Oncologie

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à une restriction alimentaire chronique à la moitié de leur ration pendant deux à six semaines, parfois avec une roue d'activité, ainsi qu'à des prélèvements de sang et des injections répétées, pour modéliser l'anorexie mentale. Le porteur présente la perte de poids comme le principal effet indésirable et indique la corriger en 24 heures si elle dépasse le seuil prévu. Il affirme qu'une approche intégrée chez l'animal est "indispensable" et ne peut être remplacée par des méthodes in vitro ou in silico.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique et des complications somatiques et psychiatriques sévères. Parmi les troubles psychiatriques, l’AM a le taux de mortalité le plus élevé et un taux de rechute important. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’AM et son évolution est donc essentielle et représente un enjeu de santé publique. L’objectif de ce projet, mené chez des souris, est de montrer l’impact d’une restriction alimentaire chronique associée ou non à de l’activité physique volontaire sur l’évolution de biomarqueurs du métabolisme. En clinique, les patients qui souffrent d’AM de type restrictif présentent de manière surprenante une adaptation efficace de la glycémie qui reste relativement stable sur la durée. Nous nous intéressons à une hormone produite en réponse à l'état de dénutrition et dont les concentrations plasmatiques sont élevées chez les patientes souffrant d'AM. Nous nous intéressons notamment à deux isoformes de cette hormone et leur implication dans la modulation de la prise alimentaire, la glycémie et de la motivation à l’activité physique. Nous évaluerons donc comment un modèle murin conçu pour s'approcher au mieux du contexte de survenue et de chronicisation des symptômes de l'AM peut permettre la mise en évidence de biomarqueurs pertinents qui seront utilisés en clinique comme potentiels facteurs de diagnostic et surtout de pronostic de l’évolution de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet, en parallèle des études menées en clinique, nous permettra de préciser les adaptations métaboliques observées en situation de restriction alimentaire et/ou de renutrition et de valider des biomarqueurs prédictifs de l’évolution de la maladie.

Procédures

Restriction alimentaire chronique (50% de la quantité délivrée en ad libitum) entre deux et six semaines. Prélévements sur animaux vigiles : prélévements d'une goutte de sang à la queue pour vérifier l'état glycémique de l'animal au cours de la restriction alimentaire, tous les 2-3 jours. Injection unique en intrapéritonéal : glucose, glycérol, pyruvate, glutamine, insuline (évaluation de la régulation glucidique). Injection en sous-cutané (sub-scapulaire) en aigu (injection unique) : isoformes de la ghréline (implication dans la régulation de la prise alimentaire et de la glycémie)

Impact sur les animaux

Nous utilisons ce modèle de restriction alimentaire depuis plusieurs années. La perte de poids induite par la restriction alimentaire est le principal effet indésirable. Toutefois, le protocole permet une perte de poids progressive et contrôlée, et l'état général des animaux est surveillé de manière quotidienne. Aussi, une perte de poids plus importante que celle habituellement observée sera régularisée dans les 24h en ajoutant une quantité de nourriture plus importante, permettant une reprise rapide de poids. Afin d'obtenir l'activité physique individuelle, certaines souris seront temporairement maintenues en cage individuelle équipée d'une roue d'activité, et ce pendant 4 jours.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à chaque fin de procédure.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif d’étudier des altérations cérébrales et comportementales (émotions, cognition et physiologie glucidique) complexes mimant la pathologie humaine, une approche intégrée chez l’animal est indispensable qui ne peut absolument pas être substituée par des approches in vitro ou in silico

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés (réduction) lors des explorations in vivo, nous répéterons différentes procédures sur le même animal lorsque cela se justifie sur le plan expérimental. Les animaux seront ensuite mis à mort pour les analyses biochimiques et/ou moléculaires.

Raffinement

Pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, l’état général des animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie (apparence physique, changement de comportement). Tout état anormal, évalué à l’aide de points limites bien définis, sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre en cas de points limites atteints (utilisation d’un analgésique, arrêt du protocole ou mise à mort). Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

Le modèle murin est ici un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire dans des conditions particulières de restriction chronique, des processus addictifs et du métabolisme énergétique. Les régulations métaboliques, hormonales et neurobiologiques mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant de très nombreuses similitudes avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet une investigation anatomique et fonctionnelle plus élaborée que ce que peuvent nous procurer les approches par imagerie chez l’humain. De plus, ces modèles bien décrits par les expériences ultérieures menées dans notre laboratoire permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies moléculaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Les troubles alimentaires et en particulier l’AM font partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets jeunes adultes et des adolescents. Dans notre projet, la majorité des procédures sera réalisée chez de jeunes souris adolescentes, sexuellement matures, à partir de l’âge de 5-7 semaines. Comme l’AM est une maladie chronique, les paradigmes expérimentaux que nous avons choisis nécessitent un suivi longitudinal de plusieurs semaines, ainsi certaines souris pourront être utilisées jusqu’à l’âge de 15-20 semaines.

400 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ trois quarts conservés comme reproducteurs et le reste tué faute de porter la mutation recherchée. Le porteur crée six lignées transgéniques et mutantes pour étudier la formation du système olfactif à partir des embryons, prélevés avant cinq jours de développement. Il indique que les formes homozygotes peuvent provoquer stérilité, stress et agressivité, et prévoit de ne maintenir que des adultes hétérozygotes pour éviter ces atteintes. Sur le remplacement, il décrit des modèles mathématiques en développement mais conclut qu'une approche in vivo sur un vertébré reste "nécessaire".

Objectifs

Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et morphométriques gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 6 Lignées pour ce projet : A. 2 lignées transgéniques : Tg(fa2h::eGFP) et Tg(8.4neurog1::nls-EOS) pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et B. 4 lignées mutantes : pitx3 , f11r.1, fa2h et oclna pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, des enzymes et pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques (maladie de Parkinson et développement du cristallin).

Procédures

Les animaux générés par ce projet seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.

Impact sur les animaux

Nous ne prévoyons pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques et mutantes à l'état hétérozygote. Cependant, nous pouvons anticiper que pour les lignées mutantes le développement des placodes craniales antérieures (cristallin, adénohypophyse et olfaction) soit perturbé. Les données bibliographiques de mutants qui perturbent le développement de l'adénohypophyse, du cristallin et de l'olfaction peuvent indiquer des effets indésirables chez les adultes homozygotes : risques de stérilité, de stress et d’agressivité. Il est important de noter que chez le poisson zèbre, ces pathologies se développent lorsque la mutation est présente à l'état homozygote et que nous maintiendrons les lignées avec des adultes hétérozygotes dans ce projet.

Devenir

Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs. Les autres qui ne portent pas l'évébement génétique requis seront mis à mort.

Remplacement

Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRIPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement dans notre projet des méthodes d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendte la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.

Choix des espèces

Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif. La perturbation de ces processus peut conduire chez l’homme à de nombreuses pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré, comme le poisson zèbre est donc nécessaire à la compréhension de ces processus dynamiques et complexes. Dans ce projet, nous générerons des poissons zèbres transgéniques ou mutants qui seront utilisés adultes à des fins reproductives.

3 328 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes puis leur greffe, pour chaque patient, ses cellules immunitaires et sa tumeur, afin de constituer des cohortes dites "avatars" servant à tester des traitements. Il indique que l'injection de cellules humaines provoque invariablement une réaction contre les cellules de la souris, avec perte de poids, de poils et de mobilité sur un à deux mois, les animaux étant mis à mort à un stade avancé pour récupérer les tumeurs. Sur la réduction, il se contente d'écrire que le nombre d'animaux "sera à évaluer au cours des expériences", justification sommaire pour un effectif de plus de trois mille souris.

Objectifs

Il est proposé d’utiliser un modèle de souris immunodéficiente afin de constituer, pour chaque patient atteint d’une tumeur, une cohorte de souris doublement humanisée/greffée (système immunitaire et tumeur) qui sera utilisée pour évaluer l’activité de thérapies, dans un délai compatible avec les contraintes cliniques, typiquement 1 mois. Les souris présentent des mutations entrainant une déficience en cellules immunitaires murines. Ces souris ont montré être des bons modèles de greffe de cellules tumorales humaines ainsi qu’un bon réservoir pour une reconstitution de système immunitaire humain. La mise en place d’une cohorte de souris porteuse de tumeur dérivée de patient (PDX) est un projet ambitieux à forte valeur ajoutée pour la recherche sur les cancers permettant d’évaluer l’activité des traitements les ciblant. Ces souris sont greffées avec des fragments de tumeur fraiche et la tumeur peut se développer dans l’environnement murin en absence de système immunitaire pouvant le reconnaitre comme étranger. Cependant, des obstacles sont présents pour optimiser l’établissement de cette cohorte : taux de prise de greffe des PDX très faible et/ou variable, temps avant apparition de la PDX (plusieurs semaines, voire mois), instabilité génétique amplifiée au cours des passages successifs des PDX dans une souris à l’autre et absence d’un système immunitaire autologue. Afin de palier à ces obstacles, les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) du patient ainsi que des fragments tumoraux, du même patient seront greffés, dans les souris sans passer par l’étape d’établissement d’une tumeur macroscopique de type PDX classique. La détection précoce de ces cellules, par les techniques d’imagerie, permettrait d’évaluer l’efficacité des traitements afin de comprendre notamment les mécanismes de résistance mais aussi d’évaluer le traitement le plus efficace parmi le choix possible actuellement et dans un futur proche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer la pertinence et la corrélation clinique des réponses aux traitements chez le patient au regard de de la réponse observable dans la cohorte avatar aux patients. En cas, de corrélation positive, cela permettre d’obtenir une preuve de concept de la pertinence d’une méthodologie comme outil de diagnostic afin de proposer aux cliniciens le traitement le plus adéquat pour chaque patient, dans des contraintes temporelles acceptables pour les cliniciens et les patients.

Procédures

Injection de thérapie deux à trois fois par semaine sur animaux vigiles ou endormis, chaque injection demande une contention de 15 à 30 secondes ; Echographie une à deux fois par semaine sur animaux endormis, le temps d'acquisition par échographie (et donc de l'anesthésie) est compris entre 10 et 20 min par souris ; Prélèvement de sang une fois au cours de la procédure sur animaux endormis, le prélévement dure entre 15 et 30 secondes (l'anesthésie environ 3 minutes). La durée pendant laquelle les animaux subiront ces interventions sera de 5 semaines à 2 mois.

Impact sur les animaux

L’injection de PBMC humain dans une souris immunodéficiente entraine, invariablement, une réaction des cellules immunitaires humaines injectées contre les cellules murines reconnues comme étant étrangères. Cette réaction entraine une perte de poids des animaux, une perte de poil et une perte de mobilité des animaux dans un délai pouvant aller d’un mois à deux mois. A un stade avancé de la maladie, les animaux doivent être sacrifiés. Aucun autre effet indésirable n’est attendu notamment par l’injection des traitements.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort car les tumeurs doivent être récupérées

Remplacement

Les méthodes actuelles permettant d’évaluer l’efficacité de thérapie personnalisé sont inefficaces, actuellement, par absence de biomarqueur fiable, permettant de choisir le traitement le plus adapté à chaque patient.

Réduction

Le nombre de souris par groupe de traitement est évalué, en fonction de la variabilité des modèles animaux. Ce nombre sera à évaluer au cours des expériences en fonction de cette variabilité.

Raffinement

Le raffinement de l’étude est : surveiller les animaux pour l’apparition de la réaction immunitaire des cellules immunitaires humaines injectées vis-à-vis des cellules murines de l’hôte qui sera monitoré deux fois par semaine.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont les seules modèles animaux correctement validés ayant montrés une prise de greffe de tumeurs humaines et de système immunitaire humain. Les animaux seront des adultes à partir de 6 semaines, stade qui a montré de bons résultats pour prise de greffe tumorale et immunitaire.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes et leur greffe des cellules tumorales marquées par fluorescence, par injection sous-cutanée ou intraveineuse, pour suivre la croissance des tumeurs et leur capacité à métastaser. Il indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements, que la peau peut s'ulcérer en provoquant une douleur modérée et que des métastases au foie ou aux poumons peuvent dégrader l'état des animaux, tous mis à mort en fin de procédure. Il affirme que ces cellules doivent être implantées dans un "organisme entier" et que le modèle souris est "nécessaire".

Objectifs

Le but du projet est de réaliser des expériences de suivi de pousse tumorale chez la souris immunodéficiente à partir de cellules cancéreuses modifiées pour qu'elles expriment plus ou moins une protéine au niveau de leur noyau. La quantité présente de cette protéine dans les cellules jouerait un rôle dans le comportement des cellules cancéreuses. Ces cellules cancéreuses seront également marquées par fluorescence en fonction de la quantité de la protéine exprimée. Ainsi cette fluorescence nous permettra de visualiser les différents types de cellules cancéreuse et d'observer leur évolution dans les tumeurs. Nous nous intéresserons à la corrélation entre le type de cellules retrouvées dans les tumeurs, la vitesse de croissance des tumeurs et l'agressivité des cellules cancéreuses à travers leur capacité à métastaser.

Bénéfices attendus

Nous serons en mesure d’analyser l'impact du niveau d’expression de TRa1 sur la croissance des tumeurs. Nous pourrons étudier si ce niveau d'expression module la capacité de croissance, de migration ou de mort cellulaire ainsi que l’agressivité du développement tumoral. A terme, une meilleure compréhension des mécanismes du développement des cancers permettra de mieux adapter les traitements et/ou d'envisager de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris du projet seront greffées avec des cellules tumorales marquées par fluorescence, soit par injection ou implantation sous-cutanée soit par injection intra-veineuse. Ces greffes se dérouleront sous anesthésie, l'opération ne durant que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris immunodéprimées. Ces animaux, par leur système immunitaire défaillant, sont hébergés dans une pièce dédiée avec toutes les barrières sanitaires permettant de garantir leur bon état de santé pendant toute la durée de leur vie. Les souris subiront chacune une unique injection ou implantation de cellules tumorales. Les souris seront donc amenées à développer des tumeurs. Ces tumeurs pourraient éventuellement les gêner dans leurs déplacements. Si la peau venait à s’ulcérer au niveau d’une tumeur, cela provoquerait une douleur modérée à l’animal. Des métastases pourraient également apparaître, notamment sur le foie ou dans les poumons. L’état des souris pourraient alors se dégrader : amaigrissement, difficultés à respirer, troubles moteurs… Il y a 3 types possible d’injection dans ce projet ; une injection sous-cutanée au niveau du flanc, une injection intra-veineuse à la veine de la queue et une implantation sous-cutanée.

Devenir

Tous les animaux, des souris, seront mis à mort en fin de procédure. En effet, ils développeront des tumeurs sur le flanc et potentiellement des métastases. De plus, des analyses doivent être menées sur plusieurs de leurs tissus afin d'étudier la distribution des différents types cellulaires dans les tumeurs et d'analyses les organes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la capacité de plusieurs types de cellules cancéreuses à former des tumeurs et à métastaser. Pour cela, ces cellules doivent être implantées dans un organisme entier afin de reproduire au mieux les conditions physiologiques dans lesquelles elles se développent habituellement. Il nous faut donc avoir recours à un système intégré et mature, dans notre cas le modèle souris.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à ce projet est de 90 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet. Nous mesurerons pour chaque animal engagé le nombre de tumeurs primaires et métastases ainsi que leur taille.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée afin d'identifier au plus tôt toute douleur ou souffrance éventuelle. De plus, les procédures se feront sous anesthésie générale. Les souris seront maintenues sur tapis chauffant toute la durée de l'anesthésie. Une couverture analgésique est mise en place afin de prendre en charge toute douleur potentielle qu'impliquerait l'implantation des cellules tumorales. Un développement tumoral est attendu, un suivi de poids et de taille des tumeurs sera réalisé 3 fois par semaine. Des points limite qui auront pour effet l'arrêt de la procédure ont été déterminés.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme organisme modèle pour reproduire chez l'animal des pathologies (inflammation et cancer du côlon). Nous avons l'expertise au laboratoire sur ce modèle animal et nos données précédentes sur le rôle de TRa1 dans des études in vivo ont été générées chez la souris. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. En effet, dans notre projet, les études de pousse tumorale ne peuvent se faire que dans des organismes complets prenant en compte l’influence de la physiologie de l’animal et du microenvironnement. Les animaux seront âgés d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur un stade adulte jeune.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur greffe des cellules tumorales directement dans le pancréas, ce qui provoque un adénocarcinome, puis les euthanasie cinq semaines plus tard alors que toutes ont développé un cancer avancé. Il indique que ce stade terminal, marqué par une ascite et des changements de comportement, entraînerait une grande souffrance si la mort n'était pas donnée, une grille de score pouvant avancer la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la relation entre système immunitaire et tumeur.

Objectifs

Cette étude permettra de déterminer le rôle exact du TNFR2 sur l’activation du système immunitaire au sein du microenvironnement tumoral et ainsi en voir l'effet sur la croissance tumorale. Cette étude fait partie d’un projet de recherche translationnelle pour la détermination des meilleurs protocoles de traitement des tumeurs du pancréas.

Bénéfices attendus

Le TNFR2 participe à l'activation et au maintien de l'activité des lymphocytes T régulateurs. Son absence permettrait de diminuer, voir d'abroger, l'inhibition de la réponse immunitaire antitumorale au sein du micro-envonnement immunitaire. Le bénéfice potentiel est que la réponse immunitaire anti-tumorale soit plus efficace, et permette un ralentissement, voir un arrêt de la croissance tumorale.

Procédures

Il n'y a qu'une intervention effectuée. Les animaux vont subir une opération chirurgicale afin d'effectuer une greffe orthotopique. Ce type de greffe vise à introduire des cellules au sein d’un tissu de même nature. Ainsi les cellules tumorales pancréatiques sont directement injectées dans le pancréas. Cette intervention dure 5 minutes sur un animal sous anesthésie gazeuse (Isoflurane). Cette intervention est accompagnée par l'administration d'analgésiques, Rimadyl et Vetergesic, ceci le jour (Rimadyl et Vetergesic) et le lendemain (Vetergesic) de l'opération. Cette administration est faite par injections intra-péritonéales pour le Rimadyl et en sous-cutanée pour le Vetergesic.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales dans le pancréas va générer l'apparition d'un adénocarinome pancréatique canalaire. Les animaux ont dans les stades terminaux de l'expérimention une déficience pancréatique associée à diiférents autres symptômes (apparition d'ascites, changements comportementaux,...). Les symptômes sont bien sur suivis via une grille de suivi, nous servant à dertiminer quand le point limite de l'expérimentation est atteint.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure par dislocation cervicale (ou par asphyxie au dioxyde de carbone le cas échéant), 5 semaines après la greffe des cellules tumorales. A cette date, la mort est donnée car l'ensemble des animaux a developpé un cancer du pancréas avancé. Ce stade peut entrainer une grande souffrance dans les jours qui suivent si la mort n'est pas donnée. Il s'agit d'un point limite de la procédure. Cependant les souris peuvent être sacrifiées avant suivant la grille de suivi de souffrances décrite auparavant et rattachée en annexe 2. En effet si le score de souffrance atteint 4 avant la ciquième semaine, la ou les souris sont mises à mort.

Remplacement

Sur la question du « Remplacement », les expérimentations in vitro ne rendent pas compte de toute la complexité rencontrée dans la relation entre le systeme immunitaire et la tumeur, notamment à cause de differents types cellulaires impliqués. A l’heure actuelle il n’existe pas des modèles experimentaux in vitro ou ex vivo qui permettent de suivre la réponse anti-tumorale. L’expérimentation animale reste dans ce cas la meilleure solution pour étudier l’effet de l’absence du TNFR2 sur les cellules immunitaires, nous ne pouvons donc pas élaborer une stratégie de remplacement efficace.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris nécessaires pour que les résultats soient signifiants. Ce nombre, impliquant les 2 groupes, est estimé à 40 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans ce cadre. Ce calcul est détaillé sur un document rattaché à ce projet nommé annexe 1

Raffinement

Pour les strategie de « Raffinement », nous allons donner tous les produits nécessaires au bien-être animal, réduisant au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Au niveau de l’hébergement au cours de l’expérimentation, des produits d’enrichissement sont utilisés comme différents types de neslets, des tubes de carton et des dômes de carton. Au cas où la souffrance animale apparait sans que nous puissions la résoudre, nous avons créé une grille regroupant les symptômes caractéristiques de notre modèle. Cette grille nous permet d’évaluer la souffrance de l’animal, et ainsi de définir des points limites. Si ces points limites sont atteints, nous sacrifions l’animal. L’animal sera surveillé sur la base de cette grille qu’à partir du jour 10 après la greffe tumorale sachant que les symptômes décrits dans la grille n’apparaissent qu’à partir du jour 18 après la greffe tumorale. La surveillance se fera tous les 2-3 jours, jusqu’à la mise à mort. Nous donnons également deux produits analgésiques différents, dispensés avant, pendant et après l’opération pour réduire au maximum la souffrance physique

Choix des espèces

La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer du pancréas décrit dans la littérature, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’homme. De plus les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires important qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation impliquées. Ainsi les souris sélectionnées pour cette étude qui sont immunocompétentes et donc présentent une réponse immunitaire complète, pourront être comparées dans leurs réponses immunitaires aux souris ayant des modifications génétiques. Les souris sont âgées de 8-10 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux.

28 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur pratique sur chacun une chirurgie d'une heure, avec dissection des vaisseaux fémoraux et implantation d'un greffon osseux entouré de membrane amniotique dans une poche sous-cutanée, pour tester une méthode de régénération osseuse. Le champ structuré du résumé indique les 28 lapins comme retournés à l'élevage, mais la justification écrite précise qu'ils subissent tous une euthanasie par injection intracardiaque en raison des douleurs et gênes motrices attendues, ce qui confirme leur mise à mort. Il affirme que le projet "ne peut être remplacé" par un modèle in vitro faute d'axe vasculaire fonctionnel.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses peuvent résulter de : -traumatisme, résection tumorale, infection, malformation. Le choix des reconstructions dépend de : -la taille de la perte de substance -état du site receveur (infection, irradiation) -perte de tissus mous associée -état général du patient. Ces paramètres déterminent des techniques de reconstruction de complexité variable. Les reconstructions par autogreffe présentent plusieurs avantages : ostéo-conduction, ostéo-induction et ostéogénèse(en cas de greffe vascularisée) avec une ostéo-intégration plus rapide permettant le retour à une fonctionnalité plus rapide. Cependant les inconvénients ne sont pas négligeables avec la quantité limitée d’os à prélever, les morbidités liées au site donneur (cicatrice, infection, douleur, fracture) et l’ostéo-intégration plus longue lors d’autogreffe non vascularisée. Ces inconvénients amènent à l’utilisation de substituts osseux synthétiques. Ces substituts ostéoconducteurs, ne sont pas ostéo-inducteurs ni ostéogéniques par apport nutritionnel sanguin insuffisant. Leur intégration plus lente favorise les échecs. Le greffon idéal doit donc combiner les avantages d’une autogreffe vascularisée en limitant les inconvénients. Les progrès de l'ingénierie tissulaire font des thérapies cellulaires une solution potentielle pour la régénération des tissus. Trois éléments lui sont essentiels: -le type d’échafaudage -les facteurs bioactifs -les cellules souches. L’enjeu est de trouver une combinaison optimale. Son application aux tissus osseux pourrait permettre d’obtenir une nouvelle méthode de traitement. Parmi les facteurs bioactifs, on trouve la membrane amniotique qui est une matrice extracellulaire acellulaire, non immunogène, biodégradable. Elle est fréquemment utilisée sur la surface oculaire pour améliorer sa régénération par ses propriétés cicatrisantes, antibactériennes et anti-inflammatoires. Malgré un potentiel de différenciation des cellules souches le long de la lignée ostéogénique, son application dans l’ingénierie osseuse a été peu étudiée. Notamment en association avec de l’os de banque. La problématique est : l’association d’un os de banque, d’une vascularisation et d’une membrane amniotique peut-il donner naissance à une régénération osseuse comportant une partie minérale et cellulaire ? Le but est d’obtenir un os ayant les caractéristiques les plus proches d’un os natif. Cela augmenterait le taux de succès des reconstructions osseuses en conditions difficiles

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de simplifier et/ou d’améliorer les réparations des pertes de substance osseuse dans les cas complexes ou chez les patients fragiles. Les avantages de cette technique sont: la facilité d’accès et l’abondance de l’os de banque et des membranes amniotiques, la limitation des comorbidités liées au site donneur et la limitation théorique des risques d'échec par une ostéointégration plus rapide. Les résultats attendus sont : - l’obtention d’un greffon osseux colonisé par des cellules osseuses - l’obtention d’un greffon vascularisé par angiogenèse à partir de la vascularisation axiale - le choix du greffon et la période optimale d’utilisation du greffon (J30, J60, J90 ou 120)

Procédures

Les animaux subiront une intervention sous anesthésie générale qui durera 1h. Tout d’abord une prémédication par Midazolam (0.5-1mg/kg) et Morphine (1-2mg/kg) intra-musculaire sera réalisée. Après 10 minutes de délai l’anesthésie générale sera réalisée en intra-musculaire par un mélange de Kétamine (25-50mg/kg) et Xylazine (5mg/kg). L’anesthésie générale sera complétée par une anesthésie locale de Lidocaïne (0,2mL/kg) au niveau de la cuisse. Le lapin sera placé en décubitus dorsal, rasé et désinfecté au niveau de la face supéro-interne de la cuisse gauche ou droite. Les conditions d’asepsie seront respectées (badigeon de bétadine dermique au niveau de la cuisse puis champage stérile). Une incision cutanée d’environ 3 cm de long du point médian de l'aine en direction du genou sera réalisée d’un côté. Après dissection aux ciseaux l'artère et la veine fémorale seront exposées sur 20mm de long. Une hémostase rigoureuse sera effectuée. L’artère et la veine seront enveloppées d'une HAM cryoconservée, puis insérées dans le cylindre de substitut osseux grâce à une fente longitudinale. L’ensemble ainsi décrit sera enfin enveloppé avec une seconde HAM cryoconservée. Chaque greffon (substitut osseux/HAM) sera dissimulé dans une poche sous-cutanée afin d’éviter une gêne fonctionnelle motrice. Le site opératoire sera suturé en 2 plans: un plan sous cutané puis un plan cutané. Une antibioprophylaxie intramusculaire par Duplocilline (0,3mL/kg) administrée en fin d’intervention, couvrira l’animal pendant 4 jours. Le traitement antalgique post-opératoire comprendra des AINS (Méloxicam 1mg/kg) toutes les 12h en per os pendant 5 jours. Il pourra être associé à une dose de Buprénorphine (0.05mg/kg) sous-cutané toutes les 8h pendant les 48 premières heures. En cas de non contrôle de la douleur, la Buprénorphine sera remplacée par de la Morphine (1-2mg/kg)La douleur sera régulièrement évaluée selon une échelle d’évaluation de la douleur comprenant 3 catégories : appréciation globale subjective évalué de 0 (pas de douleur) à 3 (douleur intense) observation à distance comprenant le niveau d’activité le comportement la posture au repos l’apparence et l’alimentation une réaction à la manipulation comprenant le mouvement à la sollicitation et la manipulation de la zone douloureuse Chaque sous catégorie sera évaluée de 0 à 3, un score de 1 à 7douleur légère de 8 à 14 modérée et 15 à 22 sévère. Le traitement antalgique sera instauré en fonction de la douleur

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont : - douleurs mécaniques : douleur rythmée par les mouvements et s’atténuant au repos - gène motrice - infection (désunion de la cicatrice, écoulement purulent, sepsis) - complications hémorragiques - allergie ou effet indésirable à certains produits médicamenteux - décès précoce de l’animal

Devenir

A l’issue de la procédure les lapins subiront une euthanasie par injection intracardiaque d’euthasol (pentobarbital) du fait de la procédure chirurgicale importante pouvant impliquer des douleurs et gènes motrices ultérieures.

Remplacement

Ce projet expérimental ne peut être remplacé par un modèle in vitro puisqu’un axe vasculaire avec un débit sanguin est nécessaire.

Réduction

Ce protocole expérimental n’a jamais été effectué et paraît indispensable à réaliser pour prouver son objectif. 24 lapins sont nécessaires pour apporter une preuve expérimentale. Augmenter ce chiffre n’apporterait aucun avantage scientifique. Le diminuer ne nous permettrait d’apporter aucune preuve scientifique supplémentaire. Le protocole d’anesthésie générale a déjà été effectué chez des lapins et a montré son efficacité avec un bon contrôle de leur analgésie.

Raffinement

Nous avons choisi le lapin en prenant en compte l’état actuel des connaissances. Ils proviendront d’un système d’élevage au sein même du laboratoire (aucun transport ne sera effectué). L’hébergement ainsi que le personnel sera le même de leur naissance jusqu’à leur mort (cage spacieuse, propre) afin d’augmenter autant que possible leur bien-être. Ils seront de même habitués à la présence humaine et au portage. La planification du protocole nous permet d'évaluer et d’éviter de potentiels obstacles. Pendant le protocole des soins pré, per et post opératoires adéquats seront instaurés. Le recours à l’anesthésie générale est nécessaire compte tenu de l’intervention chirurgicale importante. Une procédure d’euthanasie appropriée sera utilisée en cas souffrance, sepsis non contrôlés ou d’éventuelle situation entrainant une souffrance animale incontrôlable.

Choix des espèces

Nous utiliserons des lapins car c’est l’animal le plus utilisé dans l’étude de l’ingénierie tissulaire osseuse dans la littérature: cela nous permettra de comparer nos résultats avec ceux des travaux disponibles. De plus c’est un animal de moyenne corpulence, où il est possible de disséquer un axe vasculaire de taille convenable. La corpulence des lapins nous permettra aussi d’introduire un substitut osseux de taille adéquate pour les analyses anatomopathologiques tout en minimisant leur gêne fonctionnelle motrice. La génération osseuse est comparable chez le lapin et chez l’homme, ce qui permettra de transposer les résultats obtenus chez l’homme. La population cible pour la reconstruction osseuse est une population adulte. Nous avons besoin d’étudier la régénération osseuse sur un os mature. Nous utiliserons donc des lapins adultes de 16 semaines, ayant un poids d’environ 2.5-3 kg.