colorectaux constituent des outils importants pour étudier et comprendre le développement du cancer colorectal et permettent aussi d’évaluer la réponse tumorale à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Notre programme de recherche qui se déroulera en 5 ans permettra de mieux comprendre le processus relié à la formation des métastases et de proposer de nouvelles thérapies ciblées dans le cancer colorectal.

Procédures

Des greffes sous-cutanées de cellules cancéreuses seront réalisées sur l’ensemble des animaux (une seule injection en sous-cutanée sur souris vigile, durée du geste

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une infection cutanée, des plaies, ou des tumeurs nécrosées. L’examen quotidien des souris permettra également la détection des premiers signes comportementaux liés à la douleur (isolement, absence de mobilité et de réponse aux stimuli, étirements, absence de toilettage, pilo-érection, absence de prise de boisson…). Les signes relatifs à la dégradation de l’apparence physique et aux troubles du comportement seront scorés et des mesures de soulagement ou la mise à mort de l’animal seront envisagées en fonction du score.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement et à l’analyse fine des tumeurs.

Remplacement

Nous utiliserons des modèles in vitro de tumoroïdes issus de cellules en culture pour étudier les effets des protéines étudiées et des traitements proposés dans les cellules épithéliales intestinales. Par contre, Il n’existe pas d’alternative autre que l’utilisation des modèles animaux pour évaluer avec précision et pertinence, le rôle de ces protéines et l’effet de ces traitements dans un contexte mimant la physiopathologie et prenant en compte le dialogue entre les cellules tumorales et l’environnement de la tumeur, notamment avec la matrice extracellulaire et le système immunitaire.

Réduction

Grace aux données de la littérature et à l’utilisation de tests statistiques nous pouvons définir avec précision le nombre de souris suffisant par groupe pour chaque procédure.

Raffinement

Toutes les dispositions ont été prises pour le raffinement les conditions d’expérimentation. Le bien-être animal est évalué quotidiennement. Une attention particulière est portée à la formation de l’expérimentateur afin de limiter la durée de la procédure expérimentale et ainsi réduire la douleur et limiter les variations expérimentales. Une fiche de suivi est établie pour chaque animal de la procédure expérimentale. Les souris seront observées régulièrement et les signes cliniques seront recherchés : perte de poids, isolement, dos vouté… A l’apparition d’un de ces signes, des stratégies seront mises en place pour mettre fin à la douleur et au stress de l’animal.

Choix des espèces

La souris nude immunodéprimée est le modèle utilisé internationalement pour étudier la croissance tumorale des cellules humaines. Ne possédant pas de thymus, elle accepte la greffe de cellules tumorales humaines sans présenter de phénomène de rejet. Les souris immunocompétentes sont un modèle de référence pour étudier la croissance tumorale des cellules murines qui permet de prendre en compte l’implication du système immunitaire de l’hôte. Nous utiliserons des souris de 6-7 semaines, âge où l’on observe une bonne prise de greffe et des femelles, en raison de leur caractère moins agressif entre-individus.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie obstruant complètement le canal biliaire pour induire une fibrose hépatique, puis des injections quotidiennes pendant trois semaines. Le porteur indique des douleurs de laparotomie et des risques d'infection ou de rupture de suture. Il affirme qu'il est impossible de reproduire in vitro les effets de la fibrose hépatique sur l'organisme et retient la souris comme le modèle dont la génétique est la mieux connue.

Objectifs

La fibrose hépatique est définie comme la production et l'accumulation excessive de la matrice extracellulaire (ECM) dans le foie. La fibrose hépatique peut être causée par une multitude de différents stimuli et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la fibrose impliquent un programme très orchestré de changements moléculaires et cellulaires. En particulier, les modifications anatomiques et fonctionnelles de l'intégrité des tissus du foie sont consécutives à l’amplification des signaux inflammatoires. La fibrogènese hépatique est un problème clinique dans le monde entier. L’objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition d’une protéine, impliquée dans le métabolisme des acides gras et libérée par le foie, peut prévenir la fibrose hépatique induite par la cholestase obstructive.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à la fibrose hépatique, qui impact la fonction hépatique et qui est un problème clinique majeur car peut être causée par une multitude de différents stimuli toxiques.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant l'obstruction complète du canal biliaire (durée environ 30 minutes/souris). L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie et analgésie (avec un suivi analgésique post-opératoire de 2 jours). Tous les animaux recevront des injections (quelques secondes) sous-cutanées (animal vigile). L’expérience n’excédera pas 3 semaines (à partir de la chirurgie). Tous les traitements seront administrés par voie intra-péritonéale (au maximum 1 fois par jour, tous les jours, quelques secondes).

Impact sur les animaux

La procédure de ce projet n’excédera pas 3 semaines. Tous les animaux du projet seront soumis à une chirurgie induisant l'obstruction complète du canal biliaire. Aucun autre effet indésirable n’est attendu en dehors de ceux connus et causés par cette induction. Une douleur due à la laparotomie pourra apparaitre chez la souris. Des infections ou des ruptures de sutures pourraient survenir. La fibrose sera induite mais à ce stade les douleurs seront modérées. Le mouvement des souris et leur respiration ne seront pas impactés. Les injections n’induisent pas de douleurs à l’animal autre que la piqûre de l’aiguille et peuvent induire un stress dû à la contention.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la fibrose hépatique vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 600 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour les analyses pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de tapis et lampes chauffantes, ...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris nude immunodéprimées reçoivent une xénogreffe de chondrosarcome humain sous la peau, puis des injections de traitement et des mesures de la tumeur deux fois par semaine pendant douze semaines. Le porteur indique que les cultures cellulaires ne reproduisent pas le microenvironnement tumoral et affirme vouloir confirmer in vivo des molécules déjà repérées in vitro. Le projet vise à repositionner des médicaments contre ce cancer des os rare.

Objectifs

Les chondrosarcomes sont des tumeurs osseuses rares qui produisent une matrice cartilagineuse. Ces tumeurs touchent principalement les adultes et sont potentiellement fatales. Elles sont considérées comme résistantes à la radiothérapie et aux chimiothérapies conventionnelles. De ce fait, leur traitement a peu évolué au cours des 40 dernières années. Il repose sur la chirurgie et peut conduire à l’amputation d’un membre du patient. De plus, les options thérapeutiques sont limitées si la tumeur est localisée dans des zones sensibles non résecables telles que la tête et le cou ou le pelvis, ou si la tumeur métastase. C’est pourquoi il est nécessaire d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients atteints de chondrosarcomes. Nous avons montré in vitro que des molécules ciblant la voie de l’adénosine réduisent la croissance tumorale et induisent la mort par apoptose dans les chondrosarcomes humains. L’objectif de ce projet est d’évaluer les capacités anti-tumorales de quatre de ces molécules ciblant la voie de l’adénosine dans un modèle hétérotopique de chondrosarcome humain chez la souris immunodéprimée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité anti-tumorale de quatre molécules ciblant la voie de l’adénosine dans un modèle animal de chondrosarcome humain. Ainsi, nous identifierons si le ciblage de la voie de l’adénosine pourrait devenir une nouvelle approche thérapeutique pour le chondrosarcome, un cancer des os chimio- et radio-résistant de pronostic potentiellement sévère. Cette information est cruciale pour le développement clinique de cette thérapie qui pourrait à terme améliorer la prise en charge des patients atteints de chondrosarcome.

Procédures

Les gestes suivants seront réalisés sur l’ensemble des animaux (total 288) : - une implantation de xénogreffe en sous-cutané au niveau du flanc (moins de 2 minutes), sous anesthésie générale et analgésie - une mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse (moins de 2 minutes), 2 fois par semaine pendant 12 semaines, sous anesthésie générale - une injection du traitement (la molécule testée ou son véhicule) en intrapéritonéal (moins de 2 minutes), 2 à 4 fois par semaine pendant 12 semaines - un suivi pondéral (pesée, moins de 2 minutes), 2 fois par semaine pendant toute la durée de la procédure (estimée selon notre expérience, à 6 semaines pour le développement tumoral puis 12 semaines de suivi du volume tumoral)

Impact sur les animaux

D’après notre expérience et la littérature, nous ne nous attendons pas à une perte de poids, ni à une gêne lors du déplacement de l’animal, ni à des modifications du comportement, ni à des douleurs spécifiques excepté au moment de l’injection des cellules tumorales. Pour diminuer la douleur, une analgésie sera administrée lors de l’implantation des tumeurs.

Devenir

La procédure est de classe de sévérité modérée, ce qui justifie la mise à mort des animaux à l’issue de la procédure.

Remplacement

Les expériences réalisées in vitro sur des cultures de cellules ne permettent pas de modéliser l’ensemble du micro-environnement cellulaire, connu pour modifier le comportement des cellules et affecter leur réponse aux traitements. C’est pourquoi après avoir mis en évidence in vitro des molécules aux propriétés anti-tumorales, nous souhaitons confirmer ces propriétés in vivo, sur un modèle murin plus proche de la pathologie humaine, afin de faire la preuve de concept de l’efficacité des drogues utilisées en vue de proposer d’éventuels repositionnements de médicaments actuellement utilisés pour le traitement d’autres tumeurs ou maladies.

Réduction

Nous considérons que la molécule testée a un effet anti-tumoral si elle entraine une baisse de volume tumoral d’au moins 20 % en moyenne par rapport au groupe contrôle. Pour cela, le nombre d’animaux par groupe peut être réduit à 12.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux durant toute la durée de la procédure, un suivi individuel et régulier sera effectué afin d’évaluer l’état général des souris. Les implantations de xénogreffes seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Les mesures de volume tumoral seront également réalisées sous anesthésie générale. De plus, si la souris présente une perte de poids importante, les traitements seront arrêtés une à deux semaines le temps que les signes cliniques disparaissent. Si les signes cliniques perdurent, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Afin de permettre l’implantation des xénogreffes et le développement tumoral, des souris immunodéprimées (nude) seront utilisées. Les chondrosarcomes humains touchent principalement les adultes. Aussi, d’après notre expérience et les données de la littérature, des souris à un stade adulte seront utilisées.