Oncologie
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État du réseau neuronal responsable du sommeil chez un modèle de souris transgénique de sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
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- Système nerveux
Opérées sous anesthésie pendant une heure trente pour l'implantation d'électrodes, puis maintenues éveillées deux heures ou privées de sommeil paradoxal pendant 48 heures par un dispositif qui secoue leur cage, 192 souris porteuses d'une mutation de la sclérose latérale amyotrophique subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'élevage nécessaire porte le total à 378 souris, toutes tuées. L'objectif est de cartographier l'activité des réseaux cérébraux du sommeil avant l'apparition des symptômes moteurs, une question que le porteur présente comme jamais explorée. Il écrit que ce "sacrifice" est justifié par la "nécessité" d'accéder au tissu cérébral pour le marquage post-mortem des neurones activés.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), aussi connue sous le nom de maladie de Charcot, est une maladie neurologique grave et incurable qui s'attaque aux cellules nerveuses contrôlant les muscles. Elle entraîne une paralysie progressive et conduit malheureusement au décès, généralement 2 à 5 ans après l'apparition des symptômes. Si la paralysie est le symptôme le plus connu, la maladie provoque également d'autres problèmes sévères qui dégradent fortement la qualité de vie des patients, notamment une perte de poids importante et des troubles majeurs du sommeil. Pour étudier cette maladie, la recherche utilise des modèles animaux (souris) qui développent des symptômes très similaires. Aujourd'hui, nous ne comprenons toujours pas précisément pourquoi la SLA perturbe aussi gravement le sommeil. Les premières pistes suggèrent un dysfonctionnement dans une petite zone du cerveau (l'hypothalamus), qui gère à la fois l'appétit et le sommeil. Cependant, le cycle veille-sommeil est en réalité contrôlé par un ensemble de réseaux de neurones bien plus complexes et interconnectés, situés dans différentes zones du cerveau. L'état de ces autres réseaux n'a jamais encore été étudié dans le contexte de la SLA. L'objectif de notre projet est donc de combler cette lacune fondamentale. Nous allons, pour la première fois, cartographier l'activité de tous ces réseaux cérébraux durant les différentes phases de vigilance (éveil, sommeil léger et sommeil profond). Cette "cartographie" nous permettra d'identifier précisément quels circuits du sommeil sont altérés par la maladie, une étape essentielle pour comprendre l'origine de ces troubles et espérer un jour développer des traitements pour améliorer la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Ce projet est important car il nous aidera à comprendre exactement pourquoi le sommeil est si perturbé chez les personnes atteintes de SLA, un symptôme qui dégrade fortement leur qualité de vie au quotidien. En réussissant à identifier précisément quelles zones du cerveau sont responsables de ces troubles, nous espérons ouvrir la voie au développement de nouveaux traitements. L'objectif à terme serait de pouvoir corriger ces problèmes très tôt dans l'évolution de la maladie, et peut-être même avant que les symptômes moteurs, comme la paralysie, ne commencent à apparaître.
Procédures
Les souris transgéniques utilisées dans les expérimentations de ce projet seront soumises à une seule procédure chirurgicale. Cette chirurgie consiste en une implantation d’électrodes pour les enregistrements du sommeil. Elle est faite sous anestesie d’une durée totale de 1h30. À la fin du protocole, toutes les souris seront séparées en 3 groupes : Le groupe "Éveil" : Pour étudier le cerveau en état d'éveil, nous maintiendrons un groupe de souris éveillé pendant 2 heures. Le groupe "Sommeil lent" : Pour la comparaison, un deuxième groupe sera laissé au repos complet dans sa cage habituelle, pendant exactement la même période. Le groupe "Sommeil paradoxal" (Sommeil des rêves) : Pour étudier spécifiquement les effets du "sommeil paradoxal", nous utiliserons un système automatisé développé par notre équipe. Ce système surveille la souris et détecte le moment précis où elle entre dans cette phase de rêve. Il envoie alors une stimulation très légère, juste assez pour interrompre cette phase spécifique, sans pour autant réveiller complètement l'animal ni le stresser. Cette privation qui dure 48h sera suivie d’un rebond de 2 heures, durant lequel la quantité de sommeil paradoxal augmente fortement.
Impact sur les animaux
Une chirurgie légère sous anesthésie générale : Un traitement antidouleur est administré systématiquement avant l’intervention, combinant deux analgésiques complémentaires. Une douleur post-opératoire transitoire peut survenir mais est prise en charge efficacement par une analgésie continue. Une période de récupération de 10 jours est prévue, avec un suivi quotidien par fiche d’observation. Une privation sélective du sommeil paradoxal de 48h est également réalisée, qui interrompt doucement chaque épisode de REM par un léger mouvement de la cage, sans générer de stress significatif. L’ensemble du protocole est conçu pour minimiser toute souffrance ou détresse des animaux.
Devenir
À l’issue de l’ensemble des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés de manière rapide et éthique afin de permettre l’analyse histologique du cerveau, notamment des structures activées pendant l’éveil, le sommeil lent et le sommeil paradoxal (via le marquage cFos). Cette étape est indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, en identifiant précisément les neurones recrutés après manipulation expérimentale. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie profonde terminale, garantissant l’absence de douleur ou de souffrance. Aucun animal ne sera réutilisé dans un autre protocole. Ce sacrifice est justifié par la nécessité d’accéder au tissu cérébral pour les analyses anatomiques post-mortem.
Remplacement
L'étude des circuits neuronaux régulant le sommeil et leur dysfonctionnement dans une maladie aussi complexe que la maladie de charcot ne peut être modélisée autrement que par l’animal. La souris est un modèle important et pertinent dans l’étude du sommeil et de la maladie de charcot, sa neuroanatomie des circuits du sommeil est bien caractérisée et proche de celle de l'homme. De plus, les modèles transgéniques de souris sont des modèles expérimentaux très puissants (génétique connue, commercialisation d’outils moléculaires, etc). Le modèle murin est le plus pertinent car sa neuroanatomie des circuits du sommeil est bien caractérisée et proche de celle de l'homme.
Réduction
La taille d’échantillon a été déterminée à partir de données préliminaires de l’équipe sur des paramètres de sommeil et d’activité locomotrice, en tenant compte de la variabilité interindividuelle observée. Un minimum de 16 animaux par groupe est nécessaire pour détecter un effet significatif portant le nombre d’animaux à 192 animaux sur l’ensemble du projet. Aucun test inutile ou répété n’est prévu : chaque animal ne participe qu’à un seul paradigme de sommeil et l’ensemble des données exploitables est recueilli sur le même individu, ce qui contribue à limiter le nombre total d’animaux. un élevage sera mis en place dans l'animalerie du laboratoire, portant ainsi le nombre de souris total du projet à 378, permettant le maintient de l’élevage.
Raffinement
Plusieurs mesures de raffinement sont mises en œuvre à toutes les étapes du protocole. La chirurgie d’implantation d’éléctrodes est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie systématique. Les animaux sont installés sur un tapis chauffant, leurs yeux sont protégés par un gel ophtalmique, puis ils sont suivis quotidiennement pendant au moins 10 jours. En cas de dépassement des points limites définis, les animaux sont immédiatement retirés du protocole et mis à mort. Les conditions d’hébergement sont règlementaires : enrichissement systématique des cages (matériel de nidification, bâtonnets à ronger), limitation du bruit et de la lumière, manipulations réalisées par un personnel formé et, autant que possible, par les mêmes expérimentateurs afin de limiter le stress. La privation sélective de sommeil paradoxal repose sur un système validé qui interrompt les épisodes de REM par un déplacement très léger de la cage, sans augmentation mesurable du stress. Enfin, compte tenu des souris qui vont devellopper une maladie neurodegenerative du système moteur, elle seront mises à mort avant toute apparition des symptomes.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce de référence pour l’étude expérimentale de la maladie de charcot et de la régulation du sommeil. Ses circuits du sommeil sont bien décrits et proches de ceux de l’humain, et il existe des lignées transgéniques de la maladie largement caractérisées. Les techniques utilisés dans ce projet ne sont actuellement possible que chez la souris. Dans le cadre de la question posée aucune autre espèce ne permettrait de répondre aussi précisément, et aucun modèle non animal ne peut reproduire l’organisation fonctionnelle des réseaux du sommeil in vivo. Les animaux seront utilisés à partir d’environ 60 jours d’âge, au moment de la chirurgie. Ce stade correspond à un âge adulte jeune chez la souris, où les circuits du sommeil sont matures et un stade présymptomatique. Tous les enregistrements de sommeil et les paradigmes comportementaux seront réalisés entre 2 et 3 mois d’âge afin d’étudier spécifiquement les altérations précoces des réseaux d’éveil et de sommeil.
Caractérisation d’une molécule impliquée dans la synthèse des lipides chez la souris.
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13 470 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 12 672 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger qui relèvent de l'élevage et du génotypage par biopsie de queue. Les 798 autres subissent un régime obésogène de six semaines, jusqu'à 21 administrations orales, sept injections, une mise à jeun de 12 à 15 heures, et pour les femelles gestantes une injection destinée à induire la pathologie chez l'embryon. Le porteur annonce des retombées pour le cancer, le diabète de type 2, l'obésité, les maladies lysosomales et les myopathies, alors que l'objectif immédiat reste de caractériser une molécule dont il écrit que les effets sont mal connus. Il affirme que les interactions entre types cellulaires ne peuvent être étudiées de façon complète que sur des animaux entiers, ce qui rend selon lui le modèle "indispensable".
Objectifs
Récemment, des travaux sur des cellules ont montré l’identification d’une nouvelle cible impliquée dans la synthèse d'un lipide majeur constituant les membranes biologiques cellulaires. Les effets de l'activité de cette molécule sont mal connus. Le projet a pour objectif de créer des nouveaux modèles de souris présentant différentes formes d’activation de cette cible. Il sera utilisé différents traitements pharmacologiques, avec un régime alimentaire spécifique afin d’étudier différents tissus pour des analyses moléculaires et métaboliques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de confirmer les données obtenues dans des modèles cellulaires dans un contexte physiologique et pathologique. A ce jour les mécanismes de régulation de cette cible ne sont pas encore bien caractérisés. L’identification et la caractérisation de nouvelles cibles participeront à apporter une réponse thérapeutique aux maladies telles que, le cancer, le diabète de type 2, l'obésité, les maladies lysosomales et les myopathies.
Procédures
injection de femelles gestantes pour induction du modèle pathologique chez l'embryon (1 fois, 10 secondes), par voie oral d'une molécule médicament avec effet sur les lipides pour tester leur potentiel thérapeutique (21 fois, 10 secondes), injection d'une molécule médicament pour tester leur potentiel thérapeutique (7 fois, 10 secondes), induction d’un régime obésogène (1 fois, 6 semaines), mise à jeun (1fois, 12 à 15H). Entre J63-98 maximum : mise à mort précoce et prélèvement des tissus pour différentes analyses, et mise à mort précoce pour l'étude de survie à l'âge de 4 mois.
Impact sur les animaux
La contention peut causer un stress léger de courte durée. La biopsie de queue peut occasionner une douleur légère de quelques secondes. douleur légère au point d'injection. risque de fausse route. Baisse de la fonction du rein.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement d'organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet.
Remplacement
Dans un contexte de recherche physiopathologique sur des anomalies de croissances cellulaires , les intéractions complexes entre différents types cellulaires et d'autres organes ne peuvent être étudiés de façon complète que sur des animaux entiers rendant le modèle indispensable. Les expérimentations chez ces modèles sont nécessaires pour répondre à notre objectif.
Réduction
Des études préliminaires dans des modèles cellulaires ont déjà été menées. Le nombre d’animaux nécessaire pour l'élevage et l'analyse des résultats a été évalué statistiquement par des logiciels dédiés.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'un enrichissement et des mesures de raffinement ont été mis en place avec une surveillance quotidienne par les membres qualifiés de l'animalerie et lors de l'entrée en procédure par les responsables de projet afin de détecter tout signe de douleur ainsi que les weekends par les personnes d'astreinte. L'application de points limites stricts et spécifiques au projet seront respectés par les responsables du projet qui tiendront une fiche d’observation des points limites précoces stricts et adaptés.
Choix des espèces
La physiologie de la souris est proche de celle de l’Homme, L’étude de souris génétiquement modifiées est particulièrement intéressante pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et les résultats obtenus peuvent être transposables chez l’Homme. Le modèle d'anomalie de croissance est un modèle idéal pour modéliser cette maladie et représente un modèle communément utilisé dans ce domaine de recherche. De nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale.
Phénotypage comportemental d’un nouveau modèle murin pour la schizophrénie
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Soumises à un maximum de huit tests comportementaux répartis sur sept semaines, dont un jeûne de 24 heures et des nuits en cage individuelle, 180 souris privées d'un gène vont toutes être tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'invalidation du gène peut provoquer des crises d'épilepsie après l'âge de 12 semaines, ce qui conduit l'équipe à programmer les tests entre 6 et 12 semaines. L'objectif déclaré est de caractériser le comportement de cette lignée sur la souche CD1, pour disposer ensuite d'un modèle de schizophrénie où tester des traitements. Les tests censés mesurer l'anxiété, la motivation, la sociabilité et la mémoire ne sont nommés nulle part.
Objectifs
Notre projet cherche à mieux comprendre les mécanismes du cerveau impliqués dans la schizophrénie, une maladie psychiatrique complexe qui touche environ 1 % de la population. Cette pathologie se manifeste par deux grands types de symptômes : • les symptômes positifs, comme les hallucinations, les délires ou les troubles de la pensée ; • et les symptômes négatifs, tels que la perte de plaisir (anhédonie), la dépression, le retrait social ou les difficultés de concentration et de mémoire. De nombreuses études montrent que la schizophrénie serait liée à un mauvais fonctionnement de la communication chimique des neurones. Notre recherche s’intéresse à une protéine particulière, qui joue un rôle clé dans le stockage et la libération des messagers chimiques. Si cette protéine fonctionne mal, la communication entre les neurones devient désorganisée, ce qui pourrait contribuer à certains symptômes de la schizophrénie. Pour explorer cette hypothèse, nous utilisons une lignée de souris dépourvues de cette protéine, afin d’étudier comment cette absence modifie leur comportement. Nous mesurons notamment des paramètres liés à l’anxiété, la motivation, la dépression, la sociabilité, la mémoire et l’activité locomotrice, qui peuvent être altérés chez les patients schizophrènes. Certaines de ces évaluations sont déjà commencées sur un autre modèle murin proche, mais nous devrons les valider spécifiquement sur la souche utilisée (CD1), de par la spécialité scientifique et technique de l’équipe de recherche qui va l’utiliser. La caractérisation du comportement de ces souris est nécessaire car le fond génétique peut influencer les résultats et elle permettra d’avoir des connaissances approfondies des symptômes associés au manque de communication neuronal, liée à l’absence de la protéine étudiée. A terme, nous disposerons d’un modèle expérimental complet et pertinent pour tester de nouvelles approches thérapeutiques liées aux maladies psychiatriques
Bénéfices attendus
Les résultats attendus permettront de mieux relier les phénomènes biologiques observés au niveau cellulaire aux comportements mesurés chez l’animal, ouvrant la voie à une approche plus intégrée du fonctionnement cérébral. Ce travail contribuera à la création d’un modèle expérimental de référence, utile pour tester de nouvelles hypothèses et évaluer des traitements innovants ciblant les déséquilibres de la transmission nerveuse. À long terme, ces recherches aideront à mieux comprendre les bases cérébrales des troubles psychiatriques chroniques et à favoriser le développement de thérapies plus efficaces et mieux ciblées, offrant de nouvelles perspectives pour les patients souffrant de schizophrénie ou de pathologies apparentées.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests comportementaux destinés à évaluer les performances sociales, cognitives et émotionnelles dans le modèle de souris invalidées pour un gène potentiellement impliqué dans la schizophrénie. Chaque test dure entre 5 minutes à 1 nuit par session, selon la nature de la tâche, et peut s’étendre sur 1 à 4 jours consécutifs pour les épreuves nécessitant une phase d’apprentissage ou de conditionnement. Une période minimale de 48h sépare deux tests successifs pour éviter toute fatigue ou interférence comportementale. Chaque souris réalisera un maximum de 8 tests comportementaux répartis sur une durée de 7 semaines, pour un temps cumulé d’observation inférieur à 90 minutes par animal. Une partie des animaux recevra un traitement pharmacologique, 10 à 30 minutes avant le test.
Impact sur les animaux
D’après les données disponibles dans la littérature et les observations préliminaires, l’invalidation du gène peut induire des crises d’épilepsie occasionnelles après l’âge de 12 semaines et aussi des troubles émotionnels ou sociaux, tels qu’une augmentation de l’anxiété, une réduction de la sociabilité ou des signes de type dépressif. Les animaux seront soumis à différentes sessions de tests d’une durée comprise entre 5 minutes à 1 nuit, espacées d’au moins 48 heures pour limiter la fatigue et le stress cumulés. Ces tests peuvent générer des stress légers à modérés, liés à l’exposition temporaire à la lumière, la découverte d’un nouvel environnement ou de l’inconfort et de la résignation. Certains tests nécessiteront une mise en cage individuelle temporairement (12 h nocturne ou 24h) afin de mesurer les consommations individuelles de boisson, la préférence sociale ou les comportements compulsifs. Un des tests comprendra un jeûne limité à 24 heures, strictement encadré, avec contrôle du poids (perte inférieure à 10 %) et réalimentation immédiate après le test. Les injections ponctuelles réalisées uniquement sur certains animaux (solution saline ou molécules de référence) peuvent induire un inconfort, voir douleur aigûe légère au moment de l’administration, de courte durée, ainsi que des effets pharmacologiques attendus (légère sédation ou hyperactivité, retrait social, des modifications des perceptions sensori-motrices ou une modification du niveau d’anxiété). Ces effets sont réversibles en moins d’une heure.
Devenir
Toutes les procédures : Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des analyses post-mortem des tissus nerveux.
Remplacement
Il n’existe actuellement aucune méthode alternative in vitro ou in silico permettant de reproduire la complexité des comportements étudiés dans ce projet. Les tests comportementaux envisagés nécessitent d’évaluer des réponses motrices, émotionnelles, sociales et cognitives intégrées, qui ne peuvent être observées que chez un animal vivant et vigile. Les modèles cellulaires ou informatiques permettent d’explorer certains aspects moléculaires ou synaptiques, mais ils ne peuvent pas rendre compte des interactions dynamiques entre circuits neuronaux impliquées dans la régulation du comportement.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été calculé pour obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum le nombre d’animaux. Les expériences tiennent compte des différences entre mâles et femelles et du type de souris étudié (avec ou sans le gène muté). Une première phase servira à valider les tests, puis les autres permettront d’observer les effets du gène seul. Les mêmes animaux seront testés plusieurs fois, sans compromettre leur bien-être ni la qualité des résultats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des animaleries agréées dont le fonctionnement est conçu pour maximiser leur confort et limiter toute source de souffrance ou de stress. Les souris sont hébergées en groupes sociaux stables afin de préserver leurs interactions sociales naturelles. Un enrichissement du milieu est systématiquement mis en place dans chaque cage, comprenant des carrés de coton pour la nidation, des tunnels transparents favorisant l’exploration et la cache, ainsi que des barreaux de bois à ronger pour satisfaire les comportements de mastication. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel zootechnique et les expérimentateurs afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, de stress ou d’altération de l’état général (prostration, apathie, comportements anormaux). Les souris seront progressivement habituées à l’expérimentateur et aux environnements de test pour limiter les réactions de peur ou de nouveauté. Les manipulations seront exclusivement réalisées à l’aide de tunnels, méthode reconnue pour réduire le stress et les réactions de défense par rapport à la prise en main directe. Cette approche permet également d’assurer une standardisation des manipulations entre expérimentateurs et d’améliorer la qualité des mesures comportementales. Des points limites clairement définis ont été établis afin de retirer rapidement tout animal présentant un signe de mal-être ou de souffrance.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle le plus pertinent pour cette étude, car le gène d’intérêt, dont nous souhaitons caractériser les effets comportementaux associés à des troubles psychiatriques de type schizophrénique, n’est actuellement inactivé que chez cette espèce. L’utilisation d’un autre modèle n’est donc pas possible à ce stade. Des animaux âgés d’au moins 6 semaines, dont le poids est supérieur à 20 g, seront utilisés afin de garantir la maturité complète des systèmes neurobiologiques nécessaires à l’étude. Les tests comportementaux seront réalisés de préférence entre 6 et 12 semaines d’âge, période précédant l’apparition potentielle des crises épileptiques observées chez certains animaux à partir de 13 semaines.
Modèle de neuropathie induite par un anticancéreux : évaluation des atteintes nerveuses, rénales et musculaire
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Développer un modèle vendable de neuropathie, d'atteinte rénale et de fonte musculaire liées aux anticancéreux, telle est la finalité annoncée pour 900 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'anticancéreux de façon chronique, subissent des mesures de sensibilité mécanique de trente minutes, jusqu'à huit prélèvements sanguins et vingt heures en cage métabolique individuelle sans litière. Le porteur décrit une perte de poids musculaire importante, une perte d'appétit, une hypersensibilité à la douleur et une baisse de production d'urine, et signale que les traitements répétés génèrent un stress chronique. L'établissement présente ce modèle comme une ouverture de son "catalogue" d'études précliniques à un domaine où les organes atteints constituent son expertise.
Objectifs
Certaines thérapies anti-cancéreuses ont des effets néfastes sur la fonction rénale, les fibres nerveuses et/ou le poids et la masse musculaire. De nombreuses stratégies thérapeutiques sont en cours d’étude pour limiter ces effets secondaires irréversibles. Pour pouvoir tester ces stratégies, il nous faut mettre en place des modèles animaux adaptés tels qu’un modèle de rats traités chroniquement avec un composé anti-cancéreux pour induire la neuropathie (atteinte nerveuse), la néphropathie (atteinte rénale) et la cachexie (atteinte musculaire) associé aux traitements anti-cancéreux.
Bénéfices attendus
En proposant un modèle de rat d’étude préclinique de neuropathie, de néphropathie, de cachexie associées à l’utilisation d’anti-cancéreux, nous ouvrons notre catalogue à un nouveau modèle d’étude préclinique dont les organes atteints constituent notre expertise et nous permettra l’étude de nouvelles molécules. Également par la mise en place de ce modèle, nous permettrons d’éclaircir les mécanismes mis en place pour le développement de ces atteintes et nous permettrons ainsi un gain de connaissance.
Procédures
Les rats recevront des administrations de divers composés (anticancéreux et composés à tester), les administrations se font sur animal vigile (environ 30 secondes) ou sur animal anesthésié (environ 2 minutes). La composition corporelle est réalisée sur animal vigile et dure environ deux minutes et est indolore et peu stressante. La sensibilité mécanique est réalisée sur animal vigile et dure environ 30 minutes où l'animal est dans une petite cage et un stimulus mécanique est appliqué maximum 5 fois 10 secondes à intervalle de 5 minutes. La force musculaire est réalisée sur animal vigile, cette mesure dure envrion 5 minutes (3 mesures de quelques secondes espacées de 30 secondes). Pour mesurer le débit de filtration du rein, l'animal est anesthésié pendant 5 minutes pour placer le moniteur sur dos et injecter le composé fluorescent puis il est réveillé et maintenu en cage individuelle pendant 2h de mesure. Le moniteur est ensuite retiré et l'animal est remis dans sa cage d'origine. Toutes ces mesures seront réalisées 2 fois durant la période de traitement. En fin de période de traitement, nous récolterons l'urine sur une durée de 20h, l'animal sera donc mis en cage individuelle à métabolisme. Des prélèvements de sang auront lieu jusqu'à 2 fois par semaine (soit 8 prélèvements maximum) , sur animal anesthésié (2 minutes) ou vigile (30 secondes).
Impact sur les animaux
1 – l’intoxication avec l'anticancéreux : les animaux vont être atteints d’effets secondaires altérant leur bien-être tels qu’une perte de poids notamment musculaire importante, une perte d’appétit, une neuropathie se traduisant par une hypersensibilité au stimuli mécanique, une atteinte rénale altérant leur production d’urine et leur prise hydrique 2 - Les mesures réalisées : L’analyse de la sensibilité mécanique au niveau de la voûte plantaire et la mesure de la force musculaire peut induire un inconfort ou possiblement une douleur. La mesure de débit de filtration du rein nécessitant une anesthésie entraine des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal. La mesure de la composition corporelle consiste à restreindre l’animal pendant quelques minutes dans un tube à contention limitant ses mouvements 3 – Les traitements réalisés à répétition génèrent un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé : apathie, prostration, agressivité, etc.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever et analyser les organes cibles.
Remplacement
Les effets secondaires à l’utilisation d’anticancéreux touchent de nombreux organes (neurones, reins, muscles). Nous pouvons reproduire certains effets in vitro en mettant en culture des neurones et en les mettant en contact avec l'anticancéreux. Les atteintes au niveau du rein peuvent être étudiées à partir de culture de cellules rénales in vitro mais le modèle est discutable car il ne mime par réellement l’organisation cellulaire du rein. Ces deux possibilités sont actuellement étudiées mais ne répondront pas totalement au besoin puisque les effets secondaires des anticancéreux sont multiorganiques et nécessitent l’utilisation d’un animal vivant dans son entier.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation des effets secondaires aux anticancéreux ou leurs résolutions, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude.
Raffinement
Une double litière sera déposée en fond de cage en cas de polyurie pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. Dès la première injection de l'anticancéreux, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids 3 fois semaines) par les zootechniciens et la SBEA (Structure du Bien Etre Animal). Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une diarrhée, ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites fixés, ce dernier sera mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est envisagée sur 2 à 3 jours maximum au-delà, l’animal sera mis à mort. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante pendant maximum 2-3 jours. Les prélèvements de sang effectué en cours et en fin d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques et avec une couverture anesthésique et analgésique adaptée. Une phase d'habituation sera réalisée pour la mise en cage a métabolisme et la mesure de sensibilité mécanique (sans stimulation) pour limiter le stress de l'animal. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’utilisation de cage métabolique se fait la veille de la mise à mort. Pour limiter le stress, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les rats peuvent voir leur congénère à proximité. Mais pour laisser la possibilité au rat de se cacher, un papier occultant à moitié la vue sera positionné sur les cages. Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés.
Choix des espèces
Le rat est une espèce répondant correctement à l'anticancéreux. Les rats seront commandés à l’âge adulte.
Optimisation des formulations d’appâts et essais d’homologation
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1000
Autres rongeurs : 1000
1 000 souris, 1 000 rats et 1 000 autres rongeurs ingèrent des appâts rodenticides jusqu'à la mort, dans des procédures dont 400 par espèce relèvent d'un niveau de souffrance sévère. L'objet est réglementaire, produire les données d'efficacité exigées pour homologuer des appâts commerciaux, avec un seuil de 90 % de mortalité. Le porteur qualifie pourtant ces essais d'"aucune intervention", tout en écrivant que l'effet toxique doit rester asymptomatique pendant l'exposition puis tuer rapidement dès les premiers signes cliniques, pour éviter l'aversion conditionnée. Les survivants exposés aux appâts actifs sont tués, ceux nourris au placebo pouvant être réutilisés ou relâchés dans leurs enclos extérieurs.
Objectifs
Le présent projet a pour objectif d’évaluer, dans des conditions expérimentales contrôlées, l’efficacité, la palatabilité et la sécurité environnementale de différents appâts rodenticides, en vue d’optimiser leur formulation et d’améliorer la performance des substances actives incorporées. L’enjeu principal est de concevoir des appâts capables de maximiser l’ingestion par les rongeurs cibles tout en minimisant les risques de contamination secondaire et d’impact sur les organismes non ciblés. Les travaux porteront sur la sélection et la caractérisation de matrices porteuses (grains, pâtes, blocs, gels, mousses, etc.) présentant une appétence élevée et une attractivité suffisante pour surmonter la néophobie naturelle des rongeurs. Ces formulations viseront à assurer une consommation rapide et complète, sans rejet ni dispersion de la matière active dans l’environnement (matières fécales, eau ou sol). Une attention particulière sera portée à la cinétique d’action : l’effet toxique devra demeurer différé et asymptomatique durant la phase d’exposition, afin d’éviter tout phénomène d’aversion conditionnée, mais induire une mortalité rapide dès l’apparition des premiers signes cliniques. Les appâts seront conçus pour offrir une stabilité physico-chimique élevée et une résistance accrue aux conditions environnementales extrêmes (humidité, chaleur, gel), garantissant une efficacité constante sur une période minimale de deux ans. Les données obtenues contribueront à démontrer l’efficacité de ces appâts sur les principales espèces cibles (Rattus norvegicus, Rattus rattus, Mus musculus), conformément aux exigences du guide de l’ECHA “Guidance on the Biocidal Products Regulation – Volume II: Efficacy – Assessment and Evaluation”, et à constituer les dossiers techniques nécessaires à leur homologation. Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche intégrée visant le développement de rodenticides de nouvelle génération, plus sélectifs, plus écocompatibles et répondant aux exigences actuelles de durabilité et de protection de l’environnement.
Bénéfices attendus
Chaque année, les rongeurs causent des pertes considérables dans les cultures céréalières, estimées à environ 10 % de la production mondiale, par consommation directe ou dégradation des récoltes liée à leurs excrétas. Au‑delà des pertes agricoles, les rongeurs représentent un réservoir de plus de 60 zoonoses, responsables de milliers de décès chaque année dans le monde. Le contrôle de leur prolifération constitue donc un enjeu majeur de santé publique. En Europe, ce contrôle repose actuellement sur des appâts contenant des molécules rodenticides. Cependant, les rongeurs étant des animaux néophobes, ces appâts doivent être hautement appétents, surtout lorsqu’ils sont utilisés dans des environnements où la concurrence alimentaire est forte. Avant leur mise sur le marché, ces appâts doivent être homologués par les autorités compétentes, et les dossiers d’homologation exigent des données d’efficacité en laboratoire sur les espèces ciblées. Le projet permettra de : -Produire les données expérimentales nécessaires pour l’homologation des appâts rodenticides, conformément aux exigences européennes. -Acquérir des connaissances essentielles sur la formulation des appâts, notamment la composition optimale permettant de contourner la néophobie des rongeurs et d’améliorer leur appétence. -Éviter la mise sur le marché d’appâts inefficaces ou peu appétents, garantissant des formulations véritablement opérationnelles sur le terrain. -Faciliter une lutte ciblée et efficace contre les rongeurs commensaux, réduisant à la fois les dégâts aux infrastructures et les risques sanitaires pour les populations humaines et animales. -Soutenir des stratégies de lutte plus responsables, en offrant aux acteurs industriels et aux collectivités des outils fiables et sécurisés pour la gestion des populations de rongeurs.
Procédures
aucune intervention
Impact sur les animaux
Les manipulations par l'experimentateur peut induire un stress. La capture en terrarium peut induire un stress. L'isolement peut induire un stress
Devenir
les animaux exposés à des appâts rodenticides survivants au terme de la procédure seront euthanasiés Les animaux exposés à des appâts placebo ne contenant pas de substances actives pourront être réutilisés (tous) ou pourront être libérés dans leurs enclos extérieurs d'origine (rats noirs et rats bruns à phénotype sauvage)
Remplacement
Il n’est pas actuellement possible de substituer l’utilisation d’animaux pour évaluer l'efficacité et l'appétence d'appats rodenticides; les appâts avant commercialisation doivent être testés chez les espèces cibles pour démontrer qu'ils sont suffisamment appétents en raison de la néophobie des rongeurs et qu'ils sont suffisamment efficaces (>90% d'efficacité) afin d'éviter d'appliquer des produits biocides inutilement dans l'environneement. ces essais sont requis dans les dossiers d'homologation.
Réduction
le nombre d'animaux par essai a été réduit au minimum (5 mâles et 5 femelles). Des tests in vitro ont de plus été développés pour mesurer la capacité de substances anticoagulants (principales molécules actuellement utilisée comme substancee active rodenticide) à inhiber l'activité vitamine K époxyde réductase (activité cible des molécules abticoagulantes antivitamine k). Le nombre d’essais a été défini en concertation avec les partenaires industriels afin de garantir des résultats fiables tout en minimisant le recours aux animaux.
Raffinement
Les animaux sont soumis à des phases d’acclimatation adéquates afin de minimiser le stress lié à leur transfert en animalerie. Leur hébergement est conçu pour reproduire au mieux leur habitat naturel : les cages, placées dans la pénombre, comprennent des cachettes et du matériel permettant aux rongeurs de construire leur nid et d’adopter une activité normale. Même lorsqu’ils sont hébergés de manière isolée, les cages sont transparentes ou grillagées, permettant aux animaux de voir et de percevoir leurs congénères, réduisant ainsi l’isolement social. Les manipulations sont réalisées avec précaution par un personnel formé à l’élevage et à la manipulation d’animaux de faune sauvage. Des points limites ont été définis et, dès leur apparition, les animaux sont euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, le recours aux tests d’efficacité est réduit au strict minimum, privilégiant les tests d’appétence afin de limiter l’exposition des animaux aux substances actives.
Choix des espèces
LLe choix des espèces étudiées repose sur le fait qu’il s’agit des espèces cibles des appâts rodenticides. Les expérimentations doivent être réalisées sur les mêmes espèces que celles faisant l’objet du contrôle en conditions naturelles, afin de garantir la pertinence et la transposabilité des résultats. Cette approche permet de démontrer que les appâts présentent une appétence suffisante pour les espèces ciblées et qu’ils assurent une efficacité complète dans les conditions d’utilisation prévues. L’utilisation de ces espèces spécifiques est donc essentielle pour obtenir des données fiables et directement exploitables pour la mise sur le marché et l’homologation des appâts rodenticides. Par ailleurs, pour les appâts revendiqués comme efficaces chez le rat, leur efficacité doit être démontrée à la fois chez le rat brun et chez le rat noir en conditions de laboratoire, conformément aux exigences réglementaires. Les animaux doivent être utilisés à différents stades de développement. En effet les réponses en termes d’efficacité et de résidus peuvent varier en fonction du stade de développement, l’équipement métabolique évoluant en fonction de l’âge
Mécanismes moléculaires à la base de la leucémie aiguë lymphoblastique B chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris qui n'ont ni le génotype ni le sexe voulus sont mises à mort, seules les femelles étant retenues pour l'étude. 914 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de l'étude. Le seul geste déclaré est un poinçonnage de l'oreille sans anesthésie, décrit comme une douleur aiguë d'environ deux secondes, mais les lignées développent des maladies qui les rendent vulnérables aux infections, avec perte de poids et altération progressive de l'état général. Les souris sont suivies jusqu'à douze mois pour détecter l'apparition de tumeurs, une souris porteuse de tumeur étant tuée le jour même ou le lendemain.
Objectifs
Les cellules B jouent un rôle crucial dans notre système immunitaire grâce notamment à leur capacité à produire des anticorps. Dans certains contextes encore mal compris, certaines de ces cellules peuvent devenir cancéreuses. En général, la leucémie touche des cellules B aux stades précoces ou immatures de leur développement. Les mécanismes et les facteurs qui déclenchent le processus tumoral à des stades déterminés du développement des cellules B et favorisent l’expansion des rares cellules cancéreuses initiales, ou au contraire leur blocage, restent obscurs. Ceci est en grande partie dû à l’absence de modèles animaux appropriés qui miment la situation chez l’Humain. Notre projet est à visée biomédicale et a pour objectif de comprendre le mode d’action de 3 facteurs, connus ou suspectés de jouer un rôle important dans le développement des cellules B, et dans la survenue de la leucémie aiguë B, le cancer pédiatrique le plus fréquent. Ces 3 facteurs seront étudiés dans un modèle de souris.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif de comprendre le rôle de 3 facteurs dans la prolifération tumorale, ou au contraire dans son inhibition, au cours de la leucémie aiguë B. A court et moyen termes, la réalisation du projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes en jeu lors de la prolifération tumorale. Mais au-delà de cet aspect fondamental, le projet a des implications pour la santé humaine dans la mesure où la leucémie B reste un problème de santé majeur, en particulier en raison des problèmes récurrents de rémission observés chez les patients, pour qui les conséquences sont souvent fatales.Cette étude devrait donc apporter une meilleure compréhension des mécanismes de l’apparition de la leucémlie et d’autres cancers touchant les cellules B en général. A plus long terme, les résultats obtenus devraient ouvrir la voie à des approches thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à un seul geste technique consistant en l’identification par poinçonnage de l’oreille, une seule fois, sans anesthésie, avec une douleur aiguë très brève d’environ 2 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances pouvant être causées sont : stress des contentions, d’une durée d’environ 30 secondes, la douleur aiguë mais de très courte durée, ressentie lors du poinçonnage de l’oreille d’environ 2 secondes, et le développement de maladie augmentant leur vulnérabilité aux infections et pouvant entraîner le développement de tumeur.Le développement de ces maladies peut entraîner une gêne progressive c’est-à-dire une altération progressive de l’état général, se traduisant par une diminution de l’activité, une perte de poids et des modifications de la posture ou du comportement alimentaire. En cas d’apparition d’une tumeur, la souris sera mise à mort le jour même ou au plus tard le lendemain de l’observation de la tumeur.
Devenir
Le projet consiste en l’élevage des souris avec le bon génotype en vue de produire le nombre de souris requis pour l’expérimentation. Les souris excédentaires, c’est à dire ne présentant ni le bon genotype ni le bon sexe (puisque seules les souris femelles sont retenues pour l’étude) de cet élevage seront mises à mort. A la fin de l’étude, toutes les souris vivantes seront mises à mort.
Remplacement
Le projet porte sur l’étude du développement et du fonctionnement des cellules B dans des conditions normales et pathologiques. La souris est utilisée comme modèle, car sa génétique est bien connue et elle permet d’étudier ces cellules de manière fiable dans leur environnement naturel. Certaines analyses sont réalisées préalablement ou en complément sur des cellules isolées à partir des tumeurs ou d’organes comme la rate, la moelle osseuse ou le thymus. Ces approches permettent d’optimiser les expériences réalisées sur les souris et de réduire le nombre d’animaux utilisés à chaque fois que c’est possible.
Réduction
Pour les lignées contrôles, un accouplement par lignée suffisent pour obtenir un nombre d’animaux adapté aux expérimentations. Pour les lignées à analyser, la réduction est en grande partie assurée par l’optimisation des croisements qui permettent de générer directement les animaux d’intérêt, sans nécessité de génotypage. Enfin, pour les lignées ne développant pas de tumeurs, le nombre d’animaux utilisés a été réduit d’un facteur quatre, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour les comparaisons inter-lignées.
Raffinement
Aucune apparition de tumeur n’est attendue avant l’âge de 3 mois. Jusqu’à cet âge, les animaux feront l’objet d’une observation quotidienne approfondie à l’aide d’une grille de scoring spécifique, permettant de détecter précocement tout signe de souffrance. À partir de 3 mois, un suivi individuel sera assuré pour détecter l’apparition de masses tumorales et tout signe d’altération de l’état général, avec intervention immédiate selon des critères prédéfinis. Pour les animaux maintenus jusqu’à l’âge de 12 mois, l’enrichissement standard des cages sera maintenu, et une vigilance particulière sera toutefois portée au bien-être des animaux âgés, notamment en ce qui concerne leur locomotion, leur accès à la nourriture et à l’eau, ainsi que leur comportement général. Si nécessaire, des mesures adaptées pourront être mises en place, telles que l’ajout de nourriture appétente et facilement accessible afin de prévenir toute altération de l’état général. Enfin, des mesures spécifiques de surveillance renforcée et d’intervention rapide seront appliquées pour les lignées présentant un phénotype dommageable ou une immunodéficience, afin de minimiser la souffrance et d’optimiser le bien-être animal.
Choix des espèces
La souris a été choisie car c’est un modèle de recherche bien connu, dont la génétique et le système immunitaire sont proches de ceux de l’être humain. De nombreuses lignées modifiées sont disponibles, permettant d’étudier précisément les mécanismes liés aux cancers et aux déficiences immunitaires. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés entre six et huit semaines, âge correspondant à la maturité sexuelle. Pour la phase d’observation expérimentale, les souris seront suivies jusqu’à douze mois afin de détecter une éventuelle apparition de tumeurs.
Impact du traitement combiné des agonistes du GLP-1R et de l’électrostimulation des voies nerveuses sympathiques chez la souris rendue obèse par un régime riche en graisses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Rendues obèses par un régime riche en graisses, 340 souris subissent l'implantation d'une électrode reliée à un stimulateur, puis une électrostimulation des nerfs sympathiques dont la connexion aux générateurs externes entrave leurs mouvements. Toutes les procédures sont classées en niveau de souffrance sévère et toutes les souris seront tuées pour des analyses anatomopathologiques. Elles reçoivent en parallèle, tous les trois jours pendant 41 ou 70 jours, des médicaments amaigrissants utilisés chez l'être humain, avec dix jours d'isolement en cage individuelle. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico validée ne peut remplacer l'animal ici, et rappelle qu'un modèle murin est de toute façon exigé par les autorités qui autorisent la mise sur le marché des dispositifs médicaux.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est d’évaluer les effets d’une stimulation électrique, seule ou combinée à un traitement avec des médicaments, sur la réduction de la masse corporelle. Les traitements - récents de l’obésité ont été profondément transformés par l’introduction des médicaments qui permettent une réduction moyenne d’environ 18 % du poids corporel après deux ans de traitement. Cependant, ces traitements présentent certaines limites : • la perte de poids observée reste inférieure à l’objectif de 30 % de perte de poids, • l’arrêt du traitement s’accompagne généralement d’une reprise de poids, • l’administration prolongée de ces molécules peut entraîner des effets indésirables. Dans ce contexte, l'électrostimulation des nerfs pourrait constituer une approche complémentaire ou associable au traitement par les médicaments. Les travaux préliminaires réalisés dans notre laboratoire ont montré qu’une électrostimulation induit chez la souris obèse une réduction du poids et une amélioration de son métabolisme. L'objectif du projet est donc d'évaluer l'éfficacité des traitements actuels en association avec l'électrostimulation des nerfs suite à l'implantation d'une électrode connectée à un électrostimulateur.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de lutter de manière optimale contre l'obésité. Le traitement le plus efficace reste la chirurgie des voies digestives, qui est toutefois lourde, irréversible et entraîne de nombreux effets secondaires. Il est donc impératif de développer des traitements moins invasifs, plus efficaces et dépourvus d'effets secondaires pour lutter contre l'obésité. Nous proposons d'associer des traitements par des médicaments à l'électrostimulation des nerfs sympathiques. En cas de résultat positif, ce projet permettra de démontrer le concept selon lequel la stimulation du système nerveux sympathique, associée à des traitements par des médicaments à efficacité limitée, peut réduire la prise alimentaire et le poids des animaux obèses.
Procédures
Tous les animaux recevront des traitements utilisés chez l'homme pour réduire le poids tous les trois jours pendant 41 (procédure 1) ou 70 (procédure 2) jours. Ils subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 30 minutes ainsi qu'une injection de glucose. Un prélèvement sanguin terminal sera effectué sous anesthésie au moment de l’euthanasie.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures comportent une phase chirurgicale incluant les éléments suivants : • Injection d'analgésique préopératoire ; • Perte de poids et douleur durant les 2 à 3 premiers jours chez les animaux après l'intervention chirurgicale ; • Surveillance et manipulation des animaux durant les 4 jours de récupération post-chirurgicale (pesée, palpation) ; • Risques chirurgicaux inhérents à toute opération chirurgicale, tels que risques d'infection ou de rupture des fils de suture ; • Mobilité entravée par la connection aux générateurs externes pendant la période d'électrostimulation. Enfin, bien que les animaux soient en général hébergés avec leurs congénères, des périodes d'isolement (hébergement individuel) seront nécessaires lors du suivi métabolique dans des cages dédiées (10 jours en tout).
Devenir
Pour toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale pour des analyses anatomopathologiques et histologiques.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucune méthode in vitro ou in silico scientifiquement validée pouvant servir d'alternative à l'expérimentation animale pour aborder les questions soulevées par ce projet. L'étude de l'obésité ne peut en effet pas être adéquatement réalisée in vitro en raison de sa nature complexe. Elle requiert une approche in vivo prenant en compte l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L'utilisation d'une espèce aussi proche que possible de l'espèce humaine s'avère donc nécessaire, car la physiologie digestive est caractéristique de chaque groupe phylogénétique. L'utilisation d'animaux modèles de type insectes ou nématodes n'est pas réaliste pour de telles études. En revanche, le système digestif de la souris est proche de celui de l'homme, même s'il présente des spécificités dont nous devrons tenir compte. Par ailleurs, l'utilisation d'un modèle expérimental in vivo murin est essentielle en tant que prérequis pour la phase de développement préclinique, selon les autorités régulant la mise sur le marché de dispositifs médicaux.
Réduction
En nous basant sur les résultats obtenus précédemment dans notre laboratoire, nous avons déterminé le nombre d'animaux à l'aide d'une approche statistique reconnue. Notre stratégie expérimentale consiste en effet à comparer les pertes de poids des animaux traités ou non, et électrostimulés ou non. Un caclul statistique, nous a permis de déterminer le nombre d'animaux minimal nécessaire pour obtenir des résultats significatifs, en fonction des hypothèses avancées.
Raffinement
• Les chirurgies seront menées par du personnel formé à ce type d'intervention. Les animaux seront sous anesthésie et analgésie afin de prévenir toute souffrance. Nous utilisons du gel ophtalmique pendant l’anesthésie. Nous maintiendrons de la température corporelle après la chirurgie en placant les animaux dans une enceinte thermostatée à 26°C. Durant les trois jours qui suivent la chirurgie nous leur mettons à diposition du gel nutritif et hydratant. Une surveillance sera assurée deux fois par jour durant les quatre jours suivant l'opération. Les soins postopératoires incluront notamment l'administration d'analgésique pendant trois jours, ainsi que l'administration d'un traitement anti-inflammatoire dans l'eau de boisson, maintenu pendant les deux jours suivants. Les impacts sur la prise de poids seront évalués sur un nombre strictement suffisant d'animaux afin d'analyser les effets de l'électrostimulation à long terme. Enfin, des critères limites ont été définis pour anticiper toute détérioration de l'état de santé général des animaux sous anesthésie ou conscients, et pour mettre en œuvre, si nécessaire, des protocoles de soins appropriés. En cas de détérioration de la santé d'un animal, une euthanasie sera effectuée immédiatement, sur décision du responsable de l'étude.
Choix des espèces
L’espèce murine sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant les effets des médicaments sur l'obésité et l'implication du système nerveux sympathique dans la prise alimentaire sur ce modèle.
Évaluation d’une approche thérapeutique combinée dans un modèle de tumeur cérébrale chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 016 rats vont être utilisés, chacun recevant l'implantation d'une tumeur cérébrale puis deux à cinq interventions sous anesthésie générale. Toutes les procédures sont classées en niveau de souffrance sévère et tous les rats seront tués pour prélever le cerveau. Le porteur indique que la tumeur provoque, à partir de trois semaines, des troubles du mouvement et une perte d'appétit liés à l'effet de masse en phase terminale, certains groupes étant suivis dans le temps pour établir des courbes de survie. Les bénéfices annoncés restent scientifiques et précliniques, une meilleure prise en charge des patients atteints de glioblastome étant renvoyée au moyen et au long terme.
Objectifs
Le gliome est le cancer du cerveau le plus fréquent et le plus grave chez l’adulte. Il se développe rapidement, s’étend dans le tissu cérébral voisin et reste très difficile à traiter. Chaque année, environ 3 personnes sur 100 000 sont diagnostiquées avec un glioblastome. Malgré les traitements actuels, l’évolution de la maladie est défavorable : la moitié des patients vivent environ 15 mois après le diagnostic, et moins de 5 % sont encore en vie cinq ans plus tard. La radiothérapie consiste à utiliser des rayons pour abîmer les cellules de la tumeur et freiner sa croissance, tout en préservant au maximum les tissus sains. Elle est un pilier essentiel des stratégies thérapeutiques, notamment pour les cancers localisés ou en complément d'autres traitements comme la chirurgie et la chimiothérapie. Un développement prometteur pour renforcer l'efficacité de la radiothérapie est l'utilisation de particules de très petite taille appelées nanoparticules : des nanoparticules remplies avec une drogue anticancéreuse qui peuvent s'ouvrir avec la radiothérapie permettant de libérer la drogue anticancéreuse localement dans la tumeur. L'intégration des nanoparticules dans les traitements de radiothérapie pourrait ainsi représenter une avancée majeure dans l'optimisation des soins du cancer, permettant d’améliorer la précision des traitements, et de réduire les effets secondaires. L’objectif de ce projet est de tester si l’utilisation de ce type de nanoparticules, chargées en drogue anticancéreuse, améliore la radiothérapie. Cette étude utilisera des rats porteurs de gliomes et testera l’hypothèse selon laquelle des nanoparticules peuvent augmenter la réponse à l’irradiation et permettre une meilleure survie des animaux traités. Les résultats attendus pourraient fournir des preuves expérimentales robustes pour de futures stratégies thérapeutiques directement transposables chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le glioblastome reste aujourd’hui une maladie de très mauvais pronostic, malgré l’association des traitements standards incluant la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. L’un des principaux obstacles à l’efficacité de la radiothérapie est la capacité des cellules tumorales à réparer les dommages induits par l’irradiation, ce qui limite l’effet du traitement et favorise les récidives locales. Le bénéfice attendu de ce projet est avant tout scientifique et préclinique. Cette étude vise à améliorer la compréhension des effets biologiques de nanoparticules contenant un agent chimiothérapeutique administrées en association avec une irradiation, dans un modèle de glioblastome chez le rat. Elle permettra d’évaluer si cette approche combinée peut renforcer l’effet de la radiothérapie en limitant la capacité des cellules tumorales à se réparer après irradiation. À moyen terme, les résultats de ce projet pourraient contribuer à : 1/ identifier des stratégies thérapeutiques innovantes combinant l’utilisation de la radiothérapie et de nanoparticules qui augmentent son effet, 2/fournir des données expérimentales robustes pour optimiser les traitements combinés en soin du cancer , 3/réduire, à terme la résistance tumorale aux traitements actuels. À plus long terme, ces travaux pourraient servir de base au développement de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces et potentiellement mieux tolérées, susceptibles d’améliorer la prise en charge des patients atteints de glioblastome.
Procédures
Les animaux seront placés sous anesthésie générale pendant l’implantation des tumeurs et pendant les traitements. Ils recevront également des médicaments anti douleurs si nécessaire. Ils recevront un traitement de chimiothérapie et un traitement de radiothérapie ou la combinaison des deux traitements. Comme c’est le cas pour les humains, les animaux seront suivis par imagerie médicale. Le nombre d’interventions sera de 2 à 5 selon les groupes auxquels les animaux appartiennent. La durée des procédures varie de quelques minutes à 1h maximum.
Impact sur les animaux
L’imagerie sur animl vivant, la pose de cathéter dans la veine de la queue et la procédure de radiothérapie, qui seront réalisées sous anesthésie générale, présentent des contraintes légère pour les animaux. La chirurgie pour implanter les tumeurs cérébrales peut induire des douleurs, elle sera conduite sous anesthésie générale avec délivrance d’antalgiques. Le développement de la tumeur peut engendrer l’apparition de troubles neurologiques dus à l'effet de masse induit par la tumeur en phase terminale, c'est-à-dire à partir de 3 semaines après l'implantation de la tumeur (troubles du mouvement, perte d'appétit). Les autres effets indésirables attendus sont les douleurs induites des effets indésirables possibles des chimiothérapies (pertes d’appétit, toxicité rénale).
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort pour obtenir un prélèvement cérébral. Différentes analyses seront réalisées sur ces prélèvements. Certains groupes de rats seront suivis dans le temps pour évaluer l’efficacité des traitements.
Remplacement
Il n'existe pas à ce jour de méthodes alternatives (n'impliquant pas d'animaux vivants) qui permettent l'étude de l’efficacité thérapeutique en combinaison avec la radiothérapie. En effet, l’appréciation de l’efficacité d’une technique de thérapie anticancéreuse nécessite le passage par un organisme reflétant la complexité des interactions entre le tissu sain et le tissu tumoral, la présence d’une vascularisation tumorale, d’un système immunitaire et le microenvironnement tumoral. Les modèles de tumeurs les plus reproductibles et à croissance rapide ont été développés chez les rongeurs. L’un des outils permettant de mesurer l’efficacité thérapeutique, que nous utiliserons dans le cadre de cette étude, est le suivi de la régression ou progression tumorales dans le temps. Les agents de chimiothérapie qui seront testés ont déjà été utilisés dans le cadre d’études précliniques ou cliniques. L’étape d’expérimentation animale que nous proposons permettra de progresser dans la mise au point de ces nouvelles thérapies antitumorales et de procéder à leur évaluation pré-clinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour réaliser ce travail.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été dimensionné avec un logiciel dédié et sur la base de notre expérience, et prend en en compte la variabilité biologique inhérente aux modèles tumoraux. Il garantit une puissance statistique suffisante pour mettre en évidence des différences de faibles amplitudes entre les groupes traités avec les particules chargées avec une drogue anticancéreuse + radiothérapie et les groupes injectés avec la chimiothérapie de référence + radiothérapie. Afin de réduire le nombre de composés à évaluer, beaucoup d'essais ont déjà été réalisés sur des cellules en culture. Les chimiothérapies (ou nanoparticules) qui seront testées sur l’animal auront été préalablement testées et validées sur des cultures de cellules tumorales (2D et/ou 3D). Seuls les composés les plus performants seront testés chez l’animal. Dans la mesure du possible, les différentes particules seront testées en parallèle, afin de mutualiser les groupes contrôles et d'éviter de constituer des groupes contrôles redondants. Les expériences seront répétées en faisant varier les paramètres liés à l’agent thérapeutique (concentration en nanoparticules, taux de charge en chimiothérapie). Le nombre d’animaux par groupes contrôles sera alors réduit à 5. Approche statistique : La significativité des courbes de survie et celle des résultats obtenus pour l'analyse histologique seront testées. Pour les études IRM, les groupes seront comparés en utilisant des tests dédiés.
Raffinement
Des mesures de raffinement ont été adoptées afin de réduire la douleur, notamment en mettant en place des points limites. Les animaux arriveront à l’animalerie une semaine avant l’implantation tumorale pour acclimatation et seront hébergés en groupes. Nous utiliserons la procédure d’enrichissement définie par la SBEA et l’animalerie rongeur. Afin de réduire le stress et la douleur des procédures chirurgicales, de l’imagerie et de la radiothérapie, ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale, en utilisant pour chacune des étapes les analgésiques et anesthésiques les plus adaptés à chacune des situations L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés lors de l’examen clinique. Pendant la première phase de l’expérience (durant les 13 jours entre l’implantation des cellules tumorales et le premier examen IRM), l’examen clinique sera réalisé tous les 2 jours, car l’état général des animaux n’est pas affecté à ce stade. Après traitement, les animaux seront examinés 1 fois par jour pendant les 6 premières semaines, puis un jour sur 2 ou 3 en cas de bonne santé générale jusqu'à la fin de l’étude. Le suivi sera intensifié si un l’état de santé d’un animal se dégrade. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux sont mis à mort lorsque les points limites seront atteints. Toutes les mesures nécessaires seront prises pour réduire la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie adaptée, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué lors des séances d'IRM. L'administration d’antalgiques sera considérée pour soulager la douleur.
Choix des espèces
Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain. De plus, le cerveau du rat est suffisamment gros pour permettre d’obtenir des images IRM assez résolues et de réaliser des irradiations dans de bonnes conditions de préservation des tissus sains. Les modèles tumoraux les plus reproductibles et les plus rapides, conduisant à une utilisation optimisée, plus efficace et sur un plus petit nombre d’animaux, sont disponibles essentiellement chez la souris et le rat. Cela concerne en particulier la littérature abondante des irradiations comparables à nos expériences. Les lignées de cellules tumorales chez le rat que nous utiliserons sont bien adaptées pour étudier les effets de la radiothérapie sur le microenvironnement tumoral. L’ensemble des animaux sera utilisé à l'âge adulte (6 à 8 semaines pour le rat). Les protocoles sont optimisés pour des animaux de cet âge, ce qui permettra un transfert sans difficulté pour ces expérimentations.
Maintien de modèles souris de cancer pancréatique pour l’étude et la mise en place de lignées cellulaires et d’un archivage tissulaire visant à réduire l’utilisation d’animaux (2/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Biopsiées à l'oreille entre sept et dix jours pour être génotypées, les souris sont ensuite accouplées, puis surveillées jusqu'à ce que le quart d'entre elles développe des lésions cancéreuses du pancréas, avec douleurs abdominales, prostration et cachexie. 630 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 492 et modéré pour 138. Le porteur présente ce maintien de deux lignées comme un moyen de constituer une banque de tissus et des lignées cellulaires qui réduiront l'usage d'animaux non-humains, tout en le jugeant "indispensable". Les souris sont tuées à deux, cinq, huit et douze mois pour prélèvement, celles qui servent seulement à l'élevage à huit mois faute d'avoir pu être replacées.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer au diagnostic tardif qui dispose de peu de traitements thérapeutiques. Bien que des modèles alternatifs existent, certains travaux comme l’étude de nouveaux composés thérapeutiques validés in vitro ou la caractérisation de nouvelles mutations nécessite de maintenir et d’étudier des lignées de souris génétiquement modifiées qui récapitulent les étapes de la progression cancéreuse pancréatique. Notre projet s’appuie sur la nécessité de maintenir 2 modèles expérimentaux pour mettre en place une banque d’échantillons et plusieurs outils cellulaires qui permettront de mieux comprendre le rôle de nouveaux gènes dans les cancers pancréatiques tout en réduisant nos besoins d’utiliser inutilement des modèles animaux. Le projet sera réalisé au sein de 2 établissements où seront respectivement élevés et étudiés les animaux.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre la cancérogénèse pancréatique et d’établir des approches de remplacement (banques histologiques de tissus et lignées cellulaires) qui permettront de réduire l’utilisation d’animaux pour nos travaux biologiques et la caractérisation des lésions invalidées pour un nouveau gène dont l’implication est rapportée chez certains patients.
Procédures
Dans l’établissement 1, les animaux seront manipulés : - Lors du change, effectué une fois par semaine et dure 1 minute. - A leur mise en accouplement, une fois au début de la procédure, et dure 1 minute. - A l’identification des nouveau-nés, 1 à 2 fois par mois pendant 01 à 20 minutes en fonction du nombre de nouveau-nés. La biopsie tissulaire à l’oreille, réalisée sur animaux à 7-10 jours pour identification génétique sera réalisée une seule fois et durera quelques secondes. Dans l’établissement 2, les animaux seront manipulés : - Lors du change, effectué deux fois par mois et dure 1 minute. - Lors des pesées, effectuées deux fois par semaine et durent moins de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Un stress sera induit chez les animaux lors des manipulations nécessaires à leur mise en accouplement ou à l’identification des nouveau-nés. Les animaux âgés de 7 à 10 jours pourront ressentir une légère douleur lors de la biopsie tissulaire d’un bout d’oreille nécessaire à leur identification génétique. Le risque de saignement est très faible. Selon nos schémas d’accouplements optimisés, 25% des animaux développeront des lésions cancéreuses pancréatiques avec l’âge, ces lésions pourraient se caractériser par une gêne abdominale, des douleurs qui pourront se retranscrire par une prostration, une perte de poids associée à un affaiblissement musculaire (cachexie) ainsi qu’une absence de toilettage ou l’identification de signe de douleur par l’observation d’yeux clos ou mi-clos des animaux. Des signes cliniques liés à des lésions cancéreuses pancréatiques pourraient se développer chez certaines souris âgées de plus de 8 mois. Cet inconfort pourrait se caractériser par une perte de poids, une gêne ou des douleurs abdominales qui pourraient se retranscrire par une prostration, une perte d’appétit ou de comportement social.
Devenir
Toutes les souris génétiquement modifiées qui présentent le risque de développer un cancer pancréatique seront mis à mort pour collecter des échantillons qui permettront d’établir une banque d’échantillons et des lignées cellulaires. Les autres animaux expérimentaux ne développant pas de tumeurs seront également mis à mort et leur pancréas utilisé comme contrôle dans nos analyses. Les animaux servant à maintenir les élevages seront eux mis à mort à l’âge de 8 mois si leur replacement n’avait pu être mis en place au sein de l’établissement d’élevage.
Remplacement
La caractérisation et l’étude des mécanismes de progression tumorale pancréatique ne peuvent pas être totalement modélisées par des outils cellulaires. Il en est de même pour l’étude des conséquences d’une nouvelle mutation que nous souhaitons étudier dans ces cancers. Le maintien de modèles génétiques de souris permettant leur étude dans le contexte des mécanismes d’initiation et de progression tumorale est donc indispensable. Les objectifs de notre projet visent en partie à réduire la nécessité du recours aux animaux en permettant l’établissement d’une banque histologique d’échantillons collectés à différents stades de progression tumorale mais également de lignées cellulaires dérivées des tumeurs développées par les modèles murins générés.
Réduction
Notre procédure vise à établir des lignées cellulaires ainsi qu’une banque d’échantillons histologiques permettant d’étudier in vitro et ex vivo la progression tumorale de 2 modèles de souris de cancers pancréatiques. Ces outils devraient nous permettre de mieux comprendre les conséquences liées à l’invalidation d’une nouvelle mutation rapportée chez l’homme. Ils permettront également de réduire la nécessite de maintenir inutilement des expérimentations animales pour nos travaux de recherche. Nous avons réduit au maximum les élevages nécessaires à l’obtention des nombres d’animaux pour atteindre cet objectif, nous limiterons à 4 le nombre d’accouplements annuels nécessaires au maintien de nos modèles. Cette stratégie devrait limiter le besoin en une banque tissulaire utile à la mise en place de nos accouplements et la maintenance de 2 modèles précliniques différents. Par cette approche nous pourrons constituer une banque tissulaire pour les 2 sexes à quatre stades de progression cancéreuse qui ne devrait pas impliquer plus de 256 animaux. A ce nombre nous estimons que 5 animaux supplémentaires permettront l’établissement de 3 lignées cellulaires pour chaque modèle. Dès que possible nous tenterons au maximum de limiter la génération des animaux non nécessaires à nos travaux et nous n’hésiterons pas à archiver par congélation de paillettes de sperme les souches d’animaux non nécessaires à nos recherches.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi (coton pour le nid, tunnels ou maison en plastique) afin de créer un environnement familier et réconfortant. Les animaux seront habitués à être manipulés pour réduire leur stress tout au long de leur vie Un suivi sera réalisé afin d’identifier d’éventuels signes qui laisseraient envisager une souffrance ou une douleur. En cas de blessure locale, nous appliquerons un traitement désinfectant. Pour le suivi des animaux, nous mettrons en place une surveillance rigoureuse et individuelle pour chaque individu afin d’assurer que les animaux développant des tumeurs pancréatiques ne subissent pas de souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance au travers d’une grille d’évaluation détaillée. Cette évaluation de multiples critères et de points limites adaptés nous conduira à ne pas maintenir des animaux ayant atteint un score de souffrance non acceptable. Nous optimiserons au maximum la quantité d’information biologique à collecter et étudier sur chaque souris.
Choix des espèces
Les souris que nous utilisons sont porteuses de mutations rapportées chez l’homme. Elles permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale du cancer du pancréas et d’étudier sa progression. Des animaux des 2 sexes seront étudiés car les cancers pancréatiques se développent aussi bien chez l’homme que la femme. Les animaux en reproduction ont entre 2 et 8 mois et les animaux utilisés à des fins de prélèvements seront mis à mort à 2, 5, 8 et 12 mois.
Immunisation de souris en vue du développement d’anticorps monoclonaux
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à cinq injections dans l'abdomen, parfois une injection dans la veine située derrière le globe oculaire, et jusqu'à cinq prélèvements de sang à la veine de la mandibule. Le porteur indique que les injections derrière l'œil peuvent produire des effets indésirables sur cet organe, que les prélèvements exposent à la déshydratation et aux hématomes, et que le déclenchement de la réaction immunitaire altère l'état général des animaux. Elles sont tuées pour prélever la rate et en extraire les cellules productrices d'anticorps, une étape que le porteur juge "indispensable" faute de modèle informatique reproduisant une réponse immunitaire.
Objectifs
Depuis les années 1980, les anticorps ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après injection d'un élèment déchenchant une réaction immunitaire (c'est-à-dire une réaction de défense de l'organisme), l’objectif est de récupérer les cellules productrices d’anticorps (spécifiques de cet élèment) pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt. Ces dernières seront amplifiées à très petite échelle en plaques de culture. Les cellules seront ensuite éclatées pour développer les anticorps. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif.
Bénéfices attendus
Les anticorps et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique chez l'animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules productrices d’anticorps pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections et des prélèvements de sang. En effet, la réaction immunitaire sera réalisée par une injection dans l'abdomen puis par une autre injection dans l'abdomen (durée: 1 minute par injection) ou dans une veine localisée derrière le globe oculaire (durée: 5min). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris. Des prélèvements de sang (5 au maximum) pourront être réalisés à la veine de la mandibule afin de suivre le niveau de production d'anticorps des souris (durée: 2 min).
Impact sur les animaux
Les souris subiront des injections répétées dans l'abdomen (maximum 4 +1 avec une stimulation forte selon le protocole) ou une injection par voie intraveineuse. Ces administrations peuvent entraîner du stress chez l’animal lié à la contention, des douleurs, inflammations ou risques d'infections aux sites d'injection. Les injections réalisées dans la veine derrière le globe occulaire, peuvent produire des effets indésirables sur l’œil. Elles nécessitent une anesthésie par voie gazeuse des animaux pouvant générer une irritation des voies respiratoires. Les prélèvements de sang peuvent entraîner des risques de déshydratation ou de chute du volume sanguin et des hématomes aux sites de prélèvements. Le déclenchement d'une réaction immunitaire entraîne une altération de l'état général des animaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de prélever les organes pour extraire les anticorps.
Remplacement
L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules produisant les anticorps.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été fixé à N = 10 animaux maximum par série expérimentale. Cela constitut le nombre maximal pour générer des anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant sur les données de la littérature de la cible d’intérêt afin d’évaluer la difficulté à obtenir les anticorps. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, des prélèvements sanguins répétés seront effectués sur les mêmes individus au cours du temps, permettant de suivre précisément l’évolution de la réponse immunitaire sans avoir recours à différents animaux pour chaque point temporel. De plus, dès que le nombre d’individus présentant une réponse supérieure au seuil minimal requis pour les analyses statistiques sera atteint, la série expérimentale pourra être arrêtée avant d’atteindre les 10 individus initialement prévus.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation clinique. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les injections au niveau du sinus retro-orbitaire sont réalisées après anesthésie gazeuse de l'animal et analgésie locale de l’œil.
Choix des espèces
L’utilisation d’animaux pour créer et produire des anticorps reste nécessaire car aucun modèle bio-informatique ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d'un organisme étranger. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes de stimulation de système immunitaire. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite.
Axe intestin-cerveau : rôle des cellules gliales dans le dimorphisme sexuel des comorbidités de l’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
864 souris subissent une neurochirurgie de 45 minutes et 288 une chirurgie viscérale, sous anesthésie et analgésie. Au total 1 792 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever le cerveau ou d'autres tissus. Cinq cent douze d'entre elles passent quatre semaines seules en cage pour un conditionnement opérant, 544 subissent un jeûne de 24 heures, et le régime gras est censé faire grimper leur poids jusqu'à 200 % du poids initial sur vingt semaines. Le porteur annonce des tests comportementaux sur 656 souris, d'une durée de dix à cent vingt minutes, sans préciser lesquels.
Objectifs
L’obésité est problème majeur de santé publique. Cette maladie chronique touche presque 18% de la population française (quasiment la moitié des français.es si l’on compte aussi les personnes en surpoids). Elle s’accompagne de nombreuses comorbidités, notamment le diabète et les symptômes anxieux et dépressifs. On sait aussi que les bactéries de l'intestin (le microbiote) est déréglé dans l'obésité. Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour limiter les comorbidités associées à l’obésité, il est nécessaire de mieux comprendre comment le cerveau contrôle le poids corporel et les émotions, et comment l'intestin communique avec le cerveau. Nous voulons tester l'hypothèse selon laquelle certaines cellules du cerveau, appelées cellules gliales, sont sensibles à des molécules produites par le microbiote intestinal. Nous pensons que les animaux mâles et femelles ne répondront pas de la même façon à ces molécules.
Bénéfices attendus
Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre la communication entre l’intestin et le cerveau, notamment le rôle de certaines cellules gliales dans les dérèglements métaboliques et cognitifs en réponse à un régime riche en calories. Ce projet a une véritable portée translationnelle dans la mesure où s’ils supportent notre hypothèse, l’utilisation de ces molécules produites par le microbiote (également retrouvés dans le sang humain) pourrait éventuellement être proposée pour traiter des personnes souffrant d’obésité avec présence de diabète ou de symptômes anxieux. De plus, si nos résultats diffèrent entre les deux sexes, cela permettra de cibler une population donnée, ce qui participe à la mise en place d’une médecine de précision.
Procédures
1) Analyse de la composition corporelle sur animaux vigiles : 5 min, entre 1 et 5 fois. Nombre d’animaux : 1492. 2) Chirurgie viscérale, sous anesthésie et antalgie, 20 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 288. 3) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 864. 4) Test de tolérance au glucose et à l’insuline sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min. Nombre d’animaux : 560. 5) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : 16 jours en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 144. 6) Mise à jeun, 24h, entre 1 et 2 fois, espacée d’une semaine. Nombre d’animaux : 544 (1 fois), 48 (2 fois). 7) Tests comportementaux. Durée : entre 10 et 120 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de minimum 1 jour. Nombre d’animaux : 656. 8) CONDITIONNEMENT OPERANT. DUREE : 4 SEMAINES en HEBERGEMENT INDIVIDUEL. NOMBRE D’ANIMAUX : 512.
Impact sur les animaux
1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la mesure des apports et des dépenses énergétiques individuels (calorimétrie indirecte) ou une tâche d’apprentissage avec accès individuel contrôlé aux mangeoires (conditionnement opérant) sont nécessaires. Durée maximum : 4 semaines. Légère perte de poids initiale (5 %) sur les deux premiers jours avant reprise de la croissance normale (basée sur nos observations antérieures). 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD (sur 20 semaines maximum). La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (4h ou 24h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau et soit le périoste, soit la paroi péritonéale devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins de 2h, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue). 7. Les complications chirurgicales (mauvaise cicatrisation, hémorragie) devraient rester bien en dessous du seuil de 20% du nombre total d’animaux (d’après nos études antérieures). 8. Stress induit par des prélèvements sanguins répétés (maximum 6 prélèvements consécutifs en 2h). 9. Stress métabolique suite à des variations importantes de la glycémie (hyper ou hypoglycémies pendant 2h maximum).
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.
Remplacement
Ce projet et notre hypothèse sont basés sur des résultats d’études cliniques chez l’Homme (variation de concentration sanguine des molécules du microbiote chez des populations obèses). Le but de ce projet est de comprendre le rôle de l’axe intestin-cerveau dans la mise en place des désordres métaboliques et cognitifs induits par l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (notamment l’intestin où réside le microbiote intestinal). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Les variables métaboliques (poids, composition corporelle, régulation de la glycémie) et le comportement intégré (anxiété) nécessite l’utilisation d’un modèle animal. En effet, des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés cités plus haut nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe pas encore de modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance statistique) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différents tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal décrites précisément dans les procédures. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec des mesures conservatoires prévues pour chaque critère.
Choix des espèces
LLes caractéristiques suivantes font de la souris un animal de choix pour notre projet de recherche. 1) sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain ce qui fait que les résultats obtenus chez la souris sont transposables à l’Homme 2) petite taille facilitant son hébergement 3) court cycle de reproduction permettant d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement 4) possibilité d’obtenir des animaux génétiquement modifiés 5) comportement alimentaire et émotionnel depuis longtemps étudiés chez la souris 6) bon nombre des tests comportements existants chez la souris donnent des résultats qui sont transposables à l’Homme Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), âge qui correspond à un stade où le crâne a fini sa croissance, ce qui permet l’utilisation d’une cartographie de référence du cerveau (atlas stéréotaxique) pour les neurochirurgies.
Suivi de la croissance tumorale par imagerie par bioluminescence
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Huit à douze injections du substrat luminescent et une imagerie quotidienne sous anesthésie pendant trois à quinze jours : 130 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour trente d'entre elles et modéré pour cent. Cent souris reçoivent les cellules tumorales dans la veine de la queue sans anesthésie, le porteur indiquant que cette voie est inaccessible sous anesthésie. La tumeur se disperse alors dans plusieurs organes, ce qui peut provoquer une souffrance. L'objet déclaré du projet est de définir la quantité de tumeur maximale à ne pas dépasser pour le confort de l'animal, un seuil qu'il s'agit d'établir en laissant les tumeurs croître.
Objectifs
Nous étudions des cellules du système immunitaire appelées cellules NK, dont le rôle est de détruire les cellules cancéreuses. Pour comprendre comment elles agissent, nous injectons des cellules tumorales à des souris et nous observons si les cellules NK arrivent à éliminer la tumeur. Quand on injecte les cellules tumorales sous la peau, elles forment une tumeur solide, facile à mesurer. Mais quand on les injecte dans le sang, elles se dispersent dans plusieurs organes et forment une tumeur diffuse, beaucoup plus difficile à suivre car elle n’a pas de forme visible. Pour mieux voir ces tumeurs diffuses, nous avons créé des cellules tumorales qui produisent de la lumière lorsqu'on les met en présence d'une molécule appelée substrat. Cette émission de lumière est appelée bioluminescence et peut-être mesurée par un appareil appelé bioimageur. Ainsi, on peut réaliser un suivi régulier de l’évolution de la tumeur par administration du substrat aux souris et mesure de la lumière émise sur l'animal entier dans le bioimageur. L’objectif de ce projet est donc de mesurer la vitesse de croissance de la tumeur et de définir la quantité de tumeur maximale à ne pas dépasser pour le confort de l'animal, grâce au bioimageur.
Bénéfices attendus
Nous ne disposons pas à l'heure actuelle d'outils de suivi de l'évolution des tumeurs diffuses étudiées dans notre équipe, ce qui est défavorable pour l’animal. Grâce à l’imagerie par bioluminescence, ce projet permettra de définir précisément la vitesse progression de ces tumeurs et d'identifier la quantité de tumeur maximale à ne pas dépasser, afin d’améliorer le bien-être des animaux. Elle permettra également de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour les suivis sur plusieurs jours, car elle évite d’avoir recours à la mise à mort pour réaliser des autopsies.
Procédures
Les animaux recevront : - une injection de cellules NK dans le sang, sous anesthésie gazeuse (30 secondes, 10 animaux) - une injection de cellules tumorale dans le sang (veine de la queue) sans anesthésie (1 minute, inaccessible avec anesthésie, 100 animaux). Entre 3 et 15 jours après l'injection des cellules tumorales, la croissance tumorale sera suivie quotidiennement. Pour cela, les souris recevront : une injection du substrat dans l'abdomen (15 secondes 8 à 12 injections) ou une injection sous la peau (15 secondes 8 à 12 injections) ou une injection via la circulation sanguine (15 secondes, 8 à 12 injections). La mesure de la lumière sera réalisée dans le bioimageur, sous anesthésie gazeuse (10 minutes), sur un plateau chauffé à 37°C.
Impact sur les animaux
Les injections sous la peau, dans le sang ou dans l'abdomen peuvent entrainer une douleur au niveau du point d'injection. La tumeur diffuse peut croitre dans divers organes, ce qui peut provoquer une souffrance pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
L'étude de la réponse du système immunitaire à une tumeur disséminée dans l'organisme est une phénomène complexe, impliquant des intéractions entre différents types cellulaires dans divers organes. Cette complexité ne peut pas être reproduite avec des cellules et ne peut être étudiée qu’à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été defini au minimum nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique des résultats (test ANOVA).
Raffinement
Les volumes d'injections ont été réduit au minimum pour faciliter le confort de l'animal. Les injections dans le sang (sauf via la veine de la queue) et sous la peau, sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Les injections dans le sang via la veine de la queue sont réalisées après application d'une crème anesthésiante. La mesure de la lumière emise dans le bioimageur est réalisée sous anesthésie gazeuse et sur un plateau chauffant. Les animaux sont suivis quotidiennement. Des points limites adaptés ont été définis (aspect général de l'animal, test d'aggripement, perte de poids).
Choix des espèces
Des souris mâles et femelles âgées de 7 à 12 semaines au démarrage de l'éxpérience seront utilisées. Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Par ailleurs, le système immunitaire de la souris est très similaire au système immunitaire humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour l’étude des mécanismes antitumoraux.