Oncologie

Un prélèvement de sang dans la joue tous les quinze jours sur animal éveillé, plus une ponction dans le fémur qui laisse l'animal boiter : 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les organes cibles. Elles reçoivent aussi un ou deux gavages pour déclencher, au moment voulu, l'extinction du gène étudié. Le projet cherche à comprendre le rôle d'une protéine de régulation de l'ARN dans le maintien et la différenciation des cellules souches du sang, sans annoncer d'application autre que la connaissance de ces mécanismes. Le porteur retient la souris pour ses similarités génétiques avec l'être humain et la facilité avec laquelle son génome se manipule, et indique que la transgénèse chez les mammifères a commencé chez elle.

Objectifs

Le système sanguin, composé des plaquettes, globules rouges, et globules blancs, a une capacité remarquable de régénération, et ce processus s’appelle l’hématopoïèse. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH), grâce à leur capacité d’autorenouvellement et de différenciation, ont un rôle majeur dans le maintien de l’hématopoïèse au cours de la vie. Ce projet de recherche vise à étudier le rôle d’une protéine qui permet la régulation de l’expression des gènes dans le maintien, la survie, la prolifération et la différenciation des CSH.

Bénéfices attendus

Comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la régénération du système hématopoïétique est un enjeu majeur. La régénération du système hématopoïétique et la maintenance des CSH sont des processus physiologiques essentiels qui sont perturbés dans différentes pathologies mais aussi lors du vieillissement (anémie, leucémies, immunodéficience)

Procédures

Tous les animaux subissent les mêmes interventions : Gavage : 1 à 2 fois sur animal vigile et dure moins d’une minute. Prélèvement intrafémoral : réalisé sous anesthésie et dure moins de 5 minutes. Prélèvements sanguins en submandibulaire réalisés tous les 15jours sur animaux vigiles – durée moins d’1minute

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un stress dû à la contention/préhension des animaux, 2/ une gêne transitoire lors du gavage 3/ un boitement transitoire lors des prélèvements intrafémoraux. 4/ une gêne transitoire lors des prélèvements submandibulaires.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté afin de prélever les organes cibles et ainsi réaliser les analyses phénotypiques, moléculaires et histologiques nécessaires à la conclusion de l'étude. La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques.

Remplacement

Des expériences in vitro ont permis de démontrer que la délétion de notre protéine d’intérêt avait un effet sur la prolifération et la différenciation des CSH. Cependant, la régulation du système hématopoïétique fait intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro de façon efficace. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal.

Réduction

Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d’animaux. Les lignées transgéniques utilisées comportent 1. des systèmes inductibles qui vont permettre à la fois d’induire l’expression des transgènes dans un tissu spécifique mais également à un temps donné et 2. des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules délétées pour notre gène d’intérêt et ainsi permettre de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Des études pilotes seront réalisées avec de petits groupes d’animaux pour définir les doses et durées de traitement efficaces. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour chaque expérience en utilisant un test de puissance et des tests statistiques seront utilisés post expérimentation pour évaluer la significativité de nos résultats.

Raffinement

Les lignées transgéniques utilisées comportent des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules modifiées et ainsi permettre de détecter l’apparition de changements dans le système hématopoïétique très précocement ce qui permettra d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide. Les animaux recevront des analgésiques et des anesthésiques en pré et/ou postopératoire. Les animaux recevront des soins adaptés (mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. C’est la raison pour laquelle l’ensemble des techniques de la transgénèse chez les mammifères a débuté chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines lorsqu’elles ont atteint leur maturité sexuelle pour étudier l'impact sur l'hématopoïèse à l'âge adulte.

Inoculées dans le bas-ventre avec une souche de toxoplasme puis vaccinées par deux injections intramusculaires dans les pattes arrière, 60 souris femelles sont toutes tuées à l'issue, l'infection par un agent pathogène interdisant tout autre devenir. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré pour la totalité des animaux. Le projet teste une immunothérapie à ARN visant les cellules qui hébergent les kystes du parasite, transposée des vaccins contre le Covid-19 et des traitements anticancéreux. Le porteur écrit pourtant que la souche choisie ne provoque ni symptôme clinique ni souffrance notable et que les seules nuisances attendues tiennent aux deux piqûres, ce qui laisse la souffrance modérée déclarée pour les 60 souris sans description.

Objectifs

Validation in vivo d'une immunothérapie à ARN contre les parasites persistants à l'intérieur des cellules. Ce projet propose une approche innovante pour traiter le parasite appelé toxoplasme en ciblant non pas directement le parasite dormant, mais les cellules qui l’hébergent sous forme de kyste. En s’inspirant des stratégies d’immunothérapie développées contre les rechutes du cancer et la vaccination contre le Covid-19, notre objectif est de stimuler une réponse capable de détruire de façon ciblé les cellules infectées par les kystes, via une thérapie à ARN. Nous testons une immunothérapie à ARN dans un modèle murin infecté par le toxoplasme. En ciblant des protéines capables d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques, nous espérons éliminer les cellules infectées par les kystes. Ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité, la sécurité et la réponse immunitaire de cette approche innovante.

Bénéfices attendus

L’approche que nous proposons, est une première étape de validation d’une nouvelle stratégie thérapeutique adapté à l’infection de la souris par le toxoplasme extrapolable à l'ensemble de ses hôtes mammifères . Cette méthodologie pourrait ensuite être étendue à d’autres infections parasitaire à formes dormantes.

Procédures

Les interventions qui peuvent causer des nuisances sont (1) l'inoculation dans le bas ventre de 100 µL d'une souche avirulente pour la souris (la durée de cette intervention est estimée à 15 secondes) et (2) l'inoculation de l’immunothérapie de 50 µL en intramusculaire dans chacune des 2 pattes postérieures soit 100 µL au total (la durée de cette intervention est estimée au maximum à 30 secondes par injections soit 2 x 30 s), qui peuvent entrainer une gêne sur un laps de temps très court. Ces interventions seront réalisées une seule fois pour chaque souris.

Impact sur les animaux

La souche de toxoplasme inoculée est sélectionnée pour sa non virulence pour la souris. Elles ne provoquent pas de symptômes cliniques ni de souffrance notable chez les animaux, ce qui garantit une charge parasitaire suffisante pour l’étude tout en préservant leur bien-être. Le protocole inclura un suivi rigoureux des animaux qui seront surveillés quotidiennement afin de détecter tout signe de détresse ou d'effet indésirable en lien avec le traitement. Les seules nuisances ou effets indésirables potentiellement attendus sont liés à l'injection vaccinale : 2 injections intramusculaires de 50 µL chacune, même si les traitements à ARNm (vaccins COVID-19 ou immunothérapies anticancéreuses) ont démontré une innocuité préclinique solide chez la souris.

Devenir

Les animaux ayant été infectés par un agent pathogène, les souris seront systématiquement mises à mort après avoir été au préalable endormis en fin de procédure.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible à ce stade du projet. L’objectif est de valider in vivo un traitement à base d’ARN visant à éliminer les formes dormantes de parasites intracellulaires. Les mécanismes immunitaires complexes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro. Le modèle murin infecté par le toxoplasme est actuellement le seul disponible pour reproduire une infection chronique à formes dormantes.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été strictement limité. L’expérience sera conduite en duplicat sur trois groupes de 10 souris seulement, soit un total de 60 animaux, ce qui représente un compromis entre puissance statistique et minimisation du nombre de sujets. Ce design expérimental a été optimisé pour maximiser l’information obtenue par animal.

Raffinement

Un soin particulier sera apporté au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Du fait du faible nombre de souris inclues dans l’étude les souris inoculées seront hébergées dans des cages pouvant contenir plus de souris d’après les normes en vigueur. Les souris font l’objet d’un enrichissement dès leur mise en cage et jusqu’à la fin de l’expérimentation. Les souris recevront un traitement antalgique en cas de symptôme afin d'éliminer toute douleur potentielle liée à la procédure. L’infection sera induite par une souche adaptée à l’établissement d’une infection chronique sans signes cliniques pour la souris, ce qui permet d’éviter toute souffrance chez ces dernières. Les animaux seront anesthésiés et sous antalgique pour minimiser tous risque de stress et souffrance au cours de l'injection du traitement en intramusculaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter précocement tout signe de détresse ou de dégradation de l’état général et la fréquence d’observation est accentuée (deux à trois fois par jour au lieu d’une seule) en cas de symtômes. Des critères d’arrêt (score clinique) seront mis en place pour garantir leur prise en charge immédiate si nécessaire.

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont l’animal de choix pour l'entretien du parasite. Mis à part le chat domestique, la souris représente l'espèce animale de laboratoire la plus adaptée pour l'isolement et l'entretien de souches de toxoplasmes (le modèle rat par exemple ne permet pas le maintien des souches). Elle est utilisée par l'ensemble des équipes de recherche internationale qui travaille sur la culture in vivo du toxoplasme. Des souris femelles (âgées de 4 à 8 semaines) seront utilisées pour la mise en place d'une infection chronique par le toxoplasme et tester la réponse au traitement ARN. L’âge des animaux utilisés dans nos procédures correspond à une taille et un poids de l’animal minimum pour lequel l’injection des volumes d’inoculum et de traitement envisagés sont bien tolérés.

Nourris pendant soixante semaines au plus avec un aliment riche en graisses et en sucres, 1 000 souris et 1 000 rats subissent jusqu'à 240 prélèvements sanguins pour mesurer leur glycémie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils développent obésité, diabète, dyslipidémie, insulinorésistance et stéatose hépatique pouvant aller jusqu'à la fibrose, la cirrhose ou un cancer du foie, et sont tous tués à l'issue sans pouvoir être réutilisés. Le protocole vise à vérifier qu'un aliment gras et sucré stérilisé par irradiation induit toujours le même état pathologique et que le modèle reste valide. Sur le dimensionnement de l'effectif, le porteur indique s'appuyer sur son savoir-faire et ses données historiques, et écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.

Objectifs

A l’échelle mondiale, les maladies liées au surpoids représentent une part non négligeable des décès estimés à plus de 1,2 million par an. En 2016, 650 millions d’adultes étaient obèses, soit 3 fois plus qu’en 1975. En 2021, le diabète affecte plus de 537 millions de personnes. La dyslipidémie et la stéatose hépatique non- alcoolique sont provoquées par le diabète et l’obésité. La dyslipidémie touche quelques milliers de patients chaque année en France et la société nationale française de gastro-entérologie considère qu’un quart de la population française est touché par la stéatose hépatique non- alcoolique. Par l'alimentation de rongeurs avec un régime riche en lipides et glucides, il est possible d'induire ces phénotypes spécifiques : obésité, dyslipidémie, diabète. Ce protocole a pour objectif de tester un aliment riche en lipides et/ou en glucides stérilisé par irradiation à différentes doses. L’étude permettra d’évaluer si le taux d’irradiation a un impact sur le modèle, en suivant notamment la prise de poids, le maintien du phénotype attendu et l’état général des animaux. Les observations recueillies permettront ainsi de vérifier si le modèle reste valide.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des bénéfices pour l’homme. Ce projet pourra amener à long terme des solutions thérapeutiques pour traiter les syndromes métaboliques du surpoids et du diabète. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux auront à disposition un aliment standard et/ou un aliment riche en gras et/ou en sucre et une eau standard et/ou une eau additionnée de sucre, pendant 60 semaines maximum. Des prélèvements sanguins pour mesure de glycémie pourront être faits avec ou sans mise à jeun (mise à jeun de 4 à 6 heures maximum) sur les animaux en aigue (maximum 2 mesures par jour par animal, avec 3 jours de récupération entre 2 séries de mesures, ce qui fait 240 prélèvements maximum sur toute la durée du protocole) ou en chronique (une mesure par animal par semaine, ce qui fait 60 prélèvements maximum sur toute la durée du protocole). Une goutte de sang sera prélevée pour mesure de la glycémie sur une bandelette de glucose. La durée de prélèvement sera d’1 minute maximum.

Impact sur les animaux

Au fil de la prise alimentaire riche en gras et/ou sucre et d’un abreuvement standard ou riche en sucre, les animaux pourront exprimés des signes cliniques plus ou moins modérés. Les animaux vont développer une obésité et des syndromes métaboliques tels diabète, dyslipidémie, insulino-résistance, NASH pouvant aller jusqu’à une fibrose, une cirrhose ou un cancer du foie à long terme (après la phase préparatoire). Le prélèvement sanguin peut induire un léger stress transitoire et une légère douleur.

Devenir

En fin de protocole, les animaux ne pourront pas être réutilisés dans un autre projet et seront donc mis à mort selon les procédures en vigueur.

Remplacement

L’induction de modification métabolique chez l’animal fait intervenir plusieurs types cellulaires produisant des facteurs tendant à moduler ou amplifier la réponse. Toute cette cascade d’événement faisant intervenir des facteurs autocrines, paracrines ou exocrines aussi variés que complexes ne permet pas une étude significative et déterminante in vitro. Par ailleurs, l'objet de cette étude est d'évaluer l'impact sur une fonction vitale de l'organisme, ce qui ne peut être fait que sur un organisme vivant.

Réduction

Nous réalisons ce protocole alimentaire pour proposer un modèle animal pertinent avec un nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre l'objectif scientifique. Notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long de cette phase préparatoire. En cas d'anomalie clinique observée sur un animal, une grille de scoring général sera utilisée afin de déterminer l'atteinte de points limites et de décider du devenir de l'animal. Enfin, les contentions et prélèvements seront réalisés par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur les maladies métaboliques liés au surpoids car elles développent naturellement ce type de pathologie ayant une affinité à la nourriture grasse et sucrée similaire à l’Homme. Les animaux pourront commencer le régime alimentaire à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). À cet âge, le métabolisme est encore en développement, ce qui permet une meilleure induction de l’obésité par le régime enrichi en graisses et/ou en sucre. De plus, une mise en place précoce du régime permet une meilleure standardisation entre les individus et augmente la robustesse du modèle DIO.

Les tumeurs greffées peuvent s'ulcérer et s'infecter, et l'irradiation de 210 secondes qui précède la greffe de moelle peut endommager l'intestin, les poumons ou le cerveau. 670 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses post-mortem, sans qu'aucune soit maintenue en vie. Chaque souris reçoit une injection de cellules tumorales sur animal éveillé, puis un traitement tous les trois jours pendant dix-huit jours, une partie subissant une seconde greffe de tumeur huit à douze semaines après l'irradiation. Le porteur ne nomme pas la protéine étudiée et renvoie au long terme la possibilité d'explorer des molécules qui en modifieraient l'activité chez des patients.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’une nouvelle protéine dans la réponse antitumorale. Le contrôle de la croissance des tumeurs chez les patients dépend de l’activation d’une réponse immune efficace contre les cellules cancéreuses. Cela passe par le déclenchement d’une réponse immunitaire. Les protéines responsables de cette activation ne sont pas totalement connues. Nous avons récemment identifié une nouvelle protéine centrale dans l’activation de l’immunité. Ce projet a pour but de comprendre son rôle dans le contrôle des tumeurs. A terme, il est possible que les résultats de cette étude permettent de mettre au point des thérapies d’activation de l’immunité chez les patients atteints de cancers solides tels le mélanome ou le cancer du poumon. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de cette protéine immunitaire dans le contrôle du cancer.

Bénéfices attendus

La réponse immune antitumorale n’est pas totalement comprise. Nous avons récemment découvert une protéine nécessaire aux premières étapes d’activation du système immunitaire. Ce projet propose d’analyser son rôle chez la souris. À long terme, ce projet pourrait apporter la preuve que notre protéine d’intérêt joue un rôle dans l’organisme dans la protection antitumorale, ouvrant la voie à l’étude de cette protéine chez les patients. Nous pourrons ensuite explorer des stratégies thérapeutiques utilisant des molécules modifiant l’activité de cette protéine pour activer la réponse immune antitumorale.

Procédures

Toutes les interventions se font sur animaux éveillés. Dans un premier lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées aux animaux (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 injection tous les 3 jours pendant 18 jours maximum (durée de chaque geste inf à 10 sec). Dans un second lot, les animaux seront irradiés (durée : 210 sec), puis injectés avec des cellules immunitaires (durée : 10 sec). 8 à 12 semaines après, ils seront injectés avec des cellules tumorales (durée 10 sec) puis recevront un traitement anticancer à raison d’1 injection (durée 10sec) tous les 3 jours pendant 18 jours maximum. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur certains de ces animaux. Dans un troisième lot, les animaux seront irradiés (durée : 210 sec), puis injectés avec des cellules immunitaires (durée : 10 sec). 8 à 12 semaines après, ils seront injectés avec des cellules tumorales (durée 10 sec) puis recevront un traitement anticancer à raison d’1 injection (durée 10sec) tous les 3 jours pendant 18 jours maximum. Une seconde injection de cellules tumorales sera réalisée sur ces animaux (durée : 10 sec). Un prélèvement sanguin sera réalisé sur certains de ces animaux.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales, ainsi que des traitements au moyen d’une aiguille entraîne une douleur transitoire due à la piqure. Les potentiels effets indésirables de la greffe de moelle seront estimés lors d’une expérience pilote avec un petit nombre d’animaux. Il s’agit cependant d’effets indésirables très rares. La greffe de moelle osseuse implique une irradiation préalable du receveur afin d’éliminer ses propres cellules de moelle osseuse. Cette étape, bien que nécessaire, induit une toxicité significative : elle peut endommager des tissus non ciblés comme l’intestin, les poumons ou le cerveau, et affaiblir considérablement le système immunitaire, rendant l’animal plus vulnérable aux infections opportunistes. Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Greffer une tumeur chez une souris peut avoir des effets négatifs sur sa santé. Avec le temps,l’animal peut parfois perdre du poids, manger moins et avoir du mal à se déplacer, si la tumeur est volumineuse ou mal placée. La tumeur peut dans certains cas s’ulcérer, s’infecter.

Devenir

Aucun animal maintenu en vie. Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Des expériences en laboratoire ont montré que notre protéine immunitaire joue un rôle clé dans l’activation des défenses immunes de l’organisme. Quand cette protéine est absente, les cellules ne réagissent plus aux signaux censés déclencher une réponse immune. Le projet cherche maintenant à comprendre comment cette protéine aide le corps à lutter contre les tumeurs, en utilisant des souris comme modèle vivant. Même si des méthodes alternatives comme la culture de cellules ont été utilisées, l’étude sur l’animal reste essentielle pour observer la réponse immunitaire dans son ensemble, telle qu’elle se produit dans un organisme complet et fonctionnel. Cette réponse n’est pas observable avec des méthodes impliquant de la culture cellulaire.

Réduction

Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet sera de 670 souris. Le nombre de souris a été réduit en effectuant une première expérience permettant de déterminer le modèle tumoral et le régime de traitement le plus adapté à notre étude. Le reste de l’étude sera effectuée uniquement avec ce modèle et ces conditions expérimentales. De plus, la dernière expérience ne sera réalisée que si le modèle tumoral choisi en dans la première expérience présente un rejet complet des tumeurs. Le nombre de souris utilisées dans chaque groupe a été réduit au strict minimum nécessaire. En utilisant 10 souris par groupe, les chercheurs peuvent détecter des différences significatives entre les groupes avec une grande fiabilité. Pour s’assurer que les résultats sont reproductibles, l’expérience sera refaite une seconde fois avec le même nombre d’animaux.

Raffinement

Les souris sont manipulées sans stress par des personnels compétents. Le bien être des souris sera suivi quotidiennement. Les points limites conduisant à l’euthanasie des souris seront précoces et prédictifs pour l’apparition d’une douleur. Le suivi et la détermination des points limites est effectué en utilisant une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche antitumorale : souches murines parfaitement définies et modèles génétiquement modifiés, avec de grandes similarités entre les systèmes immunitaires humains et murins qui permet de transposer nos découvertes dans le modèle murin chez l’humain. De plus, nous avons documenté de manière robuste l’existence de notre protéine d’intérêt chez l’humain et chez la souris. Souris adultes ( >6 semaines) car leur réponse immune antitumorale est active.

Opérées sous anesthésie générale pour recevoir une matrice de collagène, l'incision étant refermée par des agrafes, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La lignée décrite est invalidée pour un gène d'intérêt, et le porteur prévoit après la chirurgie une douleur "modérée et transitoire", avant une prise de sang sous anesthésie générale terminale. Le projet vise à établir chez la souris une fibrose qui reproduise la rigidité des tissus tumoraux, pour étudier l'effet de la pression mécanique sur la transformation des monocytes en macrophages, avec des perspectives thérapeutiques que le porteur renvoie au conditionnel. Toutes sont tuées à la fin de la procédure pour des prélèvements destinés à "trois grandes techniques" que le porteur dit "indispensables", sans les nommer.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de discerner, dans un modèle murin, l'impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages constituent une population abondante de cellules immunitaires dans le cancer, associée à un mauvais pronostic pour les patients ; cependant, les facteurs précis qui régulent la fonction des macrophages dans le cancer sont mal compris. De nombreuses études ont identifié que le cancer induit une fibrose générale dans le microenvironnement tumoral, ce qui augmente la rigidité des tissus. L'impact de la rigidité tissulaire sur la fonction des macrophages est un aspect fondamental de la compréhension de l'immunologie tumorale. Pour mieux comprendre cet aspect, nous visons à : 1) établir un modèle murin de fibrose. 2) contourner la différenciation des macrophages pro-fibrotiques. 3) Appliquer nos observations obtenues sur les macrophages pro-fibrotiques et sur la fibrose associée au cancer. L’objectif 3 sera atteint en traduisant nos résultats en données générées précédemment à partir des modèles de cancer en laboratoire.

Bénéfices attendus

Les objectifs de ce projet sont de déterminer, dans un modèle murin, l’impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages représentent une population abondante de cellules immunitaires au sein du microenvironnement tumoral et sont souvent associés à un pronostic défavorable chez les patients atteints de cancer. Cependant, les facteurs précis qui régulent leur fonction dans ce contexte restent mal compris. De nombreuses études ont mis en évidence que les tumeurs induisent une fibrose marquée dans leur microenvironnement, augmentant ainsi la rigidité des tissus. L’influence de cette rigidité tissulaire sur la fonction et la polarisation des macrophages constitue un aspect fondamental de la compréhension de l’immunologie tumorale. Afin d’explorer ce mécanisme, nous poursuivons les objectifs suivants : 1. Établir un modèle de fibrose afin de reproduire les conditions de rigidité mécanique observées dans les tissus tumoraux. 2. Identifier les voies de signalisation impliquées dans la différenciation des macrophages pro-fibrotiques et explorer les moyens de contourner cette polarisation. 3. Appliquer les observations obtenues sur la différenciation macrophagique et la fibrose à des modèles tumoraux déjà établis au laboratoire. L’objectif final est de mieux comprendre la diversité fonctionnelle (hétérogénéité) des macrophages et les mécanismes biomécaniques qui influencent leur phénotype et leur rôle dans des environnements rigides, tels que les tissus tumoraux. Ces connaissances pourraient, à terme, ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques, en ciblant la signalisation mécanique pour moduler la fonction macrophagique dans le cancer.

Procédures

Implantation chirurgicale d’une matrice de collagène sous anesthésie générale avec analgésie, durée 10 minutes, une fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale terminale, durée 5 minutes, une fois.

Impact sur les animaux

À la suite de la procédure chirurgicale, les souris pourront ressentir une douleur modérée et transitoire. Tout inconfort proviendra de la chirurgie elle-même et des agrafes utilisées pour refermer l’incision cutanée, et non du collagène injecté. Le collagène est de petite taille et très fin, et n’affectera pas la santé des souris.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en œuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans un microenvironnement rigide dans toute sa complexité. En particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le comportement des macrophages dans un microenvironnement rigide soumis à différentes conditions en interaction avec le microenvironnement. Enfin, notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient aussi la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme. Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.

Réduction

Nous avons pris en compte de multiples facteurs qui nous permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux questions scientifiques sous-jacentes. Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expérimentaux est maintenu aussi bas que possible afin de pouvoir tirer des conclusions valables et significatives des expériences proposées, il a été déterminé par calcul de puissance. En outre, pour répondre à nos questions scientifiques, nous utiliserons des méthodes qui maximisent les connaissances acquises à partir de chaque animal. En outre, nous planifierons et exécuterons les expériences de manière à de combiner le plus grand nombre possible de tissus d'intérêt et de groupes de contrôle. Grâce à ces stratégies, nous visons à réduire le nombre d'animaux au minimum, tout en garantissant des résultats scientifiquement pertinents.

Raffinement

Les animaux disposeront d’une période d’acclimatation suffisante avant le début des procédures, incluant une familiarisation avec les expérimentateurs. Afin de réduire le stress lié à la manipulation, des méthodes raffinées seront employées . Des examens cliniques quotidiens seront effectués par l'équipe de recherche, et la fréquence des observations sera augmentée en cas de signes d’inconfort. Les procédures seront réalisées dans un environnement propre ou stérile, avec des mesures adaptées pour prévenir les infections post-opératoires. Une anesthésie et/ou une analgésie appropriée sera administrée chaque fois que nécessaire afin de minimiser la douleur et la détresse. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de différentiation des cellules, le cancer et la fibrose. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des publications précédentes. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines du fait de la population de patients..

Jusqu'à cinq chocs électriques d'une seconde en huit minutes, puis une chirurgie du cerveau d'une heure et demie pour injecter des composés et implanter à demeure une fibre de verre : 528 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour vérification histologique. Des séances de rappel de dix minutes suivent le conditionnement, sans nouveaux chocs. Le projet vise à comprendre comment le thalamus antérieur et le cortex transforment un souvenir récent en souvenir durable. Le porteur qualifie le conditionnement de peur d'aversif par définition tout en écrivant que "toute souffrance sera évitée", au motif que le bien-être des rats conditionne la qualité des données comportementales.

Objectifs

Nous cherchons à comprendre où et comment nos souvenirs sont stockés dans le cerveau. Au début, certaines structures comme l’hippocampe sont essentielles pour se souvenir d’événements ou de faits. Avec le temps, ces souvenirs deviennent autonomes et sont conservés dans le cortex. Le Thalamus antérieur aide à rendre les souvenirs durables en reliant l’hippocampe au cortex, qui stocke les souvenirs à long terme. Les connexions entre le thalamus antérieur et le cortex aident à transformer les souvenirs récents en souvenirs durables. Notre projet étudie comment cette interaction entre thalamus et cortex crée des traces mémorielles solides dans le cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de connaitre l’architecture thalamocorticale et son implication dans la formation de souvenirs à long terme. Ce projet permettra ainsi de mieux comprendre comment le thalamus et le cortex travaillent ensemble pour former et stabiliser nos souvenirs. Ces connaissances seront précieuses pour affiner les modèles de la mémoire qui sont utilisés et dont les limites sont connues. Ce travail pourrait donner une nouvelle grille de lecture des pathologies de la mémoire comme la maladie d’Alzheimer. Ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une session de conditionnement aux chocs : maximum 5 chocs de 1s en 8 minutes. Et plusieurs séances de rappel (sans chocs) de 10 minutes chacune. Ils subiront une chirurgie d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation à demeure d’une fibre de verre très fine d’une durée maximale d’une heure et demie.

Impact sur les animaux

Le protocole de conditionnement de peur au contexte est par définition aversif pour les animaux puisqu’il repose sur la survenue d’un évènement déplaisant qui consiste en un choc électrique faible répété 5 fois maximum. Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Certains animaux recevront des injections d’un produit ne provoquant pas de douleur. L’animal subira ainsi une restriction de mouvements et l’introduction d’une aiguille, l’ensemble peut provoquer un léger stress ainsi qu’une légère douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux vérifications histologiques et à l'étude de marqueurs neuronaux

Remplacement

Etudier le fonctionnement du cerveau ne peut s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche expérimentale chez l’homme n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De même, les approches alternatives faisant appel à la modélisation sont utiles mais restent complémentaires des approches expérimentales sur les animaux qui permettent de valider ces modèles.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été calculé comme étant le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistique significative sur les paramètres étudiés grâce à l’utilisation de tests robustes. Cependant le nombre de groupes pourra être réduit en cours de projet : si une des voies étudiées ne montre pas de résultats significatifs sur les premiers lots elle ne sera pas étudiée sur les lots suivants.

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, tunnel et barre à ronger) et seront hébergés en cage collective, même après les chirurgies. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés et des mesures conservatoires mises en place afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille entre individus.