Oncologie
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Rôle des récepteurs aux hydrocarbures endothéliaux sur les effets de la dioxine dans le développement du cancer du foie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de 15 jours, elles reçoivent un agent génotoxique puis, pendant douze semaines, des injections de tétrachlorure de carbone deux fois par semaine et un gavage hebdomadaire de dioxine, pour induire un cancer du foie sur fond de fibrose. Le foie et le sang sont prélevés après mise à mort. Le porteur affirme qu'il n'existe aucun moyen de remplacer une telle étude, la réponse étudiée mettant en jeu plusieurs types cellulaires.
Objectifs
Dans ce projet, nous étudierons les mécanismes par lesquels la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) favorise le développement du carcinome hépatocellulaire avec une attention particulière sur la contribution des cellules endothéliales dans ce processus. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de carcinome hépatocellulaire (CHC) qui consiste à administrer un agent génotoxique, le N-nitrosodiéthylamine (DEN), à des souriceaux mâles âgés de 15 jours puis à administrer du tétrachlorure de carbone (CCl4) 2 fois par semaine pendant 12 semaines à partir de l’âge de 8 semaines. Ce modèle permet le développement de tumeurs hépatiques (induites par le DEN) sur un foie avec une fibrose (induite par le CCl4). L’effet de la TCDD sur la carcinogenèse hépatique sera évalué en exposant les souris à une administration chronique de TCDD ou son diluant (nonane) par gavage une fois par semaine à partir de l'âge de 8 semaines jusqu'à 20 semaines.
Bénéfices attendus
Si la toxicité d’une exposition chronique à de faibles doses de 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) sur la santé humaine est largement reconnue, elle reste encore mal caractérisée, notamment d’un point de vue moléculaire et cellulaire. Ce projet permettra de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent les effets délétères de la TCDD sur le développement du carcinome hépatocellulaire. Plus largement, ce projet apportera une meilleure compréhension de l'impact des polluants environnementaux et de la voie d’aryl hydrocarbone (AhR) sur la santé humaine.
Procédures
Les souris seront soumises à une injection unique de dihétylnitrosamine (DEN) ou son diluant (NaCl) en ip 15 jours après la naissance ; deux injections par semaine de tétrachlorométhane (CCl4) ou son diluant (Huile) en ip à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 12 semaines ; une administration de TCDD par semaine en gavage à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 12 semaines. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 15 secondes par souris et les gavages de 30 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Le modèle DEN / CCl4 induira le développement de tumeurs hépatiques.
Devenir
Les animaix seront euthanasiés à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets de la TCDD.
Remplacement
Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives. En effet, il n’existe aucun moyen de remplacer une telle étude dans laquelle la réponse physiopathologique étudiée met en jeu plusieurs types cellulaires (hépatocytes et cellules endothéliales)
Réduction
Le nombre de souris a été réduit à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats.
Raffinement
Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait son euthanasie anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.
Choix des espèces
La souris est l’espèce couramment utilisée dans ce protocole de carcinogenèse hépatique. De plus, ce modèle présente l'avantage qu'il nous permet de travailler avec des souris génétiquement modifiées. En effet, nous disposons de souris invalidées pour le gène du récepteur aux hydrocarbures dans les cellules endothéliales, il s'agit de souris transgéniques qui expriment le gène codant la Cre recombinase sous le contrôle du promoteur VE-cadhérine (Cdh5) et présentent le gène AhR floxé (souris Tg Cdh5-CreERT2/+: AHRflox /flox). Pour le protocole d'induction d'un CHC sur foie cirrhotique, le protocole consiste en une injection unique de N-nitrosodiéthylamine (DEN), un agent génotoxique, à 25 mg/kg ou son diluant (NaCl) à des souriceaux mâles âgés de 15 jours. En effet, la forte prolifération des hépatocytes à ce stade permet d'induire des mutations dans des cellules en prolifération ce qui permettra le développement de tumeurs hépatiques. Six semaines après l’injection de DEN (8 semaines de vie), les souris recevront une injection de CCl4 (dose à 0,2ml/kg d’une solution de 10% )ou de son diluant (huile) qui seront faites en intrapéritonéal 2 fois par semaine pendant 12 semaines. Les souris seront exposées à une administration chronique de TCDD ou son diluant (nonane) par gavage une fois par semaine à partir de l'âge de 8 semaines jusqu'à 20 semaines.
Etude de la cinétique de réactivation du chromosome X dans l’embryon de souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent deux injections hormonales pour surproduire des ovocytes puis sont euthanasiées après accouplement afin de prélever des embryons datés, tandis que les mâles reproducteurs, maintenus vivants entre les accouplements, sont mis à mort vers quinze à dix-huit mois. Le porteur indique qu'aucun animal n'est réutilisé et étudie la réactivation du chromosome X au cours du développement embryonnaire. Il affirme développer en parallèle des modèles cellulaires in vitro, mais soutient qu'aucun ne remplace aujourd'hui l'étude de l'embryon préimplantatoire chez la souris.
Objectifs
Chez les mammifères, le formation de l'embryon et des gamètes (précurseurs des ovules et spermatozoïdes= nécessite un changement radical d'expression des gènes et de marques épigénétiques dans les cellules. Dans les deux cas, cela implique un profond remodelage épigénétique, à travers des modifications telles que la méthylation de l'ADN et les marques des histones, ainsi que des spécificités en fonction du sexe de l'embryon. En effet, Il est, il existe de profondes disparités entre les sexes en termes de développement mais aussi de maladie et d'occurrence et mortalité des cancers. Pourtant très peu de données existent sur le chromosome X au cours du développement, ainsi que sur les spécificités de la reprogrammation épigénétique en fonction du sexe. Au cours du développement, cette reprogrammation est essentielle à l’obtention de cellules reproductives et à la perpétuation de l’espèce et elle est accompagnée par la réactivation du chromosome X inactif chez les femelles. Ce chromosome inactif représente un paradigme de contrôle épigénétique de l’expression des gènes à l’échelle d’un chromosome entier. Quand et comment a lieu la réactivation du chromosome X ? Quel est son impact sur la lignée germinale ? Une meilleure compréhension du contrôle de l'expression génique au cours de la reprogrammation développementale permettra également de comprendre les aberrations transcriptionnelles observées dans les cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
L'utilisant de nouveaux modèles murins apportera de nouvelles connaissances sur la lignée germinale, le développement pré-implantatoire, les différences entre les sexes et le contrôle épigénétique des gènes. Cela pourra avoir des implications futures en médecine régénérative et de la reproduction, nous permettra d’approfondir nos connaissances sur la transmission épigénétique entre les générations, et ouvrira de nouvelles avenues thérapeutiques pour le traitement des cancers en prenant en compte le sexe des patients. Cela est aujourd'hui considéré comme crucial, et par l'Union Européenne, et par le NIH aux Etats-Unis.
Procédures
Les femelles sont super-ovulées pour produire plus d'ovocytes ce qui nous permettra d'utiliser moins d'animaux. Ces femelles seront stimulées par deux injections d'hormones à 48h d'intervale , en intrapéritonéale. Ces injections sont utilisées en routine dans de nombreuses animaleries et n'entraînent pas d'effets indésirables pour les femelles. L’injection en intrapéritonéale dure en soit quelques secondes, et l’accouplement a lieu courant de la nuit suivant la 2nde injection. Le prélèvement des embryons a lieu entre le matin et le 3e jour après l’accouplement. Au total la stimulation hormonale de la première injection à l’euthanasie de la femelle est de 68 à 120h heures. Nous ne nous attendons pas à des effets secondaires suite à cette injection qui sera pratiquée uniquement par des personnes habilitées et formées et qui est une procédure standard dans l'animalerie. Les mâles reproducteurs resteront seuls dans leur cage, une fois l'accouplement ayant eu lieu, et avant le prochain accouplement. Nous nous assurerons d'une grande quantité d'enrichissement dans les cages pour éviter tout stress lié à l'isolement. Ces mâles seront remis en accouplement très régulièrement (plusieurs fois par mois) ce qui ne donnera pas lieu à des isolements prolongés (< 10 jours). Cet isolement est nécessaire pour éviter les bagarres entre animaux mâles après accouplement.
Impact sur les animaux
Pas d'effet indésirable attendu sur les mâles isolés car ces derniers seront régulièrement mis en accouplement (plusieurs fois par mois), ce qui ne devrait donc pas générer de stress important à l'animal. Les femelles superovulées seront manipulées au minimum, avec seulement deux injections intrapéritonéales nécessaires à 2 jours d'intervalle. Nous ne nous attendons pas à des effets secondaires suite à cette injection qui sera pratiquée uniquement par des personnes habilitées et formées et qui est une procédure standard dans l'animalerie. Si toutefois un animal présentait un stress important, un problème comportemental ou une apparition d'une blessure/tumeur de façon fortuite, nous euthanasierons l'animal dans les plus brefs délais pour éviter toute souffrance animale.
Devenir
Apres superovulation ou accouplement naturel, les femelles gestantes seront euthanasiées pour récupérer les embryons datés. Les mâles reproducteurs seront gardés en vie pour production d’autres embryons datés. Les mâles seront sacrifiés autour de 15-18 mois. Tous les animaux sont euthanasiés en fin de projet, aucun ne pourra être réutilisé.
Remplacement
Notre projet a été élaboré en conformité avec le principe des 3R. Remplacement: Notre travail se base sur des données produites en amont sur des modèles de culture cellulaire. L'inactivation du chromosome X n'existe que chez les mammifères et il n'existe pas de modèle cellulaire adéquat pour l'étude de l'embryon préimplantatoire. Le laboratoire développe actuellement de nouveaux modèles de cellules gamétiques in vitro pour remplacer dans le futur l'utilisation d'animaux. La validation de nos résultats in vitro par cette approche in vivo sur modèles murins nous confortera dans l’utilisation de ce nouveau modèle, pour l’étude du chromosome X.
Réduction
Réduction: En utilisant des technologies de pointe, sur très peu de cellules, voir sur la cellule unique, nous réduisons très fortement le nombre d’embryons nécessaires à nos études. Toutes ces technologies sont d'abord mises en place et testées sur des cellules en culture. Dans le cas d’embryons avant implantation, les femelles seront, au préalable, injectées deux fois avec des hormones (piqure intrapéritonéale) pour leur permettre une plus grande ovulation. Cela minimisera le nombre de femelles nécessaires pour l’obtention du nombre adéquat d’embryons.
Raffinement
Raffinement: nous prenons soin d'effectuer une manipulation minimale des animaux vivants. Nos expériences portent uniquement sur l’accouplement des animaux sauvages ou transgéniques dans le but d’obtenir des embryons datés et l’euthanasie des femelles au moment du prélèvement des embryons. Dans le cas d’embryons avant implantation, les femelles seront également injectées deux fois avec des hormones (piqure intrapéritonéale) à 48 heures d'écart. Nous porterons un soin particulier à l’enrichissement du milieu pour que les souris puissent se créer un nid. Cependant en cas de signes de souffrance et de détresse des animaux, des procédures d’euthanasie seront immédiatement mises en place.
Choix des espèces
L’inactivation du chromosome X est un phénomène conservé et spécifique des femelles de mammifères, impliquant que notre modèle soit la souris. Notre étude ne peut en aucun cas être menée sur d’autres modèles animaux non mammifères. De plus, il est connu que l’inactivation est un processus très dynamique pendant le développement, dépendante du stade gestationnel, de l’état de différentiation et de l’origine cellulaire. Il est donc important d’avoir recours à une étude développementale sur animaux vivants pour comprendre les mécanismes de réactivation. Nous proposons d’étudier l’expression des gènes par transcriptomique, et hybridation des ARN, et les marques épigénétiques, dans l’embryon préimplantatoire de souris entre la fécondation et l'implantation (1ère vague d'inactivation et réactivation du chromosome X) et dans les cellules germinales primordiales, qui sont présentes entre 7 et 13 jours de développement embryonnaire (dpc). Les embryons seront issus de croisements entre souris sauvages et transgéniques pour nous permettre d’isoler des embryons femelles avec une inactivation biaisée du chromosome X et des marqueurs fluorescents des cellules germinales et/ou du chromosome X. Les parents transgéniques ainsi que la descendance ne présentent aucun phénotype dommageable. Les embryons (femelles et mâles en contrôle) seront collectés entre 0.5 et 4.5 et entre 7.5 et 13.5 jours de développement embryonnaire. Les animaux transgéniques nécessaires sont déjà disponibles et nous possédons un grand jeu de données transcriptomiques sur le modèle souris dans le laboratoire.
Effets d’un traitement par anticorps dans un modèle murin de cancer des voies biliaires : suivi longitudinal en imagerie nucléaire (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées d'un cancer des voies biliaires, elles reçoivent des injections hebdomadaires de traitement pendant quatre semaines et des séances d'imagerie sous anesthésie, avec un développement tumoral pouvant entraîner nécrose et perte de poids. Le porteur met à mort les animaux après la dernière imagerie pour prélever la tumeur. Il affirme que la complexité du développement tumoral ne peut être étudiée sur cellules en culture et qu'il est "primordial" de tester l'anticorps sur des souris greffées de cellules humaines.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de permettre une meilleure compréhension de la pathogenèse du cancer des voies biliaires et l’évaluation in vivo de l’efficacité d’un nouveau candidat médicament.
Bénéfices attendus
Réduction de la pousse tumorale avec le nouveau candidat medicament observée en imagerie l'aide de traceurs pertinents.
Procédures
Les souris recevront le traitement soit par injection au niveau de la paroi abdominale (éveillé, 4 injections, durée 20 secondes chacune) soit par voie intraveineuse (anesthésie , 4 injections, durée 1 minute) une fois par semaine pendant 4 semaines. Les souris seront soumises à séances d'imagerie (10 minutes chacune) à raison d'une par semaine pendant 4 semaines. Ces séances sont réalisées sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances susceptibles de survenir sont : - développement tumoral et apparition de nécrose tumorale - perte de poids de l'animal - hématome au niveau du site d'injection du radio-traceur qui disparait spontanément en 3 jours. - des nécroses au point d’injection du traitement au niveau de la paroi abdominale,
Devenir
A la fin de la procédure, c’est-à-dire après la dernière séance d’imagerie, les animaux seront mis à mort et la tumeur prélevée post mortem pour des études complémentaires (histologie, biochimie) qui viendront compléter les résultats obtenus in vivo.
Remplacement
Notre étude vise à montrer l'efficacité d'un anticorps dans le le carcinome hépatique. La complexité du développement tumoral (circulation sanguine, environnement tumoral) ne pouvant être étudié uniquement sur des cellules en culture, il est primordial de tester cet anticorps sur des modèles animaux greffés avec des cellules tumorales humaines.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été calculé afin d’inclure le minimum d’animaux pour pourvoir réaliser des tests statistiques sur les résultats obtenus. L’utilisation de l’imagerie lors d’études longitudinales permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux lors des études. De plus, le prélèvement post mortem de la tumeur pour des études complémentaires permet de compléter les informations obtenues dans l’étude sans augmenter le nombre d’animaux. Un test statistique sera utilisé pour analyser les effets d’un nouveau traitement par anticorps sur la croissance tumorale entre les différents groupes d'animaux.
Raffinement
L’environnement des animaux est enrichi (tunnel, carré de coton déchiquetable pour maintenir une activité locomotrice), les animaux sont placés à plusieurs par cage pour respecter les interactions sociales. Les souris greffées auront un suivi quotidien réalisé par du personnel préalablement formé et à l’aide d’une grille d’observation adaptée afin d’éviter toute souffrance liée au développement des tumeurs et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs lors des procédures. Les examens sont réalisées sous anesthésie gazeuse et lors des séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée avec un suivi en direct de la fréquence respiratoire et de la température corporelle afin de déceler tout signe précoce de mal-être (hypothermie par exemple). Un gel ophtalmique ainsi qu’une injection sous-cutanée de sérum physiologique à température corporelle seront administrés à l’animal juste avant le début de la séance d’imagerie.
Choix des espèces
En raison de l'absence d'une partie de son système immunitaire, les cellules tumorales injectées à cette souche particulière de souris vont pouvoir se développer et former une tumeur. Les animaux seront greffés à un âge allant de 6 à 8 semaines, âge optimal pour la prise tumorale .
Role des cellules dendritiques dans les infections virales locales et systémiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
5046 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 860 d'entre elles en gravité sévère. Elles sont infectées par trois virus, un cytomégalovirus, un virus de la chorioméningite et un virus de la grippe, administrés par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou nasale, pour étudier le rôle d'un type de cellule immunitaire dans la défense antivirale. Le porteur indique surveiller la perte de poids et euthanasier les souris atteignant un point limite. Il affirme que la mesure de la réponse immunitaire "nécessite" un organisme vivant et complet, et que la souris est le modèle "le mieux approprié" du fait de sa génétique.
Objectifs
Le système immunitaire protège l’hôte contre les infections microbiennes. Les cellules dendritiques (DC) appartiennent au système immunitaire et agissent comme sentinelles du système immunitaire Lorsqu’un pathogène est détecté, elles transmettent des signaux qui initient et orchestrent les réponses immunitaires. Les DC se divisent en conventionnelles (cDC) et plasmacytoïdes (pDC). Les cDC agissent principalement comme présentatrices d’antigènes aux lymphocytes T, qui à leur tour contrôlent l’infection et génèrent des cellules ayant mémoire du pathogène. Les pDC sont la principale source de molécules, dites Interférons (IFN), produites au cours des infections virales. Presque toutes les cellules du corps répondent aux IFN en produisant des molécules capables de bloquer les différentes phases du cycle virale (immunité intrinsèque). De plus, la réponse aux IFN est indispensable pour activer les cellules des systèmes immunitaires inné et adaptatif. Les pDC sont ainsi considérées clef dans l’immunité antivirale. Notre hypothèse est que les pDC exercent des fonctions différentes selon le type de virus et/ou d’infection qu’il engendre. Après infection, la réplication du virus peut rester limitée à l’organe d’entrée (infection locale) ou s’étendre à tout l’organisme (infection systémique). Généralement, les virus sont éliminés par l’hôte, mais, parfois, ils persistent sous forme latente ou génèrent une infection chronique. Notre objectif principal est de déterminer quelles fonctions exercent les pDC dans ces différents types d’infection. Nous étudierons la localisation et l’état d’activation des pDC présentes dans les tissus infectés dans les souris pDC-Tomato, qui permettent d’identifier spécifiquement les pDC par fluorescence. Ensuite, nous évaluerons l’impact de la perte des pDC au cours de l’infection en utilisant les souris pDC-less, qui ont un déficit sélectif en pDC. Nous infecterons nos modèles murins avec les trois virus suivants: le cytomégalovirus murin (MCMV), le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) et la souche A du virus de la grippe (IAV). IAV induit une infection locale restreinte au système respiratoire, alors que MCMV et le LCMV induisent des infections systémiques. Le MCMV persiste dans l’hôte, mais sous forme latente. En revanche, LCMV est éliminé par l’hôte, sauf dans le cas de certaines souches qui établissent des infections chroniques.
Bénéfices attendus
Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les fonctions des pDC dans l’immunité anti-virale. L’identification des mécanismes moléculaires qui instruisent les différentes fonctions des pDC murines ouvriront des perspectives de nouveaux traitements pharmacologiques visant à inhiber ou promouvoir l’activation des pDC humaines selon les différents contextes pathologiques. Nous pourrons étendre nos études à l’homme car nous avons développé dans notre laboratoire des cultures de pDC humaines dérivées de précurseurs hématopoïétiques du sang de cordon. Nous pouvons ainsi étudier dans ces pDC les conséquences fonctionnelles de la perte d’expression d’un gène candidat grâce à des technologies d’ingénierie génétique. Nous déterminerons si les mécanismes moléculaires identifiés chez la souris sont conservés dans les pDC humaines et, si oui, quel est l’impact de leur inactivation.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des procédures chirurgicales. L'infection systémique par MCMV sera effectuée par voie intraperitoneales sur des souris vigiles. Cette infection dure une minute/souris. Les infections LCMV clone Armstrong et IAV seront effectuées par voie intranasale sur des animaux anesthésiés au préalable avec un mélange de kétamine/xylasine (injection intraperitonéale). L'infection par voie intranasale dure 1 minute/souris et les souris se réveillent 30 minutes après l'injection de l'anesthésie. L'infection LCMV clone 13 sera effectuée par voie intraveineuse sur des souris anesthésiées avec de l'isofluorane. L'infection par voie intraveineuse dure 1 minute/souris, le traitement par anesthesie dure 5 minutes/souris. Dans certaines expériences nous prélèverons le sérum des souris infectées. Cela sera effectué une seule fois par prélèvement retrorbitale et sur animaux anesthésiés avec isoflurane. L'anesthésie plus le prélèvement durent en totalité 5 minutes. Le volume de sang prélevé sera de maximum 200µl.
Impact sur les animaux
Nous surveillerons différents paramètres, comme la perte de poids, la douleur, le stress, l’inactivité, une mobilité réduite, ainsi que tout comportement anormal, induits dans toutes les procédures sévères de notre projet. Nous définirons une grille de score spécifique à chaque modèle d’infection et nous surveillerons quotidiennement les souris infectées. Lorsque les souris auront atteint un score correspondant à un point limite nous procéderons à l’euthanasie immédiate des souris souffrantes.
Devenir
Mise a mort de tous les animaux
Remplacement
Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire au cours des différents modèles d’infections virales in vivo. Ainsi, l’intégration d’un système vivant et complet est indispensable. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire chez l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Ainsi le modèle murin est un modèle de choix pour notre étude.
Réduction
Nous utiliserons 5046 souris pour mener à bien cette étude. Tous ces animaux seront sous fond génétique homogène C57BL/6J pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités interindividuelles des animaux sous fonds génétiques mixtes. Ainsi, chaque expérience devrait pouvoir être répétée indépendamment deux fois, avec 4-5 animaux par groupe, minimum requis pour s’assurer de la bonne reproductibilité des résultats.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, les souris seront élevées dans des animaleries conventionnelles exemptes d'organisme pathogène spécifique (EOPS). La température, l’hygrométrie et la photopériode sont contrôlées et régulées. Un animal bénéficiera d’au moins 100 cm2 de surface. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs, notamment pour les animaux placés en hauteur car trop exposés à la lumière. Pour les animaux affaiblis, l’accès à la nourriture et à l’eau sera favorisé. Les points limites ont été définis dans chaque procédure et des grilles de score spécifiques à chaque modèle d'infection seront utilisées pour le suivi des souris infectées. Sur la base de ces points limites un système de scoring de la douleur sera scrupuleusement appliqué pour évaluer les signes de souffrance relatifs à l’expérimentation en cours, et les animaux atteignant les points limites définis seront immédiatement euthanasiés.
Choix des espèces
La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces. Nous avons maintenant formellement établi ce point en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Nous utiliserons des souris adultes dont le système immunitaire est mature. Elles auront entre 6 et 12 semaines. Dans le cas spécifique de chimères de moelle osseuse appellées « shield » nous utiliserons des souris agées de 4 semaines au moment de la reconstitution (voir procédure 1).
Mise en place de modèles de lymphomes, de cancer du sein et des LAM (leucémie aigue myéloïde), et caractérisation de thérapies ciblées dans ces modèles murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 135 d'entre elles en gravité sévère. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales sous la peau, dans le sang ou en intra-lymphatique, avec des prélèvements sanguins rétro-orbitaux répétés et des séances d'imagerie, pour créer des modèles de lymphomes, de cancer du sein et de leucémie aiguë et tester des thérapies ciblées. Le porteur indique que la dissémination tumorale peut provoquer une perte de poids et fixe un point limite quand la masse tumorale dépasse un certain volume. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro reflétant la pathologie humaine, seul l'animal permettant selon lui d'appréhender la tumeur et son microenvironnement.
Objectifs
Malgré les progrès permanents dans la compréhension des cancers et dans les traitements disponibles, de nombreux patients ne répondent pas aux traitements classiques ou rechutent après différentes périodes de rémission. L’objectif est de proposer de nouveaux traitements contre les lymphomes, les cancers du sein et les LAM. Le microenvironnement tumoral (MET) dans les cancers est aujourd’hui reconnu comme ayant un fort impact sur la résistance des cancers aux thérapies. Parmi les composantes cellulaires du MET, il y a les cellules du système immunitaire qui, même si au départ du développement tumoral sont anti-tumoral, peuvent devenir pro-tumorales ou être désactivées. Parmi ces cellules immunitaires, il y a les macrophages et les lymphocytes T (LT) auxquels nous nous intéressons plus particulièrement dans l’équipe. Nous cherchons à activer les LT et désactiver les macrophages associés aux tumeurs (TAM). Le rôle des LT qui sont cytotoxiques, est en effet d’éliminer la tumeur. Cependant, ils peuvent être inhibés par les cellules tumorales et les différentes cellules du MET au niveau par exemple des « immune checkpoints » (ICP). Le but est alors de lever cette inhibition avec des anticorps ou des molécules qui ciblent ces ICP. Les macrophages au sein de la tumeur sont sensés au départ éliminer les cellules tumorales par phagocytose par exemple, cependant, à un certain stade de la tumeur ils reçoivent des signaux les transformant en macrophages pro-tumoraux. Le but est alors d’inhiber la fonction de ces TAM. L’objectif de ce projet est donc d’optimiser des traitements classiques et/ou de proposer de nouveaux traitements contre les lymphomes, les cancers du sein et les LAM.
Bénéfices attendus
L’inoculation des différentes molécules dans les modèles murins considérés permettra de réduire les masses tumorales et/ou d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques impliquées dans l’éradication de la tumeur. Le but est de mieux comprendre le développement tumoral , d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, ou de comprendre les mécanismes d'action de certains médicaments, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro reflétant la pathologie humaine. L'utilisation d'animaux permet d'appréhender tous ces mécanismes au niveau de la tumeur mais également au sein de son microenvironnement.
Procédures
Procedure n°1: après anesthésie, injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée (SC) . La prise tumorale sera ainsi évaluée au pied à coulisse 2 fois/semaine. Des prélèvements sanguins en rétro-orbital (50μl) seront réalisés au moment de l'injection (T0) et à différents temps pendant la durée de l'expérimentation (J10, 15, 20, 30). Ces prélèvements seront faits sous anesthésie gazeuse et nous alternerons l’oeil prélevé. Afin de visualiser les anticorps thérapeutiques monoclonaux, l’injection se fera par voie IP. L’efficacité thérapeutique sera évaluée par mesure au pied à coulisse de la tumeur ainsi que par imagerie à l’IVIS (pendant 3 min). Procédure n°2: Afin que la souris développe une LAM (leucémie aigue myéloïde) humaine, après anesthésie, les cellules primaires de patients seront injectées très doucement par voie intraveineuse dans la veine caudale. Procédure n°3: l’anticorps anti-TAM couplé à une molécule fluorescente ou à une drogue ou couplé à des nanoparticules, sera injecté seul ou en combinaison avec un anti-PD1 à des souris xénogréffées. Après anesthésie, les cellules tumorales seront injectées par voie SC ou en orthotopique. La tumeur sera mesurée au pied à coulisse 2 fois/semaine. Des prélèvements sanguins seront faits de la manière que la procédure 1. Procédure n°4: Après anesthésie, les cellules tumorales seront injectées par voie SC dans le flanc, en intra-veineuse (IV) dans la veine caudale ou en intra-lymphatique (IL) dans le talon . Afin d’évaluer in vivo l’effet indirect des ACM anti-CD20, les cellules immunitaires de type NK ou lymphocytes T préalablement marquées avec des sondes fluorescentes afin de les visualiser à l’IVIS, seront injectées en IV . Les ACM, également préalablement marqués, seront quant à eux injectés en IP comme indiqué dans la procédure 1. la tumeur sera mesurée au pied à coulisse 2 fois/semaine et les souris seront pesées 2 fois/ semaine. des prélèvements sanguins seront effectués comme dans la procédure 1. Procédure 5: injection en IV, IP, SC ou intramusculaire d'une molécule à T0 puis les souris sont observées et pesées pendant 5 semaines tosu les 3 jours.
Impact sur les animaux
L'injection de cellules tumorales peut avoir un impact sur les animaux: une injection en sous-cutané pourra conduire à une croissance tumorale importante mais les animaux seront sacrifiés avant que la tumeur ne soit trop grosse, l'injection en intra-veineux sera la dissémination tumorale très importante partout pouvant induire perte de poids. Les prélevents de sang et l'analyse de la fluorescence par imagerie se feront sous anesthésie et peuvent engendrer un stress due à l'anesthésie. L'injection de molécules en intrapéritonéal ou en intraveuineux peut engendrer un stress.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prélever les organes, le sang et les tumeurs afin d'étudier l'impact du traitement appliqué.
Remplacement
La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées par observation en imagerie in vivo non invasive dans la mesure du possible. Ainsi, nous remplacerons dans la mesure du possible les mesures invasives par de l'imagerie, permettant de réduire le nombre d'animaux nécessaires.
Réduction
Le nombre d’animaux sera de 5 animaux maximum par groupe. Dans le cas d'une étude d'efficacité de thérapies anti-cancéreuses, il s'agira de distinguer les groupes d’animaux recevant la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence. Nous respecterons ainsi la règle des 3R. Nous utilisons les tests statistiques adéquats en fonction des conditions variables d'expérimentation (t-test ou Wilcoxon ou Mann Withney).
Raffinement
Concernant les mesures de raffinement, les animaux, quelque soit le mode d'injection, seront observés tous les jours afin d’évaluer leur état général. Tout animal présentant une souffrance ou une détresse sera euthanasié. Pour cela, le comportement général de l’animal sera observé (posture, réaction à un stimulus externe tel que le bruit, manque d’appétit, hérissement des poils) et des mesures seront réalisées (poids, taille de la tumeur). Si l’animal perd du poids ou si la taille de la tumeur correspond à une prise de charge tumorale supérieure à 10% (volume max: 1600-1800 mm3) ou si la tumeur est nécrosée, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et sont devenus les modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’Homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. Ils présentent de plus des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Enfin, ils ont déjà été décisifs pour la découverte de plusieurs molécules qui sont utilisés en clinique. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes.
Rôle de Rdh10 dans le contrôle des fonctions du système nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour être déficientes en vitamine A active, elles subissent une série de tests comportementaux moteurs et cognitifs, des examens de la rétine sous anesthésie et des injections répétées d'un marqueur, avant une mise à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur indique vouloir caractériser les conséquences de cette déficience sur le système nerveux et la vision. Il affirme que le modèle murin "n'est pas remplaçable" et reste "indispensable", les modèles cellulaires ne reflétant pas selon lui la diversité des mécanismes in vivo.
Objectifs
La vitamine A et ses formes actives jouent des rôles très importants au cours du développement et dans la physiologie de divers organes. Ces molécules sont les ligands de certains récepteurs nucléaires qui contrôlent l’expression de gènes. Si les fonctions développementales de la vitamine A et de ses récepteurs sont bien caractérisées, les fonctions aux stades adultes restent encore mal connues. Ceci s’explique par le fait que des modèles murins génétiquement modifiés pour étudier la fonction de la vitamine A ne sont pas compatibles avec la survie de l’embryon. La solution trouvée pour palier à ce problème a été de produire un modèle murin génétiquement modifié, déficient en certaines formes actives de la vitamine A, mais supplémenté en celles-ci via l’alimentation maternelle, afin d’obtenir des embryons viables. Ces mutants ainsi obtenus pourront être analysés à l’âge adulte pour caractériser les défauts fonctionnels résultant d’une déficience en vitamine A. L’objectif de ce projet est de caractériser les conséquences liées à un déficit de la forme active de vitamine A : (1) au niveau du système nerveux central, en effectuant un ensemble de tests comportementaux pour analyser les fonctions motrices et cognitives ; (2) au niveau de la vision (les déficits visuels étant la première caractéristique de la déficience en vitamine A chez l’humain) par des analyses des performances visuelles; (3) après complétion des tests, les cerveaux des animaux seront utilisés pour des analyses moléculaires supplémentaires afin de déterminer si le déficit en vitamine A affecte la prolifération cellulaire, et d’analyser ses gènes cibles potentiels.
Bénéfices attendus
Des déficiences dans le métabolisme de la vitamine A se caractérisent chez l’Homme par des troubles de la vision. La vitamine A est obtenue dans l’organisme sous forme bioactive par une enzyme spécifique. Ces formes bioactives de la vitamine A sont ensuite capables de se lier à différents récepteurs pour réguler l’expression de gènes. Différents modèles murins spécifiquement mutants pour ces récepteurs ont été conçus mais ceux-ci ne permettent pas d’étudier les conséquences d’une déficience en vitamine A, contrairement à notre nouveau modèle murin. Celui-ci est déficient en l’enzyme spécifique permettant d’obtenir la vitamine A, privant l’animal de la forme bioactive de la vitamine A. Ainsi, grâce à des études comportementales et visuelles et des analyses moléculaires, les conséquences de cette déficience seront comparées aux différents modèles murins mutés pour les récepteurs de la vitamine A. Ce projet permettra pour la première fois de décrire précisément les conséquences comportementales et visuelles de souris déficientes en formes actives de la vitamine A. Des mutations de certains récepteurs de la vitamine A, avaient déjà été décrites chez l’Humain mais pas entièrement caractérisées, d’où l’intérêt de ce projet pour compléter les connaissances déjà acquises jusqu’ici. Des influences environnementales, notamment nutritionnelles, vont vraisemblablement impacter la santé des individus atteints. C’est pourquoi il est important de disposer de modèles mammifères permettant de reproduire ces anomalies, afin d’en tirer les bénéfices applicables à la santé humaine par la suite. En effet, ils permettent de caractériser les conséquences fonctionnelles et pathologiques, et de les traiter par des stratégies (nutritionnelles, pharmacologiques …) pouvant aussi être mises en œuvre chez les patients humains.
Procédures
Ici, nous voulons étudier les conséquences de la déficience en vitamine A sur le cerveau et les fonctions visuelles. Pour cela, nous réaliserons divers tests comportementaux cognitifs et moteurs sur l’ensemble des animaux utilisés ici (n=24, 12 contrôles ; 12 mutants). Ensuite, la moitié des animaux (n=12) recevront une anesthésie générale par voie respiratoire (pendant 5min) afin de visualiser la rétine et ses potentiels défauts (par observation du fond de l’œil par exemple) chez le mutant. Une semaine après, une seconde expérience sous anesthésie générale par injection dans l’abdomen d’anesthésique et d’analgésique (5sec) sera réalisée pour évaluer la réactivité de la rétine à des flashs lumineux. Enfin, pour caractériser l’effet moléculaire de la déficience en vitamine A, nous procéderons à la mise à mort de l’animal pour ensuite prélever le cerveau et réaliser des analyses moléculaires. Pour déterminer l’effet cellulaire généré par la mutation de l’enzyme spécifique, nous injecterons un produit chimique dans l’abdomen de l’autre moitié des animaux (n=12) pour marquer les cellules en croissance 2 fois par jour (matin et soir) pendant 3 jours pour augmenter le signal du marquage. A l’issue de la dernière injection, les animaux seront anesthésiés généralement et recevront une perfusion intracardiaque afin de fixer les tissus et de prélever le cerveau pour réaliser des analyses immuno-histochimiques. Aucun animal n’est maintenu en vie au cours de ces expériences car nous préleverons le cerveau pour réaliser des analyses moléculaires et immuno-histochimiques.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne dépasseront pas la douleur occasionnée par l’introduction d’une aiguille dans l’abdomen de l’animal pour les injections intra-péritonéales. En effet, les tests comportementaux à effectuer ne sont pas sujets à causer la moindre souffrance, et les analyses rétiniennes sont réalisées sous anesthésie générale sans endommager les yeux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permettent de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires. D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque sera effectuée pour la réalisation de marquages immuno-histochimiques qui nécéssitent une fixation complète et homogène de l’échantillon prélévé.
Remplacement
Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les fonctions cérébrales. Il permet de même les investigations des fonctions visuelles dans le modèle le plus proche de l’Homme. En effet, la complexité biologique des signalisations par la voie rétinoïde ne permet par de remplacer les animaux par des modèles, par exemple cellulaires, parce qu’ils ne reflètent pas la diversité des mécanismes biologiques in vivo.
Réduction
Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés, le nombre d'animaux utilisés (groupes de 12, 6 expérimentaux, 6 témoins) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues, chez des souris de fond génétique mixte à la suite du test Openfield (le moins discriminant des tests effectués ici) ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques. Une différence significative entre les groupes sera recherchée par application d’un test two-way ANOVA, suivi de tests post-hoc. Il a été vérifié préalablement que la distribution des valeurs est normale avec ce type de test. La seule variable incompressible est le nombre de femelles gestantes qui permettra d’obtenir, dans les portées, le nombre de mutants requis pour les procédures. Dans l’optique de réduction, un nombre limité d’accouplements
Raffinement
En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses. Elles consistent uniquement en des études comportementales, dans une plateforme phénotypique à la pointe de l’art (Institut Clinique de la Souris), effectuées en conditions standard sans aucune administration, par exemple, de composés pharmacologiques.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de la vitamine A et les conséquences physiopathologiques de sa dysfonction, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain, des grandes fonctions physiologiques, de l’existence de tests fonctionnels validés pour ce modèle, et de la possibilité de mettre en œuvre des approches préventives (nutritionnelles) ou thérapeutiques qui pourront être ensuite transposées vers l’Humain. Chez l’humain les déficiences en vitamine A se caractérisent par des troubles de la vision. Afin de mieux caractériser le rôle de la vitamine A dans ces troubles, nous utiliserons des animaux adultes (10 semaines).
Optimisation des conditions d’acquisitions par IRM des données anatomo-fonctionnelles
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Rats : 50
250 souris et 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des injections d'agents de contraste au gadolinium ou à l'oxyde de fer sous anesthésie, puis passent des séances d'IRM, non pour étudier une maladie mais pour régler les paramètres et séquences de l'appareil d'imagerie. Le porteur décrit des procédures non invasives et indolores, et prévoit de réutiliser certains animaux entre projets quand c'est possible, les autres étant mis à mort après les acquisitions. Il affirme que le recours aux rongeurs est "inévitable" car l'étude porte sur "l'organisme en entier".
Objectifs
Notre service d’exploration non invasive du petit animal est équipé depuis Juin 2017 d’un imageur par résonance magnétique (IRM) 7T dont le diamètre utile est de 72 mm permettant son utilisation pour les projets de recherche précliniques du petit animal (souris, rat, marmouset). L'IRM est basée sur la mesure des propriétés magnétiques des tissus biologiques, permettant d'obtenir des informations anatomiques, fonctionnelles et métaboliques in vivo et de manière non traumatisante chez le petit animal. Afin de garantir le maintien du statut sanitaire des animaux durant tout le processus expérimental (prise en charge, analyse IRM, renvoi vers les différents sites de zootechnie d'expérimentation), notre service s’est doté d’installations (salle de préparation aménagée, PSM) et d’équipements (cellules de confinements compatibles IRM) spécifiquement développés en partenariat avec un fabricant d’équipements vétérinaires. Il s’agit de la première installation nationale complète permettant le maintien du statut sanitaire des animaux (souris, rat, marmouset) pour l’analyse par IRM. La demande concerne l’autorisation d’utilisation d’animaux pour l’optimisation des paramètres et des méthodes permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle par IRM sur des rongeurs (souris, rats). Ainsi, nous pourrons optimiser des méthodes adaptées à la cardiologie, la vascularisation, la diffusion de molécules d'eau, l'IRM fonctionnelle (cerveau), la mesure de la consommation d’oxygène dans le cerveau et la caractérisation des lipides dans les tissus adipeux par spectroscopie par résonance magnétique. Ces optimisations sont un préalable récurrent pour l’utilisation des nouvelles séquences d’IRM afin d'assurer la reproductibilité et un meilleur compromis sur la qualité de l'image pour les différents projets de recherche dans un environnement confiné, c'est-à-dire réalisées avec nos systèmes de confinement adaptés pour les rongeurs (souris et rats) et la configuration IRM ad hoc (résonateurs, antennes de surface). Les optimisations peuvent aussi inclure le recours à des agents de contraste. Ces agents de contraste, paramagnétiques (gadolinium) ou superparamagnétiques (oxyde de fer), permettent de modifier les temps de relaxation des tissus (foie, muscle, cerveau, cœur, etc.) de manière sélective et ainsi de mieux différencier les tissus sains et malades et les différentes régions anatomo-fonctionnelles.
Bénéfices attendus
L’optimisation de séquences en IRM permettra de réduire le temps que les animaux passent dans l’IRM lors des acquisitions. Ces optimisations permettent aussi de s’assurer de la reproductibilité de nos mesures et de la correcte visualisation des phénomènes physiologiques et physico-chimiques sur les différents modèles animaux qui seront étudiés.
Procédures
Des injections des produits de contraste pourraient être faites par voie intraveineuse ou par intrapéritonéale chez les rongeurs, selon la demande des utilisateurs. Sur des souris ou rats de réforme, on les injectera seulement une fois par projet de faisabilité. Pour des animaux commandés à des fournisseurs externes, le nombre d'injections par semaine sera maximum de 3 (une seule injection pourra être faite par jour). Il est important de mentionner que ces injections n'entrainent aucune douleur ou stress chez les animaux car elles sont faites sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Il s’agit des procédures non invasives, sans douleur et sous anesthésie.
Devenir
Pour les animaux de réforme la mise à mort est réalisée après la séance d'IRM. Pour les animaux des fournisseurs "externes", à la fin des acquisitions IRM, les animaux sont remis dans leur cage de vie et monitorés régulièrement jusqu'au réveil. Toutefois, ces animaux des fournisseurs externes seront sacrifiés à la fin du projet de faisabilité méthodologique.
Remplacement
L’utilisation des rongeurs est inévitable car nous travaillons sur des mécanismes intégratifs et donc sur l’organisme en entier.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé de façon à permettre une validation statistique des résultats expérimentaux préliminaires, tout en tenant compte des exigences de réduction. Nous réutiliserons les animaux disponibles pour différents projets de recherche quand cela sera possible et selon les demandes des utilisateurs.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement et une procédure d’estimation et de suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé à 20% de perte du poids corporel (chez les adultes) avec repérage des signes de mal-être définis au préalable par notre vétérinaire référent. Les animaux provenant des fournisseurs externes auront une période d'acclimatation de 2 semaines au nouvel environnement avant de chaque procédure expérimentale à l'IRM.
Choix des espèces
Comme nous avons indiqué dans le point 3.4.11, nous n'utiliserons que des animaux âgés de plus de 10 semaines dans ce projet. La plupart des utilisateurs de notre service d’imagerie font leurs études sur des animaux âgés de plus de 10 semaines, basés sur la littérature scientifique et le modèle étudié. Du point de vue de l’IRM, l’âge des animaux n’a pas d’impact sur la qualité de l’image. Cependant, nous utilisons des animaux du même âge et taille pour mieux interpréter les données anatomo-fonctionnelles obtenues.
Entérovirus, Immunité systémique et muqueuse, Nanoparticules
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois injections d'immunisation puis des prélèvements de sang et de salive sous anesthésie, pour identifier un candidat vaccin contre les coxsackievirus B, soupçonnés de favoriser le diabète de type 1. Le porteur indique que l'infection ne provoque pas de signes cliniques visibles, la souris n'étant pas un hôte naturel de ces virus. Il affirme que cette étape sur l'animal est "indispensable" et ne peut être remplacée in vitro, les mécanismes en jeu n'étant selon lui pas modélisables.
Objectifs
Les infections entérovirales non poliomyélitiques, en particulier les coxsackievirus B (CVB) sont associés à l'initiation et/ou la progression du diabète de type 1. Une augmentation de l'incidence du diabète de type 1 est observée notamment chez les jeunes de moins de 5 ans. Cette maladie auto-immune qui se manifeste par la perte de fonction des cellules pancréatiques productrices d'insuline résulte d'interactions complexes entre une prédisposition génétique, le système immunitaire et des facteurs environnementaux notamment les CVB. Le but du projet est d'élaborer une stratégie vaccinale universelle contre les CVB et des pathologies qui en découlent telles que le diabète de type 1. Cette stratégie consiste d'abord à identifier la voie d'inoculation générant la réponse immunitaire la plus protectrice vis-à-vis des CVB, puis d'étudier le meilleur candidat vaccin parmi les 5 espèces des CVB.
Bénéfices attendus
La finalité du projet est de choisir le candidat vaccin le plus efficace contre les CVB. Le projet s'inscrit dans la lutte contre les entérovirus; sachant que ces virus ont une responsabilité reconnue dans l'apparition du diabète de type 1.
Procédures
Les interventions type inoculation seront réalisées sous anesthésie, de même que les prélèvements des fluides corporels. L'immunisation se fera au nombre de trois injections. Les prélèvements de sang se feront seulement en 2 fois, à J0 et à terme car des études antérieures du laboratoire ont mis en évidence que les prélèvements intermédiaires n'apportaient pas d'informations significatives pouvant justifier ces prélèvements. Les prélèvements de salive se feront au nombre de 3 prélèvements par souris.
Impact sur les animaux
L'infection aux CVB ne provoque pas de signes cliniques notifiés ou visibles, car la souris n'est pas un hôte naturel des entérovirus utilisés dans ce projet. Cependant, le déroulement de ce projet peut entrainer quelques désgréments chez l'animal au niveau des points d'injection (classe légère), mais toutes les précautions sont mises en place pour limiter la souffrance et le stress de l'animal.
Devenir
A la fin du protocole, une mise à mort de tous les animaux sera réalisée pour la récolte des échantillons nécessaires aux expériences.
Remplacement
Cette étude chez l'animal constitue la dernière étape du projet de recherche. Elle est indispensable pour la suite, et ne peut être réalisée par une méthode in vitro, car les mécanismes en jeu dans cette étude n'étant pas modélisables in vitro.
Réduction
Le choix des échantillons utilisés dans cette étude est la résultante de résultats d'études précédentes in vitro qui ont permis une réduction significative du nombre aussi bien de sérotypes (5 sur une centaine des sérotypes d'entérovirus) que de peptides (3 sur une dizaine de peptides possibles) et, par conséquent, le nombre d'animaux utilisables se retrouve significativement réduit. Le nombre d'animaux par groupe est également prévu pour avoir un effectif minimum permettant des bonnes pratiques d'expérimentation et une analyse statistique significative des résultats.
Raffinement
Les conditions d'hébergement seront étroitement surveillées (enrichissement, alimentation). Le protocole établi prend en compte un nombre limité d'inoculations afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. Les prélèvements de fluides se feront sous anesthésie pour éviter une souffrance inutile. De plus, les points limites (comportement agressif, altération de l'état général, diminution de la sociabilité), seront particulièrement surveillés et les animaux sacrifiés dès la constatation de ces signes afin d'abréger leur souffrance. L'évaluation de la souffrance sera effectuée en utilisant comme support la grille de score incluant comme paramètre le poids, l'état du pelage, le comportement interactif, le score grimace chez la souris et la réaction à la manipulation. Par exemple, suite à l'injection il peut y avoir l'apparition d'abcès qui sera évaluée niveau 3. Ces appréciations seront transcrites sous forme de notes de 0 à 3 (0=absence de douleur, 1=douleur légère, 2=douleur modérée, 3=douleur sévère). Le total sera calculé afin d'apprécier l'état général de l'animal en fontion du score total (de 1 à 5 douleur légère, de 6 à 10 douleur modérée, et de 11 à 18 douleur sévère). Ainsi, le point limite à ne pas dépasser est celui correspondant au score total de 11. Les prélèvements de sang se feront seulement en 2 fois, à J0 et à terme car des études antérieures du laboratoire ont mis en évidence que les prélèvements intermédiaires n'apportaient pas d'informations significatives pouvant justifier ces prélèvements.
Choix des espèces
Ce modèle animal représente l'un des rares modèles à être sensibles aux infections à CVB, ces derniers étant des virus humains. Les animaux seront utilisés à un âge entre 3 et 5 semaines. L'utilisation des animaux à un âge relativement précoce se justifie par le fait que la souris a une sensibilité très variable à l'infection par les entérovirus. Cette variation de sensibilité est surtout liée à l'âge de l'animal: la sensibilité à l'infection par les entérovirus est élevée avant l'âge de 6 semaines et baisse au-delà de cet âge.
Imagerie fonctionnelle dans un modèle de cancer du sein chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales mammaires sous anesthésie, puis pour certaines un anticorps couplé à un isotope radioactif par voie intraveineuse et cinq séances d'imagerie. Le porteur indique que la tumeur peut réduire l'activité motrice et faire perdre du poids, la mise à mort intervenant avant que la tumeur n'atteigne 2000 mm³. Le projet teste un anticorps comme outil de diagnostic d'un cancer du sein agressif, bénéfice clinique présenté au conditionnel, et il affirme que la création de tumeurs chez la souris est "indispensable".
Objectifs
La capacité de notre organisme à se défendre face à des substances étrangères est aujourd’hui l’un des axes de thérapie innovantes notamment contre le cancer. Les anticorps sont des molécules biologiques impliquées dans l’immunité. De ce fait, les anticorps ciblant les tumeurs sont aujourd’hui largement utilisés pour le traitement de patients atteints de cancer. La spécificité des anticorps à aller préférentiellement sur la tumeur permet d’une part de gagner en efficacité thérapeutique mais également de se servir de ces anticorps comme molécule diagnostique. L’association d’un anticorps avec un isotope radioactif permet dans le cadre de la médecine nucléaire d’obtenir un outil d’imagerie in-vivo, non invasif et à haut taux de spécificité. Compte tenu de l’expérience déjà acquise au sein de notre laboratoire, le projet porte sur l’étude des tumeurs liées au cancer du sein. L’objectif de notre projet est de développer une molécule de type anticorps associé au cuivre-64, isotope radioactif, ciblant un type particulier de cancer du sein exprimant une protéine impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire (HER2 positif). Ces cancers HER2 positifs sont plus agressifs et ont un pronostic moins favorable que les autres types de cancers du sein.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de confirmer dans un modèle de cancer mammaire chez la souris la capacité de notre anticorps à ne reconnaître que les cellules cancéreuses porteuses d’une protéine particulière (HER2) à la surface de leur membrane. En cas de confirmation, résultats pourront directement influencer les pratiques cliniques actuelles concernant l’exploration fonctionnelle de ce type de cancer du sein plus agressif et au pronostic moins favorable qu’un cancer du sein n’exprimant pas HER2.
Procédures
L'étude implique des groupes de souris contrôle sans tumeur donc non injectées et des groupes de souris porteuses de tumeurs qui seront injectées avec des cellules tumorales sous anesthésie générale. Ensuite certains groupes de souris contrôles et des groupes avec tumeur recevront une injection d'anticorps radiomarqué par voie intraveineuse sous anesthésie générale (durée 5 minutes) et seront soumis (étude in vivo) à 5 séances d'imagerie d’une durée de 10 à 40 minutes (en fonction du point temporel) alors que d'autres seront inclus dans l'étude ex-vivo (pas d’imagerie, une anesthésie finale en fin d'étude).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont le développement d'une tumeur au niveau du site d'injection. Cette tumeur peut éventuellement induire une diminution de l'activité motrice et/ou une perte de poids lorsque celle-ci a un développement trop important. Les points limites de l'étude ainsi que la durée de l'étude devraient limiter ses effets indésirables. Les études d'imagerie n'induisent pas de stress ou d'effet indésirables par eux même.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude avant l'atteinte du volume de 2000 mm3 de la tumeur.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier les effets d’un anticorps couplé à une molécule radio-active à demie vie longue pour suivre au cours du temps la capacité de cet anticorps à détecter sa cible au sein de la tumeur. Les modèles in vitro ne permettent pas de créer une tumeur vascularisée possédant non seulement un amas de cellules tumorales, mais également une matrice extracellulaire, des cellules stromales de soutien et des vaisseaux sanguins, autant de cibles potentielles des stratégies antitumorales. C’est pour ces raisons que la création de modèles tumoraux chez la souris sont indispensables pour vérifier l’intérêt thérapeutique de cet anticorps comme outil de diagnostic en clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été calculé comme étant le minimum pour pouvoir faire des études statistiques dans ce type d’étude qui présente une grande variabilité interindividuelle.Les résultats obtenus entre les groupes seront analysés par des méthdoes statistiques adaptées permettant d'évaluer si le nouvel outil diagnostic utilisé en imagerie permet un meilleur diagnostic des tumeurs. Le type d'imagerie que nous utilisons permet de réduire le nombre d’animaux car un même animal peut être suivi à des différents points temporel. En fonction des données recueillies au cours de l’étude d’imagerie, le nombre de points de mesure prévu dans l’étude de distribution de biodistribution pourra être revu à la baisse ce qui concourra à réduire encore le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont placés à plusieurs par cage afin de respecter l'interaction sociale et dans un environnement enrichi (frisure de papier kraft, carré de cellulose, tunnel) afin de stimuler leur activité motrice. Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum. Des tunels sont également ajoutés dans les cages pour limiter l'agressivité entre congénères. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être. Pour se faire, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront, de sortir l'animal de l'étude et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort. Une grille d'observation adaptée à ce protocole permet de mettre en évidence ces points limites. Pendant les séances d'imagerie les animaux sont anesthésiés, hydratés et rechauffés et leurs paramètres vitaux (température et fréquence respiratoire) monitorés en continu. Un gel ophtalmique est appliqué en début de séance pour éviter le dessèchement oculaire
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu dans la communauté pour le développement de cancer induit par l'injection de cellules cancéreuses et permet également de tester la pertinence d’une approche thérapeutique. L’âge de 7 semaines correspond aux standard de la littérature dans ce domaine.
Analyses de l’infiltration immunitaire au sein de l’ovaire par des cellules issues de moëlle de souris invalidées ou non pour les récepteurs aux oxystérols LXR (Liver X Receptors) chez une souris hôte immunocompromise.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 15 sans réveil. Elles reçoivent une greffe de moelle par voie intraveineuse au sinus rétro-orbital, un prélèvement sanguin puis une stimulation hormonale provoquant une superovulation, avant mise à mort pour prélever ovaires et tissus lymphoïdes. Le porteur indique qu'une réaction du greffon contre l'hôte peut survenir et précise qu'aucun traitement antidouleur ne sera administré car il modifierait les paramètres de l'expérience, les animaux atteints étant alors tués. Il étudie le rôle de récepteurs dans l'hyperstimulation ovarienne liée à la procréation assistée et justifie la souris par la proximité de son cycle avec celui de l'humain.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans un démarche d’exploration de l’étiologie moléculaire de l’OHSS. Nous utiliserons des échantillons ovariens issues de souris NSG ayant subi une greffe de cellules de moelle issues de souris WT, invalidées pour les récepteurs LXRs et ces mêmes souris avec un transgène permettant le sauvetage spécifique des cellules de Granulosa. Le but du projet est de visualiser in vivo, le comportement des cellules immunitaires issues des moelles greffées sur le profil d’infiltration du tissu ovarien. Ce test fonctionnel in vivo va nous permettre de mieux comprendre la place jouée par LXR au sein de ces cellules dans la genèse du phénotype. Après 1 mois post- greffes, les souris seront soumises à un protocole de stimulation hormonale comme suit en vue d’une superovulation par Injection IP de PMSG, 7,5UI/souris. Les tissus prélevés seront analysés par des techniques d’histologie et d’immunohistochimie par l’étude de marqueurs des différents sous types immuniaires afin de caractérisé l’infiltrat. Ces études seront conduites en utilisant 3 donneurs de moelle osseuse distinct : 1) La lignée sauvage (Wild-Type ou WT) servant de control, 2) la lignée LXRs invalidés (LXR DKO ou LXR-/-) correspondant à un knock-out total des récepteurs LXRalpha et LXRbeta et 3) la lignée rescue pour l'expression de LXRbeta spécifiquement dans les cellules de Granulosa (Tg-AMH LXRbeta). Nous anticipons que les lignées KLXR DKO et Tg-AMH LXRbeta devrait se comporter de manière identique puisque les cellules immunitaires issues de ces souris sont déficientes pour les récepeteurs LXR. Ainsi nous pourront évaluer l'étendue et les caractéristiques de l'ensemble des infiltrats au regard du génotype des moelles implantées. Ainsi nous espérons être en mesure de conclure quand au rôle des LXRs dans les cellules immunitaires au sein de l'ovaire lors de la stimulation hormonale par la PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin).
Bénéfices attendus
Cette étude, couplé au reste du projet de recherche, qui est de plus grande envergure, va ainsi permettre de connaitre le role intrinsèque joué par les récepteurs LXRs au sein du compartiment immunitaire qui compose le tissu ovarien. Plus précisement, la greffe de cellules issues des souris transgéniques sauvages ou invalidées pour les LXRs sera injecté dans des souris avec un fond génétique NSG. Ceci va permettre de faire un rescue du répertoire immunitaire des ces souris et les cellules de l'immunité spécifiqes devraient ainsi recolonisées l'ovaire permettant de mieux comprendre comment ce dernier réagit à la stimulation à la PMSG. En termes plue vulgariseés, cette étude va permettre de comprendre le role des récepteurs LXR qui se trouve dans les cellules immunitaires au cours de la réponse de l'ovaire à une stimulation hormonale chez des patientes inclus dans un programme de procréation assistée. In fine, ces travaux pourraient permettre de trouver des biomarqueurs prédictifs de la réponse ovarienne à cette stimulation hormonale et ainsi éviter l'apparition de situation pathologique telle que le syndrome d'hyperstimulation ovarienne.
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : prélèvement sanguin par voie sous mandibulaire NOMBRE 1 DUREE 1 minute Procédures d'implantation de moelle : implantation sous anesthésie par voie intraveineuse dans le sinus retro-orbitaire NOMBRE 1 DUREE 3 minutes
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans la présente demande sont largement utilisée dans de nombreux laboratoire, en particulier dans le domaine de l'immunologie. Ainsi, il y a un recul très important sur les nuisances susceptibles d'être rencontrée au cours des différentes procédures. Certains animaux peuvent éventuellement développer une GVH. De fait, les souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) après la troisième semaine pour détecter toute manifestation de mal-être ou de souffrance. Aucun traitement antalgique ne pourra être réalisé car il conduira de facto à modifier les paramètres expérimentaux (en particulier les anti-inflammatoires). En cas de GVH, les animaux seront euthanasiés.
Devenir
Chaque animal sera implanté par une moelle d'un donneur sauvage ou transgénique puis inclus dans le protocole de stimulation par la PMSG. L'ensemble des animaux seront mise à mort en fin d'experimentation pour prélèvement des ovaires et tissus lymphoïdes secondaires en vue de la caractérisation du profil immunitaire.
Remplacement
Cette étude fait suite à des tests réalisés in vitro en culture de cellules ayant permis de caractériser le comportement des cellules vis à vis de leur statut LXR. Ceci permet donc de limiter notre étude fonctionnelle sur un nombre limiter d’individus pour valider le phénotype d’infiltration in vivo. Cette approche d'anticipation permet ainsi de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés et limiter l'étude au strict nécessaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante (test ANOVA) à l’issue du protocole, celui-ci a été fixé à 45 individus.
Raffinement
Deux points sont à prendre en compte : i) les animaux en particulier les lignées transgéniques peuvent répondre de manière « exagérée » au traitement hormonale qui induit l’hyperstimulation. De fait, ces lots de souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) pour détecter toute manifestation de mal-être ou de souffrance. Cependant, le protocole post induction est relativement court puisque les souris seront mis à mort 40 heures après l’injection de PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin. ii) l’implantation de cellules immunitaires dans les porteurs NSG peut dans certains cas induire une réponse de l’hôte contre le greffon (GVH-Graft Versus Host syndrome). Cette réponse apparaît dans les 3 semaines qui suivent l’implantation. A cette période, les souris seront mises en observation soutenues pour détecter toutes manifestations de ce syndrome. Toutefois, ce type de complication est rencontrer essentiellement lors du conditionnement des souris par irradiation, ce qui n’est pas le cas ici, ou lors de l’injection de cellules immunitaires « matures » (PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells). Dans le cas présent les cellules injectées seront des cellules de moelle, qui présente un risque faible de GVH.
Choix des espèces
Le cycle oestrien et la physiologie de l’ovaire chez la souris sont très proche de l’espèce humaine. En parallèle, l’existence de lignées transgéniques d’intérêt pour l’étude de l’OHSS justifie le choix du modèle murin. Enfin, le modèle NSG constitue un modèle de choix pour la transplantation de cellules de moelle. Nous utiliserons des femelles de 8 semaines concernant les donneurs de moëlles et des souris de 2 à 4 mois pour le modèle NSG. Les âges ont été determiné à partir des données de la littérature.
Évaluation du potentiel anti-obésité d’un composé ciblant le récepteur à l’Acide gamma amino butyrique de type B (GABAB))
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont rendues obèses par un régime gras pendant douze semaines, reçoivent un composé par gavage oral et subissent des prélèvements sanguins lors de tests de tolérance au glucose, avant une mise à mort pour analyser sang et tissus. Le porteur reconnaît un isolement en cage individuelle pour mesurer la prise alimentaire, compensé selon lui par le rapprochement des cages. Il teste un candidat médicament anti-obésité et affirme qu'il "n'existe pas d'autre alternative" que l'animal, un modèle informatique étant selon lui impossible.
Objectifs
Contexte : Pour les autorités réglementaires, la prévention de l'obésité d'origine alimentaire chez le rongeur est le modèle classique pour étudier l'effet des médicaments anti-obésité. Nous allons utiliser un modèle d’obésité d’origine alimentaire, des souris seront rendues obèses par exposition à un régime riche en graisse (RRG), dans lequel les lipides représentent 60% de l’apport calorique, les animaux seront mis en contact avec cette alimentation pendant 12 semaines avant de débuter le traitement.
Bénéfices attendus
L’obésité est un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Actuellement, plus de 300 millions de personnes sont obèses et ce nombre ne cesse de s’accroître. Ces patients ont un risque accru de développer des pathologies chroniques telles que le diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et plusieurs types de cancers. Soigner l’obésité permettrait ainsi de réduire de manière significative l’incidence de toutes ces maladies associées. Malheureusement, les traitements existants à l’heure actuelle sont peu efficaces et les régimes hypocaloriques ne conduisent qu’à une perte de poids temporaire, suivie très fréquemment par un retour rapide au poids initial dès la fin du régime (phénomène dit de « yo-yo »). Seule une intervention chirurgicale associant une réduction de la taille de l’estomac et une déviation de l’intestin est à ce jour efficace à long terme pour traiter l’obésité. Cependant, les risques et effets secondaires liés à cette chirurgie en font un choix de dernier recours réservé aux cas d’obésité les plus graves. Nous manquons ainsi de traitements qui permettraient une prise en charge efficace de la majorité des patients obèses tout en limitant les contraintes et effets secondaires. Ce type d’étude permettrait de découvrir de nouvelles pistes de traitement pharmacologique.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront potentiellement réalisés lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, si le composé montre une efficacité à diminuer le poids corporel des animaux obèses. Les quantités de sang prélevées sont minimes et correspondent à moins de 1% du volume sanguin total. L'acte en lui-même n'est pas douloureux.
Impact sur les animaux
Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte pour nous permettre de pouvoir quantifier la consommation de nourriture, afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Afin de réduire au maximum le stress ressenti par les animaux lors des différents actes expérimentaux (gavage, RMN, test de tolérance …), nous allons habituer les animaux aux expérimentateurs et à l’acte lui-même quand cela sera possible (habituation au gavage une semaine avant le début du traitement). De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement, nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront mises à mort à la fin de l'expérience pour récupérer du sang et des tissus afin de réaliser des études biochimiques et moléculaires complémentaires.
Remplacement
Pour évaluer l'efficacité d’une nouvelle thérapie pour lutter contre l’obésité, il n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale, le niveau de complexité d’une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que les nombreux mécanismes biologiques qui contrôlant la balance énergétique restent inconnus. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, que ce soit le rongeur ou l'humain. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement différent serait donc inappropriée.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé́ en se basant sur notre expérience ultérieure et en utilisant un estimation mathématique adapté. Les résultats seront analysés en utilisant des tests statistiques appropriés.
Raffinement
1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 18 semaines (10 semaines de RRG chez l’éleveur). Ils seront manipulés pendant 2 semaines, une semaine d’habituation générale à la manipulation des animaux (mesure du poids corporel et de la prise alimentaire) et 1 semaine d’habituation à l’administration par gavage oral. Cette habituation, permettra de diminuer le stress des animaux en réponse aux expérimentateurs et aux procédures qui seront pratiquées tout au long de l'étude. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement se compose de frisure de papier kraft et de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et d’un tunnel en carton pour se cacher et réaliser le transfert et la manipulation des animaux. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, les attitudes, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant) et permettent de décider si l'animal peut être maintenu dans l'étude ou s'il doit être mis à mort afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et de la balance énergétique fait de la souris un bon modèle prédictif. Toutes les souris arriveront à l’âge de 18 semaines dans notre animalerie, et nous commencerons un traitement de 4 semaines à partir de l’âge de 20 semaines (deux semaines d’habituation). Nous allons étudier l’effet d’un composé sur des animaux obèses, pour cela nous avons besoin que les animaux soient en contact avec le RRG pendant un minimum de 12 semaines (début du RRG chez des animaux adultes et âgés de 8 semaines).
Etude, chez le rat à microbiote humain, des flux microbiens et de l’impact sur la santé de produits laitiers fermentés (yaourts et fromages) fabriqués à partir de lait de vaches issues d’élevages agro-écologique ou intensif.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
224 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nés sans flore intestinale, ils reçoivent par gavage le microbiote de volontaires humains, subissent des prélèvements de selles hebdomadaires, un passage isolé de 24 heures en chambre respiratoire et une contention en tube pour mesurer leur composition corporelle, avant autopsie. Le porteur reconnaît que l'hébergement individuel et le gavage sont sources de stress, tout en les présentant comme brefs. L'objet du projet est de comparer l'effet sur la santé de yaourts et fromages issus d'élevages "agro-écologique ou intensif", et il affirme un "recours absolu" au modèle animal.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer si des produits laitiers fermentés (yaourts et fromages affinés) fabriqués à partir de lait de vaches élevées en système agro-écologique ou intensif, impactent différemment la santé du consommateur
Bénéfices attendus
Le projet vise à faire la preuve de concept de la divergence de qualité de différents produits laitiers (fromages affinés ou laits fermentés) fabriqués à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif et des conséquences positives ou négatives respectives sur la santé du consommateur
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, 3) Le passage dans les chambres respiratoires, qui permet de mesurer les gaz excrétés par les animaux (H2, CO2 et CH4), est réduit à son minimum de 24h et enfin 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.
Impact sur les animaux
Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de ce projet des volontaires sains, l'alimentation est, de plus, adaptée, n'entrainant pas de troubles digestifs ou de croissance. La supplémentation, basée sur des produits laitiers fermentés de consommation courante, n'entraine pas non plus de nuisance ou d'effets indésirables pour les animaux. Cependant le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités. Le placement des animaux en cage individuelle peut occasionner un stress lié à la découverte d'un nouvel environnement et à l'absence de congénaire. Bien que les animaux s'adaptent rapidement, une surveillance accrue sera mise en place pendant toute la durée de la procédure pour détecter d'éventuels signes de mal être. Si des signes apparaissent et persistent pendant les 3 premières heures du passage en chambre respiratoires, les animaux retourneront dans leurs hébergements d'origine. Ce stress est limité par le temps de passage dans les chambres respiratoires réduit à son minimum (24h) et des enrichissements type Sizzle Nest sont également ajoutés à l'environnement pour permettre la réalisation de nid par les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’évaluation de l’impact santé de produits laitiers fermentés étudiés (yaourts et fromages produits à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif) nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ces produits sur l’intégrité intestinale (perméabilité, immunité) et la santé cardio-métabolique (masse grasse, tissus adipeux et hépatiques) chez l’homme. Ceci nécessite en effet une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.
Raffinement
Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques, les prélèvements de selles et le passage en chambre respiratoire. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvemets de selles. De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. la classification modérée lors du passage en chambre respiratoire est justifiée par le fait que les animaux doivent etre places seul dans ces equipements afin de mesurer individuellement les excretions de gaz. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 8 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 8 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.