Oncologie

20 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur pose un cathéter dans la veine jugulaire par chirurgie sous anesthésie, puis pratique des gavages et des prélèvements sanguins répétés, pour mesurer la concentration sanguine d'une association d'antibiotiques et en optimiser la posologie en élevage porcin. Il précise que dix animaux proviennent d'une étude précédente et que chaque porc est mis à mort après trois semaines pour prélever muscle, foie et reins. Il affirme qu'aucune alternative non animale ne reproduit la cinétique plasmatique avec sa variabilité, préalable qu'il juge "indispensable".

Objectifs

L'association d'antibiotiques sulfamides/triméthoprime est classiquement utilisée en médecine vétérinaire, notamment dans la filière porcine, pour traiter certaines infections. Le ratio de doses sulfamides/triméthoprime dans la quasi-totalité des spécialités vétérinaires mises sur le marché est de 5:1. Or, ce ratio n’a pas été établi à partir de données animales, mais est une transposition directe du ratio correspondant à l’association sulfaméthoxazole/ triméthoprime (SDMX/TMP) utilisée chez l’Homme. Un biais majeur de cette transposition réside dans le fait que les vitesses d’élimination des sulfamides (illustrées par leurs temps de demi-vie plasmatiques, t1/2) peuvent être très variables selon l’espèce animale. Chez l’Homme, le SDMX et le triméthoprime ont des t1/2 assez proches, permettant de maintenir un rapport de concentrations entre les deux antibiotiques constant au cours du temps et de conserver ainsi l’effet synergique entre eux. A l’inverse, chez les animaux de rente par exemple, certains sulfamides ont des t1/2 beaucoup plus longs que celui du triméthoprime. Les sulfamides seront alors présents beaucoup plus longtemps chez l’animal, d’où une perte probable de l’effet synergique recherché et par voie de conséquence de l’efficacité de l’association. L’ensemble de ces facteurs questionne la pertinence du ratio 5:1 des formulations vétérinaires, mais aussi les posologies recommandées (doses et/ou intervalles d’administration). L’objectif principal de cette procédure expérimentale est de générer des données pharmacocinétiques (= suivi des concentrations sanguines au cours du temps) in vivo de l’association sulfadiazine(SDZ)/TMP et de SDMX/TMP chez le porc pour contribuer, par la suite, à déterminer les modalités optimales d’administration de SDZ/TMP et de SDMX/TMP par une approche de modélisation pharmacocinetique/pharmacodynamique (PKPD) (= technique permettant de relier les concentrations sanguines et l'effet observé qui est la diminution des bactéries pathogènes). Les deux sulfamides ont été sélectionnés en raison de leur différence pharmacocinétique majeure, avec un sulfamide à courte durée d’action (SDZ) et un sulfamide à longue durée d’action (SDMX). Le porc a été choisi car c’est l’une des filières les plus utilisatrices de cette association d’antibiotiques (en termes de tonnage et d’exposition).

Bénéfices attendus

La promotion de solutions thérapeutiques à base d’associations – entre antibiotiques ou entre antibiotiques et nonantibiotiques – tient une place importante dans les stratégies de lutte contre l’antibiorésistance. Lorsqu’elles associent 2 antibiotiques, ces solutions doivent viser à limiter l’émergence de résistances et non à élargir le spectre d’activité. Les formulations associant le TMP avec un sulfamide peuvent entrer dans la première catégorie, ce qui en fait une exception « vertueuse » parmi les associations disponibles en médecine vétérinaire dont la plupart ont été développées avec un objectif d’élargissement du spectre. Malheureusement, les formulations TMP/sulfamides destinées aux animaux ont été développées par transfert « aveugle » des données de la médecine humaine relatives à l’établissement d’une synergie, sans tenir compte des spécificités des espèces animales, ou des bactéries pathogènes. En outre, les données pharmacocinétiques et les études cliniques requises au moment des dépôts de demande d’autorisation de mise sur le marché (AMM) dans les années 1990 étaient minimes. Aussi, une analyse pharmacocinétique (PK) complète incluant des études pharmacocinétiques chez les espèces cibles (objectif de ce projet avec le porc) et des études pharmacodynamiques (PD) d’efficacité in vitro sur des bactéries pathogènes d’intérêt vétérinaire (futur projet) permettra de proposer de nouveaux ratios de doses et/ou de nouvelles posologies en s’appuyant sur les approches les plus modernes de la pharmacologie des antibiotiques (modèles in vitro, pharmacocinétique de population, modélisation PK/PD).

Procédures

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé au niveau de la veine jugulaire externe grâce à un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale d'une durée moyenne d'1h30 . Cet acte chirurgical peut être source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Il est prévu l'acquisition d'un échographe afin de permettre le placement du cathéter central de façon écho-guidée, permettant ainsi de réduire la durée de l'intervention chirurgicale (de 1h 30 à 45 minutes par animaux) et de minimiser le risque infectieux (acte moins invasif). Une fois le catéther posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores, sans contention particulière et réalisé en moins d'une minute. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme (2 gavages par animal au total espacés de 10 jours au minimum) mais la contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes (entre 3 et 4 minutes)

Impact sur les animaux

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé de façon chirurgicale au niveau de la jugulaire externe. Cet acte chirurgicale est source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Une fois le catéther posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores. Le plus gros stress se fera lors des gavages qui nécessitent une contention ferme (2 gavages par animal au total) mais La contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux.

Devenir

Chaque porc sera mis à mort à l’issue des 3 semaines d’expérimentation dans des conditions éthiques, et les tissus d’intérêt (muscle, foie reins) seront récoltés pour dosage des antibiotiques.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternative non-animale robuste et pertinente actuellement permettant de reproduire la cinétique plasmatique (avec la variabilité inter-individuelle existante) des molécules chez des animaux vivants, préliminaire indispensable à l’approche PKPD.

Réduction

L’utilisation de 5 animaux par groupe (soit 10 au total) est un minimum pour pouvoir correctement estimer la varabilité inter-individuelle des paramètres pharmacocinétiques (clairance, etc) par une approche de population (modèle non-liéaire à effet mixte). En outre, le design en cross-over permet d’utiliser les mêmes animaux entre 2 administrations, en garantissant la fiabilité des données grâce à l’instauration d’un wash-out. Enfin, une fois le modèle PK développé, l’extrapolation à d’autres posologies se fera par des simulations numériques sans l’utilisation d’animaux supplémentaires. Une partie des animaux (n=10) provient d'une étude précédente car il n'a pas été nécéssaire de les mettre à mort, les 10 autres seront achetés.

Raffinement

Les porcs seront hébergés par 2 lors de la phase d'acclimatation (7 jours) puis seront seuls par case (sur caillebotis) après la pose du cathéter afin de limiter les risques d'arrachement. Cependant, les barrières entre cases permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : balle et/ou rouleau et/ou jouets à macher suspendus. Les prises de sang répétées seront effectuées après la pose chirurgicale de cathéters (avec recours à une anesthésie et une analgésie suffisante pour les animaux), permettant ainsi une récolte de sang non-douloureuse et limitant le stress. Les cathéters seront protégés avec un bandage adéquat qui sera vérifié régulièrement et changé s'il est trop souillé. Un suivi-post opératoire individuel des animaux sera effectué et une analgésie sera mise en place si nécessaire (AINS +/- analgésique de type morphinique), et le début de la cinétique ne se fera que au minimum 24h après la pose du catéther. La contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Cependant, des points limites et critères d’arrêt ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux.

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible des molécules étudiées Porc sevrés, avant la puberté (~30kg)

342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur fait subir cinq injections intrapéritonéales, puis une castration chirurgicale par ablation des testicules, suivie d'un gavage cinq jours sur sept pendant quatre semaines, pour étudier la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate. Il indique des risques d'infection ou d'hémorragie postopératoires et des points limites déclenchant la mise à mort, la privation d'androgènes faisant partie du protocole. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des lésions précancéreuses et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Afin de mieux comprendre la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate (CaP), ce projet vise à étudier les effets de la castration chirurgicale dans plusieurs modèles murins de cancers prostatiques. Les résultats préliminaires obtenus au laboratoire mettent en évidence l'implication forte du facteur de transcription HIF1a induit par l'hypoxie. L'objectif est donc de conduire une étude dans laquelle les souris seront traitées par un composé inhibiteur de HIF1a, disponible commercialement, en combinaison avec une castration chirurgicale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si HIF1a est impliqué dans la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate et par quels mécanismes.

Procédures

Les souris subiront 5 injections intra-péritonéales sur 5 jours, soit une manipulation de 3 minutes par jour, puis une intervention chirurgicale (castration/sham) d'une durée de 30 minutes 3 mois plus tard et le gavage ( 3 minutes d'intervention) 5 jours sur 7 pendant 4 semaines. Aucune autre intervention n'est prévue.

Impact sur les animaux

En post-opératoire, nous surveillerons les animaux par inspection et palpation abdominale, en cas de rougeur ou de voussure, une infection post-opératoire pourra être supposée et une surveillance rapprochée sera effectuée. En cas de signe de douleur (dos vouté, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation, l'animal sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement une infection post-opératoire. L'orchiectomie bilatérale n'entraine pas d'effet secondaire à proprement parler. En cas de mauvaise ligature des artères, une hémorragie peut avoir lieu. Cette complication est très rare et facilement visible du fait du gonflement important de la zone et d'effets secondaires généraux sur l'animal. Le Px-478 est un médicament qui a déjà été utilisé en essai clinique chez l'homme avec une bonne tolérance. Cette drogue peut entrainer une perte d'appétit.L'apparition des tumeurs de la prostate se manifeste par un gonflement intra abdominal et sera surveillé par palpation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure 3. La procédure1 permettant d'induire l'inactivation des gènes. La procédure 2 est une castration chirugicale dont le but est de limiter la circulation des androgènes. Dans ce contexte, la privation en androgène fait partie du traitement et il est donc nécessaire de garder les animaux en vie après l'intervention et pendant toute la durée du traitement qui correspond à la procédure expérimentale 3.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'animaux pour avoir un système qui reproduit la maladie chez l'homme afin de comprendre les mécanismes impliqués et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de différencier les rôles de différentes molécules pouvant être impliquées dans le développement du cancer de la prostate, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 3 lignées de souris différentes. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro et des études pilotes sur un très petit nombre de souris vont être faites pour identifier le protocole efficace et pour mieux définir les expériences à effectuer sur les grands groupes de souris. Afin d'obtenir des résultats signicatifs, de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués et en raison de l'hétérogénéité des souris, nous avons réduit au maximum le nombre de souris nécessaires et nous étudierons à la fois les tissus (histologie), les gènes exprimés et les différents sous types de cellules qui composent les tumeurs. Nous comparerons systématiquement les souris mutants versus les contrôles et au sein d'un génotype donné nous comparerons les sham versus castrés véhicule et les sham versus castré + traitement. Nous comparons des paramètres quantitatif (expression de gènes, nombre de cellules positives pour certains marqueurs histologiques, taux de prolifération cellulaires, poids des tumeurs, pourcentage de glandes atteinte des tumeurs) et également quantitatifs (expression ou non d'un marqueur au niveau histologique).

Raffinement

Les souris subiront une anesthésie générale et recevront des médicaments antalgiques afin de prévenir l'apparition de douleurs. Elles seront surveillées de manière très rapprochée durant les jours qui suivront la chirurgie. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes, de 8 semaines à plus d'un an afin de faire une cinétique en fonction de l'âge.

Une partie des souris de ce projet appartient à la lignée NSG, dépourvue de système immunitaire, pour qu'elles acceptent une greffe de cellules humaines. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes irradiées puis soumises sous anesthésie à une injection dans le fémur d'une molécule à tester, une injection que le porteur dit lui-même "douloureuse". 90 d'entre elles reçoivent ensuite des cellules souches sanguines humaines par voie intraveineuse. Toutes sont tuées au plus tard deux jours après l'irradiation, pour mesurer la molécule et la part de cellules humaines dans leur moelle et leur sang.

Objectifs

L’utilisation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) suscite un fort intérêt médical du fait de leur potentiel de régénération et de différenciation. Elles sont présentes dans la moelle osseuse et sont à l’origine des cellules sanguines. Elles sont utilisées au cours des transplantations hématopoïétiques dans le but de traiter les patients atteints de leucémies ou de maladies génétiques affectant les cellules du sang (leucocytes, globules rouges, plaquettes). L’une des limites de la greffe cependant, provient de la faible proportion de CSH capables de migrer vers les niches hématopoïétiques localisées dans la moelle osseuse et de s’y implanter. La grande majorité des CSHs est en réalité perdue ou détruite avant d’atteindre la moelle osseuse. Ainsi, une proportion importante des greffons, notamment ceux issus des sangs de cordons ombilicaux présentant de faibles quantités de CSHs, ne peut pas être utilisée pour la greffe. Une solution permettant d’augmenter le nombre de greffons disponibles consiste à augmenter la proportion des CSHs « utiles », c’est à dire capables de s’implanter dans la moelle osseuse. Cette amélioration permettrait en outre de limiter les risques d’échec de greffe chez les patients transplantés. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est d’évaluer l’effet de l’injection de molécules impliquées dans le guidage des cellules vers les niches hématopoïétiques médullaires, en association ou non avec des complexes stabilisateurs, préalablement à l’injection des CSHs, sur l’efficacité de l’implantation des CSHs humaines dans la moelle osseuse. Les expériences de transplantations seront réalisées dans un modèle de souris n’ayant pas de système immunitaire, ne rejetant donc pas la greffe de cellules humaines.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait d’établir la preuve de concept que l’injection de molécules (sélectionnées sur la base de leur effet sur les CSHs) augmente la prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques (CSHs) lors d’expérience de transplantation. A terme, ces résultats concourront à l’optimisation des protocoles de transplantation de cellules hématopoïétiques chez l’humain, dans le but d’augmenter les chances de réussite thérapeutique et le nombre de patients pouvant bénéficier d’une greffe de moelle osseuse.

Procédures

Chaque animal (450 au total) sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe (3Gy soit 3min environ pour les souris NSG et de 2 fois 5.5Gy soit 2 fois 5 min environ pour les souris C57) et à l’injection intrafémorale d’une molécule sélectionnée sur la base de son activité sur les CSHs. Cette injection qui dure quelques minutes sera réalisée sous anesthésie (1h environ) avec une prise en charge analgésique. Certains animaux (90 au total) seront également transplantés avec des CSHs humaines par voie intra veineuse. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes, est réalisée sous anesthésie et analgésie. Ces procédures permettront de tester 5 molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs La durée maximale de chacune des procédures est de 2 jours et aucun prélèvement n’est réalisé sur animal vivant.

Impact sur les animaux

Compte tenu du délai très court entre l’irradiation (3Gy pour les NSG et 2x5.5Gy pour lesC57/Bl6) et l’euthanasie précose des animaux (2 jours maximum) aucune altération significative de leur santé n’est attendue. L’infusion intra-veineuse de cellules hématopoïétiques humaines ne provoquent pas de douleur et se fait sous anesthésie générale. L’injection dans l’os est douloureuse. Elle sera effectuée sous anesthésie et sera accompagnée d’une prise en charge analgésique.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier, dans la moelle et dans le sang, la concentration de la molécule étudiée pour les études de pharmacocinétique ainsi que la proportion de CSH humaines présente dans la moelle des souris pour l’expérience de transplantation.

Remplacement

La prise de la greffe au cours des transplantations de CSH est un phénomène complexe et il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de mimer ce processus in vitro. Le passage par une expérience de transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs à se loger au niveau de la moelle osseuse et ainsi d’identifier des molécules capables d’améliorer cette étape.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, nous déterminerons sur un petit nombre de souris les conditions expérimentales optimales de transplantation en fonction de chaque molécule testée. L’effet de cinq molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs sera évalué. Notre expérience ainsi que la littérature dans le domaine nous montrent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe et par expérience est de 6 animaux afin que nous puissions rendre des résultats statistiquement significatifs sur le plan hématologique. Nos expériences préliminaires par étapes successives nous permettront d’optimiser les paramètres expérimentaux et de vérifier que ce nombre d’animaux est valide lorsque l’on combine injection intra-fémorale d’une molécule à tester et injection intra-veineuse de cellules hématopoïétiques.

Raffinement

Pour limiter au maximum l’impact sur le bien-être des animaux, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Par ailleurs, une prise en charge analgésique sera effectuée si besoin au site de l’injection intra-fémorale. Enfin une surveillance accrue (minimum 2 fois par jours) sera réalisée entre le moment de l’irradiation et l’euthanasie de l’animal (soit 2 jours maximum) afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'humain. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de CSHs. Nous utiliserons 2 lignées de souris, les C57BL6 et les NSG La comparaison des résultats obtenus entre ces deux lignées nous permettra de déterminer le dosage optimal de la molécule injecté et le modèle murin qui sera utilisé pour l’étude pharmacocinétique. Les souris NSG seront utilisées pour les expériences de transplantation car ces souris sont immunodéficiences et acceptent par conséquent la greffe de cellules humaines. Ces animaux seront maintenus et manipulés stérilement. Les souris sont hébergées en groupe de 6 dans des cages stériles en portoir ventilé et un enrichissement (coton) est ajouté à leur environnement.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur greffe des cellules cancéreuses en sous-cutané puis administre un traitement par voie intrapéritonéale chaque jour pendant vingt jours, pour étudier le rôle d'une enzyme dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Comme pour un projet voisin du même laboratoire, il indique que les souris sont maintenues sans antalgique afin de ne pas modifier la croissance tumorale, tout signe de souffrance entraînant la mise à mort. Il affirme que l'effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être évalué qu'in vivo et que le modèle murin est "nécessaire".

Objectifs

Ce projet vise à démontrer l’importance de l’enzyme scd1 dans la régulation de la réponse immunitaire anti-cancéreuse et l’importance de cette enzyme dans la résistance à l’immunothérapie.

Bénéfices attendus

L’inhibition de l’activité Scd1 a montré une efficacité contre la progression tumorale. Cependant, cette réponse demeure limitée et la recherche de thérapies combinées à une thérapie anti-Scd1 pourrait améliorer la réponse. Nous attendons une réactivation bénéfique du système immunitaire anti-tumorale avec une immunothérapie anti-PDL1 à la suite d’une thérapie anti-Scd1 conduisant à une régression tumorale complète.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant 20 jours. Chaque contention et injection ne dureront pas plus de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les injections IP répétées peuvent entraîner un stress chez les souris vigiles au moment de la contention. La transplantation des cellules quant à elle, se fera sur souris anesthésiée à l’isoflurane. Les souris KO scd1 seront produites par le croisement de souris hétérozygotes scd1+/- sans phénotypes délétères pour les seules études expérimentales et ne seront jamais maintenues en colonies car elles présentent ont un phénotype délétère inflammatoire avec une adiposité réduite, une augmentation de la sensibilité à l’insuline et des lésions de la peau à un âge avancé. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses par transplantation sous-cutanée, les souris seront maintenues 20 jours en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elles seront ensuite mises à mort.

Remplacement

L'utilisation de ce modèle murin de cancer est nécessaire car l’effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être modélisé in vitro et ne peut donc être évalué que chez l’animal. De plus, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 180 souris femelles seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux Scd1 KO et WT requis sur une période de courte durée. Des souris femelles âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses.

1 490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Selon les lots, elles subissent une à trois chirurgies, chirurgie stéréotaxique, injection virale et vagotomie, puis portent des fibres optiques ou un cathéter gastrique pour des tests de comportement et de métabolisme. Le porteur indique des douleurs et infections postopératoires possibles et un stress lié aux dispositifs, et précise que tous les animaux sont mis à mort pour prélever des tissus. Il affirme que les expériences ne peuvent se faire in vitro car il a "besoin" d'observer une physiologie intégrée, et que les invertébrés n'ont pas les structures équivalentes aux mammifères.

Objectifs

La régulation de la prise alimentaire repose sur la balance entre besoins énergétiques et la valeur renforçatrice de la nourriture. Cette régulation résulte de l'intégration dynamique de plusieurs signaux qui façonnent collectivement les stratégies adaptatives pour le maintien de l'apport calorique et du poids corporel. Cependant, notre environnement alimentaire moderne fait évoluer les ajustements physiologiques vers des dysfonctionnements de la récompense et du métabolisme qui peuvent conduire au syndrome métabolique (obésité). Les composantes de la prise alimentaire (énergie et récompense) ont été souvent décrites et étudiées en termes de régulation par le cerveau. Cependant, dans les dernières années l’axe vagal (intestin-cerveau) a émergé comme un régulateur clé de la prise alimentaire en modulant à la fois le métabolisme énergétique et les processus de récompense. Le nerf vague représente un relai neuronal capable d’assurer le transfer de l’information intéroceptive entre les organes périphériques et le cerveau. Malgré ce rôle critique, les mécanismes sous-jacents à cette régulation en conditions physiologiques et/ou pathologiques (obésité) restent largement inconnus. Ce projet de recherche vise donc à étudier le rôle de l’axe vagal dans les processus de récompense et de métabolisme énergétique. Le projet est construit autour de 4 objectifs principaux. 1. Étudier la plasticité structurale et neuronale des neurones du système de la récompense suite à vagotomie. 2. Établir le rôle des afférences vagales intestin-cerveau dans les réponses adaptatives du circuit de récompense dans l'obésité : de l'alimentation à la détection des nutriments. 3. Interroger l'axe vagal intestin-cerveau pour restaurer les fonctions hédoniques et métaboliques 4. Explorer la signature moléculaire des neurones vagaux pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'obésité

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes d'inadaptations physiopathologiques en aval. Malgré les progrès et les efforts récents, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. En fait, à ce jour, les approches thérapeutiques les plus durables de l'obésité et des dysfonctionnements qui lui sont liés sont représentées par les chirurgies bariatriques, très efficaces mais extrêmement invasives et dangereuses, dont les mécanismes d'action restent largement inexplorés. Le développement récent de technologies de pointe et l'émergence de concepts révolutionnaires dans le domaine de la physiologie intégrative, comme le propose le projet, vont certainement élargir notre quête de connaissances et de solutions thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis : -pour 5 lots à une chirurgie d'injection virale (environ 1h), puis après une période de repos de 3 semaines minimum, à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles (175ul, 35ul et 35ul sur 3j à interval d'une semaine) seront fait sur deux de ces lots. -pour 4 lots à deux chirurgies (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, ou stéréotaxie 30min et après 15j de repos une vagotomie 40min), puis après une nouvelle période de repos de 15j, à des tests de comportements. -pour 1 lot à trois chirurgies qui se feront en deux fois pour le bien être de la souris (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, puis après 15j de repos une vagotomie 40min). Puis après une période de repos de 15 jours à nouveau, il seront soumis à des tests de comportements.

Impact sur les animaux

Pour l'ensemble des procédures il peut y avoir des douleurs ou infections post opératoires qui seront traitées par analgésie et antibiothérapie si nécessaire. Pour les procédures 1-2-3, le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement. De même pour les animaux portant un cathéter gastrique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Oui selon le dessin expérimentale et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nous utiliserons les tests suivant: Student T Test ; One-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; Two-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; régression linéaire. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests non-paramétriques.

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux sont bien en place.

80 souris pygmées (Mus minutoides) vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur décrit une étude qu'il présente comme "non invasive et indolore", mesure de l'activité locomotrice par caméra et de l'activité métabolique par calorimétrie sur trois jours, tout en isolant chaque animal en cage individuelle, ce qui peut provoquer un mal-être qu'il reconnaît. À l'issue, les souris sont mises à mort et prélevées de nombreux organes, cœur, rein, tête, muscle, pour des mesures complémentaires, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent rejoindre l'élevage sous peine d'être rejetées ou tuées par leurs congénères. Sur le remplacement, il affirme que l'étude "nécessite des organismes vivants dans leur intégralité" propres à cette espèce.

Objectifs

Chez les mammifères, le déterminisme sexuel XX/XY reste très conservé, à quelques exceptions près, car toute déviation mène généralement à la stérilité des organismes hybrides. Certaines espèces comme Mus minutoides échappent à cette règle. Chez cette espèce, il existe une inversion sexuelle due à un chromosome X mutant, le chromosome X*, qui féminise les individus. Par conséquent, il existe des femelles XX, XX* et X*Y et des mâles XY chez cette espèce. Outre l’inversion sexuelle, ce troisième chromosome X* entraine de nombreuses différences phénotypiques. Les femelles X*Y ont un meilleur succès reproducteur que les autres femelles, i.e. une première portée plus précoce, une taille de portée plus grande et plus de descendants au cours de leur vie. De plus, elles présentent un comportement très masculinisé, sont plus agressives et moins anxieuses que les femelles XX et XX*. Ainsi, les études jusqu’alors menées chez Mus minutoides se sont surtout intéressées aux différences génotypiques et comportementales observées entre les différents génotypes sexuels. Peu d’études ont investigué la physiologie et encore moins l’influence du génotype sexuel sur celle-ci, chez cette espèce. Ce présent projet a donc pour objectif de poursuivre le phénotypage chez Mus minutoides en réalisant de nouvelles mesures comportementales et physiologiques (de l’animal entier jusqu’à la cellule). Pour cela, 16 femelles XX, 16 femelles XX*, 16 femelles X*Y et 16 mâles XY seront utilisés. Après deux semaines d’acclimatation, les paramètres listés ci-après seront mesurés durant 3 jours consécutifs (mesures répétées) : - L’activité locomotrice par caméra infrarouge. Pour cette analyse comportementale, la durée, la fréquence et le type de déplacement seront considérés. - L’activité métabolique grâce à un système de calorimétrie indirecte. Cette mesure permettant alors d’obtenir des mesures complémentaires à celle de l’activité locomotrice en quantifiant, par exemple, l’énergie utilisée dans les fonctions vitales pour l’animal et celle impliquée dans d’autres fonctions (comme la locomotion) sur 24h. De même, il sera possible de calculer le quotient respiratoire, la prise alimentaire et la prise hydrique des individus étudiés. Cette étude, non invasive et indolore, constitue une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences physiologiques et comportementales entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet est une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences cérébrales et comportementales entre sexes et sur le rôle de l’antagonisme sexuel dans l’évolution des chromosomes sexuels. Nous sommes également dans une excellente configuration pour comprendre les bases génétiques encore largement méconnues du déterminisme sexuel chez les mammifères, qui pourrait apporter des éléments utiles à la recherche clinique. Les animaux ne pourront pas être réintroduits dans leur élevage initial sous peine d’être rejetés voire tués par leurs congénères. Ils seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires (mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, activités enzymatiques, analyse morphométrique, etc) afin de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides et d’apporter de nouvelles connaissances sur cette espèce encore peu méconnue d’un point de vue physiologique.

Procédures

Après deux semaines d’acclimatation, les souris seront placées en cage expérimentales dans les mêmes conditions de stabulation (enrichissement précédent conservé). Pour chaque individu, les paramètres listés ci-après seront mesurés durant 3 jours consécutifs : - L’activité locomotrice par caméra infrarouge. Pour cette analyse comportementale, la durée, la fréquence et le type de déplacement seront considérés. - L’activité métabolique grâce à un système de calorimétrie indirecte. Cette mesure permettant alors d’obtenir des mesures complémentaires à celle de l’activité locomotrice en quantifiant, par exemple, l’énergie utilisée dans les fonctions vitales pour l’animal et celle impliquée dans d’autres fonctions (comme la locomotion) sur 24h. De même, il sera possible de calculer le quotient respiratoire, la prise alimentaire et la prise hydrique des individus étudiés. Cette étude est non invasive et indolore. Elle constitue une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences cérébrales et comportementales entre sexes et sur le rôle de l’antagonisme sexuel dans l’évolution des chromosomes sexuels. Nous sommes également dans une excellente configuration pour comprendre les bases génétiques encore largement méconnues du déterminisme sexuel chez les mammifères, qui pourrait apporter des éléments utiles à la recherche clinique. Les animaux ne pourront pas être réintroduits dans les élevages initiaux sous peine d’être rejetés voire tués par leurs congénères, il seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires (mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, etc) qui permettront de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides.

Impact sur les animaux

Le projet est conçu de sorte à ne pas entrainer de nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux. Néanmoins, les souris seront seules dans leur cage, pour un souci d’agressivité et de conditions expérimentales, ce qui peut mener à un mal-être de l’animal. Par conséquent, nous porterons une attention particulière au comportement et à l’état physique des souris pour éviter qu’un animal ne se retrouve en souffrance. De même, les cages seront placées les unes à côté des autres pour que les souris puissent au moins se voir et ne pas se sentir isolées. Les observations faites lors du dernier projet réalisé sur cette espèce ont permis de mettre en évidence que les souris ne montrent pas de signes de stress lorsque leur cage se situe à côté de celles de leurs congénères.

Devenir

L’élevage initial ne reprendra pas les individus utilisés dans cette procédure expérimentale pour des raisons sanitaires et également de réinsertion. La souris pygmée Africaine Mus minutoides est une espèce sociale qui vit en petit groupe. A l’issu de l’expérimentation, il sera difficile de reconstituer des groupes d’individus qui auront été isolés plusieurs jours (même si le contact visuel est maintenu entre les individus), plus particulièrement avec les mâles XY et les femelles X*Y qui peuvent se montrer très agressifs. Enfin, il existe peu d’informations sur la physiologie de cette espèce et sur les différents génotypes existants chez celle-ci : femelles XX, X*X et X*Y et mâles XY. A l’issu de ce projet, les animaux seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires : mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, activité enzymatique, analyse morphologique, etc. Des mesure qui permettraient de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides, sans mettre à mort d’autres individus. Les échantillons biologiques prélevés seront nombreux (i.e cœur, rein, tête, queue, muscle squelettique, foie, muscle, tissu adipeux brun, etc) pour répondre à diverses questions soulevées au sein de notre laboratoire et dans d’autres laboratoire (Montpellier notamment). En guise d’exemple, le muscle squelettique sera utilisé par notre laboratoire pour des analyses de bioénergétique mitochondriale et les têtes des souris seront, quant à elles, envoyées à Montpellier pour des analyses de la morphologie des cavités nasales de cette espèce.

Remplacement

Ces expérimentations nécessitent des organismes vivants dans leur intégralité, en particulier une espèce, Mus minutoides, qui ne peut pas être remplacée par une approche substitutive.

Réduction

Les manipulations sont optimisées statistiquement pour réduire le nombre d’individus utilisés : 16 individus par génotype sexuel, soit 64 individus au total. En effet, un test de puissance, à partir de données préliminaires, indique que 16 individus par condition sont nécessaires pour détecter une différence : power.anova.test (groups = 4, between.var = 1, within.var = 4, power = 0.80). Chaque individu sera utilisé à la fois pour les mesures d’activité physique, de taux métabolique et d’autres mesures complémentaires (prises alimentaire et hydrique, bioénergétique mitochondriale, etc). 4 individus supplémentaires de chaque génotype seront aussi maintenus en réserve et ne seront utilisés que dans le cas où des individus seraient écartés de la procédure expérimentale ou morts. Ainsi, dans le cas où les individus supplémentaires venaient à être étudiés, 80 animaux seraient utilisés pour ce projet. Les données obtenues à l’issu de ce projet seront alors analysées statistiquement à l’aide d’une ANOVA sur mesures répétées puisque plusieurs mesures auront été réalisées sur un même individu.

Raffinement

Les mesures nécessitent ni injection, ni manipulation des individus, excepté lors du changement de cage. Les cages d’hébergement seront enrichies de nids et de jeux, et la nourriture ainsi que l’eau seront disponibles ad libitum pour limiter la solitude des individus dans la cage. Ce même enrichissement sera conservé dans les cages expérimentales et aucun changement de cage ne sera effectué lors des mesures pour limiter le stress des animaux. Une attention particulière sera portée sur diverses manifestations : les prises hydrique et alimentaire, la présence ou non de toilettage, la modification de comportement ou de posture, l’apparition d’une hypothermie et la consistance des selles. Un individu en souffrance sera écarté de la procédure et placé dans sa cage d’hébergement initiale, plus enrichie. Si son état venait à s’aggraver, l’animal serait mis à mort par dislocation cervicale précédée d’une sédation.

Choix des espèces

L’étude de l’activité physique et du taux métabolique nécessite des organismes vivants dans leur intégralité, et en particulier des femelles et des mâles Mus minutoides. En effet, ce projet cherche à comparer quatre génotypes sexuels différents : trois génotypes féminins existant chez cette espèce (XX, XX* et X*Y) et un génotype mâle (XY). Ainsi, aucune méthode alternative n’existe pour réaliser ce projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes reproducteurs. Les mesures de taux métabolique (consommation d’oxygène) et d’activité nécessitent de choisir des individus d’âge relatif similaire afin d’éviter les variations en lien avec le stade de développement. Prendre des adultes, par exemple, évite de mesurer le taux métabolique (consommation d’oxygène) alloué à la croissance des individus en développement et de mesurer par conséquent le taux métabolique basal de l’individu.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur de mélanome mesurée deux fois par semaine jusqu'à un centimètre cube, suivie avec ses métastases par bioluminescence sous anesthésie gazeuse, pour caractériser le rôle du gène BAHCC1. Le porteur reconnaît un inconfort lié à la tumeur et aux métastases, avec perte de poids et d'appétit, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la nature agressive du mélanome. Il décrit les objectifs et les bénéfices du projet en une seule phrase quasi identique, centrée sur la caractérisation de la croissance tumorale.

Objectifs

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 in vivo.

Bénéfices attendus

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 dans un contexte plus physiologique comparé aux conditions in vitro.

Procédures

Tous les animaux vivants seront suivis pour évaluer deux paramètres : 1- taille de la tumeur primitive au moins 2 fois par semaine pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : les animaux seront éveillés et la taille de la tumeur sera évaluée au pied à coulisse. Durée de intervention 5 minutes pour souris. 2- taille de la tumeur primaire et des lésions secondaires 2 fois par semaine par bioluminescence pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : durant cette procédure les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (2% d'isoflurane). Durée de intervention 15 minutes pour souris.

Impact sur les animaux

Inconfort généré par la présence de la tumeur primitive et des métastases pouvant entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés par la métastase tumorale.

Devenir

Lot A : 20 animaux subiront les procédures 1 et 2 pour caractériser la cinétique tumorale des 4 lignées cellulaires utilisées pour cette étude (5 souris pour la lignée cellulaire pour générer une étude statistique de base). Lot B : 120 animaux subiront les procédures 1 et 2 qui sont combinées pour analyser la croissance et la cinétique métastatique des tumeurs en présence ou en l'absence de BAHCC1. En raison de la nature agressive du mélanome, toutes les souris seront sacrifiées afin d'éviter tout type de souffrance et de douleur (par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale).

Remplacement

Nous avons effectué l'inactivation de BAHCC1 dans des lignées cellulaires humaines in vitro, démontrant son importance pour la prolifération des mélanomes. Cependant, ce modèle a des limites et ne prend en compte ni la croissance dans des conditions tridimensionnelles, ni le rôle du microenvironnement tumoral. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que dans un modèle in vivo tel qu'une souris immunodéficiente, facile à manipuler et capable d'héberger des cellules humaines. De plus, notre xénogreffe de souris sera comparée à d'autres modèles de mélanome de souris utilisés par nos collaborateurs de laboratoire.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 140. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Par ailleurs, plusieurs expériences sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'analyse statistique sera effectuée avec le software GraphPad (Prism 9) avec unpaired t-test ou avec One-way ANOVA non-parametric.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale et confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) pour chaque lignée cellulaire injectée à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 1 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des quatre lignées cellulaires utilisées. Toutes les lignées expriment la luciférase, nous pourrons donc surveiller en parallèle le développement et la taille des métastases en mesurant l'activité de la luciférase avec le système IVIS tous les lundis et vendredis de la semaine. La mesure de l’activité luciférase sera effectuée tout au long de la cinétique tumorale avant d'atteindre la taille limite de la tumeur de 1 cm3. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance liée au phénotype, les animaux seront suivis régulièrement et des critères d'évaluation appliqués si nécessaire.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance de BAHCC1 dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc.

3950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections d'un composé supprimant l'autophagie, puis une injection de cellules leucémiques, des prélèvements sanguins répétés, parfois une ponction osseuse, et un traitement oral ou intrapéritonéal, pour étudier le rôle de l'autophagie dans la leucémie aiguë myéloïde. Le porteur indique des effets possibles comme du stress, une perte de poids ou une gêne de mobilité après ponction osseuse. Les souris sont tuées par prélèvement sanguin intracardiaque sous anesthésie pour les analyses.

Objectifs

Malgré un taux élevé de rémission après un traitement conventionnel par chimiothérapie, les rechutes sont fréquentes chez les patients atteints de leucémies aigües myeloïdes (LAM). Comme pour d'autres types de cancer, l'un des mécanisme impliqués dans la résistance des LAM est la reprogrammation métabolique. L’autophagie est un processus catabolique impliqué dans la dégradation et le recyclage des organelles et protéines endommagées pour participer au métabolisme. La dérégulation de l’autophagie est impliquée dans de nombreuses maladies telles que le cancer. Récemment, l’importance de l’autophagie dans les cellules du microenvironnement tumoral a également été mis en évidence. En effet, cette autophagie de l’hôte favorise la croissance des mélanomes, cancer du poumon ou cancer du pancréas en fournissant les substrats nécessaires aux cellules cancéreuses. Ainsi, ce projet s’intéresse à l’étude de l'implication de l’autophagie de l’hôte dans la régulation du métabolisme des cellules de LAM et leur chimiorésistance.L

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie dans le dévelopement et la résistance des LAM et les mécanismes moléculaires exacts impliqués. Cette meilleure compréhension pourra permettre le développement de thérapies ciblant directement l'autophagie ou des voies moléculaires régulées par ce mécanisme. Ce projet permettra également la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées existantes dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 injections d'un composé permettant d'induire une déplétion de l'autophagie dans l'ensemble des organes de la souris. Les animaux seront ensuite soumis à une injection unique de cellules leucémiques par voie intraveineuse, puis à des prélèvements de sang sous anesthésie espacés de plusieurs semaines afin d'évaluer la prise tumorale et de récolter du matériel biologique (plasma) pour des analyses ultérieures. En cas de non-diffusion des cellules leucémiques, nous ferons une ponction osseuse de cellules sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement de durée variable selon le type de thérapie, allant de une à quatre semaines, par voie orale ou intrapéritonéale. Les animaux seront soumis à une présence humaine quotidienne afin d'observer leur état de bien-être et manipulés de façon hebdomadaire pour un suivi pondéral.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress, une perte de poids, une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne par exemple. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir un gêne temporaire au niveau de la mobilité même si la douleur est inhibée avec l'analgésie. En revanche, tout signe de douleur observé mettra fin à l'expérimentation pour l'animal concerné.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chaque étude contenant plusieurs procédures. Pour les procédures suivantes: injedction intraveineuse, intrapéritonéale, orale ainsi que le prélèvement sanguin mandibulaire et jugulaire, les animaux seront gardés en vie pour continuer l'étude. Pour la procédure de prélèvement de sang par voie intracardiaque sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés sans réveil après la procédure.

Remplacement

Dans le but d’évaluer la contribution de l’autophagie dans le développement leucémique et la résistance thérapeutiques, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier de façon fidèle les interactions entre la tumeur et son microenvironnement ainsi que son évolution au sein d’un organisme vivant. Bien que certains modèles in vitro (notamment de co-culture) permettent d’obtenir une première compréhension des mécanismes, ils ne sont pas suffisants. Par exemple, nous avons montré une absence de corrélation entre la réponse in vitro et in vivo à l’AraC, rendant nécessaire l’utilisation de modèle in vivo. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité in vivo.

Réduction

Les effectifs des cohortes seront calculés et limités par un logiciel de simulation et l'outil statistique. Les études antérieurement effectuées permettront d'optimiser le nombre d'animaux et le nombre d'échantillons issu de l'animal.

Raffinement

L'expérimentation fait l'objet d'une procédure de suivi du bien-être des ainmaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée s'il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à la procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites. La plupart des procédures décrites dans ce projet ont déjà obtenu l'accord d'un comité d'éthique pour l'expérimentation animale.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du cancer et du rôle de l’autophagie dans de nombreuses pathologies. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements et à la compréhension des fonctions de l’autophagie. Ils présentent des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Dans l’étude de la LAM, nous utilisons des souris immunodéficientes et immunocompétentes contrôle ou déficiente en autophagie systémique afin d’étudier l’importance de la composante immunitaire. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe leucémique. Le traitement au tamoxifène pour induire la délétion est également plus efficace à cet âge-là. De plus, les souris de cet âge sont moins susceptibles de ressentir la douleur, la souffrance et l’angoisse.