Oncologie

3 072 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques d'une maladie de calcification, elles reçoivent un régime gras, des gavages, des injections et une cryolésion cardiaque, avant prélèvement de tissus. Le porteur qualifie le phénotype de "non dommageable" tout en reconnaissant qu'une association testée n'a jamais été évaluée et pourrait entraîner une mortalité. L'étude cherche des pistes thérapeutiques contre le pseudoxanthome élastique.

Objectifs

Le pseudoxanthome élastique (PXE) est une maladie métabolique rare causée par des mutations du gène ABCC6 exprimé majoritairement dans les hépatocytes. Elle est caractérisée par un processus de perte d'élasticité et de calcification touchant principalement la peau, la rétine et les artères. La peau (récepteur) est le seul tissu accessible chez l’humain alors que le foie (émetteur) reste accessible uniquement chez la souris Abcc6-/- du fait de l’absence d’hépatopathie chez les patients. Du fait des connaissances partielles de sa physiopathologie, le PXE reste une maladie incurable. De façon notable ABCC6 n’est pas exprimé significativement dans les organes atteints par la maladie. Dans le plasma des patients PXE, il a été montré une diminution des taux de pyrophosphate inorganique (PPi), molécule endogène aux propriétés anti-calcifiantes. L’objectif général est de comprendre les mécanismes du PXE, puis de tester l’efficacité et la sécurité de stratégies thérapeutiques (Diètes, Médicaments, Thérapies géniques) afin d’aboutir à des essais cliniques chez les patients et améliorer leur prise en charge.

Bénéfices attendus

Sur le PXE: Aspects Cognitifs : Physiopathologie, rôle de l’hépatocyte, cibles thérapeutiques Aspects Cliniques : Amélioration de la prise en charge des patients, prévention des complications, thérapie génique Au dela du PXE: Pathologies vasculaires calcifiantes chroniques liées au diabète et à l’insuffisance rénale chronique. Amélioration des connaissances sur les pathologies liées à l'âge.

Procédures

1) Évaluation de la composition corporelle, 2 minutes sur animaux vigiles 2) Administration du régime athérogène HFD. 3) Administration de molécules par gavage oral, sous-cutanée et intrapéritonéale, quelques secondes sur animaux vigiles 4) Prélèvements sanguins au niveau de la veine faciale, quelques secondes sur animaux vigiles 5) Mesure de la dépense énergétique, du comportement alimentaire et de l'activité physique, 5 jours sur animaux vigiles 6) Injection intra-péritonéale de LPS, quelques secondes 7) Cryolésion cardiaque sous anesthésie. 8) Imagerie In-vivo sous anesthésie, cela peut aller de 1 minute à 1heure.

Impact sur les animaux

La souris Abcc6-/- a une durée de vie équivalente à celle d'une souris WT. Son phénotype est non dommageable. L’association HFD+LPS n'a jamais été testée dans le modèle Abcc6-/- et nous n'avons aucune donnée sur l'impact en termes de mortalité. Cette association est donc exploratoire. Si nous constatons une létalité trop importante, cette association sera abandonnée. Les données de la littérature de cette association dans d'autres modèles murins sont rassurantes. Même si l'extropolation au modèle Abcc6-/- ne peut se faire sur le plan scientifique, nous faisons l'hypothèse que le phénotype ne sera pas dommageable compte tenu de la durée de vie de la souris Abcc6-/-.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus pour analyse complémentaire.

Remplacement

Ces expériences sont indispensables car nous voulons d’une part mieux comprendre la physiopathologie du PXE en la recentrant sur le foie, de caractériser le ou les substrats endogènes transportés par Abcc6 en réponse à différentes diètes et de thérapeutiques permettant de bloquer la fragmentation et la calcification des fibres élastiques. D’autre part, nous espérons que ce projet apportera des connaissances qui permettront de fournir des résultats précliniques transposables dans des essais cliniques chez les patients. Le PXE est le prototype d'une maladie métabolique "endocrine" où le foie (l'émetteur), principale source d'expression d'Abcc6, n'est pas touché par la pathologie et les cibles sont les organes périphériques n'exprimant pas ou peu la protéine Abcc6. La substitution totale et complète d'un tel système physiopathologique par d'autres méthodes alternatives n'est pas possible. Enfin, comme il n'existe pas d'hépatopathie chez les patients, il est non éthique de proposer aux patients une biopsie de foie.

Réduction

le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables pour valider les données obtenues à la fin de la procédure. Un test statistique ANOVA, étudiant la significativité des résultats nous permettra de traiter les données tout en prenant en considération la mortalité possible des souris en cours d’expérience.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une structure agrée qui tient compte de l' éthique animale. L'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté dans chaque cage afin de minimiser le stress induit par l'hébergement. Le raffinement sera complété par une surveillance journalière des animaux pour s'assurer que les conditions de bien être sont respectées. De plus, le suivi hebdomadaire du poids des souris et de leur comportement constitueront les principaux points limites. Pour réduire la douleur nous utiliserons un antalgique. Pour notre protocole, une grille de score avec des points limites adapatés a été mise en place.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée sera la souris C57BL/6J KO pour le gène Abcc6 et WT. La souris est un bon modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme (95% du patrimoine génétique identique). Notre travail se base sur l’étude de lignées de souris génétiquement modifiées. L’absence ou la sélectivité relative des outils pharmacologiques disponibles pour étudier la signalisation d’intérêt fait de ces animaux un outil d’étude approprié et puissant. Pour élucider cette maladie complexe qu'est le PXE, une souris transgénique a été générée par ablation du gène Abcc6 chez la souris. Les souris Abcc6-/- développent des calcifications de la peau, des vaisseaux et de la rétine, reproduisant ainsi le phénotype humain du PXE non dommageable. La minéralisation des vibrisses débute dès l'âge de 5 semaines et progresse jusqu'à l'âge de 2 ans. Nos investigations débuteront sur des animaux adultes de 6 semaines étant donné que le phénotype PXE débute à 6 semaines d'âge jusqu'aux âges de 3, 6, 12 et 18mois, soit 16,5 mois de traitement au maximum. Les différentes interventions auront pour but de comparer le phénotype des souris et d'identifier les molécules susceptibles d'inhiber ou de moduler favorablement le phénotype.

960 canards mulards vont être utilisés, tous abattus à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit l'épointage du bec et le dégriffage par cautérisation infrarouge à un jour d'âge, puis tous sont élevés en claustration et gavés pour la production de foie gras. Le porteur reconnaît que l'épointage provoque un stress et une douleur aiguë modifiant le comportement jusqu'à deux semaines. L'étude compare ces pratiques dans le mode d'élevage qu'il décrit lui-même comme "le plus contraignant" pour l'animal.

Objectifs

En élevage le canard de Barbarie et le canard Pékin peuvent manifester des comportements anormaux, dont la cause principale n’a pas été identifiée, générant des problématiques de picage et de griffures causant des lésions et portant ainsi atteinte à leur bien-être. Les méthodes principales permettant de prévenir ou de contrôler ces comportements sont l’épointage et le dégriffage. L’épointage est réalisé par cautérisation de l’extrémité bec du caneton à 1 jour à l’aide d’un faisceau infrarouge afin de limiter sa croissance. Le dégriffage est réalisé selon le même procédé sur la pointe des griffes. Il n'existe pas de données bibliographiques sur ces problématiques chez le canard mulard, hybride issu d’un mâle Barbarie et d’une femelle Pékin. Or, ces pratiques préventives sont potentiellement douloureuses. L’objectif du premier essai est donc de caractériser et de comparer le comportement, l’état corporel et les performances zootechniques (croissance pondérale, efficacité alimentaire, poids des pièces de découpe) de lots de canards ayant été soit épointés, soit dégriffés, épointés et dégriffés ou n’ayant eu aucune intervention (lot témoin) afin d'obtenir des données liées à ces pratiques. Ces animaux seront élevés en claustration, le mode d’élevage le plus contraignant pour l’animal qui soit pratiqué en élevage, notamment lors de la mise à l’abri en période d’influenza aviaire. Un environnement contraignant devrait mettre en exerge les différences entre lots. Selon les résultats issus de ce premier essai, un second essai nous permettra de tester un levier pour limiter les effets indésirables en l’absence des pratiques d’épointage et de dégriffage (enrichissement de l'hébergement, lumières, accès extérieur, densité...). L'objectif appliqué étant de définir les modalités d'élevage les plus adaptées à la biologie du canard afin de favoriser son bien-être .

Bénéfices attendus

Le projet permettra de disposer de données spécifiques au canard mulard sur les problématiques du picage et des griffures en conditions de confinement, ce mode d'élevage étant celui devant être adopté lors des périodes d'influenza aviaire. Ces essais permettront d’évaluer, faute de données disponibles pour cette espèce et ce mode de production, les conséquences de l’arrêt de ces traitements en conditions défavorables (confinement), sans autre changement dans la conduite, dans un objectif d’amélioration du bien-être animal. En fonction des résultats obtenus, différents leviers seront in fine proposés à partir d’éléments issus de la bibliographie disponible chez d’autres espèces afin de pallier les problèmes rencontrés et l'un d'entre eux sera testé expérimentalement

Procédures

Les animaux seront soumis à des contentions (manipulation individuelle par un opérateur formé et mise en caisse adaptée à l’âge et l’espèce des animaux) nécessaires à leur pesée et à l'évaluation de leur état corporel (7 au maximum par animal au cours des 12 semaines d’élevage). La durée totale de chaque contention n'excèdera pas 30 minutes. A l'âge de 84 jours ils seront placés dans des caisses de transport et transférés de loges de 30 animaux à des parcs collectifs de 4 canards. Ce transfert n'excèdera pas 1 heure. 120 animaux seront épointés au couvoir à 1 jour d'âge par application d'un faisceau infrarouge sur la pointe du bec. 120 animaux seront dégriffés selon la même méthode, le faisceau infrarouge étant appliqué sur la pointe des griffes, parmi ces 240 animaux. 120 animaux seront à la fois épointés et dégriffés selon ces procédés.

Impact sur les animaux

En l’absence de traitement du bec, les animaux sont susceptibles d'exprimer des comportements mutuels d’arrachage des plumes (picages), pouvant amener à des lésions plus ou moins graves et donc à une altération de leur bien-être. Ce risque est généralement accru vers l'âge de 6 semaines. L'épointage est effectué au couvoir peu après l'éclosion par chauffe de la pointe du bec à l'aide d'un faisceau infra-rouge. Cette méthode inhibe la multiplication des cellules à la pointe du bec et limite son développement. L’épointage provoque également un stress et une douleur aiguë transitoires qui, chez les canards Pékin et Barbarie, se manifestent par des changements comportementaux (augmentation du repos et diminution des comportements nécessitant l'utilisation du bec tels que l’alimentation, l’abreuvement, le lissage des plumes et l’exploration) pouvant être observés jusqu'à 2 semaines après l’épointage. En l’absence de traitement des griffes et d'accès à l'extérieur pour assurer leur abrasion, les animaux sont susceptibles de se blesser mutuellement (griffures), notamment si le lot s’avère réactif à des évènements soudains (réactions au bruit notamment). Le dégriffage est une procédure similaire à l'épointage avec un traitement infrarouge sur l'extrémité des griffes afin de limiter leur croissance. Les canards en phase d’engraissement suivront une procédure de gavage, susceptible dans de rares cas où elle serait mal réalisée de générer des lésions dans leur oesophage. Le mode d’hébergement en loges collectives limitera leurs possibilités de mouvements, bien qu’en engraissement les animaux aient une activité amoindrie et plus de repos immobile lié à la digestion.

Devenir

Les animaux seront abattus en abattoir agrée en fin d'essai afin d'effectuer des mesures sur leurs performances zootechniques (poids des pièces de découpes: cuisse, magret, peau du magret, poids du foie, test de fonte).

Remplacement

Le comportement des animaux en élevage étant étudié, l’animal vivant ne peut pas être remplacé par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.

Réduction

960 animaux répartis en deux essais de 480 canards mulards mâles seront requis. Pour chaque essai cela représente 120 canards par modalité, soit 30 animaux par parc. Pour comparer statistiquement les modalités et détecter des différences entre-elles, un effectif minimal de 99 animaux par modalité est nécessaire, soit 25 animaux par parc. Après vérification sur des données de croissance pondérale d'un essai précédent, cet effectif permettra de différencier les lots dès un écart de moyenne de 343g. Ce projet étant le premier mesurant des paramètres liés à l'épointage et au dégriffage, un tel effectif permettra également de détecter des effets faibles lors de l’utilisation des tests statistiques. Afin de pallier les aléas expérimentaux, l'effectif par loge est fixé à 30 animaux pour s'assurer un nombre minimal de valeur pour tester statistiquement les hypothèses. L'hétérogénéité des réponses chez les canards mulards sera également prise en compte au sein de chaque modalité.

Raffinement

Les mesures de comportement seront réalisées par vidéos pour ne pas cause de stress par la présence d’un humain. Les mesures nécessitant la manipulation des animaux seront regroupées afin de limiter les contentions, qui seront réalisées sur le nombre minimal d'animaux nécessaire (25 par loge). Le transport de l'élevage à l'engraissement se fera parcs par parcs pour minimiser le temps passé en caisse de transport (moins d'1h). Les animaux seront élevés en groupe et surveillés quotidiennement. En engraissement avant chaque repas un contrôle du jabot sera effectué par le gaveur par palpation. Ce contrôle de la digestion permet de limiter le risque de blessures en limitant le volume du jabot et la dilatation de l'oesophage, en ajustant la dose d'aliment donnée. Cela permet aussi de détecter les éventuelles lésions. En cas de lésions sévères ou de perforation de l'oesophage l'animal est euthanasié car cette blessure est irréversible. Le gaveur étant entraîné à réaliser l'embucage, le nombre d'animaux lésés est rare. Le picage et les griffures pouvant occasionner des lésions sévères, une grille d’indicateurs sera mise en place afin de déterminer le point limite, c’est-à-dire le moment ou la souffrance et/ou la détresse de l’animal doit être pris en charge et des actions mises en place. La grille regroupe des critères auquel un score est attribué selon leur déviation d'un état normal (aspects : taille, poids, état du plumage, lésions ; physiologie : respiration, consommations ; comportement : agressivité, isolement, postures, boiteries, troubles de l’équilibre). Lorsque la déviation est mineure la surveillance est renforcée jusqu’à retour à un état normal. Les conditions d’ambiance pourront être modifiées (ventilation, température). En cas de déviation modérée des mesures sont prises pour atténuer la souffrance (nettoyage de la plaie, mise en infirmerie jusqu’à cicatrisation, modifications de la complexité de l’hébergement : ajout d’objets à manipuler, de litière…). En cas de déviation grave l'animal sera euthanasié si le retour à l’état normal est impossible ou nécessite un isolement prolongé, source importante de stress car le canard est un animal social. Si dans un parc au moins la moitié des animaux présentent des déviations modérées à sévères la surface de la loge pourra être doublée et le vétérinaire pourra être consulté.

Choix des espèces

Les travaux ont un objectif finalisé d’application au sein de la filière palmipède à foie gras (canard). Il n’est donc pas pertinent de choisir une autre espèce animale que le canard gras, et en l’occurrence le canard mulard mâle, espèce légalement autorisée pour la production de foie gras (règlement CE 1538/91 de la commission du 5 juin 1991, portant modalités d'application du règlement (CEE) n° 1906/90 du Conseil établissant des normes de commercialisation pour les volailles). Les animaux utilisés pour l’essai seront âgés de 1 à 94j. De 1 à 83j, ils seront élevés au sol en loges collectives de 6m². Seront suivis le comportement, l’état corporel et les performances des canards en élevage. Après transfert dans un autre bâtiment, les animaux seront engraissés par gavage de 84 à 95j en loges collectives afin de mesurer les effets potentiels des paramètres testés jusqu’à la fin du cycle de production classiquement suivi pour la production de foie gras. Seront suivis le comportement, l’état corporel et les performances des canards lors de l’engraissement par gavage. Ces âges correspondent à ceux retrouvés en élevage de canard gras standard.

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont isolées quinze jours puis placées en cages métaboliques, le porteur reconnaissant que l'isolement et le passage en analyseur de masse corporelle provoquent un stress modéré. L'étude vise à caractériser le comportement alimentaire et la dépense énergétique de souris porteuses d'une mutation liée à l'obésité. Le porteur affirme que l'exploration du métabolisme énergétique ne peut se faire que sur un "organisme entier".

Objectifs

Lors des dernières décennies, l'obésité et le surpoids ont atteint les proportions d’une épidémie mondiale impactant 1.9 milliard d’adultes en surpoids et plus de 650 millions d’obèses en 2016. Plusieurs études ont clairement montré que les voies de l’immunité innée sont impliquées, notamment via leur activation par les bactéries du microbiote intestinal, dans la mise en place de l’obésité et des maladies métaboliques qui y sont associées. Récemment une nouvelle voie de l’immunité innée a été identifiée. Cette voie implique un récepteur intestinal. Chez l’homme, des mutations du gène de ce récepteur ont été associées à l’obésité, à la prise de poids et au diabète de type 2. Une lignée de souris mutées pour ce récepteur a donc été développée afin de mieux caractériser les effets de cette voie de signalisation sur la mise en place de l'obésité et afin de comprendre les mécanismes sous-jacents liant cette voie à l’obésité. Par rapport à des souris contrôles issues de la même fratrie, la prise de poids de ces souris en réponse à un régime riche en lipides est réduite de 20%. Cependant aucune mesure de la structure détaillée des repas ainsi que des données sur la balance énergétique ne sont disponibles à ce jour. Or il a clairement été montré que la structure des repas (quantités d'aliments ingérés, taille, heure et fréquence des repas) ainsi que le statut de la balance énergétique sont déterminants dans la prise de poids. Afin d’identifier les mécanismes liant ce récepteur et la prise de poids il est nécessaire de caractériser précisément la structure des repas, de même que la dépense énergétique des animaux et leur composition corporelle précise. L’ensemble de ces paramètres peuvent être obtenus de manière non invasive via l’utilisation de cages métaboliques et d'un analyseur de la composition de la masse corporelle.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les mécanismes régulant le comportement alimentaire et la dépense énergétique est essentiel dans le cadre de la lutte contre les maladies métaboliques telles que l’obésité. En effet l’obésité, pandémie mondiale aux conséquences médicales et économiques multiples et dévastatrices, est une pathologie résultant d'une dérégulation de la balance énergétique et implique notamment une dérégulation de la prise alimentaire et/ou de la dépense énergétique. Le modèle de souris portant une modification du recepteur intestinal, compte tenu de la résistance à l'obésité qu'elles développent indique que l'étude de cette voie de signalisation et de son lien avec le comportement alimentaire et/ou la dépense énergétique peut permettre la découverte de nouvelles cibles therapeutiques utiles dans la lutte contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à un isolement durant 15 jours. L’analyse métabolique ( 8 jours) n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne necessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Aucun prélévement n'auront lieu sur animal vigile. Les animaux seront monitorés tous les jours, ils seront pesés: 1 fois/ jours (2 minutes/animal) lors de l'individualisation, puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition coporelle analysée (3 minutes/animal) de maniére non invasive 1 fois au debut de l'individualisation puis à l'entrée, lors du changement de régime et à la sortie des cages calorimétriques, soit 4 fois durant l'expérience.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré susceptible d'apparaitre durant la totalité de l'expérimentation. La durée totale de l'isolement des animaux est de 15 jours. De même les souris seront placées pendant 2 minutes dans un analyseur de masse corporelle. Cette technique bien qu'étant non invasive peut entrainer un stress modéré durant le temps de l'analyse. Aucune douleur n'est attendue durant le protocole. Le poids et la prise alimentaire de ces animaux sera surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 10% du poids initial. L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal.

Devenir

Aprés que les animaux sont retirés des cages métaboliques, leurs poids et leurs composition corporelle évaluées. Il n 'y a pas de nécéssité de conserver les animaux, ainsi les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les interactions entre immunité innée/régime alimentaire et comportement alimentaire/dépense énergétique/composition corporelle. Enfin, l’exploration du métabolisme énergétique et des comportements attenants ne peut se faire que sur un organisme entier, en raison de l’organisation et de la coopération des tissus métaboliques actifs.

Réduction

Afin de réduire de nombre d'animaux nous proposons dans cette étude d'étudier le comportement alimentaire, la dépense énergétique et le composition corporelle sur les mêmes animaux. D’après les études de comportement déjà menées en laboratoire, nous estimons que 8 souris par groupe expérimental sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80% ) compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. La lecture métabolique effectuée sur plusieurs jours permettra de réduire la variabilité intrinsèque de l’animal et inter animal, et limite le nombre d’animaux utilisés. Enfin le changement de régime au cours de l'analyse et sur les mêmes animaux permettra aussi d'évaluer les capacités adaptatives de l'animal lors d'un changement de régime.

Raffinement

L'analyse calorimétrique et la mesure de la composition corporelle sont deux analyses non invasives. -L’animal est hébergé dans une cage d’hébergement classique (500 cm2) dans le système de calorimétrie indirecte. -Les animaux bénéficieront d’un enrichissement, un abri en propylène rouge ainsi que deux carrés de coton et une nacelle pour faire leur nid. -les capteurs sont encastrés dans le couvercle de la cage et ne gênent pas l’animal, -l’air des cages est renouvelé à un taux de 2litres/min (débit calibré pour une mesure précise de la consommation de O2 et la production de CO2). Le mal-être a des conséquences directes sur les paramètres de la balance énergétique (prise alimentaire, activité locomotrice, dépense énergétique) et in fine sur la qualité et la validité des données obtenues. Pour cela, les animaux seront surveillés quotidiennement (surveillance visuelle plus suivi de la prise alimentaire et hydrique et du gain de poids). Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés et calculés quotidiennement au moyen du système de calorimétrie, le tout est effectué de manière automatique, de jour comme de nuit et sans intervention de l’opérateur. Des points limites et des critères d'arrêt de l'expérience ont été prévu en cas d'anomalie de comportement ou d'alimentation. Si un de ces paramètres affiche une valeur anormale, l'opérateur/responsable en recherchera l'origine.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est le seul modèle de souris transgéniques disponible qui permet d’étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude du métabolisme et est largement utilisé pour les recherches sur les maladies liées à l’alimentation. de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris et du transport intestinal du fructose sont un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les animaux adultes (entre 10-12 semaines) seront utilisés. c'est à dire à l’âge adulte : (1) lorsque toutes les structures cérébrales sont stabilisées pour ne pas impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au cours du temps ; (2) la masse de l’animal est plus stable à l’âge adulte ce qui permet une analyse fiable et robuste durant le temps de l’expérimentation.

216 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à neuf injections dans l'abdomen puis développent un cancer de la prostate avant d'être disséquées pour étude de la prostate. Le porteur présente l'étude comme un projet pilote destiné surtout à mettre au point le protocole expérimental. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité des lésions précancéreuses.

Objectifs

Afin de mieux comprendre l’évolution des cancers de la prostate (CaP), ce projet pilote ,utilisant des lignées de souris génétiquement modifiées, vise à déterminer le protocole expérimental pour identifier les populations cellulaires qui prolifèrent dans les lésions précancéreuses présentant des mutations et une cinétique similaires que celles trouvées chez l’Homme.

Bénéfices attendus

ce projet pilote déterminera le protocole expérimental permettant d'identifier les populations cellulaires qui prolifèrent dans les lésions précancéreuses.

Procédures

Les souris subiront au maximum 9 injections intra-péritonéales espacées de 1 à 10 mois, soit 1 injection quotidienne en intra-péritonéales pendant 5 jours de tamoxifène dans un premier temps, et 1 injection quotidienne d'EdU pendant 4 jours au temps de cinétique choisi. Aucune autre intervention n'est prévue.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques injectées développeront des cellules tumorales qui évolueront en cancer de la prostate (CaP). De plus, une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’injection pour éliminer tout risque d’infection (pas de zone rouge autour de la zone ou de présence de pus).

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure 1 et 2 afin d'être disséqués pour l'étude de la prostate.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de différencier les rôles de différentes molécules pouvant être impliquées dans le développement du CaP, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 2 lignées de souris différentes soit 216 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions statistiquement significatives. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro et des études pilotes pour identifier le protocole efficace ont été réalisées afin d’éliminer certaines hypothèses et de mieux définir les expériences à effectuer sur les modèles in vivo.

Raffinement

Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé, est inactif après stimulation, ou si les points d'injections présentent des signes d'infection ou d'inflammation il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave (blessure importante par exemple), l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes, de 8 semaines à plus d'un an afin de faire une cinétique en fonction de l'âge.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe d'un million de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, puis est tuée par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque entre 3 et 28 jours plus tard, pour étudier l'influence des fibres nerveuses sur le cancer du sein. Le porteur indique que les cellules mises en co-culture avec des neurones peuvent donner des tumeurs plus volumineuses voire des métastases. Sur le remplacement, il décrit un test de co-culture in vitro déjà mis au point mais affirme qu'il ne reproduit pas la complexité de l'organe, d'où le recours aux souris.

Objectifs

Les cancers du sein sont la première cause de décès liés au cancer dans le monde occidental chez la femme. Dans ce cancer l'environnement autour des cellules cancéreuses joue un rôle crucial. Récemment, un nouvel élémentde cet environnement tumoral a été identifié : les prolongements des neurones (axones) du système nerveux périphérique. S’il est maintenant clairement établi que certaines cellules de l'environnement tumoral influencent la progressiondu cancer, le rôle des cellules nerveuses et notamment des fibres nerveuses infiltrant les tumeurs reste mal compris. Nous proposons donc d’étudier l’influence du système nerveux dans le développement des cancers du sein. Ainsi, le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle de l’innervation au sein des tumeurs mammaires et de caractériser les interactions entre les projections nerveuses et les cellules tumorales. Nos données in vitro ont montré que les cellules cancéreuses de cancer du sein de souris co-cultivées avec des neurones étaient capables de proliférer plus rapidement que les cellules cancéreuses cultivées seules. Nous souhaitons donc à travers ce projet valider ce résultat chez la souris. Dans un premier temps, nous étudierons le développement tumoral d’une implantation dans la glande mammaire de cellules cancéreuses de souris ayant été au préalable en co-culture pendant 6 jours avec des neurones. Nous utiliserons comme contrôle des cellules tumorales ayant été en culture seules 6 jours avant implantation. Afin d’étudier la cinétique du développement tumoral, nous procéderons à des euthanasies au bout de 3, 7, 14 et 28 jours (ou atteinte d’un point limite). Pour finir, dans une deuxième et dernière procédure, nous souhaitons vérifier que le caractère pro-tumoral des cellules cancéreuses est bien dû à la présence des neurones. Pour cela, nous induirons une mort des neurones en traitant nos cellules avec une drogue en co-culture avant l’implantation dans la glande mammaire. Nous utiliserons comme contrôle des cellules cancéreuses ayant été en culture seules 6 jours avant implantation et traitées avec la drogue induisant la mort neuronale. Afin d’étudier la cinétique du développement tumoral, nous procéderons à des euthanasies au bout de 3, 7, 14 et 28 jours (ou atteinte d’un point limite).

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va donc identifier de nouvelles interactions entre les neurones et les cellules cancéreuses applicables dans la lutte contre les cancers. A ce jour, les thérapies couramment utilisées en clinique ciblent principalement les cellules tumorales (chimiothérapie) et, plus récemment, le microenvironnement tumoral en visant les vaisseaux sanguins de la tumeur. L’identification des mécanismes à l’origine du dialogue entre les neurones et les cellules cancéreuses sera une avancée majeure pour le traitement des cancers et pourra déboucher vers de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de lutter contre le développement de la tumeur primaire mais aussi des métastases.

Procédures

Les souris reçoivent une injection de 1 000 000 de cellules tumorales implantées avec une seringue à insuline (29 G) au niveau de la glande mammaire sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une minute, et maintien au masque à 2.5% isoflurane d’environ 2-3 minutes, temps nécessaire à l’injection des cellules dans la glande mammaire).

Impact sur les animaux

La lignée de cellules cancéreuses utilisée est issue d’un carcinome mammaire spontané apparu chez la souris femelle, et est décrite comme peu agressive et non métastatique. En effet, ces cellules ne sont pas capables de sortir du site d’injection primaire et le volume tumoral moyen à 28 jours n’excède pas 1cm3. Aucune métastase n’est donc détectée dans les poumons, le foie et les ganglions lymphatiques 7 semaines après implantation. Dans nos procédures, nous nous limiterons à 28 jours post implantation afin de limiter au maximum la souffrance animale. Cependant, nos données in vitro montrent que la co-culture de ces cellules avec des neurones sympathiques augmente les capacités oncogéniques des cellules tumorales. Il est donc possible que les cellules cancéreuses ayant été en co-culture soient plus agressives et donnent donc des tumeurs plus volumineuses ainsi que des métastases. Dans nos procédures, nous utiliserons une fiche de score adaptée et nous nous limiterons à 28 jours post implantation afin de limiter au maximum la souffrance animale.

Devenir

Dans l’ensemble des procédures, les euthanasies seront réalisées par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque. En effet, nous procéderons à une euthanasie par dislocation cervicale dans un premier temps car nous souhaitons effectuer des tests de prolifération et d’invasion in vitro ainsi que des coupes fines du tissu avec des marqueurs spécifiques afin de visualiser la tumeur ou les métastases possibles sur le foie et les poumons. Ces expérimentations sont toutes compatibles avec une euthanasie par dislocation cervicale. Dans un deuxième temps, nous souhaitons réaliser une description plus précise des phénomènes observés lors de notre étude, nous devons donc travailler sur des tissus dont la structure morphologique et l’organisation cellulaire sont parfaitement conservées. Pour cela, une perfusion intracardiaque sous anesthésiant est préconisée suivie d’une exsanguination induisant la mort de l’animal. La technique de perfusion intracardiaque est détaillée dans chacune des procédures. Pour les animaux ayant ateint un point limite, l'euthanasie se fera par dislocation cervicale.

Remplacement

Nous avons mis au point un essai in vitro de co-culture de cellules cancéreuses et de neurones qui permet de récapituler le mieux possible les interactions entre neurones et cellules cancéreuses. Nous avons observé que la croissance des fibres nerveuses déclenche une augmentation de l'invasion et de la prolifération des cellules cancéreuses. Même si nous avons exploité au maximum les données in vitro, nos co-cultures ne récapitulent pas la complexité́ de l’organe. En effet, une tumeur se développe par l’interaction des cellules cancéreuses avec leur environnement tumoral très complexe constitué de cellules immunitaires, de vaisseaux sanguins, de fibroblastes ect… La culture in vitro des cellules tumorales avec uniquement un seul constituant du microenvironnement tumoral (ici, les neurones) ne reproduit donc en aucun cas un développement tumoral physiologique d’où notre recours aux animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est choisi afin d’obtenir une taille d’effet d’intérêt avec un nombre de souris minimum. Le nombre de souris se justifie par la taille moyenne des tumeurs 28 jours après implantation des cellules tumorales.

Raffinement

Dans le respect de la réglementation européenne, les animaux seront manipulés dans le calme ,4/cages, avec une alternation jour/nuit de 12h, eau et nourriture à volonté. Chaque cage est enrichie (maisonnette en carton, carrés de coton). Les cages sont séparées des élevages pour un suivi adapté. La période d’acclimatation suite à la livraison des souris sera de 5 jours, à la fin de laquelle les souris recevront les cellules tumorales. L’injection des cellules tumorales est réalisée sous anesthésie générale. Le suivi sera effectué 3 fois par semaine et évalué via la grille de score associés à des critères de mal-être . Un score cumulé limite entrainera la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle des fibres nerveuses dans le développement tumoral du cancer du sein. Dans cette optique, nous souhaitons utiliser le modèle d’implantation de cellules tumorales dans la glande mammaire. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Ce modèle est un outil puissant et couramment utilisé dans l’étude des cancers du sein. Les implantations de cellules tumorales seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines, âge auquel la glande mammaire est mature/formée. Dans les nos 2 procédures les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront à 3, 7, 14 et 28 jours après implantation des tumeurs. En effet, afin d’étudier le comportement des cellules tumorales co-cultivées avec les neurones, il est nécessaire de regarder à différents temps du développement tumoral. Ainsi nous pourrons mieux comprendre comment les cellules tumorales deviennent plus agressives lorsqu’elles sont en contact avec les neurones et déceler des mécanismes qui s’opèrent au début du développement.

6 615 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de cellules de mélanome, sous la peau, dans la veine caudale ou par injection intrasplénique sous anesthésie, puis des injections d'inhibiteurs trois fois par semaine pendant jusqu'à soixante-dix jours, pour tester des molécules censées lever la résistance aux traitements du mélanome. Le porteur décrit des tumeurs pouvant provoquer nécroses cutanées, perte de poids et prostration avant l'atteinte des points limites. Il affirme qu'il n'est "pas possible de s'affranchir" de la souris faute de méthode reproduisant des interactions aussi complexes.

Objectifs

Malgré les progrès dans le traitement des patients atteints de mélanomes avec les thérapies ciblées (TT), combinaison d’inhibiteurs (vémurafénib/tramétinib ou dabrafénib/cobimétinib), et les immunothérapies (ICT) (nivolumab, pembrolizumab et/ou ipilimumab), plus de la moitié des patients développent des résistances à ces traitements. De nouvelles approches thérapeutiques pour permettre de contourner ces résistances et resensibiliser les patients aux traitements deviennent alors nécessaires. Notre équipe a montré que l'altération du paysage épigénétique est un événement clé associé à la plasticité des cellules de mélanome et à l'acquisition de résistances. L'épigénétique est l'étude de l'activité des gènes sans modification de la séquence d'ADN. Nous avons étudié le rôle de l’épigénétique sur les résistances des cellules de mélanome au TT et aux ICT. In vitro, nos résultats montrent que l’inhibition de répresseurs transcriptionnels (appelés CtBP1 et CtBP2) et du modificateur épigénétique (appelé G9a) est capable de resensibiliser les cellules de mélanome résistantes aux TT et aux ICT. L’objectif du projet est de valider in vivo, chez la souris, les résultats montrant la re-sensibilisation des cellules de mélanome aux TT et/ou ICT. Par ailleurs, les mélanomes métastasent facilement aux poumons, au foie et dans les os, entre autres, causant le décès des patients. La localisation des métastases influence les réponses aux traitements, qui peuvent être différentes en fonction de l’environnement pulmonaire, hépatique ou osseux. Nous étudierons donc l’effet des drogues épigénétiques sur le développement des métastases dans divers organes. Ainsi, nous validerons nos résultats montrant une diminution de la capacité métastatique des cellules de mélanome.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une validation in vivo, chez la souris des observations faites in vitro, sur la capacité des drogues épigénétiques à resensibiliser les cellules de mélanomes résistantes aux thérapies ciblées. Il permettra aussi de vérifier les effets de ces drogues dans le contexte d’un système immunitaire complet et de vérifier que les drogues utilisées n’affectent pas le système immunitaire. Ces validations sont indispensables pour envisager un développement clinique de nos approches thérapeutiques (inhibiteur épigénétique en association avec les thérapies ciblées ou les immunothérapies).

Procédures

Pour les procédures 1 et 5 une injection de cellules en sous cutanée au niveau du flanc gauche sur souris vigile puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (864 souris procédure 1 et 648 souris procédure 5, au total 1512 souris). Pour les explorations métastatiques, les souris seront injectées 15 min avant l'imagerie par voie intra-péritonéale avec de la D-luciferine puis anesthésiées avec de l'isoflurane selon le protocole préconisé (voir procedure expériementale). Pour les procédures 2 et 6, la formation de métastases pulmonaires grâce à l’injection veine caudale sera suivie par bioluminescence 24h après l'injection (=confirmation du signal) puis 2 fois par semaine pour suivre l'évolution des métastases, puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (864 souris procédure 2 et 648 souris procédure 6, au total 1512 souris). Pour les procédures 3 et 7, une injection intrasplénique de cellules sur souris sous anesthésie générale (anesthésie environ 1h et acte chirurgicale environ 30min), puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (864 souris procédure 3 et 648 souris procédure 7, au total 1512 souris). Le suivi des métastases se fera comme pour la procedure 2 et 6. Pour les procédures 4 et 8, une injection intracardiaque de cellules sur souris sous anesthésie générale (environ 30min), puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (1188 souris procédure 4 et 891 souris procédure 8, au total 2079). Le suivi des métastases se fera comme pour la procedure 2 et 6.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des drogues thérapeutiques, soit par l’acte chirurgical initial. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des drogues pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..). Le site d’injection IP sera surveillé et changera de côté pour chaque injection. En cas d’altération au site primaire d’injection, l’injection suivante s’effectuera de l’autre côté. En cas de rougeurs des deux côtés, l’injection sera reportée au tour suivant. L’acte chirurgical (injection intracardiaque, injection intra splenique) pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site de l’opération. La cicatrice sera surveillée. En cas de persistance des signes décrits ci-dessus, l’animal sera sacrifié. Il a été montré dans la littérature que la combinaison de DMSO + PEG 300 + Tween 80 ne présente aucune toxicité pour l’animal et a déjà été administré chez les patients atteints d’un cancer. (Kalepu & Nekkanti, Acta Phamaccutica Sinica B, 2015). Les drogues A et B ont déjà été testées in vivo par des pairs et les concentrations utilisées sont réduites par rapport aux données de la littérature (Chen et al., Journal of Cancer, 2021, doi: 10.7150/jca.50255).

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes. Les études in vitro que nous avons réalisées dans un premier temps ont montré l’efficacité des drogues épigénétiques dans l’induction de la mort ou l’arrêt de la prolifération des cellules de mélanome cutané ainsi que dans l’inhibition de leur capacité invasive.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test de puissance statistique dans le cas où la différence de moyenne de chaque groupe est supérieure au moins d’un quart à notre écart type (1.25 fois notre moyenne contrôle) et une puissance de 0.9 et un risque de 0.01. Pour la réalisation de ce projet, il faudra 6615 souris. Les groupes contrôles sont mis en commun pour les différents traitements avec les inhibiteurs afin de réduire le nombre d’animaux. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs/métastases et organes (tels que le foie, la rate, les poumons) pour des analyses histologiques et biochimiques. Il est fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inférieur à la fin du projet. En effet, certaines procédures ou parties de procédures pourront être abandonnées, ou le nombre d’animaux réduit, en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi et seront observées deux ou trois fois par semaine selon la procédure par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est fait par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum grâce à un suivi longitudinal précis et quantifiable par imagerie.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant de similitudes génétiques avec l’homme. De plus, elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien connu, une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Nous utiliserons un modèle de souris C57BL/6J (pour les cellules de mélanome murin) et Nude (pour les cellules de patients). Grâce à un système immunitaire très faible, la souris nude pourra recevoir des cellules humaines sans risque de rejet. D’autre part, ce modèle de souris est commercialisé, bien établi et d’importantes études ont déjà été réalisées à partir de ce modèle. Pour les procédures expérimentales, les souris C57BL/6J et Nude sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation. Concernant les souris Nude, déprimées en cellules T, il a été montré qu’après 10 semaines il pouvait y avoir un retour d’une petite proportion de cellules T dans ces souris. En effectuant les injections à 7 semaines, la prise tumorale aura eu lieu avant le possible retour de la population des cellules T, et les tumeurs grossiront principalement en absence de la population T sur une majeure partie de l'expérimentation. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature (Ohanna et al, Genes&Dev, 2011; Bonet et al, Journal of Biological Chemistry, 2012 ; Ohanna et al, Oncotarget, 2013).

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation chirurgicale d'îlots pancréatiques sous la capsule rénale ou par voie intraportale et des injections répétées, après induction d'un diabète, pour tester une molécule censée améliorer la survie des greffons. Le porteur renvoie l'application clinique au conditionnel, les résultats devant "facilement" être transposés, tandis que les souris sont rendues diabétiques puis opérées. Il indique avoir mené des essais in vitro préliminaires mais affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet d'aller plus loin.

Objectifs

Notre projet porte sur l'application préclinique de nouveaux composés ciblant une voie innovante que nous avons identifiée chez les mammifères, et dont les inhibiteurs peuvent prévenir les lésions tissulaires induites par l'ischémie associées au processus de transplantation. Après avoir démontré leur efficacité dans un modèle préclinique de transplantation rénale et d'accident vasculaire cérébral, notre objectif est d'évaluer leur utilité dans la transplantation d'îlots pancréatiques, connue pour être une thérapie curative du diabète de type 1. Les applications cliniques ont clairement montré que cette procédure améliore le contrôle glycémique chez les patients mais elle présente certaines limites liées à la survie des Îlots.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette étude est de déterminer l'efficacité de notre traitement pour améliorer le rendement, la survie et la fonctionnalité des îlots avant et après transplantation. Les résultats pourront ainsi être facilement transposés à la clinique.

Procédures

Les animaux receveurs seront soumis à une procédure chirurgicale de transplantation soit sous la capsule rénale (procédures 1 et, 2) soit par voie intraportale (procédure 3). Les actes chirurgicaux seront effectués une seul fois par animal et dureront le moins longtemps possible (20-30 minutes max). Les animaux bénéficieront d'un suivi journalier dans les premiers jours post-opération. Les animaux seront soumis à des injections IP (avec aiguille G25), selon la procédure, avec des produits (médicaux ou pharmacologiques) qui n’entrainent aucune souffrance physique.

Impact sur les animaux

Les souris diabétiques développeront l'hyperglycémie typique de cette pathologie qui sera monitorée par bandelettes. Le traitement pharmacologique préconisé dans les procédures utilise un produit déjà breveté qui ne cause aucune toxicité pour l'animal. Les animaux receveurs qui subiront une procédure chirurgicale seront attentivement suivis afin d'éviter toute complication post-opératoire (infection, inflammation et douleur).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasie à la fin de chaque procedure ou lors qu'ils attaignent le point limite identifié.

Remplacement

Des études préliminaires sur lignée cellulaire (INS-1E) et îlots primaires isolés de souris nous ont permis 1) d'établir la concentration optimale du produit pour obtenir la meilleure survie et fonctionnalité des îlots pancréatiques et 2) de démontrer la capacité de notre composé à protéger les îlots en culture des phénomènes d’anoxie. Toutes ces étapes d'optimisation ont été effectuées in vitro avec un nombre très limité d'îlots par rapport aux expériences de transplantation. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude.

Réduction

Les études d'optimisation in vitro nous ont permis de réduire le nombre de souris nécessaire pour les procédures chirurgicales. En plus, selon les résultats obtenus dans les procédures 1 et 2, nous pourrons éventuellement choisir un seul type de préparation d'îlots avant transplantation (pré- ou per-conditionnement), en réduisant le nombre des souris nécessaires dans la procédure 3. Le nombre de souris utilisé dans l'étude est strictement calculé pour obtenir des résultats statistiquement concluants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis qui entraineront l'euthanasie de l‘animal par dislocation cervicale. Une attention particulière sera portée au point d’injection abdominal (rougeur) et à la zone de chirurgie pour les animaux transplantés.

Choix des espèces

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude. En effet, la complexité des organes ne peut être récapitulée in vitro, ni le modèle d’ischémie et reperfusion. Les alternatives d’anoxie et d’hypoxie in vitro sont limitées dans leur mise œuvre et dans la pertinence des résultats obtenus. Les animaux seront utilisés entre 8 et 10 semaines post-natales qui est par expérience l’âge optimal pour la chirurgie.

6 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, cinq gavages, quatre injections et des prélèvements de sang, puis est tuée pour analyse des tumeurs et organes, afin d'étudier le rôle du microbiote intestinal dans la réponse aux traitements anticancéreux. Le porteur renvoie au développement de médicaments à base de bactéries comme bénéfice attendu, tandis que des tumeurs sont induites chez chaque souris. Il affirme la "nécessité d'un organisme entier" porteur de tumeur et juge ces modèles "indispensables".

Objectifs

L’efficacité des traitements anticancéreux ciblant le système immunitaire fait actuellement l’objet de nombreuses études cliniques. Ces traitements permettent une réinduction de la réponse immunitaire qui se trouve supprimée par les cellules cancéreuses. Cependant, certains patients développent une résistance à ce traitement. Des résultats obtenus au sein de notre laboratoire ont démontré le rôle crucial du microbiote intestinal dans l’activation du système immunitaire permettant d’améliorer l’effet de thérapies anticancéreuses. Chez les patients atteints d’un cancer, de nombreux facteurs entraînent un déséquilibre du microbiote qui pourrait être impliqué dans la résistance aux traitements. En effet, des données publiées ont démontré que la prise de traitements antibiotiques impacte l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Par ailleurs, des données générées par des études cliniques chez des patients atteints de cancer ont identifié certaines bactéries associées à l'efficacité des traitements anticancéreux. En conséquence, ce projet a pour but de caractériser le rôle des bactéries isolées du tube digestif des patients atteints de cancer (et de leurs produits actifs (métabolites)) et d'évaluer leur capacité à moduler la réponse aux thérapies anticancéreuses chez des souris porteuses de tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment certaines bactéries améliorent l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Il permettra de développer de nouveaux médicaments contenant des bactéries pour améliorer les réponses aux traitements anticancéreux chez les patients atteints de cancer. En effet, beaucoup de patients développent des résistances à ces thérapies. Des essais cliniques utilisant des bactéries vivantes sont en cours de réalisation.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection de cellules tumorales durant toute la durée de l’expérience (sous anesthésie, durée: 5 minutes ). Ces injections se feront après anesthésie générale gazeuse. 5 gavages oraux espacés à intervalle de 3 jours seront effectués (durée: quelques secondes). 4 injections sous anesthésie locale seront pratiquées (durée 20 minutes, incluant l'anesthésie locale). Du sang pourra être prélevé au niveau submandibulaire après anesthésie générale sous anesthésie gazeuse (1 fois par semaine), durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Croissances tumorales. Nuisances limitées liées à la présence d'une tumeur par animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses sur les tumeurs et organes.

Remplacement

Les procédures expérimentales mises en jeu ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants (nécessité d’un organisme entier, vivant, avec un système immunitaire complexe, proche de l’homme, porteur de tumeur). Les modèles de souris traitées par antibiotiques nous sont indispensables pour étudier les interactions avec le microbiote intestinal et les mécanismes qui régissent l'efficacité des thérapies anticancéreuses. Les modèles in vitro de lignées cellulaires testés ne permettent pas de récapituler la complexité des interactions entre l’hôte, le cancer, son microbiote intestinal, son système immunitaire et des thérapies anticancéreuses.

Réduction

Les groupes seront constitués d’un minimum d’animaux assurant la fiabilité des résultats en termes de statistiques. Le nombre de prélèvements pré- et post-mortem seront optimisés dans le souci du confort de l’animal afin d’étudier le plus de paramètres possibles et ainsi d’éviter la répétition d’expérimentation. Deux bactéries ou selles de volontaires sains seront testés simultanément pour limiter le nombre de groupes contrôle et référence.

Raffinement

Le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. L’inoculation des cellules tumorales se fera sous anesthésie générale. L’injection intra-péritonéale des traitements anticancéreux ainsi que les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Une surveillance accrue du comportement des animaux sera effectuée et mis au regard de points limites.

Choix des espèces

La souris est un mammifère et un modèle décrit, validé, facile à mettre en œuvre et admis dans la communauté scientifique. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Des femelles seront utilisées car les modèles de tumeur ont été obtenus à partir de souris femelles. Les précédentes expériences publiées ont été validées à l’aide de souris femelles ayant atteint l'âge de maturité sexuelle. Les souris seront donc utilisées à partir de l’âge de 7 semaines, période à laquelle la maturité sexuelle est atteinte chez les souris.

124 bars européens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tués pour prélèvement de tissus après la première saison de reproduction et 76 gardés en vie et réutilisés pour suivre leur reproduction sur cinq ans. Chaque poisson subit une vingtaine de manipulations sous anesthésie, biométrie, prises de sang et biopsies ovariennes ou vérification de la présence de sperme, à raison d'une par mois quatre mois par an. Le porteur décrit une exposition prolongée à une eau acidifiée pour mesurer les effets du changement climatique sur la reproduction. Il affirme qu'il "n'existe pas d'alternative" à l'expérimentation puisqu'il cherche les mécanismes physiologiques dépendant du pH.

Objectifs

Les émissions de CO2 causées par l'homme vers l’atmosphère sont absorbées par les océans, entraînant une acidification des océans, correspondant à une baisse des valeurs de pH de l’eau océanique. Le GIEC (Groupement d’Expert Intergouvernementaux sur l’Evolution du Climat) prévoit une baisse de 0,4 unité de pH pour 2100, soit un pH de 7,6 contre 8 aujourd’hui. Cette acidification de l’eau affecterait le fonctionnement du système nerveux central des poissons marins, avec un impact indirect sur la maturation sexuelle et la reproduction. Les dernières études scientifiques démontrent que les bars élevés depuis leur naissance dans une eau avec un pH abaissé à 7,6 ont une période de ponte plus tôt dans l’année et la qualité des gamètes diminue également chez les deux sexes. Dans ce contexte, ce projet vise à étudier les effets intergénérationnels sur la maturation sexuelle et la reproduction du bar européen d’une exposition à long terme à l’acidification pendant 5 saisons de reproduction successives.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer les effets à long terme et intergénérationnels de l’acidification océanique sur les reproductions successives d’un poisson marin à fort intérêt écologique et économique. Les connaissances ainsi acquises contribueront à l’évaluation des effets du changement climatique sur les organismes marins et pourront potentiellement faire évoluer la stratégie de gestion et de conservation des écosystèmes marins.

Procédures

Les poissons seront soumis à des manipulations répétées (biométrie, prise de sang, biopsie ovarienne/vérification de la présence de sperme), une fois par mois pendant 4 mois par ans (en janvier, février, mars et avril) et durant 5 ans consécutifs. Soit pour 1 poisson 20 manipulations de 5 min en 5 ans.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont modérés. La pêche des poissons peut entraîner un léger stress car les poissons sont sédatés dans leur bac avant d’être pêchés et anesthésiés. Après l’anesthésie, les manipulations s’enchaînent (biométrie, prise de sang, biopsie ovarienne pour les femelles ou massage abdominale pour les mâles) en moins de 5 minutes par poisson. L’intervalle d’un mois est suffisant pour la réalisation de ces manipulations répétées sur un même individu sans que cela n’engendre aucun signe de souffrance, de perte d’appétit ou de retard de croissance. On ne s’attend pas à avoir de nuisances dues à la répétition de ces gestes (4 fois par an et pendant 5 ans successifs) car ce sont des gestes réalisés en routine pour l’élevage commercial et le contrôle de la reproduction de cette espèce.

Devenir

A la fin de la première période de reproduction (en avril de la première année du projet) 6 mâles et 6 femelles par bassin (c’est-à-dire 48 animaux en total) seront mis à mort pour faire de prélèvements tissulaires. Les animaux restant (124-48=76) seront gardés en vie afin de suivre leur reproduction le temps du projet (5 ans). Cette décision a été prise par le responsable du projet en accord avec la SBEA.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous cherchons précisément à identifier les mécanismes physiologiques contrôlant la reproduction des poissons qui dépendent des conditions de pH de l’eau.

Réduction

Le nombre de poissons a été déterminé à partir de premières données (biochimiques) issues d’expérimentations précédentes (avec les poissons de la génération F0). Des calculs de puissance statistique reposant sur des analyses de variance (ANOVA pour mesures répétées et modèles mixtes linéaires) ont été réalisés en ce sens afin de déterminer le plus petit nombre d’animaux permettant une analyse statistique rigoureuse avec un nombre minimal de réplicats (2 bassins par traitement), compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des réponses hormonales entre les individus. De plus, le bar étant une espèce grégaire (qui vit en banc), ce nombre correspond au maintien d’une densité minimale compatible avec le bien-être animal et le bon déroulement de l’expérience (i.e. n’induisant pas de perturbations physiologiques pouvant fausser l’étude).

Raffinement

Les poissons seront mis à jeun 48h avant la procédure pour éviter la défécation et les vomissements. Les manipulations (biométries, prises de sang, biopsies ovariennes et massages abdominaux) sont regroupées afin de ne pas multiplier les anesthésies. Les poissons sont sédatés dans leur bac, puis pêchés délicatement à l’épuisette vers le bac d’anesthésiant. Le bac d’anesthésie contient un bullage qui permet d’apporter un maximum d’oxygène aux branchies et d’éviter toutes formes d’hypoxie. Les manipulations hors de l’eau dure moins de 5 minutes. Les poissons sont manipulés avec soin, ils sont posés sur un linge humide et épais pour protéger leurs écailles. Un linge humide est déposé sur les yeux pour les protéger et limiter le stress. Après les manipulations, les poissons sont placés dans un bac de réveil avec une légère sédation. Quand les mouvements respiratoires et l’équilibre sont revenus, ils sont transférés dans leur bassin d’élevage. Une attention particulière sera portée aux poissons les heures suivant les manipulations.

Choix des espèces

Les expériences proposées utiliseront le bar européen (Dicentrarchus labrax) comme modèle animal. Il existe une grande quantité d’informations disponibles concernant la zootechnie, la biochimie, le comportement et l’endocrinologie du bar ce qui permet d’envisager une étude approfondie des effets de l’acidification sur la physiologie de cette espèce. Les données obtenues par ce projet seront comparées à celles obtenues précédemment chez les bars géniteurs (F0) du lot utilisé dans ce projet (comparaison intergénérationnelle). Des stades adultes seront utilisés pendant la saison de reproduction, afin de répondre à l’objectif principal du projet : l’étude de la maturation sexuelle en fonction des traitements, qui implique nécessairement l’utilisation de poissons adultes matures des 2 sexes.