Oncologie

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la muqueuse orale ou, par incision du thorax, dans le poumon, puis subissent des irradiations et des séances d'imagerie scanner sous anesthésie. Le porteur indique que la tumeur ORL peut gêner l'alimentation et la tumeur pulmonaire la respiration, et prévoit des points limites déclenchant la mise à mort. Le projet vise à entraîner des algorithmes d'intelligence artificielle sur les images, retombées cliniques présentées au conditionnel, tandis qu'il affirme que l'étude de la réponse immunitaire exige un "organisme vivant entier".

Objectifs

L'avènement de l'immunothérapie a conduit à un changement de paradigme dans le traitement de plusieurs cancers solides et hématologiques, conduisant à des résultats impressionnants en termes de survie et de réponse tumorale. Cependant, seule une fraction des patients répond à l'immunothérapie, soulignant ainsi le besoin urgent de biomarqueurs pronostiques et prédictifs. L'infiltration immunitaire tumorale est un élément essentiel de la réponse immunitaire contre le cancer, conditionnant la réponse à l’immunothérapie. Le développement de stratégies non invasives pour quantifier cette infiltration immunitaire tumorale et prédire le résultat du traitement pourraient représenter une avancée majeure. Ce projet vise à développer et tester, dans des modèles tumoraux murins, une approche basée sur l’analyse d’images radiologiques (CT-scans) combinée à des méthodes d’intelligence artificielle pour développer des algorithmes prédictifs.

Bénéfices attendus

À l'ère de la médecine personnalisée, où les stratégies thérapeutiques sont de plus en plus adaptées aux profils spécifiques des patients et des tumeurs, le développement d’algorithmes prédictifs pourrait représenter un outil précieux d'aide à la décision, guidant la prise en charge des patients atteints de cancer. La possibilité de déchiffrer de manière non invasive le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement, par le biais de signatures radio-immunes, pourrait impacter de façon majeure la pratique clinique. De plus, l’opportunité de suivre dynamiquement et "en temps réel" l’infiltration de cellules immunitaires peut nous permettre de proposer de nouveaux traitements sur mesure. Cela pourra améliorer l’efficacité des thérapies et réduire les chances d’échec thérapeutique, en sélectionnant les patients qui ont le plus de possibilités de répondre au traitement sélectionné et en arrêtant précocement des traitements inefficaces.

Procédures

Des injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux, soit au niveau de la babine soit au niveau pulmonaire : - Les cellules tumorales seront injectées directement dans la muqueuse orale des souris préalablement anesthésiées, avec une aguille de petit diamètre (aiguille à insuline) (durée < 5 min). - L’injection de cellules dans le poumon prévoit une petite incision chirurgicale à niveau du thorax de souris (sous anesthésie systémique) pour exposer la plèvre. L’injection sera effectuée travers la plèvre avec une aguille de petit diamètre (aiguille à insuline) (durée max 20 min). Les irradiations seront faites sous anesthésie Kétamine/Xylazine (durée 15 min) Les imageries au micro-CT seront faites sous Kétamine/Xylazine ou Isoflurane (durée 15 min)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables chez les animaux seront occasionnés par l’injection des cellules tumorales. Des difficultés d’alimentation pour les souris avec une tumeur ORL sont possibles. Pour le modèle pulmonaire, la croissance de la tumeur peut engendrer une difficulté respiratoire. Pour ces raisons, nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation nous permettant de déterminer des points limites suffisamment précoces afin de limiter la douleur à son minimum. En effet, les animaux seront surveillés quotidiennement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de la radiothérapie localisée combinée ou non à des immunomodulateurs sur le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement pour dévoiler des signatures radio-immunes. L’étude du recrutement et de la réponse des leucocytes dans la tumeur nécessite la présence d’un système immunitaire efficace dans un modèle dynamique (depuis la production des cellules dans la moelle osseuse, leur libération dans le sang, leur maturation dans les organes lymphoïdes secondaires, jusqu’au recrutement sur le site tumoral) qui ne peut pas être réalisée in vitro. Ceci met en jeu des interactions complexes nécessitant un organisme vivant entier. Les modèles murins sont imparfaits d’un point de vue purement biologique mais permettent d’étudier la réaction immunitaire anti-tumorale in vivo et ont l’avantage d’être d’une taille bien plus faible que chez l’humain, ce qui permet une inclusion en totalité des tumeurs et des tissus environnant pour une analyse histologique exhaustive. Cette inclusion en totalité ouvre une possibilité plus importante de mise en correspondance spatiale d’images histologiques et radiologiques, non réalisable en clinique, et apportera des éléments concrets quant à la réalité biologique d’hypothèses faites depuis plusieurs années en clinique. De plus, des modèles murins permettant la modulation in vivo de sous-populations spécifiques de cellules immunitaires (par exemple la déplétion vs l'enrichissement en CD8) au sein du microenvironnement immunitaire tumoral pourraient renforcer la signification biologique de notre signature radiomique. Nous envisageons pour cela un traitement personnalisé incluant radiothérapie et agents immunomodulateurs (par exemple anti-TGF beta, anti-CD8) capables d'agir sur la contexture immunitaire tumorale.

Réduction

La génération d’un algorithme prédictif et pronostique par deep learning nécessite l’analyse d’un large set de données. En effet, cela est nécessaire pour un bon entraînement des algorithmes de prédiction. De plus, il est nécessaire d’utiliser une cohorte indépendante sur laquelle tester l’efficacité des algorithmes développés. Il n’existe aucune donnée dans la littérature concernant des analyses radiomiques dans des modèles tumoraux murins. Notre estimation de 50 souris par groupe est donc basée sur des observations cliniques et sera adaptée sur la base des données obtenues pendant la réalisation du projet. En outre, les modèles murins que nous utiliserons ont déjà été testés et validés dans de nombreuses publications, et la collaboration avec Gustave Roussy nous permettra d'avoir des modèles déjà testés et performants, minimisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation afin de réduire au minimum la souffrance et la douleur des animaux. Les souris seront hébergées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Les animaux seront anesthésiés pour les procédures d’injection des cellules tumorales, d’irradiation et d’imagerie. De plus, l'environnement des animaux sera enrichi en permanence par du coton ou des nids en carton afin de diminuer leur angoisse et favoriser leur bien-être. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limites seront strictement appliqués. - Le développement de la tumeur ainsi que les signes de toxicité (perte de pois, prostration) seront évalués 3 fois par semaine (euthanasie des souris dès qu’un point limite est atteint). -Un complément alimentaire (Renutryl, Nestlé) sera administré aux souris pour limiter les effets de l'asthénie et de l'irradiation. - Des aliments mous (pellets ramollis d’eau) pourront également être mis dans les cages pour faciliter l’alimentation des animaux

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures. De plus, les modèles tumoraux ORL et pulmonaire ont été développés et caractérisés en utilisant des souris de cet âge, et nous allons maintenir ces mêmes paramètres pour cette étude.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est rendue obèse et prédiabétique par un régime hypercalorique de deux à quatre mois, puis toutes sont opérées pour poser un cathéter dans l'intestin grêle et reçoivent des perfusions quotidiennes et des prélèvements de sang à la queue. Elles sont ensuite tuées pour prélever leurs organes. Le porteur présente le projet comme un "passage obligé vers la clinique" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un organisme vivant.

Objectifs

De nombreuses bactéries vivent dans le tube digestif, elles représentent 90% du microbiote intestinal. Celui-ci régule le métabolisme énergétique et le système immunitaire. Ces bactéries produisent une grande diversité de substances bactéricides, appelées bactériocines. Ces bactériocines agissent comme des antibiotiques et permettent aux bactéries qui les produisent de se défendre contre des bactéries pathogènes. Nous utiliserons un modèle préclinique de souris, rendues obèses et prédiabétiques par un régime alimentaire riche en graisses. Ces animaux souffrent également de dysbiose. Les animaux contrôles, seront nourris avec un régime standard. Suite à des recherches bibliographiques, nous avons sélectionné une bactériocine, qui pourrait avoir un effet bénéfique sur l’homéostasie glucidique et la composition du microbiote intestinal. Nos résultats précédents nous ont permis de démontrer l’effet positif d’un traitement intra-péritonéal avec cette molécule sur la tolérance au glucose et la sécrétion d’insuline chez des souris prédiabétiques. Ainsi, ce peptide est potentiellement une cible d’intérêt via un effet direct sur des tissus cibles. Nos derniers résultats ont également montré que, lorsque ce peptide est administré par voie orale pendant plusieurs jours, celui-ci est dégradé au niveau du duodénum. Ainsi il n’atteint pas le colon, au niveau duquel il pourrait avoir un effet bénéfique sur la composition du microbiote intestinal. Ce peptide est produit naturellement dans l’intestin et il agit sur son environnement immédiat en participant à l’équilibre de l’écosystème microbiotique. C’est pourquoi nous aimerions l’administrer quotidiennement par voie entérique, à l’aide d’un cathéter placé directement au niveau iliaque de l’intestin grêle chez la souris. Notre projet vise à étudier et valider la preuve de concept du rôle de ce peptide en tant que régulateur de l'homéostasie du glucose et ayant un effet bénéfique sur la composition du microbiote intestinal. Ainsi cette molécule pourrait constituer une nouvelle classe de médicaments pour le traitement du diabète de type 2. Au cours de cette étude, qui durera 5 ans, nous utiliserons 192 animaux.

Bénéfices attendus

Le peptide que nous utilisons est produit naturellement dans l’intestin et il agit sur son environnement immédiat en participant à l’équilibre de l’écosystème microbiotique. Dans des situations de déséquilibre de cet écosystème, comme observé dans les situations d’obésité ou de diabète de type 2 (DT2), une administration par voie entérique de notre molécule pourrait avoir des effets sur la composition du microbiote intestinal et sur la régulation de l’homéostasie glucidique. Notre projet vise à étudier et valider cette preuve de concept, et pourrait constituer une nouvelle classe de médicaments pour le traitement du diabète de type 2.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1. La moitié des animaux sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 2 à 4 mois, ainsi ces animaux deviendront prédiabétiques. 2. Les animaux seront opérés pour placer un cathéter dans l’intestin grêle. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. 3. Les animaux seront perfusés une fois par jour pendant 10 minutes, pendant 5 jours. Puis ils auront 2 jours de pause avant d’être à nouveau perfusés une fois par jour pendant 10 minutes, pendant 5 jours. Les animaux seront vigiles. 4. Les animaux seront utilisés pour faire des tests : deux fois pendant deux heures, à 7 jours d’intervalle. Pendant ces 2 heures nous mesurerons leur glycémie 6 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 4 fois). Les animaux seront vigiles.

Impact sur les animaux

Pour tous nos protocoles nous veillons à diminuer les effets indésirables prévus sur les animaux. Nous utilisons un régime alimentaire riche en gras, pour rendre nos animaux obèses, mais nous leur laissons le régime standard pour que les animaux aient toujours le choix. Malgré leur prise de poids, les animaux se déplacent correctement. Pour la chirurgie nos animaux reçoivent des soins avant, pendant et après l’opération afin d’éviter toute souffrance. Nous les surveillons tous les jours après l’opération jusqu’à leur rétablissement. Avant d’effectuer des tests sur nos animaux, nous les habituons pour diminuer leur stress le jour de l’expérience. Pendant l’expérience, nous respectons les volumes de prélèvement et d’administration autorisés, et nous les surveillons.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.

Remplacement

Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet anti-diabétique d'une nouvelle molécule. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de reproduire la complexité d'un organisme vivant. Enfin, nos modèles murins, à savoir les souris C57BL6j mâles rendues obèses par régime hypercalorique, sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre.

Réduction

Dans le domaine de la diabétologie et vu le type de mesures que nous allons effectuer, nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe (n=8) de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue avant, pendant, et après l’opération. L’ensemble des procédures de ce projet visent à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal.

Choix des espèces

Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'Homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie; et sont souvent utilisées comme modèles de pathologies humaines, comme l'obésité et le diabète de type 2. De plus, nous voulons tester l'effet de notre molécule sur un modèle animal, dans la perspective de la tester ensuite dans une phase clinique humaine. Afin d'obtenir des souris obèses et prédiabétiques, nous devons les soumettre à un régime hypercalorique, à partir de l'âge de 8 semaines, pendant 2 mois. Ainsi, toutes nos expériences seront réalisées sur des souris adultes d'un âge minimal de 4 mois. Utiliser des animaux adultes mime la situation chez l'Homme où le diabète de type 2 apparait également à l'âge adulte.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein triple négatif, puis un suivi hebdomadaire par imagerie et des contentions répétées pour mesurer la tumeur, celle-ci pouvant atteindre 2 000 mm³ avant la mise à mort, avec perte de poids et parfois nécrose. Elles sont ensuite tuées pour prélever tumeur, poumons et rate. Le porteur affirme que ces phénomènes "ne peuvent être reproduits in vitro" et conclut que le recours aux animaux est "indispensable".

Objectifs

Les cancers figurent parmi les principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Les origines du cancer sont multiples et font intervenir à la fois des facteurs génétiques et des agents extérieurs. Il a été démontré que la suractivation et/ou la surexpression de la protéine Rac1 (membre de la superfamille des protéines Rac) entraine l’initiation de différentes étapes de l’oncogénèse telles que la progression, l’invasion tumorale et la formation de métastases. Ces résultats suggèrent que l’inhibition de l’activité de Rac1 serait une nouvelle stratégie thérapeutique contre la progression tumorale et des métastases. Notre objectif général est de développer de nouveaux inhibiteurs de Rac1. Après un programme de recherche dédié à l’identification de nouveaux inhibiteurs, nous avons sélectionné une molécule « lead » qui inhibe spécifiquement la protéine Rac avec une efficacité et une affinité supérieure aux molécules commerciales (EHT1864 et NSC23766). Les propriétés thérapeutiques anti-métastatiques de cette molécule lead ont été évaluées dans des modèles murins de cancer du sein triple négatif . Les résultats prometteurs de cette étude nous ont amenés à développer une série chimique issue de notre molécule lead pour optimiser ce nouvel inhibiteur de Rac et envisager une utilisation clinique. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets anti-tumoraux de ces nouvelles molécules sur la croissance tumorale, le système immunitaire et la survie à l’aide de modèles murins ( immuno-compétents et immuno-déficients) de cancer du sein triple négatif

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier et de caractériser de nouveaux inhibiteurs de Rac. Au regard de nos premiers résultats, ces inhibiteurs devraient présenter des propriétés anti-tumorales et anti-métastatiques. Ainsi le développement de ces molécules permettrait d’envisager de nouveaux traitements (first in class) dans de nombreux cancers invasifs tels que le cancer du sein ou le cancer du côlon pour lesquels les impasses thérapeutiques sont nombreuses, menant au décès du patient.

Procédures

Les animaux (n=1800 maximum) subiront une greffe de cellules de cancer du sein (modèle triple négatif). Une imagerie sera réalisée sur tous les animaux une fois par semaine pour suivre l’évolution des métastases. Tous les animaux seront également soumis à une contention (2 fois par semaine pendant 40 jours maximum) pour évaluer la croissance tumorale (mesure au pied à coulisse). Aucun prélèvement sera réalisé sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Ces 2 modèles de cancer du sein triple négatifs sont maitrisés dans notre laboratoire depuis plusieurs années. Notre première étude met en évidence que l’injection chronique d’un inhibiteur de Rac1 n’induit pas de toxicité chez l’animal mais permet de diminuer la fréquence des métastases, le volume de la repousse tumorale et augmente statistiquement la survie des animaux. Les 2 procédures expérimentales consistent à effectuer des greffes sous-cutanés chez des souris. Ce geste chirurgical de grade modéré peut entrainer une légère douleur et une irritation passagère qui seront surveillées et contrôlées par une médication appropriée et décrite dans cette saisine. L’évolution de la tumeur sera surveillée tout au long du protocole pour limiter les nuisances liées au modèle. En effet, par exemple la taille de la tumeur ne doit pas entraver la mobilité de la souris. Par conséquent, si la tumeur atteint 2000mm3, point limite de ces procédures, la souris sera mise à mort. Dans ce type de modèles, les nuisances attendues sont également une perte de poids (ou une non prise de poids, surtout au début du protocole) et parfois une nécrose au niveau de la tumeur peut également apparaitre. Les nuisances attendues dans ce type de modèle devraient être moindre chez les souris traitées avec les inhibiteurs de Rac1.

Devenir

Procédure 1 : Mise à mort des animaux au maximum 40 jours après le début des traitements ou si un point limite est atteint. Procédure 2 : Mise à mort des animaux faite pour récupérer la tumeur, les poumons et la rate. Ces prélèvements biologiques post-mortem seront nécessaires pour étudier et caractériser les lymphocytes infiltrant la tumeur

Remplacement

Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes et de nombreux acteurs conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur dissémination dans l’organisme. Tous ces paramètres ne peuvent être reproduits in vitro c’est pourquoi le recours aux animaux est indispensable.

Réduction

Ce projet utilisera au maximum 1800 souris sur 5 ans. L’utilisation d’une technique d’imagerie permet de suivre au cours du temps de façon non invasive la taille des tumeurs ainsi que la cinétique d’apparition des métastases et d’autre part d’évaluer l’efficacité des traitements. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires par groupe. Cette approche permet également de visualiser et quantifier le volume des tumeurs et donc, en parallèle de l’observation comportementale, de pouvoir adapter l’analgésie à mettre en place et de déterminer le jour auquel il faut procéder à l’euthanasie de l’animal. De plus, en cas de résultats négatifs d’une molécule testée dans la 1ère étape expérimentale, l’étape 2 ne sera pas engagée ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées (soit 240 souris/molécule testée). Nous utiliserons un test de Mann-Whitney pour les analyses intergroupes, un test de Wilcoxon pour les intragroupes et un test de Log-rank sera utilisé pour l’analyse de la survie. Une p-value inférieure à 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par des personnes expérimentées afin d’assurer le bien-être des animaux et détecter toute souffrance. Uniquement le personnel qualifié et expérimenté réalisera les expérimentations animales afin que les procédures soient réalisées efficacement et avec les soins appropriés afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés 3 à 5 par cages et les cages sont enrichies avec des frisottis. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines (modèles de xénogreffes sur souris immunodéprimées) et murines (modèles syngéniques sur souris immunocompétentes). Pour cette étude, nous utiliserons de jeunes femelles adultes (âgées de 8 semaines) pour bénéficier de l’influence hormonale sur la croissance tumorale (tumeur mammaire)

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie, puis une plongée simulée en caisson hyperbare suivie d'une heure d'observation pendant laquelle un accident de décompression peut provoquer des symptômes douloureux. Le porteur indique que les rats seront tués dès l'apparition des premiers symptômes, et qu'ils sont tous mis à mort pour prélever sang et organes. Il justifie le recours à l'animal par l'absence de biomarqueur fiable et par l'étude sur "l'organisme entier".

Objectifs

L’accident de décompression (ADD) est un syndrome systémique survenant suite à la formation de bulles dans la circulation sanguine et dans les tissus lors d’une diminution de la pression environnementale. Les mécanismes de l’ADD sont encore aujourd’hui assez peu connus et cet accident est décelé uniquement sur la base des symptômes qu’il déclenche. Dans le but d’approfondir les connaissances sur le rôle de l’inflammation et de la coagulation dans la mise en place et la susceptibilité à l’ADD, nous allons étudier les réponses cellulaires de globules blancs et de plaquettes lorsque ces dernières sont exposées à différents stress rencontrés en plongée. L’objectif de ce projet est donc double : (i) confirmer/infirmer l’existence d’une relation entre la résistance à l’ADD et des modifications fonctionnelles des globules blancs et des plaquettes, (ii) étudier les différences liées au sexe dans les mécanismes de résistance à l’ADD.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes de résistance à l’accident de décompression (ADD) ainsi que les mécanismes physiologiques impliqués dans la mise en place de ce syndrome. Ces travaux pourront être bénéfiques en santé humaine et plus particulièrement dans un cadre de prévention de l’ADD. A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur la compréhension de la sensibilité à l’ADD. Plus particulièrement, sur l’implication des réponses leucocytaires et plaquettaires face à une modification de la pression hydrostatique et de la pression de l’air. A moyen terme, l’intégration de ces réponses au niveau physiologique et la caractérisation du type de stress ayant eu un impact plus marqué sur les réactions cellulaires permettra d’orienter nos recherches futures. A plus long terme, la mise en évidence de facteurs de risque permettrait de prévenir l’ADD avant une plongée. La perspective d’avoir une meilleure approche sur les mécanismes de l’ADD permettrait de mettre en place des protocoles de décompression toujours plus fiables afin de mieux prévenir l’accident.

Procédures

Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin par voie rétro-orbitaire réalisé sous anesthésie / analgésie. Si cela est nécessaire, les animaux de l'étude préliminaire pourront être soumis à un deuxième prélèvement sanguin dans les mêmes conditions. Les deux prélèvements seront séparés d'une période de 3 semaines. Au minimum 4 semaines après le dernier prélèvement retro-orbitaire, les animaux seront soumis à un protocole hyperbare de 60 minutes au total suivi d'une période d'observation d'1 heure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : - Le stress lié à la préhension et à l’injection d'asnesthésiques / analgésiques. Ces nuisances légères ne durent que le temps de l’injection (1 – 2 minutes). - Une possible diminution de la température corporelle au cours de l’anesthésie. Cette nuisance est légère et dure environ 20 minutes. - Le prélèvement sanguin au niveau du sinus rétro-orbitaire entraine un stress. Ces nuisances ne durent que le temps du prélèvement (1 – 2 minutes). - L’angoisse lors de la plongée simulée. Cette nuisance est légère et dure 2h30 (temps de l’exposition hyperbare et temps d’observation). - La douleur induite par l’apparition de symptômes de l’ADD lors de la période d’observation. Ces nuisances seront modérées et très brèves (moins de 1 minutes).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de cette procédure car nous avons besoin de prélever du sang et des organes afin de réaliser des analyses multiples (Cultures primaires, dosages sanguins (facteurs inflammatoires, facteurs de coagulation), histologie…).

Remplacement

Notre travail porte sur l’étude de la sensibilité à l’accident de décompression (ADD). Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler uniquement sur le modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité accrue à l’accident. De plus, l’accident de décompression est un syndrome systémique impliquant de nombreuses réponses autres que l’inflammation et la coagulation comme le stress oxydant et la dysfonction vasculaire par exemple. L’analyse des tissus post exposition hyperbare nous permettra de confronter nos résultats obtenus au niveau des globules et des plaquettes sanguines à ce que l’on observe sur l'organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et de permettre la réalisation d’une mise au point de la culture primaire (déterminer la quantité de cellules que nous pouvons mettre en culture suite au premier prélèvement, viabilité cellulaire…). Les tests statistiques utilisés intègreront 2 facteurs à étudier : susceptibilité à l’accident de décompression et sexe. De plus, après mise à mort des animaux, les prélèvements tissulaires vont nous permettre d’approfondir nos résultats de manière intégrée en sortie de plongée.

Raffinement

Tout au long du protocole, les conditions de stabulation sont réalisées dans un souci de bien-être de l’animal et les animaux sont suivis quotidiennement. Toute la procédure expérimentale est réalisée par des personnes formées et habituées à travailler avec des animaux de laboratoire. Pour réduire au maximum la douleur du prélèvement sanguin, l’animal sera ponctionné sous anesthésie/antalgie. L’induction de l’anesthésie sera réalisée par voie gazeuse afin de réduire au maximum le stress lié à la préhension et à l’injection. L’animal sera placé sur tapis chauffant et sa température corporelle sera monitorée jusqu’au réveil. Après le prélèvement sanguin, un suivi quotidien des animaux est réalisé avec une grille de score adaptée. Avant de démarrer le protocole d’exposition hyperbare, les animaux sont maintenus pendant 30 minutes dans le caisson hyperbare afin de les habituer à l’environnement et de réduire le stress. Le protocole de plongée utilisé limite au maximum l’apparition d’ADD sévère et les animaux seront mis à mort dès l’apparition des premiers symptômes pour réduire au maximum la souffrance.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De ce fait, nous disposons d’un certain nombre de données, en particulier sur la souche Wistar qui est couramment utilisé au laboratoire afin de caractériser les mécanismes de résistances à l’accident de décompression. Nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Nos travaux précédents ont été effectués sur des animaux matures sexuellement. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement. Lors de l’étude préliminaire, le prélèvement sanguin sera réalisé à l’âge de 8 et 11 semaines et la plongée simulée dans le caisson hyperbare à l’âge de 15 semaines. Lors de l’étude définitive, le prélèvement sanguin sera réalisé à l’âge de 10 semaines et la plongée simulée dans le caisson hyperbare à l’âge de 14 semaines.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un modèle génétique leur fait développer des tumeurs pulmonaires chez toutes les souris dès six semaines, avec un affaiblissement respiratoire et une mortalité atteignant 100 % à 35 semaines, et elles reçoivent sur animal vigile un génotypage par prélèvement de la queue puis des injections répétées dans l'abdomen. Les souris perdant plus de 20 % de leur poids ou qui se prostrent sont mises à mort. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne permet cette évaluation et conclut à la "nécessité" d'un système immunitaire complet.

Objectifs

Ces dernières années l’immunothérapie connu un essor important dans la prise en charge des cancers. Elle a montré une efficacité conséquente dans diverses indications, cependant un certain nombre de patients présentes des résistances spontanées ou acquises. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’efficacité anti-cancéreuse des anticorps monoclonaux seuls ou en combinaison avec une immunothérapie dans des modèles de souris. L’objectif secondaire est d’appréhender les mécanismes d’action de ces anticorps par l’évaluation des modulations du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Nous évaluons l’effet anti-tumoral de thérapies ciblées seules ou en combinaison avec une immunothérapie dans le cadre de plusieurs projets cliniques. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement des candidats médicaments et de leur fonctionnement en association avec des inhibiteurs de point de contrôle. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Toutes les souris prévues dance ce protocole subiront un prélèvement tissulaire de 2mm au niveau de la queue afin de réaliser leur génotypage et un marquage à l’oreille à 4 semaines postpartum. Ce geste est pratiqué sur animal vigile et prend 5 secondes. Toutes les souris prévues dans le protocole subiront des injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine à partir de 8 semaines) et/ou une immunothérapie (1 injection par 2 semaines de 12 à 18 semaines). Elles sont faites sur animal vigile dans un délais de 20 secondes à partir de la contention.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris conduit à la formation de tumeurs pulmonaires dans 100% des souris à partir de 6 semaines et de manière moins fréquente à des lymphomes thymiques. Les symptômes du développement tumoral et l’apparition possible d’une mortalité chez certains individus est observée à partir de 12 semaines. Une mortalité de 100% des souris est observée à 35 semaines. Ces lésions induisent ainsi des difficultés respiratoires conduisant à l’affaiblissement général de l’animal. Toutes les souris prévues dans le protocole subiront des injections intrapéritonéales pouvant générer de la douleur. Elles sont faites sur animal vigile dans un délais de 20 secondes à partir de la contention.

Devenir

Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet. Les animaux ne présentant la modification génétique à l’origine du développement tumoral seront mis à mort à 18 semaines dans la procédure 1 ou en même temps que les dernières souris présentant la modification génétique et qui atteignent un point limite dans la procédure 2.

Remplacement

La présence d’un système immunitaire complet, des cellules tumorales et du tissu sain d’origine est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité de notre candidat médicament. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de son efficacité dans le contrôle de l’immunité et les cellules cancéreuse.

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience, les études déjà publiées utilisant ce modèle ainsi que pour disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Procédure 1) Le nombre de souris sera de 20 par groupe de traitement avec 4 traitement différents effectués sur des animaux porteurs ou non de la maladie. Soit un total de 20 souris x 8 groupes = 160 souris. Cette procédure sera réalisée en 2 lots de souris soit 320 souris pour l’ensemble de la procédure de manière à pouvoir réaliser l’ensemble des analyses biologiques nécessaire à l’évaluation de l’activité du candidat médicament et à la compréhension de son mécanisme d’action. Procédure 2) Le nombre de souris sera de 35 par groupe, permettant d’effectuer les études de survie avec les 4 traitements différents sur les animaux porteur ou non de la maladie. Soit 35 x 8 = 280 souris. Procédure 3) Le nombre de souris sera de 10 par lot dans les deux procédures. Chaque lot de la procédure 3 est préalable aux lots de la procédure 1 et 2. Soit un total de 30 souris. La réalisation du second lot de la procédure 1 et la procédure 2 seront conditionnés aux résultats obtenus avec la première expérience. S’il n’y a pas d’effet sur l’incidence tumorale, le reste du protocole ne sera pas réalisé, constituant une réduction. La stratégie de croisement des souris génétiquement modifiées est optimisée de manière à générer des individus qui seront tous utilisés dans les différentes procédures. De plus, les femelles et les mâles entreront dans les analyses de manière à utiliser tous les individus générés pour ce projet.

Raffinement

Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Le poids des animaux sera évalué 1 à 3 fois par semaine selon les phases du développement tumoral. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance seront surveillés 2 fois par semaine puis 3 fois par semaine à partir d’un âge de 12 semaines. Des signes de fatigue, cachexie et d'isolement sociale sont également possibles ainsi qu'un blanchissements et refroidissement des extrémités. Ces signes peuvent être en lien avec l’affaiblissement provoqué par l’atteinte pulmonaire caractéristique de ces souris. Les individus concernés seront mis à mort. Les animaux seront mis à mort si la perte de poids supérieure est à 20% du poids maximal observé ou la prostration de l'animal. Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure, soit à 18 semaines en procédure 1 ou à l’obtention d’un point limite en procédure 2. Les animaux non porteurs de la maladie de la procédure 2 seront mis à mort en même temps que les derniers animaux porteurs. Dans la procédure 3, la stratégie de croisement fait appel à des femelles sauvages de manière à ce qu’elles ne présentent pas les effets délétères liés à la mutation génétique. Les mâles sont prélevés et restitués à l’élevage de la lignée de manière à ne pas avoir à générer d’individus pourteurs de la maladie supplémentaires.

Choix des espèces

Certaines de ces molécules sont des anticorps dirigés contre des cibles de souris. La souris compétente est le modèle le plus approprié pour greffer du tissu de cette même espèce tout en permettant de faire des suivis de pharmacocinétique et pharmacodynamie dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux et de inhibiteurs de point de contrôle. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres modèles tels que le zebrafish. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes tels que les souris sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément aux modèles établis.

250 lamas vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des anticorps par immunisations suivies de prélèvements sanguins. Le porteur indique que la plupart sont gardés vivants et réutilisés d'une étude à l'autre, une minorité étant tuée pour prélever la quasi-totalité du sang. Les effets décrits se limitent au stress de la contention, des injections et des prélèvements, répartis sur environ vingt-cinq études par an pendant cinq ans. Il affirme qu'il n'existe "aucune méthode substitutive" et que cette production animale est "indispensable" à la recherche.

Objectifs

Les lamas sont aujourd'hui des animaux très utilisés dans la recherche basée sur les anticorps, les biotechnologies... En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, le plus faible coût de production, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de lamas. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic…

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements.

Devenir

Dans certains cas (très rares chez le lama), les animaux inclus pourront être mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité de volume sanguin circulant. Dans le cas où le prélèvement terminal de la quasi-totalité du volume sanguin circulant n'est pas nécessaire (très souvent le cas), les animaux inclus pourront être gardés en vie et maintenus sur le site avec leurs congénères. Ils pourront ensuite être réutilisés dans d'autres études après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux nécessite une immunisation de l'animal et donc son utlisation. Il n'existe aucune méthode substitutive pour cette production qui est indispensable à l'avancement de la recherche, de la médecine, du développement de test de diagnostic...

Réduction

Le nombre d'animaux est choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Le lama permet d'obtenir des quantités de sérum suffisantes à l'atteinte des objectifs du projet, sans porter atteinte au bien-être animal. Ainsi, 1 ou 2 lamas seront immunisés par étude permettant ainsi d'obtenir une quantité suffisante de sérum. Le nombre de 2 lamas pour une étude sera choisi dans le cas de certaines études où il y a besoin de prendre en compte le facteur diversité/variation génétique qu'il peut y avoir entre 2 animaux. Un nombre de 25 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 250 lamas sur 5 ans. Sur ces 250 lamas, il y aura des possibilités de réutilisation de lamas d'une étude pour une autre étude, après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser. Dès que le caractère naïf des lamas n'est pas demandé et n'est pas utile pour l'étude, des lamas issus d'études précédentes seront utilisés dans le respect de leur bien-être et si leur état de santé le permet. Ainsi, cela permettra de réduire le nombre de lamas différents utilisés.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : pâture extérieure, litière de paille, brosse à vache, objects à manipuler...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lama sera ici utilisé pour la production d’anticorps. En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. Les animaux sélectionnés seront de jeunes adultes (entre environ 9 mois et environ 6 ans) car c'est à ce stade qu'ils sont entièrement immunocompétents.

260 souris et lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 230 tués à l'issue et 30 lapins proposés à l'adoption. Des tiques sont placées sur leur dos dans des capsules pour se nourrir de leur sang, ce que le porteur reconnaît provoquer une gêne et des démangeaisons. Chaque animal ne sert qu'une fois en raison de l'immunité développée contre les tiques. L'élevage vise à maintenir des colonies de tiques saines pour des expériences d'infection.

Objectifs

Le présent projet vise au maintien, en laboratoire, de colonies de tiques, dont les tiques de l’espèce Ixodes ricinus, « sans agent pathogène» afin de pouvoir réaliser des expériences d’infection expérimentale avec divers agents pathogènes pour analyser leur transmission par cet arthropode. Les tiques étant des hématophages stricts(ne mangent que du sang), il est nécessaire de les nourrir régulièrement avec du sang, ce qui est réalisé suivant les stades concernés sur souris vigiles (pour les larves et les nymphes) ou sur lapin vigile (pour les nymphes et les adultes). Pour cela les différents stades de tiques sont placés sur les animaux (dans une capsule fixée sur le dos des souris ou capsules fixées sur le dos des lapins) afin de permettre leur gorgement. Une fois gorgées, les tiques se détachent toutes seules, sont récupérées puis placées en flasque de culture cellulaire en attendant leur métamorphose.

Bénéfices attendus

Le maintien d'un élevage de tiques saines permet de pouvoir développer des projets de recherche portant sur les tiques elle-mêmes : étude du microbiote des tiques, développement de vaccin antimicrobiote de tique, neurophysiologie des tiques ; mais également sur les interactions entre les tiques et les agents pathogènes qu'elles vectorisent (bactéries, parasites et virus) afin de mieux comprendre ces systèmes et de trouver des moyens de lutte contre les tiques et les agents pathogènes qu'elles transmettent.

Procédures

Il n'y aura aucun prélèvement réalisé sur les animaux, juste la récupération des tiques gorgées présentes dans les capsules.

Impact sur les animaux

Le gorgement des tiques induit une gêne modérée (grattement) pour les souris ou les lapins utilisés mais afin de limiter l’inconfort lié à une démangeaison trop intense due aux piqûres de tiques, le nombre de tiques (larves/nymphes/femelles) par animal est limité. Lorsqu’une douleur ou gêne trop intense est vue chez le lapin ou la souris, nous enlevons les tiques qui ne se sont pas encore gorgées ou réduisons celles déjà attachées afin de réduire l’inconfort du lapin/souris.

Devenir

Pour les souris, tous les animaux seront mis à mort. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Pour les lapins: environ la moitié (30) seront mis à mort si les tiques gorgées avaient des agents pathogènes (tiques collectées en forêt) , et l'autre moitié (30) seront proposés à l'adoption via une association. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un système de gorgement artificiel sur membrane a été développé au sein de notre équipe, il est utilisé lors des essais de transmission des agents pathogènes. Cependant son efficacité ne permettant pas toujours de maintenir un assez grand nombre de tiques, il est donc necessaire de maintenir l’élevage de tiques sur lapins et souris.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé en fonction du nombre de tiques gorgées que l'on peut récupérer sur l'animal et par rapport à nos besoins en tiques pour nos différentes expérimentations. Pour chaque élevage, les gorgements seront réalisés au rythme de 1 par stade de tiques (3 stades) tous les 3 mois nécessitant à chaque fois 4 lapins et 5 souris. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements.

Raffinement

Les souris et les lapins sont élevées dans les conditions naturelles d'élevage des lapins et souris avec pour les souris : un maison en plastique par cage, un support pour grimper ; pour les lapins : une balle en plastique dure, un baton de bois à ronger. Les souris sont hebergées à raison de une souris par cage pour éviter le retrait de la capsule par ses congénères.

Choix des espèces

Les tiques présentent des spécificités d'hôtes relativement strictes et n'acceptent de se gorger que sur certains animaux dont les souris (larves et nymphes) et les lapins (nymphes et adultes). De plus, afin de maintenir un élevage, il est nécessaire d’obtenir un grand nombre de tiques gorgées pour chaque stade. Les tiques adultes et nymphes prélevant un volume de sang important, le gorgement sur lapin évite (1) la spoliation sanguine de l’animal hôte contrairement au gorgement sur souris, et (2) le recours à plus d’animaux. Adultes pour les souris et les lapins Age Minimum 5 semaines pour les souris pour pose des capsules Age indifférent pour les lapins