Oncologie

Irradiées en une dose unique, injectées jusqu'à quatre fois dans l'abdomen, piquées à la veine faciale jusqu'à dix fois au cours de leur vie, 2 838 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart. Une partie, dépourvue de système immunitaire fonctionnel, reçoit des cellules prélevées sur des patients atteints de leucémie, ce qui suppose une préparation entraînant jusqu'à 8 % de perte de poids. Le porteur décrit une anémie provoquée par les procédures, qu'il présente comme transitoire et réversible, et écrit dans la même rubrique qu'aucun signe de souffrance n'est attendu. Toutes sont tuées, la grande majorité pour prélever leurs organes.

Objectifs

Ce projet s'intéresse à l’érythropoïèse, processus essentiel conduisant à la production des globules rouges. Au cours des dernières années, notre compréhension de l’érythropoïèse ainsi que des processus par lesquels des cellules normales du sang deviennent cancéreuses (transformation leucémique) a beaucoup progressé. Cependant, de nombreux facteurs régulateurs et gènes, impliqués ou non dans l’apparition des cancers, restent à identifier et à caractériser fonctionnellement. Nous savons désormais que certaines maladies ne sont pas seulement liées à des anomalies dans les gènes eux-mêmes, mais aussi dans les petites séquences d’ADN qui contrôlent leur activité. Cela montre à quel point ces éléments régulateurs sont importants pour un fonctionnement physiologique normal. En étudiant le mécanisme de formation des globules rouges, nous cherchons à mieux comprendre comment certains éléments du génome influencent l’activation ou l’inactivation des gènes chez les mammifères. Nous voulons aussi identifier les perturbations qui peuvent conduire à des pathologies graves, comme certaines formes rares et agressives de leucémie (cancer du sang). L’anémie, qui se caractérise par un manque de globules rouges fonctionnels, est un problème de santé majeur à l’échelle du globe. Pourtant, malgré les avancées scientifiques, de nombreux aspects liés aux gènes (et à leur fonctionnement) du contrôle de la production des globules rouges restent encore mal connus. Avec des technologies de pointe, ce projet vise à : • Découvrir comment les gènes sont régulés dans les cellules du sang, • Identifier de nouveaux acteurs impliqués dans ce contrôle, • Comprendre comment ces mécanismes fonctionnent normalement et ce qui se passe lorsqu’ils sont altérés dans certaines maladies. En explorant ces aspects, nous espérons mieux comprendre les causes génétiques des leucémies érythroïdes (un type particulier, rare et agressif de cancer touchant les globules rouges), et ouvrir la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent la production des globules rouges, aussi bien dans des conditions normales que pathologiques. Il comprend également l’étude de certaines mutations génétiques pouvant entraîner un cancer rare du sang, appelé leucémie érythroïde, afin de mieux comprendre comment ce type de maladie se développe. À long terme, ces travaux pourraient ouvrir la voie à de nouvelles pistes de traitement pour traiter ces leucémies en ciblant plus précisément les anomalies génétiques responsables de la maladie

Procédures

Les interventions sur animal vigile prévues dans cette étude sont des injections intrapéritonéales, des prélèvements sanguins et une irradiation. Les injections intrapéritonéales seront limitées à un maximum de 4 par animal, soit 2 injections sur 2 jours consécutifs, soit 4 injections espacées de 48 heures chacune. Sur la base de notre expérience, ce geste est rapide et maîtrisé et ne dure pas plus de 20 secondes, après quoi l’animal est immédiatement replacé dans sa cage. Pour les prélèvements sanguins, ils sont effectués au maximum 10 fois au cours de la vie de l’animal. Notre pratique régulière de ce geste nous montre que la piqûre à la veine faciale est unique et rapide, et la collecte du sang ne nécessite que 20 secondes. Concernant l’irradiation, les animaux seront exposés à une dose unique. Tous les prélèvements d’organes seront réalisés après anesthésie et euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales peuvent provoquer un stress et une gêne temporaire chez les animaux. Notre pratique régulière de ces injections nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Les cages restent sous surveillance rapprochée au moins 20 minutes après toute injection pour détecter le plus rapidement possible les signes de souffrance éventuelle chez les animaux (prostration). L’anémie induite par les procédures constitue un autre effet indésirable. Toutefois, elle est transitoire et réversible : en moins d’une semaine, le taux de globules rouges revient à environ 80 % du niveau normal. Un suivi hebdomadaire des paramètres sanguins permet de s’assurer du caractère temporaire de cette anémie. Enfin, la préparation des animaux en vue de la greffe de cellules issues de patients peut entraîner une perte de poids transitoire, limitée à un maximum de 8 % du poids initial.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés, la grande majorité en vue de prélèvement d'organes.

Remplacement

Nous avons dans un premier temps effectué des expériences in vitro sur des lignées cellulaires de souris et humaines. Cependant, comme ces cellules ont été modifiées pour se multiplier indéfiniment en laboratoire, il est difficile de savoir si elles se comportent comme des cellules normales dans le corps, et surtout ces modèles ne permettent pas de prendre en compte le contexte tissulaire. Il n’existe pas d’alternative autre que l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour évaluer avec précision et pertinence physiologique le rôle des nouveaux gènes de notre étude. Nous utiliserons le modèle souris, permettant l’inactivation des gènes d’intérêt. Concernant l’étude de certaines formes de cancers du sang (leucémies aigües érythroïdes), compte tenu du nombre restreint de cellules d’intérêt, une amplification des cellules tumorales via une greffe chez la souris est nécessaire pour pouvoir effectuer les analyses détaillées des mécanismes de la maladie au niveau des gènes et des molécules.

Réduction

Nous avons réalisé une étude préalable pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaires dans chaque groupe, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux tout en obtenant des résultats fiables. Cette estimation repose sur des outils statistiques et sur nos expériences précédentes. Ainsi, nous avons montré qu’un nombre de 10 souris par groupe suffisent pour détecter des différences significatives entre les groupes, tout en tenant compte des variations possibles d’un animal ou d’une expérience à l’autre.

Raffinement

Les procédures expérimentales sont clairement définies et publiées. Toutes les manipulations susceptibles d’induire une gêne sont réalisées sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques appropriés, afin de prévenir toute douleur ou inconfort. Des critères stricts de surveillance sont mis en place pour garantir le bien-être des animaux. Aucun signe de souffrance n’est attendu. En cas d’anémie, bien que non douloureuse, un point limite est fixé : si le taux de globules rouges ne remonte pas à au moins 80 % de la valeur normale après une semaine, l’animal sera euthanasié à titre préventif pour éviter toute souffrance prolongée. Un suivi individuel est assuré tout au long de l’expérimentation. Les animaux immunodéprimés sont hébergés dans des conditions très strictes d’hygiène et de sécurité : matériel et eau stériles, manipulations en environnement protégé, afin de limiter les risques infectieux liés à leur fragilité.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des souris pour lesquelles le système de production de toutes les cellules du sang est très proche de celui de l’homme, et extrêmement bien connu. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire fonctionnel et complet ainsi que de plusieurs souches dérivées dont les animaux ont été génétiquement modifiés. Une souche dont le système immunitaire est non fonctionnel sera également utilisée pour permettre les greffes de cellules primaires humaines issues de patients chez la souris. A noter que cette dernière souche nécessite un hébergement confiné afin d’éviter tout risque d’infection ou de contamination. Nous utiliserons à la fois : - des animaux en cours de développement (avant la naissance) afin de comprendre le rôle des gènes étudiés pendant une étape clé de la fabrication des globules rouges, qui se déroule dans le foie du fœtus. - des animaux âgés de 2 ou 3 mois. Nous analyserons le tissu responsable de la formation de toutes les cellules du sang afin de comprendre comment certaines modifications génétiques influencent son bon fonctionnement.

Des sons à 110 décibels et des chocs électriques sur les pattes, des souriceaux isolés deux fois cinq minutes pour enregistrer leurs cris, des femelles gestantes soumises à un stress par contention trois fois 45 minutes pendant six jours : 3872 souris vont être utilisées, 2064 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1808 d'un niveau modéré. D'autres gestantes subissent une ouverture de l'abdomen sous anesthésie profonde de 45 minutes pour une électroporation in utero, suivie de trois jours d'injections analgésiques. Le porteur écrit qu'aucun phénotype dommageable n'a été observé ni décrit pour les génotypes concernés, et qualifie de modérées les réactions de freezing que ces tests provoquent. Sur les 3872 souris, 1680 sont tuées après avoir achevé leur "rôle de reproduction", les autres pour des analyses histologiques, épigénétiques, électrophysiologiques ou comportementales.

Objectifs

Notre étudions une molécule sécrétée dans le milieu extracellulaire qui contrôle des étapes cruciales du développement du cerveau. En effet, des altérations de niveaux de cette protéine d’intérêt sont observés dans de nombreuses pathologies psychiatriques dont l’autisme, la schizophrénie et la dépression mais aussi la lissencéphalie et l'épilepsie. Or plusieurs populations cellulaires sécrètent cette protéine lors d'étapes successives du développement du cerveau. L'objectif du projet est d’identifier les rôles respectifs de ces populations sources de notre potéine d'intérêt dans le développement du cerveau et l’étiologie des troubles du neuro-développement en combinant des approches moléculaires, histologiques, électrophysiologiques et comportementales.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ces travaux nous permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’étiologie des troubles du neurodéveloppement, pour envisager de nouvelles approches diagnostiques ou thérapeutiques.

Procédures

Tous les souriceaux de plus de 7 jours subiront un stress léger lié à la contention et au tatouage (1 min) ainsi qu’une douleur légère liée au prélèvement à la queue (10 sec) entre P7 et P10. Cette intervention n’aura lieu qu’une fois, sauf cas exceptionnel de prélèvement dégradé. Lot1: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec); Lot 2: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) en juvénile puis perfusion intracardiaque à P25 (2 injections de 10 sec); Lot 3 : Tatouage (1min), isolation pour vocalisations (2x5min) et prélèvement (10sec) en juvénile, puis OF (20 min), EPM (7 min), 3-chambers (30 min), NOR (30 min), tests d'inhibition du réflexe de sursaut (32 min) et de conditionnement par la peur (8min/jour x 4 jours). Lot 4a: perfusion intracardiaque à P4 ou P7 (2injX10 sec); Lot 4b: Eléctroporation in utero (1injX10sec, chirurgie sous anesthésie générale profonde 35min, suture 10min, 2 injX10secX3 jours), tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) puis perfusion intracardiaque (2injX10sec); Lot 5: stress prénatal (3X45minX6jrs). Modification : Les animaux du lot 3 subiront en plus un test d’hyperlocomotion induite par la d-amphétamine (1h30 dont 2 inj x 10 sec). Les animaux du lot Lot 5 subiront soit un stress prénatal par inflammation maternelle (1 x 10sec, ip), soit un stress prénatal dû aux injections d’antidépresseur fluoxetine ou de saline de la mère (1x 10 sec injection ip x 6jrs) soit un stress postnatal dû aux injections d’antidépresseur des nouveaux nés ( 1X 10 sec d’injection sous cutanéex 3jrs puis 1x 10sec d’injection ip x 3jrs) .

Impact sur les animaux

Les souriceaux subiront après la naissance une contention pour permettre un tatouage des coussinets des phalanges et un prélèvement à la queue qui peuvent entrainer un stress et une douleur légers. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer une souffrance si elle est mal prise en charge par le traitement analgésique. A noter que l'étape d’anesthésie en elle-même peut également provoquer un stress chez l’animal. Pour réaliser l’enregistrement des vocalisations, certains souriceaux devront être isolés pendant 2 fois 5min , ce qui est une source de stress. De même, les tests comportementaux successifs adultes sont une source de stress, notemment les tests d’inhibition du réflexe de sursaut ou de conditionnement par la peurqui imposent aux animaux de subir des sons à très hauts décibels (110db) et des chocs électriques sur les pattes, qui même si modérés, induisent une réaction de stress notable (posture de freezing). Pour l'étude des conséquences du stress prénatal sur l'épigénétique, certaines femelles gestantes subiront un stress répété par contention. Afin de marquer les astrocytes, certaines autres gestantes subiront une analgésie (voie sous-cutanée) et une anesthésie générale profonde (par voie respiratoire) de 45 minutes, suivies d’un acte chirurgical comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures, puis des injections sous cutanées d’analgésique d'une durée de deux minutes 2 fois par jours pendant 3 jours. Aucun phénotype dommageable n’a été observé ou décrit dans la littérature pour les génotypes décrits.Modification : Les animaux réalisant les tests comportementaux subiront un stress additionnel à la fin pour étudier leur hyperlocomotion induite par l’exposition à la d-amphétamine. Pour l'étude des conséquences du stress prénatal sur l'épigénétique certaines femelles subiront soit un stress prénatal de contention maternelle (3x45min x6jrs) ou un stress dû aux injections répétées d’antidépresseurs. De même, pour l’étude des conséquences du stress postnatal, les souriceaux subiront un stress lié aux injections répétées d’antidépresseurs.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le cadre de l'étude seront mis à mort, soit à des fins d'études histologiques (lot 2, 384 animaux; lot 4, 368 animaux), épigénétiques (lot 5, 224 animaux), électrophysiologiques (Lot 1b, 384 animaux) ou comportementales (lot 3, 384 animaux), soit après avoir achevé leur rôle de reproduction (lot 1a, 1680 animaux). Modification : le lot 5 comprend maintenant 675 animaux qui seront mis à mort à des fins d'études épigénétiques.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire in vitro la complexité du cortex en développement et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part, ce qui rend l’utilisation d’un modèle murin indispensable à la réalisation de ce projet. Notamment, les effets du stress périnatal impliquent des interactions précises, transitoires et adaptatives entre les hormones, les neurotransmetteurs et les neuro-modulateurs, mais aussi avec les systèmes inflammatoires, digestifs et sanguins qui sont encore mal connues et ne peuvent être reproduites in vitro.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous optimisons les croisements des lignées transgéniquespour obtenir un pourcentage maximal d’animaux d’intérêt et nous optimisons au maximum les échantillons obtenus en réalisant plusieurs séries de coupes par cerveau pour réaliser plusieurs marquages différents sur un même cerveau. Pour les études histologiques, un test de puissance G réalisé à partir de résultats antérieurs sur un autre modèle de souris nous préconise une taille de groupe de 6 individus par genre. Pour les études comportementales, nos résultats antérieurs préconisent une taille de groupe de 12 individus. Les analyses statistiques seront réalisés par un test adapté.

Raffinement

Des points limites strictes et spécifiques à chaque procédure sont appliqués. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton de nidification et bâtonnet de bois) et sont regroupés en groupes sociaux de 2 à 6 individus par cage. La mise à mort par perfusion de paraformaldéhyde est réalisée sous anesthésie générale profonde et après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine. La chirurgie d’électroporation in utero est réalisée sous anesthésie profonde préalable par l’isoflurane (4% pour l’induction et 2% pour le maintien de l’anesthésie) et sur une plaque chauffante (37°C), et ce après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine, la désinfection du site d’incision et l’ajout d’une gel ophtalmique pour la protection des yeux. Après l’opération, l’animal reçoit à 24 et 48h l’analgésique Meloxicame en sous-cutané.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées, grâce à la présence précoce des cellules sécrétant notre protéine d’intérêt à la surface du cortex. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés sont disponibles chez la souris. Le génotypage et les prélèvements seront réalisés sur les souriceaux entre 4 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges sans douleur. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Pour étudier les rôles des sous-populations cellulaires sources de Reln dans la formation des couches corticales nous allons étudier les stades embryonnaires E12.5, E14.5 et E16.5, puis les stades postnataux P0 et P25. En effet, les neurones corticaux sont générés entre E12.5 et E16.5, atteignent majoritairement leur position à P0 mais continuent à migrer et à se différencier dans les couches corticales jusqu’à P25. Les effets des quantités de Reln sur la prolifération et la maturation des astrocytes seront analysés aux stades post-nataux P4 et P7 (avant et après la phase de prolifération) et P25 (pour pouvoir visualiser une arborescence mature). Les effets du stress prénatal sur l’expression de Reln seront évalués à P0, quand les deux sources principales de Reln corticale sont simultanément présentes. Enfin les rôles spécifiques des sous-populations sur le comportement seront analysés à P6 pour les vocalisations néonatales (âge du pic de vocalisation induite par l’isolation) et à l’âge adulte (P60-P120) pour les autres tests comportementaux qui nécessitent une maturation achevée des circuits. Modification : Afin de différencier les effets du stress postnatal de ceux du stress prénatal, nous analyserons aussi des animaux à P8, quand les deux sources sont encore simultanément présentes.

Six sessions de deux heures, une prise de sang à l'extrémité de la queue toutes les quinze minutes, précédées d'un jeûne de 6 à 16 heures : 733 souris rendues obèses et diabétiques par leur alimentation vont être utilisées, 66 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 667 d'un niveau modéré. L'objectif déclaré est de savoir si un réseau de neurones hypothalamiques peut devenir une cible thérapeutique contre ce que le porteur nomme la "diabésité". Les souris passent aussi par un gavage et par un hébergement individuel en cage d'enregistrement métabolique, avant d'être tuées pour le prélèvement de leurs organes. Le porteur admet que cet isolement constitue une nuisance, qu'il dit minorer en raccourcissant le test et en tuant l'animal immédiatement après.

Objectifs

Depuis plus de vingt ans, il est clairement établi que des systèmes de régulation situés dans l’hypothalamus jouent un rôle central dans le contrôle de l’équilibre énergétique et glycémique de l’organisme. Un dysfonctionnement de l’un de ces systèmes pourrait ainsi contribuer au développement de maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type 2. Ces pathologies sont étroitement liées, donnant naissance au terme « diabésité ». Aujourd’hui elles touchent des centaines de millions de personnes dans le monde et constituent un enjeu majeur de santé publique. Ainsi, mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces maladies permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et de nouveaux traitements pour leur prévention et leur prise en charge. Néanmoins, notre connaissance des réseaux de neurones et systèmes moléculaires impliqués dans ces processus de régulation reste encore très limitée. Ce projet s’intéresse plus particulièrement à une population de neurones hypothalamiques impliqués dans la régulation de la balance énergétique et glucidique. Ces observations nous ont conduits à proposer le présent projet. Celui-ci vise à étudier chez des souris rendues obèses et diabétiques les altérations de ce réseau de neurones, ainsi que son fonctionnement. L’objectif est donc de déterminer si ce circuit neuronal peut représenter une cible thérapeutique pertinente pour améliorer le contrôle de la balance énergétique et glycémique dans un contexte d’obésité et de diabète de type 2.

Bénéfices attendus

De récentes études ont permis d’élucider le rôle et le fonctionnement d’une population neuronale dans la régulation de la balance énergétique et glucidique en condition physiologique. L’objectif de cette présente étude est donc d’étudier les potentielles altérations fonctionnelles et anatomiques de cette population de neurones en condition pathologique d’obésité/diabète. Ces recherches apparaissent cruciales non seulement pour la recherche fondamentale mais aussi dans la lutte contre la pandémie de « diabésité », afin de proposer des solutions innovantes dans la prévention, la prise en charge et le traitement de ces maladies.

Procédures

- Pour établir le profil glycémique des souris, leur glycémie sera suivie par un prélèvement sanguin à l’extrémité de la queue, pendant moins de 10 secondes toutes les 15 minutes, au cours de sessions expérimentales de deux heures. Chaque animal sera soumis à 6 expérimentations au maximum, chacune espacée d’une semaine de repos. Durant l'un de ces tests, les souris recevront une administration orale d'un composé avec l'aide d'une sonde de gavage : ce test s'ajoute aux autres tests de suivi de glycémie que les souris subiront. - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages d’enregistrement, permettant d'évaluer les paramètres métaboliques, avant d’être réunis avec leurs congénères préalablement connus.

Impact sur les animaux

Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chronique chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. - Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront une mise à jeun de 6 à 16 heures avant chaque test physiologique. Nuisances prévues : perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test. Une semaine de repos minimum leur sera donnée entre chaque expérimentation. - Toujours pour suivre la glycémie, les animaux subiront une incision à l’extrémité de la queue. Nuisance prévue : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique et potentielle infection prévenue par la désinfection systématique des plaies. Un test de suivi de glycémie supplémentaire sera ajouté, les nuisances prévues sont similaires aux autres tests. De plus, durant ce test, les souris recevront une administration orale d'un composé avec l'aide d'une sonde de gavage. Nuisance prévue : potentiel stress, diminué par habituation - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés dans des cages d’enregistrement permettant d'évaluer les paramètres métaboliques. Nuisance prévue : hébergement individuel inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible et une mise à mort qui suit immédiatement le test.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèver les organes.

Remplacement

Afin de mieux comprendre la physiopathologie de l’obésité/diabète, de caractériser les altérations neuroanatomiques ainsi que du fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques à 26RFa/orexines dans leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme, l’utilisation d’un modèle in vivo intégré est obligatoire. Il est nécessaire de pouvoir étudier la communication qu’il existe entre le système nerveux et les systèmes périphériques de l’organisme afin de comprendre l’influence du premier sur le second ; dans notre cas l’influence du réseau de neurones à 26RFa/orexines sur la régulation de la glycémie et du métabolisme énergétique (tel le comportement alimentaire ou l’activité physique). La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. Il n’existe alors à ce jour pas d’alternative non-animale.

Réduction

Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, une planification expérimentale a été réalisée en amont. De plus, pour chaque expérience, le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été estimé afin d’obtenir des résultats fiables tout en réduisant au mieux le nombre d’animaux utilisés. Anticiper ainsi les effectifs adaptés permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, de diminuer le risque de devoir répliquer une expérience avec de plus gros effectifs ainsi que le double emploi. Ces estimations ont été réalisées avec un site en ligne qui calcule le nombre d’animaux requis en fonctions de plusieurs paramètres : la force de l’effet attendu, la variabilité entre individus, et les paramètres statistiques souhaités.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Ils seront maintenus à un minimum de trois par cage pour éviter l’isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. La taille des cages est réglementaire. L’état général des animaux sera quotidiennement évalué et les signes de mal-être seront surveillés attentivement. L’établissement de points limites nous permettra de veiller au bon suivi des animaux et de leur apporter au besoin les soins adéquats. Si les points limites sont dépassés, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et l’animal sera en fonction des cas, écarté des expérimentations ou mis à mort.

Choix des espèces

Seul un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre d’étudier la physiopathologie de l’obésité/diabète. Nous pourrons ainsi explorer dans un contexte d’obésité/diabète, les altérations des réseaux de neurones hypothalamiques, des systèmes moléculaires d’intérêts, et de leurs répercussions sur leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. La souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.

Capturées à la pêche électrique, au carrelet ou à la nasse dans deux marais, 2 120 anguilles européennes sauvages vont être anesthésiées par balnéation puis relâchées à l'endroit exact de leur capture, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Deux mille reçoivent une puce électronique en trois minutes, et 120 subissent une incision d'un centimètre refermée par deux points de suture pour recevoir en plus une marque acoustique. L'espèce est classée en danger critique d'extinction, et le projet vise à mesurer combien d'individus parviennent à quitter les marais malgré les ouvrages hydrauliques, pour ajuster la pêche et la gestion des vannes. Le porteur écrit qu'aucun modèle numérique ne peut remplacer ce travail faute de données existantes, et se dit "très confiant" sur l'absence d'effets létaux au vu des marquages précédents.

Objectifs

Le projet s’intéresse à l’anguille européenne, une espèce de poisson migratrice classée en danger critique d’extinction par l’Union Internationale pour la Conservation de la Nature (UICN). Le projet a deux objectifs, le premier est de caractériser la population des anguilles européennes Anguilla anguilla, aux stades jaunes et argentées, de deux marais. Le second est d’évaluer la proportion d’anguilles argentées qui arrive à quitter les marais pour rejoindre leur site de reproduction avec identification des voies migratoires de l’espèce face aux nombreux ouvrages hydrauliques présents dans la zone.

Bénéfices attendus

L’anguille européenne étant une espèce en danger critique d’extinction, il est important de pouvoir réaliser une évaluation des populations dans différents milieux et de voir quelle proportion de cette population participe à la reproduction et donc au maintien de l’espèce. Les résultats de l’étude permettront d’adapter la gestion locale des anguilles européennes, soit par un meilleur contrôle de l’activité de pêche, soit par l’amélioration de l’utilisation des ouvrages hydrauliques se situant sur les voies de migration préférentielles de l’espèce. Dans les deux cas, l’objectif de gestion sera d’augmenter la proportion d’individus participant à la reproduction pour ainsi améliorer le statut de l’espèce.

Procédures

Ce projet comprend deux types de procédures pour répondre aux deux objectifs du projet. La première procédure, d’une durée totale de 3 minutes,comprend l’insertion unique d’une puce électronique de type « Passive integrated Transponder » (PIT), qui se fait sous anesthésie générale réalisée en balnéation, mais ne nécessitant pas de réaliser une incision ni une suture. Le marquage PIT nous permettra d’identifier les poissons qui seraient recapturé par les pêcheurs des marais étudiés et ainsi obtenir une estimation des taux de captures et de l’abondance de l’espèce dans ces environnements par la méthode de capture marquage recapture. L’objectif est de marquer 2000 individus > 20 cm sous cette procédure. La seconde procédure, d’une durée totale de 5 minutes,est une procédure chirurgicale avec insertion de deux marques : une marque acoustique et un PIT. Cette procédurenécessite une incision d’environ 1 cm et 2 points de suture. Les marques acoustiques émettent un signal ultrasonique régulièrement ce qui permet de suivre le déplacement des individus marqués dans un rayon compris entre 20 m et 500m selon les conditions locales de bruits et de turbidité, et ainsi estimer le taux d’échappement des anguilles argentées. L’objectif est de marquer 120 individus avec cette procédure. Les deux procédures se feront sous anesthésie générale par balnéation. Les deux marques sont encapsulées dans une coque moulée en résine epoxy inaltérable et biotolérée afin de n’avoir aucune incidence sur le bien-être du poisson pendant toute la durée de leur vie, ce qui dans le cas des anguilles argentées sera de 3 ou 4 ans après la date du marquage car les individus meurent après leur reproduction. Tous les individus seront mesurés et pesés avant marquage afin de de ne pas dépasser la charge des marques à 2% du poids du poisson et ainsi ne pas impacter sa capacité de nage.

Impact sur les animaux

Comme toutes expériences en écologie comportementale, le stress lors des captures doit être pris en compte. Pour cela, seuls des pêches électriques et carrelets et nasses seront utilisés pour la capture des anguilles. Ces engins sont des pièges et non des filets, et disposent d’un volume assez conséquent dans lequel les poissons sont piégés. De plus, ces pièges sont relevés quotidiennement afin de réduire le stress d’une captivité prolongée. Malgré les précautions prises, un problème lors de l’insertion chirurgicale est toujours à envisager. Mais l’expérience de l’équipe et la robustesse des anguilles européennes nous amène à être très confiants sur l’absence d’effets létaux ou délétères lors du marquage. Sur les marquages précédents, aucune mortalité à court terme (48h) n’a jamais été observée. De plus, des tests d’effet ont déjà été réalisés sur les anguilles et n’ont jamais montré aucune mortalité ni effet délétère. Le marquage chirurgical sera réalisé sous anesthésie générale et un analgésique local sera injecté par prévention de toute douleur. Après le marquage, l’individu est placé dans un bac de réveil pendant 1 heure au maximum.

Devenir

Tous les animaux marqués seront replacés dans leur milieu naturel, à l'endroit de leurs captures.

Remplacement

Les données sur la population des anguilles européennes Anguilla anguilla et leurs voies migratoires n’existent pas encore dans les marais étudiés. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle écologique par des modèles numériques et/ou physique et/ou de l’analyse de données existantes

Réduction

Le nombre d’individus marqués en PIT (N = 2000) est statistiquement suffisant pour estimer l’abondance de la population par capture marquage et recapture. Le nombre d’individus marqués en acoustique (N = 120) a été pensé de manière à minimiser fortement le nombre d’animaux utilisé. Nous prévoyons de marquer 60 individus en 2025 et 60 individus en 2026, ce qui correspond à la limite statistique pour ce suivi.

Raffinement

Plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors des captures et des marquages. La capture se fera avec les engins les plus adaptés pour limiter les blessures, ainsi que leur stress. Les engins de pêche seront relevés tous les jours afin de limiter le temps de captivité. La pose de marque télémétrique et PIT s’effectuera sous anesthésie générale en balnéation, avec entretien par flux continu et ajustement si nécessaire de manière à maintenir la stabilité de l’anesthésie tout au long de l’intervention. Avant incision, un analgésique sera injecté localement pour prévenir toute douleur pendant et après la procédure. Après marquage, les animaux seront placés en réveil dans un bac d’eau oxygénée jusqu’à dissipation totale des effets de l’anesthésiant et récupération complète avant relâche dans le milieu naturel à l’endroit de la capture. Les points limites seront atteints si une détresse post-opératoire est observé (altération du comportement de nage, réactions violentes, ou au contraire absence de reprise d’activité normale).

Choix des espèces

L’anguille européenne est une espèce animale en danger critique d’extinction. Toutes les mesures visant à améliorer le statut de l’espèce, comme l’augmentation du nombre de géniteurs présents sur le site unique de reproduction sont essentielles. L’étude portera sur plusieurs stades de vie des anguilles européennes : les stades anguilles jaunes et argentées. Nous souhaitons dans un premier temps déterminer l’abondance d’anguilles jaunes pour connaitre la capacité des marais étudiés à produire des anguilles argentées. Dans un second temps, l’étude se focalisera sur le stade anguilles argentées, afin d’étudier leurs possibilités de rejoindre le milieu marin pour leur reproduction, leurs voies migratoires. Le but de l’étude étant d’améliorer la gestion des ouvrages hydrauliques si cela s’avèrerai nécessaire.

894 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à quarante gavages, douze à vingt-quatre séances d'imagerie sous anesthésie et douze injections, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un virus déposé dans leur trachée active un gène qui déclenche un cancer du poumon, pendant qu'un régime riche en graisses et en sucres leur fait prendre du poids sur plusieurs mois. Le porteur indique que les grosses tumeurs peuvent bloquer les voies respiratoires et provoquer des complications sévères, et que la maladie mène parfois à la cachexie. Les bénéfices annoncés vont de nouvelles cibles thérapeutiques à des "arguments scientifiques solides" pour des politiques de santé publique, tous renvoyés au moyen et au long terme, quand les 894 souris sont toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs poumons, rate, pancréas, foie et ganglions.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment le syndrome métabolique, une maladie fréquente liée au surpoids et à une alimentation riche en graisses et en sucres, peut favoriser le développement du cancer du poumon et influencer la réponse aux traitements. Le syndrome métabolique associe souvent obésité abdominale, excès de graisses dans le sang, hypertension et résistance à l’insuline. Sa fréquence est en forte augmentation dans la population mondiale. De nombreuses études montrent que les personnes atteintes de syndrome métabolique ont un risque plus élevé de développer un cancer, en particulier lorsqu’elles présentent aussi une mutation du gène KRAS, très souvent retrouvée dans les cancers du poumon. Cependant, on ne connaît pas encore précisément les mécanismes par lesquels ce trouble métabolique induit la maladie ou l’aggrave. Pour répondre à ces questions, nous devons utiliser l’animal. La souris permet de reproduire fidèlement les effets du régime alimentaire occidental sur le métabolisme, l’immunité et le développement du cancer. Aucun autre modèle (culture cellulaire, informatique) ne peut à ce jour recréer l’ensemble des interactions entre organes et le système immunitaire. Nous analyserons les différentes étapes du développement tumoral et testerons des traitements déjà utilisés contre le diabète et l’obésité, afin de savoir s’ils peuvent aussi limiter la progression du cancer du poumon. À terme, ce projet vise à mieux prévenir les cancers liés au mode de vie et à améliorer la prise en charge précoce des patients les plus à risque, en réduisant l’impact négatif du syndrome métabolique.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment le syndrome métabolique, lié à une alimentation riche en graisses et en sucres, influence le système immunitaire et favorise l’apparition de lésions précancéreuses dans le poumon. Ces connaissances sont indispensables pour identifier les mécanismes par lesquels le surpoids et les troubles métaboliques augmentent le risque de cancer du poumon. À moyen terme, ce projet pourra conduire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les personnes à risque de développer un cancer du poumon du fait de leurs maladies concomittantes, en particulier lorsque ces dernières sont difficiles à corriger par des mesures de mode de vie seules. À plus long terme, grâce aux nouvelles connaissances générées, ce projet fournira des arguments scientifiques solides pour soutenir les politiques de santé publique visant à réduire l’impact du syndrome métabolique sur la santé. Les résultats pourront ainsi contribuer à la mise en place de stratégies de prévention plus efficaces et à une meilleure protection de la population face au risque accru de cancer.

Procédures

Prélèvements sanguins : réalisés sur souris éveillée par petite ponction à la queue, maximum deux fois pendant l’étude, anesthésie locale, durée 2 minutes. Administration dans la trachée : dépôt d’un petit volume de solution contenant un virus inoffensif servant à activer un gène, via un petit tube souple, sous anesthésie générale (n=1,durée 1 minute). • Imagerie médicale : réalisée sous anesthésie générale, durée 4 minutes, n=12-24. • Gavage oral : administration de traitements à l’aide d’un petit tube souple introduit dans la bouche, limité en fréquence pour réduire le stress, durée 1 minute,vigile, n maximum = 40. • Injections sous anesthésie locale, n max=12, durée 1 minute. Dans certains cas, pour récupération d'organes exploitables pour des analyses post-mortem, une chirurgie terminale de perfusion intracardiaque pourra être mise en oeuvre, durée 5 minutes, n=1.

Impact sur les animaux

Certaines interventions peuvent provoquer un inconfort temporaire : • Le régime riche en graisses et sucres entraîne une prise de poids, et peut entraîner une baisse d’activité et parfois des difficultés respiratoires modérées. • Les anesthésies peuvent causer une somnolence brève ou, rarement, des complications respiratoires. • L’administration dans la trachée peut provoquer un essoufflement transitoire. • Le scanner sous anesthésie peut provoquer une légère hypothermie, transitoire. • Le gavage oral et les injections peuvent causer un inconfort momentané au point d’entrée • Les traitements testés peuvent parfois entraîner une perte de poids modérée, de la diarrhée ou une baisse temporaire de l’appétit. • Le développement de lésions pulmonaires précancéreuses ou de petites tumeurs peut, dans certains cas, provoquer un essoufflement ou une fatigue. • Dans le cas de tumeurs pulmonaires de tailles plus importantes, les voies respiratoires peuvent se bloquer entrainant des complications plus sévères. • L’évolution de la maladie entraine parfois une cachexie (perte de la masse graisseuse et musculaire).

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés à la fin des procédures. pour prélèvement de tissus multiples (poumons, rate, pancréas, tissus adipeux, ganglions lymphatiques, foie) pour des études histologiques, immunologiques et moléculaires.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux vivants est indispensable dans ce projet en raison de la nature systémique du syndrome métabolique (MetS), qui affecte simultanément plusieurs organes et le système immunitaire. À ce jour, aucun modèle in silico ne permet de reproduire fidèlement les interactions complexes inter-organes, dont l'identification précise constitue justement l'un des objectifs majeurs de notre projet. Par ailleurs, les méthodes alternatives in vitro telles que les cultures cellulaires classiques, les organoïdes ou les organes sur puce sont insuffisantes pour étudier les effets systémiques globaux du MetS. Ces modèles in vitro ne peuvent pas reproduire intégralement l'environnement physiologique, les interactions intercellulaires et la réponse immunitaire globale observée chez un organisme entier. Ainsi, l'utilisation d'animaux vivants est incontournable pour appréhender pleinement les mécanismes complexes du MetS et leur impact sur la progression tumorale dans le contexte de ce projet.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour obtenir un résultat est calculé à partir de méthodes statistiques afin d’obtenir des résultats fiables avec le moins d’animaux possible. Ces estimations sont possibles grace aux connaissances du modèle utilisé par l'équipe. Les procédures sont conçues pour permettre plusieurs analyses sur un même animal, évitant ainsi de répéter inutilement les expériences.

Raffinement

L' état de santé des animaux sera évalué quotidiennement par l'équipe de recherche, et les points limites prédéfinis précoces seront appliqués strictement. Pour limiter les biais liés à l’activité physique ou à la prise de poids, tous les groupes auront libre accès à des jouets pour rongeurs. L'utilisation d’aiguilles fines pour les injections, ainsi que de sondes souples pour les gavages, permettra de limiter la douleur et l’inconfort. Toutes les procédures nécessitant une contention prolongée ou potentiellement douloureuses seront effectuées sous anesthésie générale ou locale, selon les cas. En cas de perte de poids liée à la charge tumorale, de signes de souffrance ou d'altération du comportement, des mesures de soutien seront immédiatement mises en place (nourriture appétente, gels de réhydratation). Enfin, toutes les méthodes utilisées dans ce projet sont validées et optimisées pour minimiser le stress, la douleur et l’impact global sur l’animal, conformément au principe de raffinement.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris car c’est l’espèce la plus adaptée pour ce type de recherche. Son organisme réagit de façon similaire à celui de l’être humain en ce qui concerne le métabolisme, le fonctionnement du système immunitaire et le développement du cancer du poumon. Des modèles bien établis existent déjà pour reproduire l’obésité, le diabète de type 2 et leurs effets sur l’immunité. Les animaux en procédure seront des adultes ayant un système immunitaire mature et une physiologie métabolique stable.