Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Optimisation des conditions d’acquisitions par IRM des données anatomo-fonctionnelles
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Rats : 50
250 souris et 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des injections de produits de contraste sous anesthésie pour régler les paramètres d'un appareil d'IRM, l'enjeu déclaré étant d'optimiser les réglages de l'imageur plutôt que de produire une connaissance biologique. Le porteur décrit ces injections comme n'entraînant "aucune douleur ou stress" puisque réalisées sous anesthésie, et prévoit la mise à mort des animaux de réforme après la séance comme des animaux extérieurs en fin de projet. Il affirme que le recours aux rongeurs est "inévitable" parce que l'étude porte sur "l'organisme en entier".
Objectifs
Notre service d’exploration non invasive du petit animal est équipé depuis Juin 2017 d’un imageur par résonance magnétique (IRM) 7T dont le diamètre utile est de 72 mm permettant son utilisation pour les projets de recherche précliniques du petit animal (souris, rat, marmouset). L'IRM est basée sur la mesure des propriétés magnétiques des tissus biologiques, permettant d'obtenir des informations anatomiques, fonctionnelles et métaboliques in vivo et de manière non traumatisante chez le petit animal. Afin de garantir le maintien du statut sanitaire des animaux durant tout le processus expérimental (prise en charge, analyse IRM, renvoi vers les différents sites de zootechnie d'expérimentation), notre service s’est doté d’installations (salle de préparation aménagée, PSM) et d’équipements (cellules de confinements compatibles IRM) spécifiquement développés en partenariat avec un fabricant d’équipements vétérinaires. Il s’agit de la première installation nationale complète permettant le maintien du statut sanitaire des animaux (souris, rat, marmouset) pour l’analyse par IRM. La demande concerne l’autorisation d’utilisation d’animaux pour l’optimisation des paramètres et des méthodes permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle par IRM sur des rongeurs (souris, rats). Ainsi, nous pourrons optimiser des méthodes adaptées à la cardiologie, la vascularisation, la diffusion de molécules d'eau, l'IRM fonctionnelle (cerveau), la mesure de la consommation d’oxygène dans le cerveau et la caractérisation des lipides dans les tissus adipeux par spectroscopie par résonance magnétique. Ces optimisations sont un préalable récurrent pour l’utilisation des nouvelles séquences d’IRM afin d'assurer la reproductibilité et un meilleur compromis sur la qualité de l'image pour les différents projets de recherche dans un environnement confiné, c'est-à-dire réalisées avec nos systèmes de confinement adaptés pour les rongeurs (souris et rats) et la configuration IRM ad hoc (résonateurs, antennes de surface). Les optimisations peuvent aussi inclure le recours à des agents de contraste. Ces agents de contraste, paramagnétiques (gadolinium) ou superparamagnétiques (oxyde de fer), permettent de modifier les temps de relaxation des tissus (foie, muscle, cerveau, cœur, etc.) de manière sélective et ainsi de mieux différencier les tissus sains et malades et les différentes régions anatomo-fonctionnelles.
Bénéfices attendus
L’optimisation de séquences en IRM permettra de réduire le temps que les animaux passent dans l’IRM lors des acquisitions. Ces optimisations permettent aussi de s’assurer de la reproductibilité de nos mesures et de la correcte visualisation des phénomènes physiologiques et physico-chimiques sur les différents modèles animaux qui seront étudiés.
Procédures
Des injections des produits de contraste pourraient être faites par voie intraveineuse ou par intrapéritonéale chez les rongeurs, selon la demande des utilisateurs. Sur des souris ou rats de réforme, on les injectera seulement une fois par projet de faisabilité. Pour des animaux commandés à des fournisseurs externes, le nombre d'injections par semaine sera maximum de 3 (une seule injection pourra être faite par jour). Il est important de mentionner que ces injections n'entrainent aucune douleur ou stress chez les animaux car elles sont faites sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Il s’agit des procédures non invasives, sans douleur et sous anesthésie.
Devenir
Pour les animaux de réforme la mise à mort est réalisée après la séance d'IRM. Pour les animaux des fournisseurs "externes", à la fin des acquisitions IRM, les animaux sont remis dans leur cage de vie et monitorés régulièrement jusqu'au réveil. Toutefois, ces animaux des fournisseurs externes seront sacrifiés à la fin du projet de faisabilité méthodologique.
Remplacement
L’utilisation des rongeurs est inévitable car nous travaillons sur des mécanismes intégratifs et donc sur l’organisme en entier.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé de façon à permettre une validation statistique des résultats expérimentaux préliminaires, tout en tenant compte des exigences de réduction. Nous réutiliserons les animaux disponibles pour différents projets de recherche quand cela sera possible et selon les demandes des utilisateurs.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement et une procédure d’estimation et de suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé à 20% de perte du poids corporel (chez les adultes) avec repérage des signes de mal-être définis au préalable par notre vétérinaire référent. Les animaux provenant des fournisseurs externes auront une période d'acclimatation de 2 semaines au nouvel environnement avant de chaque procédure expérimentale à l'IRM.
Choix des espèces
Comme nous avons indiqué dans le point 3.4.11, nous n'utiliserons que des animaux âgés de plus de 10 semaines dans ce projet. La plupart des utilisateurs de notre service d’imagerie font leurs études sur des animaux âgés de plus de 10 semaines, basés sur la littérature scientifique et le modèle étudié. Du point de vue de l’IRM, l’âge des animaux n’a pas d’impact sur la qualité de l’image. Cependant, nous utilisons des animaux du même âge et taille pour mieux interpréter les données anatomo-fonctionnelles obtenues.
Développement d’un nouveau système de régulation génique contrôlé par la nutrition. Application à un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
498 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 450 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une greffe de métastases hépatiques de cancer colorectal, des injections répétées d'un vecteur viral et de molécules anticancéreuses, un gavage trois fois par semaine et des prélèvements de sang jusqu'à une ponction intracardiaque terminale, pour valider un système de régulation génique appelé NUTRIREG. Le porteur renvoie le transfert vers l'homme à une échéance qu'il qualifie de "rapide", tandis que les atteintes infligées aux souris sont immédiates. Il indique avoir mené des expériences in vitro préliminaires mais juge "indispensable" de répéter les expériences sur les animaux.
Objectifs
ll est nécessaire de valider notre système de régulation génique NUTRIREG dans un modèle de pathologie pour pouvoir envisager des tests cliniques chez l'homme. Nous avons choisi le modèle des métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC), pour son intérêt médical, sa faisabilité et son transfert rapide en médecine humaine. En effet, le foie est le site privilégié des métastases du cancer colorectal puisqu'il concerne 50% des patients, avec seulement 25% de survivants à 5 ans. Par ailleurs, notre voie de régulation est très réactive dans le foie. Nous avons ainsi choisi d’utiliser NUTRIREG dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL associé ou non avec une molécule anti-cancéreuse (ONC-212 ou 5-Fu). Il a été démontré que ces 2 molécules sont capables d'améliorer l'action de TRAIL pour induire l'apoptose des cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons maintenant valider l’approche NUTRIREG dans un modèle animal pour le traitement d’une pathologie de façon à pouvoir rapidement transférer cette technologie à l’homme. Nous avons choisi d’utiliser NUTRIREG dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie gazeuse pour implanter les métastases hépatiques (Procédure 1, 30 min par souris). Cette procédure inclut également une injection en sous-cutané de Torbugésic sur animal vigile 10 à 15 min avant la chirurgie). La luciférine sera injectée en IP sur animal vigile avant anesthésie gazeuse pour mesure de la bioluminescence 2 fois par semaine (Procédure 2, 15 min par souris). Un vecteur AAV sera injecté dans la veine de la queue au début de l'expérimentation, sur animal vigile maintenu en contention dans un tube, après dilatation des veines sous lampe chauffante (Procédure 3, 10 min par souris). L'anticorps MD5 sera injecté en IP sur animal vigile une fois par semaine (Procédure 5, 1 min par souris). La molécule ONC-212 sera administrée par gavage 3 fois par semaine sur animal vigile (Procédure 8, 3min par souris) et le 5-Fu sera injecté en IP une fois par jour sur animal vigile (Procédure 8, 1min par souris). Du sang sera prélevé chez ces souris, 2 fois au cours de l'expérimentation en sub-mandibulaire sur animal vigile (Procédure 6, 2 min par souris) et à la fin de l'expérimentation par ponction intra-cardiaque sous anesthésie gazeuse (Procédure 7, 2min par souris).
Impact sur les animaux
Durant l'étude, tout sera mis en oeuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition tube plastique rouge et/ou bille métallique). Pour chaque expérience, des points limites (perte de poids, prise alimentaire, comportement...) seront définis et des groupes "contrôles" adaptés au protocole seront constitués.
Devenir
Pour toutes les procédures sauf la n°7 : il n’y a pas de mise à mort avant la fin de la totalité de l'expérience. Procédure 1 --> "Génération du modèle murin de métastases hépatiques par injection de cellules murines de cancer colique dans la rate" : le comportement des souris est surveillé afin de leur administrer une nouvelle dose de Torbugésic en cas de signe de mal-être.. Procédure 2 --> "Mesure de la bioluminescence émise par l'expression du gène rapporteur luciférase dans les cellules murines de cancer colique" : Les souris regagnent leur cage après le retour de la mesure de bioluminescence. Procédure 3 --> "Injection du vecteur AAV dans la queue des souris" : Les souris sont hébergées dans des cages à filtre durant une semaine après l’injection des AAV. Procédure 4 --> "Protocole nutritionnel avec consommation de régimes carencés en acide aminés" : les souris sont, de manière alternée : mises à jeun, nourries avec du régime carencé pour activer la voie puis avec du régime contrôle pour éviter les effets néfastes d’une carence trop longue. Procédure 5 --> "Potentialisation de l’action de la protéine TRAIL avec un anticorps monoclonal MD5-1 dirigé contre le récepteur à TRAIL (DR5)" : les souris regagnent leur cage après injection IP. Procédure 6 --> "Prélèvements sanguins au niveau de la veine submandibulaire " : les souris regagnent leur cage après la prise de sang Procédure 7 --> "Prélèvements sanguins par voie intra-cardiaque" : les souris sont anesthésiées sans réveil pour réaliser cette prise de sang. Procédure 8 --> "Amélioration de l’action de la protéine TRAIL par administration d'une molécule anticancéreuse" : les souris regagnent leur cage après administration de ces molécules.
Remplacement
De nombreuses expériences préliminaires réalisées in vitro sur la lignée de carcinome colique MC38 ont permis d'abord de tester l'efficacité de TRAIL combinée avec l'anticorps MD5-1 puis ensuite de sélectionner 2 molécules (5-Fu et ONC-212) qui sont capables de faciliter l'action apoptotique de TRAIL. Ces expériences ont permis dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience est calculé au minimum en fonction du test statistique retenu. Cependant, étant donné l'hétérogénéité inter-animal notamment pour le développement des métastases hépatiques, il s'avère indispensable de répéter les expériences.
Raffinement
Durant l'étude, tout sera mis en oeuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition tube plastique rouge et/ou bille métallique). Pour chaque expérience, des points limites (perte de poids, prise alimentaire, comportement...) seront définis et des groupes "contrôles" adaptés au protocole seront constitués. Si un animal présentait un état douleureux inacceptable ou des signes de mal-être important, il sera examiné par un responsable de la mise en oeuvre du projet, et si nécessaire, anesthésié puis euthanasié. Par ailleurs, l'utilisation de cellules exprimant la luciférase pour générer les métastases hépatiques nous permettra de suivre leur évolution à l'aide d'une méthode non invasive (bioluminescence).
Choix des espèces
La souris est l'animal de référence dans ce type d'étude. Les souris utilisées dans ce projet sont de fond génétique C57 Bl/6. Des souris mâles jeunes adultes de 3-4 mois sont utilisées pour le modèle murin de MHCC. Le stade adulte (3-4 mois) permet de s’affranchir des effets liés au développement de l’animal ou par la suite de ceux liés au vieillissement.
« Read-out » pharmacologique par hypothermie induite et biodistribution chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Elles reçoivent des injections de vecteurs par plusieurs voies et des prélèvements de sang à la queue, l'effet étant lu à travers une baisse provoquée de leur température corporelle, pour évaluer des molécules censées franchir la barrière du cerveau. Le porteur reconnaît un risque de choc immunitaire, de réaction allergique ou de détresse cardio-respiratoire, tout en pariant sur l'absence d'effet à court terme. Les animaux sont tués par exsanguination sous dose létale d'anesthésique pour prélever sang et tissus.
Objectifs
Les neuropathies, myopathies, et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde et, à l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent très insatisfaits, sans aucuns traitements curatifs, ou palliatifs. Les maladies neurodégénratives telles qu’Alzheimer ou démences associées, les maladies lysosomales, les myopathies (Duchenne) sont des exemples d'enjeux de santé publique. Ces dernières années, les recherches privées et publiques ont augmenté leurs efforts de recherches, suscitant de grands espoirs pour les patients malades et leurs familles. Cette demande de projet s’inscrit dans cette dynamique, avec pour objectif d’améliorer et de proposer à terme des perspectives thérapeutiques. Le savoir-faire de la société consiste en la conjugaison de peptides vecteurs à des pro-drogues ou molécules en cours de développement, voire déjà utilisées sur le marché, mais dont l'efficacité reste insuffisante ou encore à démontrer. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces par manque de passage et d'accès au région ou organes à traiter. La maladie d’Alzheimer est un de ces exemples de neuropathies majeures, pour laquelle aucun traitement efficace n’existe, tout comme bon nombre de pathologies périphériques ou cancers. L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaitre des partenaires endogènes spécifiques (récepteurs cellulaires) et d'utiliser leurs mécanismes naturels de trancytoses pour traverser les barrières cellulaires, protectrices des régions et organes sensibles de l'organisme. Dans notre cas, il s'agira en priorité du passage de la Barrière HématoEncéphalique (BHE) vers le système nerveux central (SNC). Par ce principe, nous pouvons passer naturellement ces barrières et amener in situ le médicament par la technique du cheval de Troie. Un avantage considérable qui permet de concentrer les médicaments au niveau des tissus à traiter et ainsi, de potentialiser les chances de traitements. Cette demande de projet s'inscrit dans ce contexte, en développant et optimisant nos molécules-vecteurs (VHH : Domaine variable chaine lourde Anticorps) pour améliorer la délivrance d’agents thérapeutiques. Par des approches systémiques, en administration intra-veineuses ou dermiques, en sous-cutanées, nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments, sur lignée murine consanguine (C57BL/6J) et génétiquement modifiée pour un récepteur cible.
Bénéfices attendus
En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos VHH et les faibles quantités administrées (3R : raffinement), ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. Le faible nombre d'individus et l'optimisation des tests mettent en avant l'importance et la nécessité de bien caractériser la procédure. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos Vecteurs médicaments (VHH) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Au cours de notre procédure, nous allons manipuler les animaux en vigile, ce pour toutes les administrations (administration i.v. 5.5ml/kg ; i.p. ou s.c.10ml/kg) ou prélèvements de sang intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl). Les administrations, rapides (quelques secondes) et précises, se feront sous forme de bolus ou injections répétées. L’expertise des expérimentateurs garantit la rapidité du geste et de la manipulation sans stress. De même, le prélèvement intermédiaire, en caudal (PI) (≤ 50 microlitres) sera réalisé en 1 seule fois. L'animal sera alors placé et immobilisé en contention spécialisée, puis, par une légère et micro-incision cutanée de l’extrémité de la queue (idem biopsie génotypage), le sang sera collecté sur tube hépariné (10UI/ml) ou EDTA, à raison de 2-3 gouttes de 50 µl de sang. En point final de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour l’exsanguination et les prélèvements de tissus/organes. Les prélèvements finaux en post-mortem (exsanguination, prélèvements tissulaires) se feront sur animal euthanasié : anesthésié/analgésié à dose létale (Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg), aiguille 25G (‘’5/8’’ ; 0.5*16mm), environ 10 minutes avant la fin de la cinétique. Donc ici, pas de procédures chirurgicales avec réveil, seulement une euthanasie et prélèvements sur du post-mortem.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous proposons d’étudier nos VHH sur des temps d’incubation relativement courts. D’une part, sur un read-out de la thermorégulation corporelle, pour valider le passage spécifique à travers la barrière hémato-Encéphalique du cerveau. D’autre part et sur les mêmes animaux, une biodistribution plus précise et quantifiable de nos VHH sélectionnés, et/ou une mesure d’efficacité, par dosage des quantités d’ANRm rémanentes dans les organes ou tissus d’intérêts. Les cinétiques d'incubations (maximum quelques jours) ne suffisent pas à générer d'effets indésirables ou de conséquences physiologiques, notamment, car les conjugués administrés présentent une demi-vie relativement courte, de quelques minutes à quelques heures. Le principal risque se trouve être la réaction immunitaire aigüe et spontanée. Dans le cadre de nos recherches, ces problématiques sont étudiées en amonts et en post-expérimentales (immunogénicité) couplée par de la littérature, ainsi que de notre expertise chimie et in vivo. Les composés VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité. Le savoir-faire de la société et les données issues de la littérature nous permettent d'anticiper les principaux risques de toxicité, couramment observés post-administration (choc immunitaire (anaphylactique) ; réaction allergique ; détresse cardio-respiratoire ; modification et troubles comportementaux). Dans le cadre de nos études, les conjugués VHH pourront être couplés à des peptides, drogues, ou autres, tel que de petits ARN interférents (siRNA). Ces derniers nous intéressent particulièrement, car leur rôle sera de bloquer en amont les ARN messagers responsables de l’expression de protéines impliquées dans l’apparition symptomatique de certaines pathologies. Notre étude, sur fond standard C57BL/6J et lignée hTfr (même fond ; cf. Annexe 2), permettra de mieux comprendre et appréhender les disfonctionnements physiologiques, sans que pour autant nos conjugués VHH n'aient, à court termes, d’effets sur la santé et le bien-être animal (3R : raffinement). Malgré ces précautions, une observation comportementale des animaux sera faite de manière quotidienne, à la recherche du moindre signe de souffrance (cf. Procédure, annexe1 MGS), le tout accompagné d'un suivit du poids des animaux entre le début et la fin des cinétiques, afin de s'assurer que les animaux ne perdent pas plus de 10% de poids initial.
Devenir
A l'issue de la procédure (biodistribution) les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de sang et tissus (Dose létale d'anesthésique en intrapéritonéal ; Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg). Si des problèmes ou souffrances anormales sont rencontrées en cours de procédure, alors les animaux seront immédiatement sédatés par la même solution d’anesthésique à dose létale, suivit d’un sacrifice par une dislocation des cervicales.
Remplacement
Pour mener à bien nos modèles précliniques après validation in vitro, nous envisageons de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, modèle indispensable pour l’étude des mécanismes in situ (3R : remplacement). Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres physiologiques, mécanistiques et homéostasiques, indispensables pour étudier une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit pour cela de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. Les faibles cohortes d'animaux permettront, malgré tout, d’obtenir un maximum de résultats, suffisant pour l’obtention de données statistiques significatives (3R : remplacement et réduction).
Réduction
L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur de petits groupes de n=4, à raison de 240 souris/an, réparties sur 3 études de 80 individus (10 groupes sur fond C57BL/6J et 10 groupes sur fond mutant hTfr), suffisant pour appréhender un effet de la sélection de conjugués sur les souris des 2 lignées. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus) nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, un test de Kolmogorov-Smirnov ou encore une analyse de variance (N.S one-way ANOVA). En cas d’analyse dite qualitative, on parlera de succès ou d’échec. Pour la partie échantillonnage et prélèvements de tissus en fin de procédure, une liste précise et déclinée sur plusieurs types de post-expérimentations, permettra d'optimiser chacune des souris, de manière qu'il n'y ait pas d'utilisation abusives et inutiles de souris. La réalisation de prélèvements intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl) en cours de cinétique permettra d'obtenir des données plasmatiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal (voir points limites Annexe 1 MGS), appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien et vétérinaire pour exercer dans le respect des 3R. Comme cité dans cette même partie de la procédure, nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 4 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain (C57BL/6J et C57BL/6J hTfr), la simplicité des administrations uniques ou répétées (administration i.v. 5.5ml/kg (Aiguilles 27G (3/4 ; 0.4/19mm)) ; s.c. 10ml/kg (Aiguilles 26G (‘’3/8’’ ; 0.45*10mm)) et i.p. 10ml/kg (Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm))) sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules (cinétique de quelques heures à maximum 1 semaine), nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de chez deux fournisseurs différents.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières études pré-cliniques. Le développement préclinique nécessite tôt ou tard une première approche in vivo, sur un modèle animal tel que le rongeur, dans notre cas, la souris. C’est le modèle le plus standardisé et utilisé dans la racherche en expérimentation animale, notamment par sa physiologie connue (mammifère) et relativement proche de l’homme. Le modèle rongeur facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la partie pharmacologie (diminution des posologies). En pratique, on l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations, l’obtention de groupes jusqu’à 6-8 individus sans trop de contraintes de stabulation. Le modèle souris est surtout préférentiel lorsqu’il s’agit de mette en place l'élevage d’une lignée génétiquement modifiée avec une (des) mutation(s) donnée(s), ou encore d'étudier de nombreux modèles de pathologies, plus facilement accessibles. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, organes ou liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter individus, qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 25-27g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).
Efficacité de la Léciréline pour induire l’ovulation chez la jument, et impact sur la survenue d’une gestation à 12 jours
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
40 juments vont être utilisées, puis rendues au troupeau expérimental de l'établissement, dans des procédures déclarées de gravité légère. Chacune subit un suivi gynécologique sur quatre cycles avec échographies transrectales quotidiennes, inséminations, injections d'induction de l'ovulation, collectes d'embryons par lavage utérin et biopsie utérine, pour tester une molécule (léciréline) déclenchant l'ovulation. Le porteur déclare "aucun" impact sur les animaux, alors que les actes répétés touchent l'appareil génital. Le bénéfice annoncé vise la filière d'élevage équin, et le porteur affirme que l'usage de juments de l'espèce de destination est "indispensable".
Objectifs
Tester l'efficacité de la léciréline (molécule analogue de la GNRH) pour l'induction de l'ovulation ainsi que son impact sur la survenue ou non d'une gestation chez la jument. Cette étude se propose de réaliser le suivi gynécologique de 40 juments durant 3 mois (avril, mai, juin), sur 4 ovulations chacunes. Chacune des juments devra subir deux inductions d'ovulation par une injection de Léciréline et deux inductions d'ovulation par une injection de gonadotrophine chorionique humaine (hCG), les ovulations 1 et 3 seront induites sur chaleur délenchée par un traitement lutéolytique (injection de Cloprosténol), tandis que les ovulations 2 et 4 seront induites sur retour en chaleur spontané. On pourra ainsi comparer l'efficacité de la léciréline à celle de la gonadotrophine chorionique humaine sur chaleurs spontanées et sur chaleurs déclenchées par un traitement lutéolytique (cloprosténol) sur 40 juments. Par ailleurs, l'impact de la molécule utilisée pour induire l'ovulation sur le taux de gestation sera évalué grâce à l'exploitation en insémination artificielle (semence fraîche) 24 heures après l'induction d'ovulation des deux cycles spontanés de chaque jument. Suite à des collectes d'embryons à 12 jours post ovulation, les effets de l'âge et de la parité de la jument sur l'embryon seront aussi déterminés.
Bénéfices attendus
Offrir à la filière élevage équin des données d'inocuité et d'efficacité d'une molécule légalement utilisable chez la jument pour l'induction de l'ovulation, selon le principe de la cascade. Améliorer les connaissances liées aux effets du vieillissement de la jument sur l'embryon
Procédures
- échographie ovarienne et utérine par voie transrectale (2 minutes par examen, examen quotidien à biquotidien du début des chaleurs au constat d'ovulation) - insémination artificielle par voie transcervicale (1 minute, 2 fois par jument) - injection intraveineuse d'induction de l'ovulation (5 secondes, 4 fois par jument) - injection intramusculaire de cloprosténol (3 secondes, 2 fois par jument) - collecte d'embryon par lavage utérin par voie transcervicale (15 minutes, 2 fois maximum) - prise de sang (10 secondes, 1 par collecte, 2 fois maximum) - biopsie utérine (5 minutes, 1 fois par jument ayant donné un embryon) - Lavage utérin pour réalisation de cytologies (en même temps que la collecte d'embryon pour les juments avec un diagnostic de gestation positif à 12 jours et 15 minutes, maximum 2 fois par jument pour celles n'ayant pas donné d'embryon).
Impact sur les animaux
Aucun
Devenir
Retour au sein du troupeau expérimental de l'établissement utilisateur
Remplacement
L'objectif étant de valider l'inocuité et l'efficacité de la léciréline chez la jument, cet essai clinique impose l'utilisation d'individus vivants de l'espèce de destination (cheval).
Réduction
Exploitation de 4 cycles oestraux sur chaque jument afin de réduire le nombre d'animaux impliqués. Chaque jument sera son propre témoin. Afin de réduire l'utilisation des animaux, une collecte d'embryon sera effectuée au cycle 2 et 4 si un diagnostic de gestation positif est obtenu à J12. Des tests statistiques unilatéraux seront utilisés pour tester l'hypothèse de non-infériorité clinique de la léciréline par rapport au traitement de référence (hCG) sur la survenue de l'ovulation et de la gestation. Après la vérification de la normalité des données, des modèles linéaires à effets mixtes seront effectués à l’aide du logiciel Rstudio pour analyser l’effet de l’âge et de la parité. Si les données ne sont pas normales, des tests de permutations seront effectués pour corriger la p-value.
Raffinement
Les juments utilisées pour ce protocole sont des animaux parfaitement habitués aux examens et manipulations qui leur seront imposés dans le cadre de notre étude (examen gynécologique, insémination artificielle, collecte d'embryon par lavage utérin, injection intramusculaire, injection intraveineuse, prise de sang). Elles resteront dans leur environnement habituel (en groupe) où elles seront manipulées par leurs soigneurs habituels. Les actes de suivi gynécologique seront exclusivement réalisés par un vétérinaire équin expérimenté en suivi de reproduction de la jument. Les actes d'insémination artificielle, de collecte d'embryon, de lavage utérin, de biopsie, d'injections intraveineuse et intramusculaire et de prise de sang seront exclusivement réalisés par des manipulateurs habilités (inséminateurs équins, chefs de centre ou vétérinaire).
Choix des espèces
Il s'agit d'un essai clinique chez la jument d'un médicament vétérinaire disposant d'une autorisation de mise sur le marché pour cette même indication chez la lapine et la vache. L'utilisation d'animaux femelles à maturité sexuelle, de l'espèce de destination est indispensable.
Exploration du métabolisme énergétique de la souris portant une invalidation totale ou tissu spécifique d’une protéine clef du métabolisme énergétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent par des cages de calorimétrie qui mesurent le métabolisme sans intervention invasive, mais isolées, avant d'être mises à mort par dislocation cervicale pour prélèvement de sang et de tissus. Le porteur reconnaît que l'isolement empêche l'animal de préserver sa température en groupe et peut accroître l'anxiété. Il classe pourtant la gravité en modérée et affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour étudier le métabolisme de façon intégrée.
Objectifs
Le métabolisme énergétique se traduit globalement par une adaptation équilibrée du comportement alimentaire et de la dépense énergétique, comprenant différents paramètres tels que l’activité musculaire, le maintien de la température corporelle et le métabolisme de base, chacun dépendant du statut de l’individu (veille, sommeil) et des conditions environnementales (température, présence ou absence de nourriture). Un élément majeur dans la régulation de la balance énergétique est la capacité de l’organisme à: transformer les nutriments ingérés afin de les stocker, de signaler au reste de l’organisme le statut des réserves énergétiques, et enfin, de mobiliser ces réserves le moment voulu. Jusqu'à récemment, l'évolution a favorisé la capacité à stocker efficacement les nutriments sous forme de graisse pendant les périodes d’abondance tout en développant des stratégies pour se prémunir contre les périodes de disettes intermittentes. Cependant, cet avantage sélectif est devenu délétère dans notre société moderne, caractérisée par la sédentarité et l’abondance de nourriture riche, propice au développement de maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type 2. Pour cela nous nous intéressons à une protéine clef du métabolisme énergétique, impliquée dans la transformation du sucre en gras, et reconnue dans le développement de la stéatose hépatique inflammatoire, de l’obésité, et du diabète de type 2. L’objectif de ce projet est d’étudier au moyen de cages calorimétriques (un outil non-invasif et complètement automatisé), le métabolisme énergétique et la capacité adaptative au cours de la journée des lignées de souris vigiles génétiquement invalidées pour le gène codant cette protéine clef du métabolisme énergétique de façon globale ou ciblée (dans le foie, le tissu adipeux et l’intestin) dans le but de mieux comprendre les processus métaboliques et moléculaires impliqués dans le devenir des nutriments, leur stockage et l’implication des trois organes. Il s’agit de remettre en perspective les caractéristiques (Prise alimentaire, dépense énergétique, utilisation des nutriments et comportement) de l’animal vigile des différentes lignées , au regard 1) du métabolisme de l'animale de nuit (période active) comme de jour (période de repos), et 2) dans différentes conditions environnementales de température et d’accès à la nourriture.
Bénéfices attendus
Les différents paramètres évalués au moyen de l’analyse calorimétrique permettent de caractériser les mécanismes biologiques de l’animal in vivo reliant la prise alimentaire, la balance énergétique, la capacité d’utilisation des aliments, et les comportements de l’animal. L’analyse statistique combinée des 4 différentes lignées permettra, au regard de chaque paramètre analysé, d’évaluer l’importance de cette protéine clef du métabolisme énergétique de manière tissu spécifique et son impact sur les fonctions des autres tissus. In fine, ce projet permettra une meilleure compréhension des maladies métaboliques (obésité/diabête/stéatose hépatique). Les tests d’adaptations permettent de mettre l’animal dans une situation physiologique qui implique les différents paramètres impliqués dans la régulation de la balance énergétique (La prise alimentaire et hydrique, la consommation d’oxygène et la production de dioxyde de carbone, le quotient respiratoire indicatueur du type nutriment utilisé, La dépense énergétique globale de l’animal issue de l'activité locomotrice, de la thermogénèse et du métabolisme de base, l’activité locomotrice spontanée ) selon l'absence ou la présence de la protéine d'intérêt dans les différents organes (foie, le tissu adipeux et l’intestin). Ceci permettra d'effectuer une analyse croisée des paramètres génétiques, des tests d’adaptations, le tout en fonction du temps. Exemple : L’absence de nourriture induit une diminution de la dépense énergétique, une mobilisation des réserves lipidiques (tissu adipeux), une plus grande activité métabolique de conversion au niveau du foie. A l’inverse la reprise alimentaire fait appel aux capacités ; d’ingestion au niveau de l’intestin et de stockage au niveau du tissu adipeux. Ce projet sera donc un apport important dans la compréhension du rôle de cette protéine dans le stockage, l’utilisation des nutriments et l’implication des trois organes.
Procédures
L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal et n'est pas invasive. Aucun prélévement n'aura lieu sur animal vigile. Les animaux seront monitorés tous les jours, ils seront pesés: 1 fois/ jour lors de l'individualisation (7 fois), puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition corporelle analysée (3 minutes par souris) de manière non invasive 1 fois au début de l'individualisation puis à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques (soit 3 fois par souris).
Impact sur les animaux
L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. En effet, l’animal est hébergé dans une cage d’hébergement classique (500 cm2) dans le système de calorimétrie indirecte. La seule nuisance pouvant entrainer une modification du comportement de l'animale et du comportement d'espèce est que la mesure en cage de calorimétrie ne peut se faire que sur animal isolé. L'animal préserve mieux sa température corporelle lorsqu'il est en groupe, pour remédier à cela l'animal aura à sa disposition tout le matériel nécessaire à la confection d' un nid. L'interaction sociale (hiérarchie, diminution de l’anxiété, routine journalière) entre animaux de la même espèce est reconnue, l’individualisation peut avoir une incidence comme un surcroit d’anxiété. L'observation régulière de l'animal est primordiale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure par dislocation cervicale. Le sang et différents tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques et transcriptomiques
Remplacement
L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier le métabolisme énergétique de manière intégrée. Elle ne peut se faire que sur l’animal vigile. L’étude des différents paramètres métaboliques impactés par une modification d’expression du gène cible dans des organes précis nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo. La souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en tenant compte des impératifs de l’analyse statistique. La lecture métabolique effectuée sur plusieurs jours permettra de réduire la variabilité intrinsèque de l’animal et inter animal, et limite le nombre d’animaux utilisés. Le choix de l'analyse statistique est déterminant. l'ANOVA, ANCOVA ou une ANOVA avec mesures répétées entre les lignées et leurs contrôles respectifs seront prioritaires. Enfin à l’issue de cette étude une analyse en composante Principale (CPA) sera menée en intégrant les 4 lignées en interaction avec les tests d'adaptation (Jeun, reprise alimentaire et thermoneutralité) afin de ranger en ordre (avec sa probabilité) l'importance de chaque organe (dont le facteur de transcription aura été invalidé) dans les paramêtres mesurés, le tout en fonction du temps.
Raffinement
L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal. Elle est non invasive et limite au maximum le stress de l’animal. La mesure en calorimétrie indirecte s’effectue dans des cages d’hébergement classiques. L'animal aura à sa disposition tout le matériel nécessaire à la confection d' un nid. Pour rappel, les conditions d’hébergement et les caractéristiques de la cage métabolique sont les suivantes : - l’animal est hébergé dans une cage d’hébergement classique (500 cm2), conforme à la directive 2010/63/EU : 371 x 189 x 126 mm (LxlxH). - différents enrichissements sont présents dans la cage (roue d’activité, carré de coton). - les capteurs sont encastrés dans le couvercle de la cage et ne gênent pas l’animal dans ses déplacements - les cages sont non-hermétiques et sont soumises à un flux d’air calibré de 2litres/min. En cas de problème technique, un échange d’air (passif) avec l’extérieur est maintenu. Des points limites et des critères d'arrêt de l'expérience ont été prévus en cas d'anomalie de comportement ou d'alimentation. Le tout est effectué de manière automatique, de jour comme de nuit et sans intervention de l’opérateur. L’analyse ne peut se faire que sur l’animal individualisé.
Choix des espèces
L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est le seul modèle de souris transgéniques (KO) disponible qui permet d’étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. De plus,l'utilisation de modèles de souris transgéniques permet une étude approfondie de l'étiologie de maladie métabolique comme le diabête de type 2, la stéatose hépatique, et l'obésité en général. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris doivent être âgées au minimum de 12 semaines, c'est à dire à l’âge adulte : (1) lorsque toutes les structures cérébrales sont stabilisées pour ne pas impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au cours du temps ; (2) la masse de l’animal est plus stable à l’âge adulte ce qui permet une analyse fiable et robuste durant le temps de l’expérimentation.
Evaluation de l’impact de la prédation sur le sommeil du rat et validation d’un nouveau dispositif d’enregistrement sous cutané et autonome.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
10 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de deux heures pour implanter des électrodes et un dispositif d'enregistrement sous la peau, reste isolé cinq semaines, puis est exposé à des odeurs et images de chats pour provoquer un stress de prédation. Le porteur reconnaît que l'isolement prive l'animal de son comportement social et que la présence simulée d'un prédateur induit "probablement" un stress, objet même de l'étude. Ce projet préliminaire vise à obtenir des données pour une demande de financement, et les animaux sont tués pour analyser leur cerveau et les tissus entourant l'implant.
Objectifs
Ce projet utilisant un nombre réduit d’animaux (n=10) est une demande préliminaire à une demande ANR jeune chercheur. Il a pour but de valider la fonctionnalité et la pérennité d’un système d’enregistrement électrophysiologique, la tolérance de l’animal à l’implantation sous cutanée du dispositif dans une durée de 30 jours maximum. Il aura également pour but d’exposer le rat à un contexte de prédation, uniquement sous réserve d’une totale cicatrisation des plaies et de scorage de suivis nuls. Cette expérience permettra de récolter des données préliminaires de sommeil simulant l’exposition à un contexte de prédation le plus écologique possible. Ces données serviront de base à une resoumission de projet à l’ANR en mars 2022. L’objectif global de l’ANR est de comprendre comment la prédation (l'un des principaux facteurs de sélection naturelle) a façonné le phénotype et l'évolution du sommeil. En effet, l’omniprésence du sommeil dans le règne animal suggère qu'il est essentiel à la survie, cependant, le sommeil et ses sous-états restent mal compris. Les animaux exposés à la prédation doivent être plus vigilants pour augmenter leur chance de survie, cependant quand ils dorment ils sont potentiellement plus vulnérables car moins sensibles à leur environnement. Le sommeil constitue donc un comportement extrêmement risqué pour de nombreuses espèces. Pour cette raison, la pression de prédation a été proposée comme explication de la diversité des habitudes de sommeil observées chez les mammifères et autres animaux. Une variabilité de certaines caractéristiques du sommeil, telles que sa durée quotidienne chez les paresseux, les quantités relatives de sommeil paradoxal et sommeil lent chez les rats, la durée quotidienne de sommeil chez les rats, le sommeil unihémisphérique chez les canards et la fragmentation du sommeil chez les colombes, a pu être corrélée indirectement avec une pression de prédation. Cependant, aucune étude n'a testé expérimentalement (sur des animaux élevés en laboratoire ou sauvages) comment les phénotypes du sommeil à plusieurs niveaux (physiologie, activité cérébrale, métabolisme et comportement) sont affectés par la pression de prédation, et si les processus associés à cette interaction sont plastiques (régulé par les effets environnementaux) ou génétiques et donc héréditaires. C’est le but de du projet ANR, qui se basera sur l’étude du sommeil de populations de rats sauvages ayant grandi avec ou sans prédation.
Bénéfices attendus
Outre l’obtention de données préliminaires qui permettront grandement d’augmenter les chances de financement, ce projet permettra le développement d’une méthodologie d’enregistrement complet du sommeil des animaux en conditions semi-naturelles. En effet, le développement d’un implant sous cutané, miniature, de grande autonomie, dédié au sommeil ouvre de nouvelles perspectives pour une meilleure compréhension des animaux en veillant à leur bien être puisqu’ils ne seront plus équipés de câble et pourrons même être, à terme, stabulés en groupe. C’est une vraie amélioration d’un point de vue qualité et quantité des données acquises, permettant ainsi de répondre à des questions plus complexes tout en limitant le nombre d’animaux. Enfin, étudier l’effet de la prédation sur le sommeil permet aussi de comprendre le lien entre stress/peur et sommeil, deux états étroitement liés et source de nombreux troubles chez l’homme.
Procédures
Les 5 animaux seront isolés durant les 5 semaines prévues pour la procédure. Ils subiront une anesthésie générale pour une intervention chirurgicale consistant à implanter des électrodes pour les enregistrements des paramètres physiologiques (activités cérébrales, musculaires, oculaires, cardiaques et température) et un dispositif autonome sous cutané de récolte des données physiologiques pendant 40 jours. La durée de l'intervention chirurgicale durera 2 heures maximum. Après 15 jours de récupération et validation de la tolérance à l'implant sous cutané et 1 semaine pour ceux ayant un implant externe, les animaux seront exposés au protocole de prédation pendant 1 semaine (à raison de 2 fois 3 heures par jour).
Impact sur les animaux
Ils subiront d’abord une anesthésie générale pour une chirurgie implantatoire (pose d’électrodes pour les enregistrements électrophysiologiques du sommeil et d’un implant sous cutané au niveau dorsal pour enregistrer le sommeil en autonomie totale). La procédure chirurgicale de la pose des électrodes est maitrisée. Le caractère novateur de ce projet d’un point de vue expérimental sera la présence d’un implant sous cutané dont la taille a été réduite au maximum (1cm x 4cm x 1.5cm et 15g) et rendu biocompatible (encapsulation en silicone). Ceci pourra donc entrainer une gêne pour l’animal. C’est d’ailleurs ce que nous chercherons à évaluer et à éviter grâce à un suivi quotidien des animaux et à l’optimisation de notre implant. Enfin, si l’aspect implantation sous cutané est validé et ne pose aucun problème aux animaux, durant les 15 jours de récupération, ils seront exposés individuellement et de façon périodique pendant une semaine des stimuli olfactifs et visuels provenant de chats. Bien que les animaux soient en totale sécurité dans leur cage dotée d’un abri, ils vont ressentir probablement un stress dû cette présence. C’est d’ailleurs aussi tout l’objet du projet, évaluer l’impact de ce stress sur leur sommeil. Enfin, dans l'intérêt de leur bonne récupération, l'obtention de résultats reproductibles en éliminant toute interférence provoquée par l'effet groupe, les rats seront isolés durant les 5 semaines de la procédure. Ils n'auront donc pas la possibilité d'exprimer leur comportement social durant cette procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Bien que rendu biocompatible, il sera nécessaire d'évaluer le degré de tolérance de l'implant sous cutané. Pour cela, l'implant sous cutané sera retiré. Les données d'enregistrements seront récoltées et les tissus environnants seront prélevés pour effectuer une analyse histologique qui nous indiquera le degré éventuel d'inflammation provoqué par sa présence. De plus, il sera primordial de prélever le cerveau des animaux et d'analyser histologiquement les potentielles structures cérébrales impactées par le contexte de prédation et les perturbations attendues du sommeil.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer le modèle animal dans le cadre de ce projet qui s’intéresse à la réponse complexe d’un organisme. Le rat est le modèle idéal de par sa taille, sa disponibilité et l’étendu des connaissances que nous avons déjà sur sa physiologie.
Réduction
En augmentant la quantité des paramètres collectés nous réduisons le nombre d’expérience et donc le nombre d’animaux. Par ailleurs, dans le cadre de ce projet, le nombre a été limité au strict minimum (5 animaux avec implant sous cutané et 5 avec implant externe) pour permettre la validation du dispositif et la collecte de données préliminaires. De plus, nos connaissances et notre maitrise en chirurgie implantatoire sur cette espèce nous permet de prévoir un nombre d'animaux minimal. A noter que ces effectifs ne seront pas utilisés dans leur totalité si nous sommes capable d'enregistrer la totalité des expériences prédation avec les animaux avec implant. L'objectif global est recolter des données de sommeil en contexte de predation sur 4 animaux au total et de valider la fiabilité de l'implant sur deux animaux (car sa tolérance a déja été validée sur deux animaux pendant 30 jours) cf DAP V6.
Raffinement
En développant un implant sous cutané, nous permettons à l’animal de se déplacer librement et d’exprimer toute la complexité de son comportement. Ce projet préliminaire s'inscrit d'ailleurs dans un projet futur plus large, qui nous permettra d'enregistrer des animaux en milieu semi naturel donc hautement enrichi. L’enregistrement de plusieurs paramètres physiologiques et cérébraux permet aussi en une expérience d’accumuler beaucoup d’information qui aurait nécessité plusieurs dispositifs parfois filaires auparavant et donc plus gênant pour l'animal.
Choix des espèces
Ce projet est préliminaire et permettra, une fois validé expérimentalement, d’utiliser le dispositif d’enregistrement dans le cadre d’un futur projet de plus grande envergure sur des rats sauvages en milieu naturel. Le rat est suffisamment gros pour supporter notre instrumentation et son sommeil est très bien connu en laboratoire. Par ailleurs c’est une espèce invasive. Il est donc disponible facilement à l’état sauvage. Il a aussi colonisé différent milieu plus ou moins exposé à la prédation, il est donc un modèle de choix pour notre projet. De plus, le sommeil est un état complexe. L’objectif de l’étude est de déterminer quelle part de son expression est influencée par la prédation (rythme, physiologie, mouvement, position, localisation, activité cérébrale). Des rats adultes de 4 mois seront utilisés pour ce projet. Les animaux devront d’une part avoir un âge avec unepleine maturité cérébrale et, d'autre part, une taille et un poids suffisants (400g environ) afin de supporter l’implant sous cutané.
Evaluation de la fertilité après induction et synchronisation des ovulations en utilisant une molécule GnRH de synthèse chez la brebis
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système urogénital
60 brebis de race Lacaune vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes gardées en vie dans l'établissement à l'issue. Chaque animal reçoit un implant de mélatonine et une injection intramusculaire, et subit dix-huit prises de sang, pour tester une hormone de synthèse censée déclencher et synchroniser les ovulations en dehors de la saison sexuelle. Le porteur inscrit le projet dans le remplacement d'une hormone existante par une molécule posant selon lui moins de problèmes de "bien-être animal", à des fins d'insémination en élevage. Il affirme qu'aucune alternative n'existe pour étudier l'efficacité de ces hormones sur l'ovulation.
Objectifs
La reproduction chez les ovins et caprins est saisonnée. Chez les deux sexes, il existe au cours de l’année une période d’activité sexuelle maximale (saison sexuelle), en général d’août à janvier, et une autre d’activité minimale ou de repos sexuel (contre-saison), en général de février à juillet. La durée de la saison sexuelle est très variable selon les races. La reproduction des brebis et des chèvres en contre-saison permet aux éleveurs d’étaler la production de lait ou de viande sur l’année, et ainsi de répondre à la demande des consommateurs.
Bénéfices attendus
La reproduction chez les ovins et caprins est saisonnée. Dans le cadre d’une mise à la reproduction des brebis et des chèvres en période de contre-saison (période de repos sexuel, pratique appelée « désaisonnement »), l’insémination animale est pratiquée chez les petits ruminants quasi exclusivement après un traitement hormonal d’induction et de synchronisation des chaleurs et des ovulations (mimant les mécanismes endocriniens), méthode aujourd’hui la plus efficace pour désaisonner la mise à la reproduction. Le projet s'inscrit dans un contexte d'évolution des pratiques de maîtrise de la reproduction vers la réduction, voire la suppression, de l’utilisation de traitements hormonaux pour la synchronisation des chaleurs et des ovulations. La recherche de méthodes alternatives est en cours via le développement et/ou l’évaluation de traitements vétérinaires (molécules de synthèse) posant moins de problème en termes de bien-être animal et d’enjeux environnementaux.
Procédures
Les brebis seront soumises à une pose d'implant sous-cutané de mélatonine (une seule fois par brebis, durée moyenne d'environ 30 secondes), à des injections par voie intramusculaire (une seule injection par brebis, durée de quelques secondes) et à des prises de sang (au total 18 prélèvements/brebis, durée de prélèvement moyenne d'environ 30 secondes par brebis).
Impact sur les animaux
Lors des prises de sang (par ponction à la veine jugulaire), des injections (par voie intramusculaire) et de la pose des implants sous-cutanés de mélatonine, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général. Une surveillance journalière de l’état général des animaux et du site de prélèvement sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite) voire d’une infection. La contention des animaux pour les interventions réalisées par les animaliers (en binôme) est faite dans un espace réduit en présence de congénères pour limiter le stress. La présence journalière répétée des animaliers lors de l'alimentation et des soins est associée à une diminution du stress des animaux.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie dans l'établissement utilisateur à l'issue du projet.
Remplacement
L’étude de l’efficacité des hormones gonadotropes sur l’induction et la synchronisation des ovulations chez les brebis ne peut être réalisée qu’avec l’utilisation d’animaux vivants. Aucune alternative n’existe.
Réduction
Le projet utilisera 60 brebis réparties en 5 lots de 12 brebis. Les variables étudiées seront la proportion de brebis ovulant après traitement, le jour d’augmentation de progestérone plasmatique > 0,5 ng/ml et la proportion de brebis gestantes. Des calculs de puissance ont été faits avec ces 3 variables afin de déterminer le nombre de brebis/lot. Le nombre minimum de brebis à inclure par lot est déterminé par la variable proportion de brebis gestantes. Avec 12 brebis par groupe, nous pourrons montrer : # une différence notable pour la proportion de brebis ovulant après traitement, entre 67 % (8/12, observée dans des études antérieures avec GnRH) et 100 % (12/12, attendue dans le lot témoin avec eCG) avec un risque alpha (p) de 5 % et une puissance de 83 %. # une différence (>= 1,5 jours ± 1 jour) du jour moyen d’augmentation de progestérone après ovulation (entre le groupe avec eCG et un groupe avec GnRH) avec un risque alpha de 5 % et une puissance de 92 % (test de Mann et Whitney). # une différence notable pour la proportion de brebis gestantes, entre 17 % (2/12, échec de fertilité dans les lots avec GnRH) et 67 % (8/12, fertilité attendue dans le lot témoin avec eCG) avec un risque alpha (p) de 10 % et une puissance de 83 %. L’objectif de cette étude exploratoire est de déterminer si les ovulations induites par la GnRH de synthèse sont fertiles et si la fertilité obtenue nous incite à poursuivre (ou pas) cette stratégie pharmacologique.
Raffinement
Les brebis passeront 6 semaines en bergerie de quarantaine avec une visite journalière pour l’alimentation et l’observation sanitaire. L’habituation des brebis à la manipulation dans ce nouvel environnement commencera au bout de 2 semaines après leur arrivée en quarantaine, avec une pesée. Après 4 semaines, les deux prises de sang pour le test de cyclicité seront réalisées. Après 6 semaines en bergerie de quarantaine, les brebis intègreront la bergerie de l’installation pour commencer le traitement de synchronisation des ovulations. Les lots expérimentaux seront alors constitués (habituation au parc de tri et marquage de la toison avec une peinture adaptée, pour repérer les lots). Afin de respecter la grégarité de l’espèce, les brebis sont placées ensemble sur litière paillée et leur contention pour les différentes interventions est faite dans un espace réduit en présence de congénères pour limiter le stress dû à l’isolement. La présence journalière répétée des animaliers lors de l'alimentation et des soins aux animaux est associée à une diminution du comportement de stress. Les brebis sont surveillées de façon journalière. Lors des prises de sang (par ponction à la veine jugulaire), des injections (par voie intramusculaire) et de la pose des implants sous-cutanés de mélatonine, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général. Les animaux seront tondus au niveau du cou pour une visualisation aisée des veines. Dans la mesure du possible, les prélèvements seront réalisés en alternant les veines jugulaires droite et gauche. Une surveillance de l’état général des animaux et du site de prélèvement sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite) voire d’une infection. En cas de signes de maladie (fièvre >40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé sur 48 h, anorexie, perte de poids >à 15%...) un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil ou avec son intervention si nécessaire.
Choix des espèces
L’espèce ovine, et notamment la brebis de race Lacaune laitière, est la cible de l’étude de façon à remplacer l’utilisation de l’hormone eCG dans le cadre du traitement d’induction et de synchronisation des ovulations utilisé en élevage (afin de pratiquer l’insémination animale). De façon à tester l’efficacité d’hormones gonadotropes pour contrôler le cycle oestrien des brebis, le projet utilisera des brebis adultes de race Lacaune, sexuellement matures et ayant déjà agnelé lors d’une reproduction antérieure.
Etude des effets antagonistes du sélénium sur la toxicité au mercure chez les géniteurs de truite arc-en-ciel.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
5 778 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère, une partie mise à mort sous anesthésie sans réveil. Reproductrices et alevins sont nourris pendant plusieurs semaines avec un aliment contenant du méthylmercure à quatre fois la limite légale, pour étudier l'effet protecteur du sélénium sur cette contamination. Le porteur revendique des retombées pour la santé humaine et pour la valorisation de coproduits de thon dans l'élevage de la truite. Il affirme que l'étude des mécanismes chez la descendance ne peut être menée sur lignée cellulaire ni par modélisation.
Objectifs
L’objectif de ce projet sera de mieux comprendre et caractériser l’antagonisme du sélénium vis-à-vis du méthylmercure dans l'alimentation des géniteurs de truite arc-en-ciel, principale espèce aquacole produite en France, sur son métabolisme, sa détoxication, ainsi que sur les paramètres antioxydants et la réponse pro-inflammatoire chez la descendance.
Bénéfices attendus
Ces travaux auront ainsi des répercutions en santé humaine en améliorant les connaissances sur les conséquences qu’entraînent une exposition, par l’alimentation parentale, au méthylmercure sur la descendance. Cette expérimentation permettra aussi d’évaluer la possibilité d’utiliser des coproduits de thon comme ingrédient alternatif pour l’élevage de la truite arc-en-ciel.
Procédures
Trois prélèvement de sang au maximum de 2 mL chez les géniteurs de truites d'un poids moyen compris entre 0,6 et 1 kg anesthésiés dans un bain de benzocaïne (durée : environ 1 minute pour chaque prélèvement de sang). Alimentation pendant 6 mois de plusieurs lots de géniteurs de truite (90 animaux au total) avec un aliment contenant 2 ppm de méthylmercure. Alimentation pendant 3 semaines de plusieurs lots d'alevins de truite (1800 animaux au total) issus des géniteurs utilisés dans le projet avec un aliment contenant 2 ppm de méthylmercure.
Impact sur les animaux
La limite légale de mercure et de sélénium dans les aliments aquacoles est de 0,5 mg/kg, donc la dose la plus haute représente ici 4 fois la limite légale pour le mercure et 8 fois la limite légale pour le sélénium. Ces concentrations ont été choisies suite à un premier essai nutritionnel réalisé chez des truites juvéniles ainsi qu’une étude bibliographique des effets du sélénium et du mercure chez les poissons au stade géniteur (Penglase et al., 2014 ; Khadra et al., 2019). Ces doses assurent l’observation d’un challenge pro-oxydant et inflammatoire par le mercure, tout en évitant une non métabolisation de ce dernier ainsi qu’un blocage de la reproduction ou une mortalité certaine des poissons. Une légère baisse de la croissance transitoire avait été observée chez les juvéniles et pourrait également être observée chez les géniteurs ou alevins, en plus de l'observation au niveau métabolique d'un stress oxydant et pro-inflammatoire limité.
Devenir
L’ensemble des animaux de l’expérimentation sera euthanasié et destiné au prélèvement d’échantillons pour analyses
Remplacement
S’agissant d’un essai nutritionnel chez des géniteurs de truite et dans le but d’étudier les mécanismes physiologiques et moléculaires qui en découlent chez la descendance, l’étude ne peut donc pas être réalisée sur des lignées cellulaires ou par des calculs et des modélisations informatiques.
Réduction
Le nombre de poissons mis en expérimentation est calculé a minima compte-tenu de la variabilité individuelle observée dans des études antérieures avec dix femelles et cinq mâles par bassin pour pouvoir obtenir suffisamment de pontes simultanées dans chaque lot pour la deuxième partie de l’essai sur la descendance. Avec 6 régimes testés chacun dans deux bassins, le nombre de géniteurs de truite mis en expérimentation sera de 6x2x15=180. A J0, 9 poissons n’ayant pas encore reçu de régime expérimental seront prélevés pour les analyses, soit un total de 189 géniteurs utilisés pour cet essai sur les géniteurs.
Raffinement
Les procédures sont raffinées avec des conditions d’élevage optimisées énoncées ci-dessus. Les animaux seront nourris à satiété visuelle afin d’assurer leur bien-être et ne pas polluer le milieu par une trop grande distribution d’aliment qui ne serait pas consommé. Les effectifs seront limités afin de réduire les rejets dans l’eau. La supplémentation en mercure organique sera testée car mieux assimilée que la forme inorganique, donc potentiellement plus toxique pour l’animal mais moins polluante au niveau environnemental. Les doses minimales à partir desquelles un effet est visible ont été choisies. Le mercure sera ajouté avant extrusion de l’aliment afin de limiter sa potentielle dissolution dans le milieu aquatique. Un mélange attractant sera ajouté dans l’aliment végétal afin de maximiser la prise alimentaire. Des analyses de mercure seront réalisées en cours d’essai afin de vérifier l’absence de pollution de l’eau. Si tel était le cas, l’essai serait stoppé.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est la première espèce piscicole produite en France et a donc un poids agronomique et commercial important, ce qui en fait un choix privilégié pour cet essai, en plus de son intérêt scientifique : espèce à gros œufs avec alevins contenant de larges réserves vitellines issues des dépôts maternels. Les animaux utilisés seront des géniteurs de truites femelles et mâles avec un ratio 2/1, afin d’être dans les conditions optimales de reproduction et pouvoir étudier l’effet de l’alimentation parentale : maternelle et paternelle (en particulier pour les effets épigénétiques) chez la truite arc-en-ciel.
Évaluation préclinique de l’Accident de Décompression : injection post-plongée de nanocapsules contenant de la perfluorodécaline.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
76 rats Wistar vont être utilisés, tous les survivants tués à l'issue, dans des procédures que le porteur lui-même classe en gravité sévère. Chaque rat, cathéter posé dans la veine caudale, est maintenu en contention pendant une plongée hyperbare simulée de 83 minutes puis observé une heure, épisode décrit comme provoquant une douleur et une angoisse sévères, pour tester des nanocapsules d'oxygène contre l'accident de décompression. Le porteur indique qu'un analgésique est administré avant la plongée sans modifier l'apparition des symptômes, dont la paralysie fait partie du tableau clinique. Il affirme que l'accident de décompression ne peut être induit et étudié que chez l'animal, faute de marqueur biologique validé.
Objectifs
L’accident de décompression (ADD) représente le risque le plus grave chez les plongeurs subaquatiques professionnels et de loisir, mais concerne aussi toutes les personnes soumises à des modifications de la pression ambiante (patients et personnels des chambres hyperbares, pilotes, astronautes, ouvriers tunneliers…). Ses manifestations vont de la simple démangeaison jusqu’à la paralysie définitive ou, à l’extrême, au décès. Or, environ un tiers des personnes accidentées conserve des séquelles invalidantes malgré les traitements actuels. Il est donc nécessaire d’améliorer l’efficacité du traitement de cette pathologie. L’administration intraveineuse de solutions de perfluorocarbone (PFC) a montré son efficacité chez des modèles animaux (rongeurs et miniporcs). Ce transporteur d’oxygène est potentiellement efficace dans le traitement de nombreuses pathologies dont l’ADD. L’encapsulation du PFC dans des nanocapsules d’albumine (Albumin-derived perfluorodecalin-containing nanocapsules, A-PFC-N) offre des perspectives prometteuses. Ces préparations présentent une faible toxicité autorisant des applications thérapeutiques ; de plus, l’enveloppe d’albumine, soluble à la fois dans l’eau et les lipides, ne provoque pas de réaction immunitaire. Enfin, ces capsules sont stables en solution et peuvent être administrées par voie intraveineuse. Un travail récent a montré l’intérêt des A-PFC-N sur un modèle murin d’ADD en réduisant l’apparition des ADD. Aujourd’hui, notre objectif est de tester l’efficacité des A-PFC-N dans la prévention secondaire de l’accident de décompression chez un modèle murin d’ADD. Nous projetons ainsi d’appliquer ce traitement expérimental non plus en préventif, comme précédemment, mais après une plongée simulée, afin de se rapprocher des conditions susceptibles de se produire chez l’humain.
Bénéfices attendus
A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur l’étude de l’efficacité des nanocapsules d’albumine contenant de la perfluorodécaline en traitement secondaire de l’ADD. Nous allons pouvoir confirmer ou infirmer ce que nous avions déjà observé en comparant les différents groupes. A moyen terme, si les résultats sont confirmés positivement, une étude clinique pourra être envisagée pour le traitement secondaire de l’ADD chez l’humain. A long terme, les bénéficiaires seront tous les personnels susceptibles d’être atteints d’ADD.
Procédures
Tous les animaux (n=76) sont soumis à deux actes pendant la procédure. Dans un premier temps, pour chaque animal, un analgésique sera administré 1 heure avant la plongée simulée, avant qu'une anesthésie gazeuse ne soit réalisée. Puis, l'animal sera placé dans un tube de contention et un cathéter veineux souple sera implanté dans la veine caudale latérale. L'ensemble de ces gestes dure 10 minutes au maximum. Puis, toujours sous l’effet de l'analgésique et vigile, les 76 animaux seront maintenus en contention pendant le protocole hyperbare, qui est une procédure sévère et dure 83 minutes au maximum. A l'issue de la plongée simulée, tous les animaux recevront immédiatement, via le cathéter veineux, une injection dont le contenu est différent entre les groupes que nous avons constitués. Ils seront alors extraits du tube de contention et une observation stricte de l’évolution des symptômes sera réalisée pendant une heure à l’aide de la table de suivi de soin. Enfin, à l’issue de la période d’observation de 60 min, tous les animaux vivants seront anesthésiés et mis à mort.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : le stress généré par la mise en place du cathéter au niveau de la veine latérale caudale (intensité légère, durée 3 heures) ; le stress généré par le maintien du rat dans un tube de contention (intensité modérée, durée 2 heures) ; l’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules (intensité légère et durée maximale de 2 minutes) ; la douleur et l’angoisse lors de la plongée simulée et lors de la période d’observation de l’apparition des symptômes pendant une heure post-plongée (Intensité sévère, durée maximale deux heures) ; le stress généré par la préhension et l’injection de l'anesthésique à l'issue de la période d'observation (intensité modérée, durée maximale 2 minutes).
Devenir
A l’issue de la période d’observation de la plongée simulée, tous les animaux survivants seront mis à mort. Nous prélèverons du sang, des tissus, les organes d'intérêt pour des analyses multiples (Histologie des tissus prélevés, dosages biochimiques des paramètres inflammatoires, détermination des activités enzymatiques) afin de déterminer si notre traitement est efficace.
Remplacement
Les expérimentations cliniques induisant des accidents de décompression ne sont envisageables que chez l’animal. Chez l’humain, le risque d’ADD est quantifié à partir de la quantité de bulles veineuses circulantes, or les données récentes montrent clairement que cette mesure est très insuffisante. Par ailleurs, en l’absence de marqueur biologique validé de l’ADD, les approches in vitro ne peuvent être mises en œuvre que sur des échantillons de tissus prélevés sur des animaux préalablement soumis à des décompressions génératrices d’accidents de décompression. De même, les modèles cellulaires, par ailleurs utilisés au laboratoire, permettent d’étudier les effets de la pression ambiante, mais ne sont pas applicables à l’étude de l’ADD. Le remplacement n’est donc pas possible dans cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe (4 groupes de 15 animaux) correspond à l'effectif minimal pour assurer une puissance statistique de 0,8 au risque alpha = 0,05. Plusieurs variables sont analysées : - la proportion d’animaux souffrant d’un accident de décompression, en relation avec le traitement pharmacologique, - la gravité de l’ADD et son évolution en relation avec le traitement pharmacologique - les paramètres biologiques d’intérêt, déterminés à partir de dosages biologiques dans les tissus prélevés. Les paramètres suivant une loi normale sont comparés à l’aide d’une ANOVA à 1 facteur suivie de tests post-hoc (Dunnett contre un groupe témoin, en l’occurrence le groupe “contrôle NaCl” pour l’incidence et la gravité de l’ADD). Si la distribution normale n’est pas respectée, les différences entre groupes sont analysées à l’aide d’une ANOVA non paramétrique (Kruskall Wallis). En ce qui concerne la procédure expérimentale N°1, dès lors que le profil de plongée simulée est validé, la procédure s’arrête. Si des rats ont déjà été livrés, ils intègrent la procédure expérimentale n°2.
Raffinement
A partir de l’âge de 10 semaines et jusqu’à 12 semaines, âge d’entrée dans la procédure, les rats sont habitués à l’usage d’un tube de contention quotidiennement et de manière progressive. Ils sont manipulés tous les jours par des personnes formées et habituées à travailler avec des rats de laboratoire. On commence par 5 minutes de contention le premier jour puis on augmente progressivement la durée jusqu’à 2 heures. Une heure avant la plongée simulée, un antalgique est injecté par voie sous-cutanée afin de diminuer la douleur pendant les injections des nanocapsules et la période d’observation sans modifier l’évolution des symptômes. L’implantation d’un cathéter souple au niveau de la veine latérale caudale est réalisée sous anesthésie gazeuse. L’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules est légère et ne dure que 2 minutes après la sortie du caisson hyperbare, cela relève davantage de la contention à laquelle les rats sont déjà habitués pendant la période d’habituation au maintien dans un tube de contention. L’appréciation de la survenue d’un ADD à l’issue du protocole hyperbare ne peut se faire que sur des animaux vigiles et dont le comportement n’est pas modifié par d’autres facteurs que la présence d’ADD. C’est un accident grave mais certains animaux survivent et ne présentent aucun symptôme. La grille que nous utilisons pour évaluer la gravité de l’ADD est un outil robuste avec des critères fiables. Dans cette étude l’évolution de l’ADD sera appréhendée en fonction de sa gravité sur 60 minutes. C’est le temps nécessaire pour observer et s’assurer que les traitements sont efficaces ou pas. Puis les animaux seront mis à mort. Le point limite est la convulsion, seul critère qui conduira systématiquement à l’arrêt de la procédure avant les 60 minutes d’observation.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans ce projet sont des rats Wistar. Il s’agit d’un modèle utilisé couramment au laboratoire et lors de notre première étude concernant les nanocapsules de PFC. Chez ce modèle expérimental, nous possédons à la fois de nombreuses données biologiques concernant les effets d’expositions hyperbares et une bonne connaissance des symptômes d’ADD. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Afin d’être certain d’avoir atteint le stade de «jeunes adultes», matures sexuellement, au moment de la plongée simulée dans le caisson hyperbare, tous les animaux sont âgés de 12 semaines pour qu’ils atteignent la masse corporelle de 450g environ (c’est ce paramètre le plus important dans notre projet).
Evaluation des effets d’une exposition chronique au TiO2 sur l’homéostasie intestinale et métabolique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées pendant 115 jours au dioxyde de titane, additif alimentaire E171, avec gavages et prélèvements de fèces réguliers, pour évaluer ses effets sur l'intestin et le métabolisme. Le porteur affirme attendre un léger surpoids, une perméabilité et une inflammation intestinales, et présente le recours à l'animal comme "difficilement remplaçable" pour reproduire les échanges entre organes sur une longue durée. Il indique que les résultats doivent aider industriels et autorités à décider du maintien de l'autorisation du E171.
Objectifs
Les particules minérales manufacturées sont abondantes dans les produits de la vie quotidienne (cosmétiques, textiles, matériaux de construction), dont l’alimentation. Parmi ces particules, le dioxyde de titane (TiO2) est un additif alimentaire utilisé comme colorant/opacifiant et agent de brillance dans les confiseries, les aliments transformés, les sauces et le glaçage. En Europe, l'utilisation du TiO2 alimentaire (référencé E171) est autorisée sans établissement d'une dose journalière acceptable. L'autorité européenne de sécurité sanitaire des aliments (EFSA) a estimé les niveaux d'exposition journalière au E171 entre 0,9 et 10,4 mg/kg de poids corporel (p.c)/jour chez l’enfant et entre 0,3 et 6,8 mg/kg p.c/j chez l’adulte. Face à ces niveaux élevés de consommation, les conséquences pour l’homme d'une exposition chronique aux particules de TiO2 soulèvent des questions de santé publique. Les craintes vis-à-vis de cet additif composée de particules micro- et nanométriques reposent sur des effets génotoxiques, de stress oxydant et inflammatoires des nanoparticules de TiO2 observés sur cellules intestinales. Cependant, la toxicité orale du TiO2 est encore peu étudiée et les autorités sanitaires ont conclu à la nécessité de tests pour évaluer les risques pour la santé des additifs alimentaires contenant des nanoparticules, particulièrement avec le E171. Dans les pays occidentaux, l'augmentation de la prévalence de l'obésité associée à des désordres métaboliques suggère des facteurs de risque liés au mode de vie. Parmi ces facteurs, l'ingestion chronique de particules inorganiques a été proposée. Le but de ce projet est d'étudier le lien entre l'exposition orale chronique au E171 et l'apparition et/ou l'aggravation de désordres métaboliques et intestinaux.
Bénéfices attendus
Outre l'apport de données inédites sur les effets d'une ingestion de TiO2 alimentaire sur le développement de désordres intestinaux et métaboliques, ce projet aidera les parties prenantes et les industriels dans leur décision de maintenir ou non l'autorisation et l'utilisation du E171 dans les aliments. Ce projet pourrait également permettre d'établir un lien potentiel entre facteurs environnementaux (ici ingestion d'additif alimentaire) et augmentation exponentielle dans les pays occidentaux de désordres métaboliques. En conclusion, ce projet fournira des données précieuses pour l'évaluation des risques chez l'Homme d'une exposition au TiO2 alimentaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à un gavage avec du Dextran-FITC à J94 pour évaluer la perméabilité intestinale et à un gavage avec du glucose à J108 pour réaliser le test de tolérance au glucose. Des prélèvements de fèces seront réalisés tout au long de l'expérimentation (1 fois toutes les deux semaines).
Impact sur les animaux
Il est attendu que les animaux exposés au E171 développent un léger surpoids accompagné d'une perméabilité inestinale, d'une inflammation intestinale a bas bruit ainsi que d'une intolérance au glucose. Toutefois ces désordres intestinaux et métaboliques devraient être d'une intensité inférieure a celle observé lors d'un traitement des animaux avec un régime riche en graisse. Nos données préliminaires n'indiquent aucune altération de comportement et de prise alimentaire chez les animaux exposés au E171 incorporé aux croquettes à la dose testé dans cette étude.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réasliser différents prélèvements de tissus sur l'animal en fin d'expérience.
Remplacement
Le projet étudie les effets du E171 (nanomatérieux alimentaires) après une période d'exposition chronique de 115 jours. De plus, l'étude portera sur les impacts sur l'axe microbiote-intestin-foie. Aucun modèle alternatif ne permet de recréer tous les dialogues inter-organes sur une période aussi longue. Le recours à l'animal est donc nécessaire et difficilement remplaçable par des modèles in vitro ou ex-vivo.
Réduction
Les régulations attendues, principalement concernant les tests de tolérance au glucose peuvent être assez fines. Ainsi, chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris pour que les résultats soient statistiquement exploitable, après analyse avec des tests statistiques adaptés. De plus, les procédures de notre projet seront réalisées 2 fois pour pouvoir générer suffisamment d'échantillons pour nos différents end points.
Raffinement
Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées aux animaux, la coupure effectuée au niveau des queues de souris nécessaire pour la mesure de perméabilité intestinale et le test de tolérance au glucose seront réalisé sous analgésie locale. De plus, de l'enrichissement sera disposé dans les cages, sous la forme d'une maisonnette et de dispositif de nidification. Le bien-être des animaux sera assuré par une observation quotidienne et également par un suivi de poids et prise alimentaire hebdomadaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Les souris utilisées seront âgées de 5 semaines afin de faire des observations sur des souris adultes et matures.
Combinaison de la protonthérapie et de l’immunothérapie pour les tumeurs cérébrales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
402 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées dans d'autres protocoles au sein de leur établissement d'origine. Elles reçoivent une implantation de tumeur cérébrale sous anesthésie puis une irradiation de 20 Gy fractionnée en deux séances par jour sur quatre jours, avec prélèvement de sang, pour comparer protonthérapie et rayons X sur la réponse immunitaire. Le porteur indique que les séances répétées peuvent baisser la fréquence respiratoire et entraîner une perte de poids, et que la chirurgie tumorale peut être douloureuse. Il affirme que l'étude du système immunitaire lié à une tumeur cérébrale ne se fait pas in vitro et qu'aucune espèce moins évoluée que la souris ne convient.
Objectifs
« La radiothérapie (RT) fait partie des traitements les plus utilisés chez les patients atteints de cancer. A l’heure actuelle, en France, 60% des patients diagnostiqués pour un cancer sont traités par RT. Pour les tumeurs du cerveau, la RT fait partie du traitement standardisé. Nous avons précédemment montré que l’irradiation aux rayons-X pouvait modifier le système immunitaire dans le cas des tumeurs du cerveau, notamment en augmentant la proportion de cellules associées à une progression tumorale et en diminuant la quantité de cellules anti-tumorales dans le sang. Contrairement à la RT conventionnelle qui utilise des rayons-X, la protonthérapie utilise des particules chargées plus lourdes et de haute énergie. Parce qu’elle peut déposer de façon précise des doses d’irradiation dans le tissu, la protonthérapie peut être utilisée pour : i) limiter les risques de toxicité en réduisant l’exposition du tissu sain, et ii) augmenter la dose déposée à la cible pour accroître le contrôle tumoral. Le premier objectif de cette étude est d’appréhender si la protonthérapie pourrait présenter des avantages par rapport aux rayons-X au niveau du système immunitaire anti-tumorale dans le cas d’une irradiation cérébrale. Le second objectif est de déterminer si la combinaison de la protonthérapie et de stratégies thérapeutiques ciblant le système immunitaire serait bénéfique pour le traitement des tumeurs du cerveau. »
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’améliorer les connaissances scientifiques sur les effets de la protonthérapie sur l’inflammation. De plus, cela permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant la protonthérapie et l’immunothérapie (dont les tumeurs cérébrales sont très résistantes). Le projet scientifique global présente également une partie clinique dont le comité de proection des personnes a été accepté en décembre 2021. Les résultats du projet ci présent pourront ainsi être comparés aux données cliniques. Ainsi, l’ensemble de ces résultats pourra rapidement être adapté à la clinique dans le but d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de tumeurs cérébrales. Plus généralement, ce projet permettra d’appréhender en détail les relations entre la protonthérapie et les immunothérapies.
Procédures
Les animaux subiront plusieurs types d’interventions (irradiations, prélèvements sanguins, …). Les interventions spécifiques, leurs fréquences et leurs durées pour chaque animal sont détaillées en Annexe I. -Initiation du développement de la tumeur : L’implantation des tumeurs est réalisée sous anesthésies L’implantation dure quelques minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. -L’irradiation du cerveau : alors qu’ils sont anesthésiés. L’irradiation est réalisée sous anesthésie générale. Lors de l’irradiation, une dose totale de 20Gy sera délivrée de manière fractionnée comme en clinique : 2.5Gy/séance avec deux séances par jour (espacées de 6h) sur 4 jours consécutifs. - Le prélèvement sanguin sera réalisée sur souris éveillée Ce prélèvement dure une minute et n’est réalisé qu’une seule fois/souris.
Impact sur les animaux
L’irradiation par elle-même n’induit pas de douleurs mais peut induire une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations/min. Les répétitions bijournalières et ce sur 4 jours consécutifs peuvent également induire une perte de poids des animaux jusqu’à 10 jours après irradiation. Le prélèvement sanguin ne provoque pas de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale peut induire des douleurs. Le transport des animaux peut induire un stress surtout que cette étude.
Devenir
Tous les animaux de l'étude qui seront transportés dans notre EU pour les protocoles d'irradiation retournenront dans leur EU d'origine pour la poursuite des protocoles
Remplacement
L’évolution du système immunitaire et ce en lien avec la circulation sanguine cérébrale après un traitement ainsi que la formation et l’évolution de l’inflammation tumorale ne peuvent pas être évaluées in vitro. Les expériences in vivo sont absolument nécessaires pour étudier l’impact d’un traitement et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient être transposées à la clinique, on ne peut pas utiliser d’espèces moins évoluées que la souris. La souris présente un système immunitaire similaire à l’homme et nous disposons d’un modèle in vivo de tumeur cérébrale bien maitrisé dans le laboratoire qui récapitule plusieurs caractéristiques retrouvées chez les patients.
Réduction
Afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour les analyses, le nombre d’animaux nécessaires / groupe prend en compte la variabilité entre les individus basée sur des expériences antérieures et des expériences préliminaires. Ce nombre d’animaux a été déterminé mathématiquement grâce à des logiciels statistiques adaptés afin de réduire au maximum tout en assurant une puissance statistique satisfaisante. Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, à chaque fin de protocole, les tissus (cerveaux, rates et ganglions lymphatiques) seront prélevés pour des études post-mortem.L’imagerie nous permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en évitant des euthanasies à tous temps. »
Raffinement
Les animaux subiront une période d’habituation, d’acclimatation avant la radiothérapie. Les animaux subissent une anesthésie pendant l’irradiation. Les animaux sont surveillés tous les jours pendant toute la durée du protocole, weekend compris. Le poids des souris est suivi tous les 2-3 jours avant, pendant et deux semaines après l’irradiation. Pendant l’irradiation et la semaine suivante, les animaux disposent de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter la perte de poid. Pour le modèle de tumeur, les animaux sont anesthésiés pendant la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux sont surveillés tous les jours pendant le protocol, weekend compris. Les souris sont hébergées dans des cages avec 5 souris/cage dans un environnement enrichi (roues/cartons/bâtons à ronger). Le transport des animaux sera pris en charge par un transporteur agréé.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux chez l’animal sont indispensables pour récapituler au mieux l’environnement des tumeurs qui se développent chez les patients. Nous utiliserons une souche de souris qui présente toutes les populations de cellules immunitaires et parce que le modèle de tumeur cérébral utilisé repose sur l’injection de cellules tumorales issues de cette souche. De plus, pour cette espèce et pour les cellules étudiées, tous les outils de caractérisation sont déjà validés. Les animaux seront agés de 7 semaines. Ce stade correspond à de jeunes adultes et est parfaitement adapté en termes de physiologie aux pathologies ciblées.
Les inhibiteurs d’ERAP comme nouvelle approche pour traiter les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
192 rats transgéniques HLA-B27 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie tous les sept jours jusqu'à J63, pour tester des inhibiteurs d'ERAP contre des maladies auto-immunes comme la spondylarthrite ankylosante. Le porteur indique que l'inflammation de ce modèle reste légère et transitoire, ce qui l'amène à ne prévoir ni analgésique ni anti-inflammatoire. Il présente ces maladies comme relevant d'un fort "besoin médical" et le rat transgénique comme un modèle de référence.
Objectifs
Les ERAPs sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour traiter les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires. Les ERAP 1 et 2 sont des amino-peptidases intracellulaires (métalloprotéases) chargées de la transformation finale des antigènes peptidiques pour présentation par les molécules du CMH de classe I. Ils régulent ainsi la réponse immunitaire adaptative par les lymphocytes T cytotoxiques (LcT) et affectent l'immunodominance en impactant le répertoire peptidique global présenté par le CMH-I. Ces enzymes ont beaucoup attiré l'attention depuis la première découverte d'ERAP1, puis d'ERAP2. Les enzymes ERAP ont des rôles complémentaires et des fonctions importantes in vivo. Un certain nombre d'haplotypes ERAP sont liés au risque de souffrir de diverses maladies auto-immunes ou auto-inflammatoires, notamment le diabète de type 1 (T1D), la spondylarthrite ankylosante (SA), le psoriasis, la maladie rare de Behçet (BD) et l'uvéite de Birdshot (BU). Plusieurs études (voir état de l'art) ont révélé comment les ERAP modulent l'immunopeptidome dans différents contextes pathologiques. Un obstacle scientifique est la disponibilité de petites molécules inhibitrices d'ERAP efficaces, sélectives et biodisponibles. Aucun inhibiteur d'ERAP n'a été évalué in vivo jusqu'à présent et les rapports sur la modulation de l'immunopeptidome par les composés ERAP ne sont pas disponibles. L'objectif du projet est d'identifier des inhibiteurs pharmacologiques d’ERAP à travers méthodes intégrés de chimie médicinale (du criblage fonctionnel de la présentation de l'antigène combiné au profilage des immunopeptidomes dans les cellules des patients) et l’évaluation préclinique de leur efficacité thérapeutique dans un modèle de rat transgénique HLAB-27. Ce modèle présente une maladie inflammatoire multi-systémique avec un phénotype proche de la clinique des spondylarthropathies humaines, des arthrites réactives et autres maladies. La susceptibilité génétique des rats transgéniques exprimant l’allèle HLA-B27/β2-microglobuline humaine en fait un modèle de choix pour cet objectif.
Bénéfices attendus
Ce projet et les composés identifiés pourraient ouvrir la voie à des traitements personnalisés des maladies auto-immunes/auto-inflammatoires. A terme, nous souhaitons proposer de nouvelles options thérapeutiques pour la spondylarthrite ankylosante et la maladie de Behçet qui sont des maladies à fort besoin médical.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins réalisés en rétro-orbitaire, à partir de J0 et chaque 7 jours après le début du protocole de traitement, jusqu'au sacrifice (J63). Ces prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%. Le volume maximal prélevé sera égal à 500μL. Pour chaque rat, le prélèvement sanguin durera au maximum 5 minutes, y compris la durée de l'anesthésie
Impact sur les animaux
Le rat transgénique HLA-B27 présente une maladie inflammatoire multisystémique avec un phénotype proche de la clinique des spondylarthropathies humaines, des arthrites réactives, et autres maladies. L'apparition et la sévérité des symptômes inflammatoires chez le rat HLA-B27 sont liées à l'environnement extérieur (le microbiote intestinal pathogène est responsable des lésions inflammatoires plus sévères). L'état sanitaire de l'animalerie centrale de l'Institut Pasteur de Lille prévoit un élevage sans pathogènes. Dans ces conditions, notre cohorte de rats HLA-B27 présente des formes légères d'inflammation multisystémique, c'est pourquoi l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires n'est pas envisagée. L'inflammation intestinale, ainsi que les douleurs articulaires apparaissent dès la 10ème semaine de vie mais surviennent de manière ponctuelle, discontinue et transitoire (d'une durée variable d'un ou deux jours) et se manifestent, respectivement, par des diarrhées, sans perte de poids et par des douleurs d'articulations, touchant les membres inférieurs, uni ou bilatérale. L'uvéite se manifeste aussi de façon ponctuelle et transitoire avec un dégrée de sévérité très limité. Concernant les molécules candidates qui seront administrés, leur toxicité est préalablement testée par la plateforme ADME de l'institut Pasteur de Lille et leur administration tiendra compte des études de toxicité et de pharmacodynamique afin de ne pas avoir d'effets indésirables qui pourraient interférer avec les résultats de l'expérimentation.
Devenir
A l'issue de la procedure tous les animeaux seront euthanasiés
Remplacement
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, le criblage d'une série d'inhibiteurs d'ERAP1/2 préalablement modélisés et synthétisés par l'équipe partenaire (Deprez) sera réalisé sur des modèles cellulaires par la plate-forme ADME de l'Institut Pasteur de Lille (incluse dans l'Infrastructure Nationale ChembioFrance), par quantification LCMS-MS. De plus une évaluation de la sécurité sera exprimée sous la forme d'un rapport IC50 et CC50 (test cellulaire à haut contenu d'apoptose ou de nécrose (Caspase-3/7 activité Propidium iodure) et évalué la plateforme Equipex Imaginex. Les inhibiteurs candidats seront préalablement testés par des expériences de pharmacodynamiques afin de garantir une exposition et une voie optimale avant les tests chez les rats HLA-B27.
Réduction
Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques pour petits échantillons (tests de Kruskal Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, et corrélation de Spearman). Le nombre d’animaux par groupe est de n = 8, qui est calculé sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminés auprès de la littérature et suite à des expériences pilotes).
Raffinement
Tout rongeur montrant des signes de douleur ou de mal-être sera euthanasié. Les animaux sont observés et pesés d’une manière quotidienne pour une attention particulière aux points limites suivants: -une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris, blessure) -une perte de poids supérieur à 15%. Le suivi quotidien de l'état de santé des rats permettra d'observer l'apparition et l'évolution des manifestations inflammatoires typiques de ce modèle (uvéite, orchite, douleurs articulaires). Le modèle de rat HLA-B27 est maitrisé au laboratoire depuis plusieurs années et nous avons pu observer que ces types de manifestations inflammatoires sont transitoires (d'une durée maximale d'un ou deux jours) et souvent extrêmement légères et ne sont pas prises en compte comme points limites.
Choix des espèces
Le rat transgénique HLA-B27/β2-microglobuline est, à ce jour, considéré comme un modèle animal de référence des maladies inflammatoires systémiques. Caractérisé par un faible nombre de copies de HLA-B27 et une expression transgénique élevée de la β2-microglobuline humaine, le rat HLA-B27 présente une forte ressemblance clinique et histologique avec les spondylarthropathies humaines, avec arthrite réactive, rhumatisme psoriasique, inflammation articulaire périphérique et axiale, uvéite et l'iritis. Chez l'homme, ces maladies sont fortement associées à l'allèle HLA-B27. Les bases moléculaires de la maladie inflammatoire multisystémique chez les rats HLA-B27 résident principalement dans le stress du réticulum endoplasmique (RE) généré par le mauvais repliement des chaînes lourdes de HLA-B27 avant leur association avec ß2m, avec une accumulation conséquente dans le RE induisant l'activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en particulier dans les macrophages. Ces évidences soutiennent la pertinence du modèle HLA dans l'évaluation de l'effet thérapeutique des inhibiteurs d'ERAP. L'utilisation des rats non transgéniques (nTg-Fisher 344) de la même colonie sera justifiée par la nécessité de comparer d’un côté la difference du niveau d’inflammation entre les rats HLA-B27 et les rat wild-type et d’un autre coté les effets des molécules testées dans un modèle non inflammatoire.