Oncologie

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, une partie est exposée huit jours à une hypoxie sévère (10 % d'oxygène, équivalent à 4 500 mètres) pour reproduire la grande prématurité, reçoit une injection de 4-hydroxytamoxifène, puis à l'âge adulte une implantation d'électrodes cérébrales et une privation de sommeil paradoxal de 48 heures, avant mise à mort et analyse du cerveau. Le porteur indique que la chirurgie a un effet négatif modéré et peut provoquer des irritations autour de l'implant. Il affirme que l'analyse in vivo reste "incontournable" et que la souris est "nécessaire" faute de modèle reproductible in vitro.

Objectifs

La période postnatale correspond à la période critique au cours de laquelle l’environnement façonnent et affinent les neurones contrôlant nos comportements et notre cognition. Des perturbations induites durant cette période peuvent avoir des conséquences dramatiques et persistantes sur le fonctionnement du cerveau. Cette situation se retrouve chez les bébés en prématurité. Il est possible de reproduire la plupart des déficits observés chez les bébés grand-prématurés à travers un modèle rongeur classique dit d’hypoxie chronique. Des études récentes suggèrent une perturbation des réseaux de neurones dans ce modèle animal, qui sont profondes et persistantes. Il est probable que ces perturbations soient responsables de déficits cognitifs variés, incluant des troubles du sommeil. Dans ce contexte, notre projet vise à évaluer la perturbation du sommeil dans un modèle souris d’hypoxie chronique, et de caractériser les perturbations du développement et de l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents

Bénéfices attendus

La prématurité touche entre 50 000 et 60 000 naissances par an et est en hausse sur ces dernières années. Comprendre ses effets à long terme c’est permettre de mieux le traiter à terme. Ainsi à travers notre projet nous pourrons évaluer : - l’effet de l’hypoxie sur l’activité neuronale global chez le nouveau-né -l’évolution de cette activité chez l’adulte à partir de l’enregistrement de l’activité cérébrale de l’animal -Cela nous permettra également de savoir à terme comment le sommeil paradoxal est impacté par ce phénomène.

Procédures

L’animal sera soumis à différents protocoles : Protocole 1 (classe modérée) : Après leur naissance, nous exposerons la moitié des animaux à une période d’hypoxie de 8 jours (réduction de la concentration d’oxygène à 10% correspondant à une altitude d’environ 4500 mètres). Les animaux seront ensuite immédiatement marqués après la période hypoxique par injection d’hydroxytamoxifen (4-OHT), marquant définitivement l’activation neuronale chez ces petits puis seront exposés à la suite des protocoles à l’âge adulte. Protocole 2 (classe modérée) : Les animaux seront implantés d’électrodes, permettant d’enregistrer l’activité cérébrale, sous anesthésie à l'âge de 12 à 16 semaines. Cette procédure est utilisée depuis de nombreuses années dans notre laboratoire et optimisée pour limiter son impact sur le bien-être animal. Après une période de récupération d'une semaine, les animaux seront enregistrées afin d’identifier leur activité cérébrale. Des mesures d’enrichissements seront mises en place pour permettre à l’animal d’exprimer un maximum de comportements naturels et compenser son isolement social durant les expérimentations. Protocole 3 (classe modérée) : Ensuite, nous exposerons les animaux, âgées de 12-16 semaines, à une privation spécifique de sommeil paradoxal (SP) pendant 48h. Cette privation conduit, une fois terminée, à une accumulation du SP dans un court lapse de temps (1h30) permettant d’observer son activation neuronale durant une période restreinte (~2h). Cette procédure a été initialement élaborée afin de limiter l’impact de l’expérimentation sur le bien-être animal.

Impact sur les animaux

L’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été élaborées et sont maîtrisés depuis plusieurs années au sein de notre laboratoire. Aucun signe indicatif de douleur n’a été remarqué pour ces procédures. Cependant, un suivi journalier des souriceaux sera effectué durant l’ensemble des protocoles. Certains effets indésirables minimes peuvent apparaitre : Protocole 1 : Outre les critères d'appréciations de l'état des mères (stress, léthargie…) et des petits (estomac vide, abandon de la mère…) durant la phase d'hypoxie il est possible d’observer une activité de la mère réduite lors de la mise en place de l’hypoxie (réduction du taux d’oxygène). Afin de limiter cet impact il est possible de réduire le taux d’oxygène par paliers afin de passer de 20.9% à 10%. De plus l’injection de 4-OHT peut induire une légère gêne des membres postérieurs de l’animal réduisant légèrement sa mobilité. Cet effet s’estompe généralement dans la demi-heure après injection. Protocole 2 : Les étapes de chirurgies induiront un effet négatif modéré sur le confort des animaux adultes. Outre les critères d’appréciations de l’état des souris post-chirurgie (réduction poids, posture, pelage …) il est possible d’observer chez l’animal des petites lésions/irritations induites par le toilettage de cette zone ou un grattage excessif autour de l’implant. L’application d’une pommade ou de Bétadine sur la zone lésée est alors recommandée. Protocole 3 : Aucun signe indicatif de douleur ni d’effet indésirable n’a été remarqué pour ce protocole.

Devenir

Afin d'évaluer l'impact de l'hypoxie dans la mise en place du sommeil paradoxal chez les nouveaux nés et sur ses réseaux à long terme, tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus et effectuer une analyse histologique poussée (marquage immunohistochimique, densité de population neuronale ...)

Remplacement

L’analyse in vivo reste incontournable pour ce projet de Recherche. En effet, les séquelles neurologiques posthypoxiques dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus l’étude du SP ne peut être conduite sur des animaux de niveau phylogénétique inférieur (mouche, poisson rouge…). Par ailleurs, notre projet permet d’établir l’évolution d’une activité cérébrale et plus particulièrement du sommeil paradoxal au cours du développement chez les nouveaux nés et à l’âge adulte, nécessitant alors le modèle transgénique décrit précédemment et, par définition d’un modèle transgénique stable, des souris.

Réduction

La petite taille des lots de souris a été calculée au plus juste à partir de nos études antérieures utilisant les mêmes protocoles dans le but de générer des données reproductibles dont la significativité sera validée par les tests statistiques adaptés (Par exemple, si paramétrique, un test de variance Anova à deux dimensions, et si non paramétrique, à une seule dimension, Kruskal-Wallis avec comparaison multiple de Dunn). Elle tient donc compte des ‘’erreurs et échecs’’ qui peuvent survenir à chaque étape de la procédure expérimentale. Pour finir, nous avons mis en place dans l’équipe depuis plusieurs années un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissu, accessible à l’ensemble de l’équipe est mise à jour systématiquement lorsque de nouveaux tissus ont été produit à la suite d’une coupe de cerveau. Le nombre d’échantillon/puits de coupes disponibles y est indiqué et peut être utilisé à d’autres fins ou futurs projet si ces derniers ont déjà été exploités sur leur projet d’origine. Ainsi, elle permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors des procédures décrites dans ce projet. Toute procédure de chirurgie (implantation d’électrode…) est étudié pour durer le minimum de temps possible (environs 45min) et sera accompagnée systématiquement d’utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Pour la procédure d’hypoxie, les femelles seront échangées tous les 2 jours entre les cages normoxiques et hypoxiques, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux. Afin de prévenir le stress engendré par la manipulation de l’animal avant chirurgie par exemple, plusieurs handling seront effectuées les jours précédant le protocole et l’animal sera habitué au préalable à chaque condition (habituation au câble d’enregistrement, aux injections en IP…). Des critères d’interruption des expérimentations et d’exclusion (souffrance physique et psychique, perte de poids…) seront estimés avec une grille d’évaluation quotidienne, leur impact étant délétère sur le sommeil.

Choix des espèces

Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques afin d’évaluer l’influence de l’hypoxie au cours du temps sur l’activité cérébrale de l’animal et en particulier de l’activité du sommeil paradoxal. Les séquelles neurologiques post-hypoxiques dépendent de mécanismes complexes qu’il est impossible de reproduire in vitro. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier les conséquences à court et long terme de l’hypoxie sur l’activité du sommeil paradoxal. Or, la souris est un des modèles animaux les plus adaptées dans la mise en place d’un génome modifié. De plus l’ensemble des données précédentes recueillis par les différentes équipes sur l’impact de l’hypoxie et sur l’activité du sommeil paradoxal ont été effectuée chez la souris. Ainsi à travers notre protocole une partie des souriceaux seront soumis à une hypoxie de P3 à P11 (8 jours) lorsque les autres seront en condition normoxique. Ensuite l’ensemble des souris retourneront en condition d’hébergement standard jusqu’à l’âge de 12-16 semaines environs, période où l’implantation des électrodes sera effectué pour l’enregistrement de sommeil paradoxal à l’âge adulte une semaine plus tard.

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras de douze semaines pour induire obésité et diabète, une chirurgie de constriction de l'aorte par thoracotomie que le porteur associe à une mortalité de 10 %, une injection de virus AAV, puis des mesures cardiaques, pour tester l'effet protecteur d'une protéine, la myotubularine MTM1. Les bénéfices sont annoncés au conditionnel, comme une "nouvelle perspective thérapeutique". Le porteur conclut qu'il n'existe pas de modèle in vitro permettant de "s'affranchir" du modèle animal.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de la surexpression de la myotubularine MTM1 dans la progression de l'insuffisance cardiaque chez la souris, notamment dans un contexte lié à l'obésité. Nos résultats in vitro sur des cellules cardiaques en culture montrent que la surexpression de MTM1 réduit le stress oxydant et préserve les fonctions mitochondriales au cours d'un stress. Ces résultats suggèrent un effet protecteur de MTM1 et ouvrent la voie à des essais in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les effets protecteurs de la surexpression de MTM1 dans l'insuffisance cardiaque liée à l'obésité, d'étudier les mécanismes moléculaires impliqués et de proposer la myotubularine MTM1 comme nouvelle perspective thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront soumis à 5 interventions différentes: 1/ un régime riche en graisse (60%kcal) pendant 12 semaines afin d'induire un phénotype obèse et diabétique de type 2; 2/ une procédure chirurgicale visant à réaliser une constriction de l'aorte afin d'induire un stress cardiaque, pendant 4 semaines; 3/ une injection iv par la veine caudale de virus associés aux adénovirus (AAV) permettant de surexprimer la myotubularine MTM1; 4/ une échocardiographie transoesophagienne afin de mesurer la fonction cardiaque des animaux; 5/ une mesure de la composition corporelle (echoMRI).

Impact sur les animaux

Le régime HFD 60% induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime HFD auront un suivi plus précis avec des remplissages des biberons d'eau et changes de litières plus fréquents si nécessaire. La chirurgie TAC étant une procédure chirurgicale invasive impliquant une thoracotomie, elle peut entrainer une mortalité post-opératoire (précédemment observée à 10% de l'effectif). Les AAV sont utilisés en thérapie génique et vaccinologie. Plus spécifiquement, les AAV-MTM1 sont actuellement en essais cliniques pour des thérapies géniques sur le chien (labrador) et chez l'homme atteints par la myopathie myotubulaire liée à l'X (pathologie consécutive à une mutation de MTM1). L’échocardiographie transoesophagienne est réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2%) et n’entraîne pas de nuisances pour l’animal. La mesure de la composition corporelle est réalisée sur animal vigile et acclimaté.

Devenir

Tout les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle pas de modèle in vitro permettant de s’affranchir du modèle animal.

Réduction

Le critère principal de jugement sera la mesure de la fraction d'éjection (EF) et de raccourcissement (FS) du ventricule gauche. Des données de la littérature nous permettent de prévoir que nos groupes expérimentaux doivent comporter 12 individus afin d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales: anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l’animal. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, perte de poids, absence de toilettage.

Choix des espèces

Ce projet vise à caractériser les effets de la surexpression de MTM1 sur la progression de l'insuffisance cardiaque. Ces aspects complexes et interconnectés ne peuvent être reproduits qu'in vivo sur des modèles expérimentaux. Seul l'animal vivant peut permettre d'évaluer ces paramèters et il n'existe pas à l'heure actuelle de moyens alternatifs. Les animaux utilisées seront âgées de 2 mois (jeune adulte). Les souris de 2 mois sont les plus réceptives à la chirurgie TAC et les plus sensibles à l'induction par AAV (des souris plus âgées ont été décrites comme pouvant être résistante à l'induction).

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, après dissection de la peau, elles reçoivent dans la trachée une injection d'une molécule provoquant une fibrose pulmonaire, puis une greffe de cellules précurseurs de cellules graisseuses, avant mise à mort et prélèvement des poumons au 21e jour. Le porteur indique que l'induction de la fibrose peut entraîner des difficultés respiratoires et une perte de poids. Il présente le projet comme une étude de faisabilité et affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un "organe entier".

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie rare, chronique et progressive de cause inconnue. Elle est très sévère, avec une survie inférieure à 30% à 5 ans après le diagnostic. Cette maladie se caractérise par des dommages pulmonaires liés à une cicatrisation anormale et chronique, avec l'accumulation de tissu fibreux (fibrose) menant à la destruction des alvéoles pulmonaires. Ces alvéoles sont de minces sacs creux qui prolongent les voies respiratoires, où se déroulent les échanges gazeux avec le sang; elles sont essentielles à la respiration. L'accumulation de tissu fibreux dans le poumon est en grande partie due à l'accumulation de fibroblastes et à leur activité de sécrétion de différents facteurs. Ces fibroblastes sont des cellules d'aspects fusiformes, normalement présentes dans le tissu; ils sont parfois appelés "cellules de soutien". Dans la FPI, les processus menant à la fibrose sont encore mal connus. Or, des travaux récents ont mis en évidence la présence de cellulles graisseuses dans les poumons de patients atteint de FPI. De plus, des données ont montré que ces cellules graisseuses diminuaient in vitro l'activité des fibroblastes de fibrose. Dans d'autres organes, le tissu graisseux a une influence démontrée sur la fibrose (foie, rein, coeur). Nous souhaitons donc étudier son rôle potentiel dans la fibrose pulmonaire. Cependant, des travaux préliminaires n'ont pas permis de mettre en évidence de cellules graisseuses chez la souris dans les modèles de fibrose pulmonaire. Dans le cadre de ce protocole (étude de faisabilité d’une durée de 1 an), la greffe de cellules donnant naissance à des cellules graisseuses dans le poumon sera testée dans un modèle de fibrose pulmonaire chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces expériences préliminaires de transplantation de précurseurs de cellules graisseuses permettront de démontrer la faisabilité de cette approche pour étudier le rôle des cellules graisseuses dans la fibrose pulmonaire. Il s'agit d'une première étape importante afin d’identifier le tissu graisseux pulmonaire associé à la fibrose pulmonaire comme potentielle cible thérapeutique dans cette maladie mortelle.

Procédures

En début de procédure (jour 1), les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répété. Cette intervention dure 5 à 10 minutes pour chaque souris. Cinq jours plus tard, les souris recevront une injection unique de cellules capables de donner naissance à des cellules graisseuses (cellules précurseurs), soit au travers de la paroi thoracique, sous anesthésie gazeuse brève (5 minutes), soit via la trachée, après intubation, sous anesthésie générale, (10 minutes) avec des suites post-opératoires similaires à l’injection du produit fibrosant. A l'issue de la procédure (jour 21), les souris seront euthanasiées après anesthésie profonde, après quoi plusieurs prélèvements seront effectués. Un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le prélèvement des poumons.

Impact sur les animaux

L'induction de la fibrose pulmonaire chez les animaux peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Une surveillance quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et de la motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance au moins 3 fois par semaine minimum des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon la grille d'évaluation des points limites (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et de la motricité, etc.). La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon leur état général et leur poids.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. Les prélèvements seront effectués après euthanasie de l'animal. Les animaux ne subiront qu'un seul protocole complet au cours de leur vie.

Remplacement

Le modèle murin est pertinent de par son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique, tout en tenant compte du risque de mortalité si les points limites sont atteints. De plus, les prélèvements obtenus grâce à une seule souris permettent de mener de multiples mesures.

Raffinement

Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures et recevront des antalgiques systématiquement concomitament de l'anesthésie. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance clinique au moins 3 fois par semaine des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon une grille d'évaluation (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et motricité, douleur, etc.): en cas d'atteinte d'un ou plusieurs point limite, les animaux seront sortis de la procédure et euthanasiés. La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En post-opératoire, la douleur et la cicatrice seront suivies de manière rapprochée. La douleur sera prise en charge par l'administration d'antalgiques. En cas de douleur et d'atteinte d'un point limite, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle souris est pertinent car son système respiratoire est proche de celui de l’Homme. Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature. Les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. Des animaux adultes d'au moins 8 semaines seront utilisés car la fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

1700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes d'acide hypochloreux dans la peau, cinq jours par semaine pendant six semaines, induisant une fibrose et des ulcérations cutanées, pour tester une thérapie cellulaire contre la sclérodermie. Elles sont toutes tuées en fin de procédure pour prélever les organes. Le porteur affirme que l'efficacité d'un tel traitement ne peut être évaluée sur les seuls modèles in vitro dans un contexte d'inflammation et de fibrose.

Objectifs

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune grave. Elle est caractérisée par une fibrose systémique, des anomalies vasculaires et une auto-immunité. Cette fibrose peut concerner d’autres organes que la peau, notamment le poumon qui représente une atteinte fréquente, sévère et mortelle de cette maladie systémique. Elle touche aussi les reins ou le cœur. Des thérapies basées sur les cellules stromales mésenchymateuses (ASC) sont en cours d'évaluation clinique et les résultats préliminaires sont encourageants. Nous avons récemment montré que les vésicules extracellulaires (VE) produites par ces cellules ont des effets biologiques comparables aux cellules parentales. Cependant, des données controversées existent sur la capacité thérapeutique des ASC isolées de patients et aucune étude in vivo dans un modèle proche de la pathologie humaine n’a été réalisée. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses ou des vésicules extracellulaires issues de patients sur la sclérodermie induite chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces approches de thérapie cellulaire chez l’animal ont une portée translationnelle avant leur utilisation en clinique chez des patients souffrant de sclérodermie et pour lesquels il n’existe aucun traitement disponible à ce jour. Les cellules sont déjà en cours d’évaluation en clinique et les vésicules extracellulaires pourraient être utilisées à moyen terme dans cette pathologie. Nos études in vitro ont identifié des molécules qui pourraient jouer un rôle dans l’effet thérapeutique des cellules. Si elles confirment leur intérêt in vivo, nous pourrions valider un nouveau médicament plus efficace que les cellules en cours d’évaluation clinique. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement de la sclérodermie qui est une maladie mortelle. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux recoivent des injections d’acide hypochloreux (HOCl) en intra-dermique (5 jours/semaine pendant 6 semaines) et une injection intraveineuse du traitement 1 fois à J21. L’épaisseur de la peau est mesurée au site d’injection avec un caliper toutes les semaines pour évaluer la fibrose cutanée. Ces mesures permettent d’avoir un suivi clinique de la pathologie.

Impact sur les animaux

Les cellules stromales mésenchymateuses et leurs vésicules extracellulaires ont été déjà validées pour leur rôle thérapeutique dans ce modèle de sclérodermie avec un bénéfice associé au traitement. Les injections répétées d’HOCl peuvent générer un inconfort des souris mais elles ne montrent plus de signes d’inconfort après quelques jours de manipulation quotidienne. L’injection quotidienne d’HOCl prend moins d’1 min sans anesthésie. Le modèle peut provoquer des ulcérations cutanées mais qui sont améliorées par le traitement. Le suivi des ulcères est réalisé au quotidien et les injections de HOCl sont suspendues le temps de la cicatrisation.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures pour permettre l’analyse du modèle expérimental et des traitements réalisés (prélèvements d’organes et histologie).

Remplacement

Avant de proposer une thérapie cellulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses ou de leurs vésicules extracellulaires dans un modèle pré-clinique pertinent. Des modèles in vitro sont utilisés en amont mais ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements dans un contexte in vivo comportant de l’inflammation, de la fibrose et du remodelage tissulaire qui sont observés au niveau cutané et pulmonaire.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire et avons calculé que l’inclusion de 8 souris par groupe expérimental permet d’obtenir des valeurs significatives pour au moins deux marqueurs importants de la maladie.

Raffinement

Enrichissement du milieu : Les animaux sont hébergés en portoirs statiques avec couvercles filtrants. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle quotidien. Surveillance liée aux procédures : Les souris sont examinées tous les jours pour vérifier l’apparition potentielle d’ulcères et l’absence d’infections. Si un ulcère apparait, le comportement des souris est particulièrement observé pour s’assurer que d’autres signes de souffrance n’apparaissent. L’injection intraveineuse des traitements est une procédure très rapide qui ne génère qu’un léger stress lié à la manipulation des souris pendant moins d’une minute

Choix des espèces

Le modèle murin de sclérodermie systémique a été choisi parce qu’il présente l’avantage de reproduire assez fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’homme et est considéré comme une référence de sclérodermie. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6 semaines, à maturité sexuelle. Les études de mise en place du modèle ont montré une incidence à 100% de la sclérodermie.

360 animaux non-humains, cobayes, hamsters dorés et gerbilles de Mongolie, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par injection de leptospires pour tester la virulence de souches bactériennes, l'infection provoquant prostration, poils hérissés et perte de poids, les individus moribonds étant mis à mort. Le sang et les organes sont prélevés après mise à mort par CO2. Le porteur affirme que seuls ces animaux développent des signes proches de la maladie humaine et qu'aucun autre modèle n'existe pour étudier la virulence.

Objectifs

Les mécanismes de virulence des leptospires pathogènes restent largement méconnus. Depuis quelques années, le laboratoire a développé des outils génétiques pour l’inactivation de gènes potentiellement impliqués dans la virulence de ces bactéries. Le seul moyen de tester pour la virulence de ces mutants est l’utilisation d’animaux : si un gène code pour un facteur de virulence, l’inactivation de ce gène par l’utilisation d’outils génétiques doit rendre ce mutant non virulent (les animaux survivent à l’infection). Le laboratoire a ainsi publié de nombreux articles sur la caractérisation de mutants non virulents et démontré le rôle de certains mécanismes comme la mobilité et la résistance aux stress, dans la virulence de ces bactéries. Nous envisageons aussi de déterminer les gènes dérégulés lors d’une infection chez la bactérie et l’hôte par des approches de transcriptomique. Le laboratoire peut aussi être amené à tester le caractère virulent de certaines souches cliniques isolées chez des patients présentant des formes plus ou moins graves de leptospirose. Ce projet a donc pour but de tester la virulence de souches de leptospires (mutants obtenus par manipulation génétique ou souches cliniques) et d’identifier les gènes ou voies induites lors d’une infection dans les modèles animaux sensibles (cobayes, hamsters ou gerbilles).

Bénéfices attendus

Les travaux menés jusqu’à maintenant à l’aide de mutants dans les modèles sensibles à la leptospirose ont permis d’identifier de nombreux facteurs de virulence, ce qui nous permet de mieux comprendre les mécanismes de la pathogénèse de la leptospirose. L’analyse transcriptomique de la bactérie et de son hôte permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes impliqués lors de l’infection. Enfin, ce projet permettra de mieux évaluer le degré de virulence de différentes espèces pathogènes ou de certaines souches cliniques. Ceci permettra de mettre en place des outils moléculaires pour la détection rapide de souches plus virulentes chez les patients. .

Procédures

L’infection se fera par injection intra-péritoneale d’une solution de bactéries dans l’animal (10 min). Le sang pourra aussi être prélevé par ponction cardiaque immédiatement après la mise à mort de l’animal (

Impact sur les animaux

Les animaux infectés par des souches virulentes présentent habituellement des signes caractéristiques à partir de J5 après l’infection (le délai peut -être plus long en fonction de la dose injectée ou de la nature de la souche de leptospires utilisée), notamment perte d’activité, prostration, poils hérissés et perte de poids.

Devenir

Les animaux utilisés lors des expériences seront mis à mort par inhalation de CO2. Ces animaux qui sont infectés avec des souches de leptospires potentiellement virulentes ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.

Remplacement

La virulence des leptospires est très probablement multifactorielle (mobilité flagellaire, adhésion aux cellules, résistance aux stress, production d'hémolysines, reconnaissance de la surface des leptospires par le système immunitaire, etc) et seul l'animal permet d'étudier l'ensemble de ces mécanismes et leurs rôles au cours de l'infection. Cependant, pour l’étude de certains phénotypes comme l’adhésion des bactéries aux cellules de l’hôte, nous avons maintenant mis en place un modèle de cultures de lignées cellulaires afin d'étudier les interactions bactéries-cellules de l'hôte (notamment la capacité des leptospires à adhérer aux cellules et à traverser une couche monocellulaire). Des collaborations sont aussi envisagées pour utiliser ces modèles. Cependant, aucun modèle autre que celui des animaux existe pour l’étude de la virulence.

Réduction

On procèdera tout d'abord à une sélection rigoureuse des souches à tester dans les modèles animaux. Pour l'étude de la virulence d'un mutant (principale activité de l'unité), on ne sélectionnera que les mutants présentant une forte probabilité d'être atténués dans leur virulence (analyse du gène inactivé, étude préalable du phénotype du mutant in vitro, etc). On pourra regrouper le nombre de mutants à tester afin de le comparer à un seul groupe contrôle. Dans le cadre de l’analyse de la charge bactérienne, du transcriptome ou de la réponse immunitaire au cours de l’infection, on limitera les points de prélèvements à la phase précoce (J1 post-infection) et à la phase tardive (J3 et/ ou J6 post-infection).

Raffinement

A réception, les animaux resteront en cage 1 semaine avant toute intervention pour une bonne acclimatation. Les cages seront enrichies avec de l’aliment sous forme de gel, des cylindres en plastique et du coton. On pourra utiliser les chaufferettes et pratiquer la réhydratation sc avec le sérum physiologique. Une infection par les leptospires pathogènes entraîne chez les animaux sensibles (gerbilles, hamsters, cobayes) une prostration et les poils hérissés. Pendant la période de l'infection aigue chez l'animal (pour l'inoculation de 10e4-10e6 bactéries, la mortalité est maximale entre les jours 5 et 9 après l'infection), on procédera à deux visites dans la journée (matin et après-midi), y compris les week-ends et jours fériés, afin d'observer tous signes extérieurs (poils hérissés et prostration). Pour certaines souches virulentes, une perte de poids avant la mort (une perte de 10% de poids chez le hamster indique une leptospirose avancée et irréversible) est aussi observée. Dans ce cas, les animaux sont pesés quotidiennement. Les animaux moribonds seront mis à mort.

Choix des espèces

Cobaye, Gerbille et/ou Hamster : seuls ces animaux sont capables de développer la maladie avec des signes cliniques proches de la pathologie humaine, en particulier avec atteinte des organes tels que le foie, le rein et les poumons. L’inoculation de souches virulentes chez ces animaux par voie intra-peritonéale entraîne la mort des animaux infectés. L’application de points limites permettra de limiter la douleur. Pour les cobayes et hamsters, on privilégiera l'utilisation d'animaux âgés de 4 semaines; des animaux plus âgés peuvent être plus résistants à l'infection (maturité du système immunitaire). Ce n'est pas le cas pour les gerbilles, on pourra donc utiliser des gerbilles jeunes ou adultes.

2800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales sont injectées dans leur patte puis une bithérapie anticancéreuse administrée, la croissance de la tumeur pouvant provoquer perte de poids et nécroses cutanées relevant du point limite. Les souris sont tuées par dislocation cervicale pour prélever tumeurs, rate et ganglions. Le porteur affirme que la complexité du cancer ne peut être appréhendée in vitro et que la souris est la seule espèce disponible pour ces modèles.

Objectifs

Ces dix dernières années, l’immunothérapie a suscité un engouement dans le monde de la cancérologie. Cette dernière consiste à mobiliser le système immunitaire des patients pour cibler et éliminer les cellules tumorales. Dans certains cancers, les cellules tumorales sont capables d’inhiber certains mécanismes du système immunitaire. Par exemple, certaines cellules tumorales expriment la protéine PD-L1 qui est le ligand du récepteur PD-1 présent à la surface des lymphocytes T (LT) activés. Cette liaison, entre PD-1 et PD-L1, entraîne un épuisement des LT. L’une des approches de l’immunothérapie est d’empêcher l’épuisement des lymphocytes T en utilisant des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI). Ces inhibiteurs sont des anticorps monoclonaux dirigés, par exemple, contre PD-1 et PD-L1. Cet outil thérapeutique a montré des effets puissants et durables seulement sur un faible pourcentage de patients (20 à 25%). L’une des raisons pouvant expliquer ces résultats pourrait être un manque d’infiltration des LT au sein de la tumeur. Une des manières permettant de rétablir un infiltrat lymphocytaire dans la tumeur est de cibler l’angiogenèse. L’angiogenèse correspond à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants et est nécessaire pour assurer le transport des nutriments et de l’oxygène dans la tumeur. Ce processus implique de nombreuses molécules, notamment le VEGF qui en est l’inducteur principal. L’inhibition de l’angiogenèse favorise la réponse anti-tumorale en réduisant l’environnement immunosuppresseur et en augmentant l’infiltration immunitaire. La combinaison thérapeutique des ICI et des anti-angiogéniques est aujourd’hui approuvée dans plusieurs cancers solides. En dépit d’une réelle avancée dans l’étude de cette bithérapie, une compréhension plus approfondie des mécanismes d’action de cette combinaison est nécessaire pour mieux cibler les patients répondeurs et apporter des réponses quant à son efficacité. De ce fait, l’objectif de ce projet est d’identifier les acteurs de la réponse immunitaire après une bithérapie αPD-1 et αVEGFR-2. Nous avons montré que cette bithérapie améliore les réponses anti-tumorales dans deux modèles de cancers colorectaux : MC38 et CT26 et dans un modèle de cancer du pancréas KPC. Au regard de ces résultats, nous souhaitons comprendre comment la réponse immunitaire se met en place dans ces modèles.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est d’explorer l’effet de la combinaison αPD-1 et αVEGR-2 dans plusieurs modèles pour déterminer les acteurs clés permettant d’améliorer l’efficacité des thérapies. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont injectés en sous-cutané dans la patte sous anesthésie à l’isoflurane avec les cellules tumorales (5 minutes pour l’anesthésie et 30 secondes pour l’injection). Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en IP (30 secondes). 1,3,7,10 et 14 jours après le premier traitement par αPD-1, les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l’isoflurane (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour le sacrifice). Par la suite, les tumeurs, ganglions drainants et rates sont récupérés (2 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection des tumeurs en sous-cutané dans la patte des souris pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. De ce fait, il est possible qu’un effet indésirable de cette expérimentation soit une perte de poids. Pour y remédier, des croquettes seront mises à disposition directement dans la cage après observation de la perte de mobilité. En réalisant des injections en sous-cutané, il est possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Ces nécroses seront prises en compte dans le score limite et pourra mener à la mise à mort de l’animal si nécessaire. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections SC (cellules tumorales) et IP (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendu. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation. De plus, diverses souches de souris immunocompétentes sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, telles que les souris C57Bl/6 (TC-1, MC38, KPC, LLC-1,) et les Balb/c (CT26, TS/A et 4T1). Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.