Oncologie

Toutes biopsiées à l'oreille au poinçon ou aux ciseaux, et 320 d'entre elles gavées une fois par semaine jusqu'à seize fois, 1 536 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des modifications génétiques qui leur font développer des tumeurs pulmonaires entre trois et quatre mois, et sont tuées au plus tard à cinq mois pour prélever des tissus, ou parce que le porteur les juge "inutilisables" pour le projet. L'objet est de savoir si les cellules sénescentes freinent ou favorisent le cancer du poumon. Le porteur reconnaît que ces tumeurs sont indétectables à l'œil comme à la palpation et annonce un simple suivi hebdomadaire, sans dire comment il repérera la souffrance des souris chez lesquelles elles progressent.

Objectifs

Malgré les efforts considérables déployés pour lutter contre le cancer et trouver des traitements efficaces, cette maladie demeure l’une des principales causes de mortalité en France et dans le monde. Un des principaux défis des différentes approches anticancéreuses est leur incapacité à éliminer toutes les cellules tumorales. En effet, une petite proportion de ces cellules parvient à survivre aux traitements puis redonne naissance à des tumeurs. La nature de ces cellules cancéreuses résistantes reste largement méconnue et sujette à débat, néanmoins, il pourrait s'agir de cellules sénescentes (CS). La sénescence est un processus qui se déclenche lorsqu’une cellule est soumise à un stress susceptible de la rendre cancéreuse, entrainant un blocage définitif de sa capacité à se multiplier, et donc a créer des tumeurs. Néanmoins, certaines études suggèrent que les CS sont non seulement sont très résistantes aux traitements anticancéreux, mais pourraient contourner leur blocage et redevenir capable de se multiplier. Pire encore : ces traitements pourraient paradoxalement induire la sénescence par le stress qu’ils engendrent, et donc permettre a des cellules précancéreuses de survivre. Nous supposons donc que la sénescence n’est pas nécessairement une barrière définitive et qu’elle pourrait être contournée, permettant ainsi à des cellules potentiellement tumorales de survivre aux traitements et de compléter ultérieurement leur transformation en cellules cancéreuses, expliquant ainsi le retour du cancer chez les patients traités. Le but de ce projet est de comprendre comment les cellules pulmonaires sénescentes influencent le développement du cancer en utilisant un modèle murin développant des tumeurs pulmonaires associé à des systèmes génétiques et pharmacologiques permettant de marquer et d'éliminer les cellules sénescentes.

Bénéfices attendus

En déterminant la contribution des cellules sénescentes dans le développement tumoral, nous espérons pouvoir déterminer si elles inhibent ou au contraire promeuvent celui-ci. Dans ce dernier cas, nous aurons découvert une nouvelle cible pharmacologique dans la lutte contre le cancer pulmonaire.

Procédures

Biopsie : La totalité des 1536 souris seront biospiées, par prélèvement d'un petit bout de tissu par punch ou avec des ciseaux (3 mm). Fait une seule fois dans la vie de l'animal pour une durée inférieur a 1 minute. Gavage : 320 souris seront gavées une fois par semaine à partir de l’âge d’un mois et jusqu’à leur mise à mort a l'age de 2 mois (4 gavages), 3 mois ( 8 gavages), 4 mois (12 gavages) et 5 mois (16 gavages). 80 souris seront traitées pour chaque âge. La procédure de gavage prend moins de 15 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le modèle murin utilisé dans ce projet développe des tumeurs pulmonaires entre 3 et 4 mois au point d'impacter leurs bien-être à partir de 6 et de causer la mort a près de 7 mois. Néanmoins, ces souris seront mises à mort à 5 mois maximum, soit avant que des problèmes sanitaires n'apparaissent. Il est néanmoins possible que certaines d'entre elles développent des difficultés respiratoire mineures. De même, il existe une faible probabilité de voir apparaître des prolapsus rectal et des papillomes sur le corps de la souris. Les souris seront également maintenues en contention puis biospiées : elles devraient donc subir un stress et une douleur légère pour un court laps de temps. En ce qui concerne le gavage, les souris ne devraient alors ressentir qu'un léger et fugitif inconfort, peu de stress et aucune douleur.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure pour les raisons suivantes : soit les souris seront susceptibles de développer des tumeurs pulmonaires et doivent dont être mises à mort avant que cela ne se produise ; soit les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus aux temps impartie ; soit les souris seront inutilisables pour ce projet (mauvaise combinaison de gènes ou souris trop âgée).

Remplacement

L'étude de la senescence est un processus intégré impliquant une communication intra- et inter-cellulaire et tissulaire. Il est ainsi impossible de mimer in vitro ou in silico le développement tumoral au sein des poumons et son interaction avec des cellules sénescentes. Pour ce projet, le recours à l’animal reste donc indispensable.

Réduction

Nous n’avons pas trouvé de système in vitro permettant de faire des analyses préliminaires susceptibles de diminuer le nombre de souris à utiliser. Des efforts seront faits pour limiter le nombre de souris nécessaires par groupe, par exemple en utilisant les règles statistiques adéquates et des logiciel dédiés. En se basant sur la littérature déjà existante et en prenant en compte les exigences de réduction, nous constituerons des groupes expérimentaux composés de 20 animaux. Pour cette étude, nous aurons besoin de souris sur 4 à 5 ans. Les effectifs ont été choisis en prenant en compte 2 paramètres : -(1)Le nombre minimum de souris permettant d’obtenir des résultats significatifs. –(2)Le taux de mortalité/échec associé au travail sur animaux et a la part d’incertitude, notre modèle murin cancéreux développant un phénotype dommageable.

Raffinement

Le raffinement sera assuré par: 1) Un enrichissement permettant l’expression des besoins comportementaux et physiologiques de l’espèce (morceau de bois, abris dans la cage...). 2) Un suivi sanitaire hebdomadaire par les membres de l’équipe (expérimentateurs + personnels techniques). Ce suivi permettra d’indiquer si la souris a atteint des points limite préalablement définis et imposera la prise de mesures adéquats. La fréquence de ces examens sera intensifiée en fonction des symptômes relevés sur un animal jusqu'à la disparition du problème ou la mise à mort de l'animal. Le suivi permettra notamment d'identifier un développement tumoral non pulmonaire visible qui peut rarement se produire dans notre modèle murin. En ce qui concerne les tumeurs pulmonaires, il sera impossible de les détecter visuellement ou par palpation. Cependant, elles se traduisent par un affaiblissement de l'animal associé à un essoufflement marqué de la souris. De plus, le développement de cancers pulmonaires entre 3 et 4 mois n'aura qu'un impact mineur sur le bien-être des souris car nous les mettrons à mort à 5 mois maximum (le bien-être étant impacté à partir de 6 mois et la mort survenant à 7 mois)». Pour le gavage, nous utiliserons une sonde à bout rond et de longueur appropriée afin de limiter les risques d'irritation voire de blessures. Plusieurs mesures correctives seront faites suivant les problèmes sanitaires rencontrés : désinfection en cas de plaie, nourriture gélifiée+mesure du poids si la souris parait amaigrie, antalgique en cas de signe de souffrance de la souris, et enfin consultation du vétérinaire en cas de doute sur la conduite à tenir.

Choix des espèces

Il s'agit d'une étude exploratoire et innovante basée sur les modèles murins transgéniques qui ont déjà été utilisés dans le cadre d'études portant sur la sénescence. À notre connaissance, il n'existe pas d'autres organismes modèles transgéniques comparables et utilisables pour étudier la sénescence, tant au niveau de leur disponibilité, de la vitesse de leur vieillissement et de leur capacité a générer rapidement les animaux expérimentaux nécessaires. Nous aurons besoin d'animaux adultes à l'âge adulte, tant pour générer les animaux expérimentaux que pour mener nos expériences. En effet, nous suivrons le développement tumoral, lequel n'apparaît que chez les souris adultes. Pour des raisons scientifiques (d'étude de la croissance tumorale) et éthiques ,toutes les souris expérimentales seront mises à mort entre 2 et 5 mois.

1 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 80 recevront trois injections dans le ventre par semaine pendant six à huit mois. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever des organes. 970 subissent un prélèvement de peau à l'oreille et 570 une injection sous la peau, le porteur attendant douleur, perte de poids et mobilité réduite à mesure que les cancers cutanés se développent. Les retombées annoncées, de nouveaux marqueurs et de nouvelles cibles thérapeutiques, sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat restant de comprendre le rôle d'une protéine dans la pigmentation de la peau.

Objectifs

Des données de plus en plus nombreuses indiquent que des protéines impliquées dans la croissance des cellules ont un rôle clé dans le fonctionnement de la cellule. Dans ce contexte, le but de notre projet est d’étudier les rôles d’une protéine dans le fonctionnement des cellules de la peau qui sont responsables de la pigmentation. Ces cellules sont également responsables du développement de certains cancers, et un second objectif de notre projet sera d’étudier le rôle de cette protéine dans le développement de ces cancers de la peau. Pour atteindre notre objectif, nous utiliserons différents modèles de souris génétiquement modifiées nous permettant d'inactiver notre protéine d’intérêt spécifiquement dans les mélanocytes et d'évaluer les conséquences sur la croissance de ces cellules et sur leur capacité à pigmenter.

Bénéfices attendus

A court terme, notre projet vise à comprendre le rôle d'une protéine dans le fonctionnement des cellules de la peau et le développement des cancers de la peau. Nos travaux permettraient ainsi de comprendre comment se forment ces cancers et identifier de nouveaux marqueurs prédictifs voir même de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter ces cancers. De plus, il existe de nombreuses pathologies cutanées associées à des défauts de pigmentation de la peau, et à long terme nos travaux pourraient également avoir des retombées sur la compréhension de ces maladies dermatologiques.

Procédures

Sur les 1450 souris du projet : - 970 auront un prélèvement de peau à l’oreille (1 minute) - 80 recevront uniquement 3 injections dans le ventre (2 minutes par injection) – 80 recevront 3 injections dans le ventre par semaine et pendant 2 semaines (2 minutes par injection) - 80 recevront 3 injections dans le ventre par semaine et pendant 1 mois (2 minutes par injection) - 80 recevront 3 injections dans le ventre par semaine et pendant 6 à 8 mois (2 minutes par injection) - 570 recevront une injection sous la peau (3 minutes par injection) dont 240 recevront en plus 3 injections dans le ventre par semaine

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sur les animaux de notre projet sont notamment des effets associés au prélèvement à l’oreille, aux injections dans le ventre, à la manipulation des animaux et au développement des cancers de la peau, à savoir de la douleur, une perte de poids, une mobilité réduite et du stress. Nous n’attendons pas d’effet secondaire des différents traitements proposés sur la base de travaux déjà publiés dans la littérature.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes pour la réalisation d'analyses.

Remplacement

Notre étude in vivo s’appuie sur nos résultats expérimentaux obtenus à partir de lignées cellulaires en culture. En effet, nous montrons dans ces modèles que la perte de notre protéine conduit à une forte diminution des facteurs qui régulent la pigmentation. Certains de ces acteurs étant également essentiels au développement des cancers de la peau, nous émettons l’hypothèse que la perte de notre protéine aura un impact majeur sur la croissance de ces tumeurs. Etant donné que ces travaux ne nous permettent pas d’aborder les différentes questions liées à l’initiation et au développement tumoral, nous souhaitons aborder ces questions dans des modèles intégrés in vivo, et notamment les modèles murins génétiquement modifiés.

Réduction

Nous générerons plusieurs groupes expérimentaux contenant 10 animaux chacun et le nombre d'individus par groupe a été déterminé à partir de tests statistiques. Par ailleurs, nous avons intégré une étude préliminaire afin de minimiser notre nombre d'animaux.

Raffinement

Une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée. La sévérité des signes sera déterminée selon une grille d’évaluation qui permettra la mise en place de soins éventuels (administration d’anti-douleurs) ou conduira à l’euthanasie des animaux. Enfin, les conditions d’hébergement sur des portoirs adaptés ainsi que le suivi du statut sanitaire des animaux immunodéprimés permettent de les protéger.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour nos études in vivo car c'est la seule espèce dans laquelle nos gènes d'intérêts ont déjà été modifiés, permettant ainsi de limiter le nombre d'animaux à générer pour notre étude. Nous estimons que les conclusions de ces études réalisées chez la souris pourront être étendues à d'autres mammifères, dont l'homme. Des similarités sont observées entre nos lignées de souris génétiquement modifiées et les patients atteints de cancer de la peau ce qui nous laisse penser que ce modèle animal est un excellent modèle d'étude de la pathologie humaine et qu'il permettra, à terme, d'établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter ce cancer de la peau. Selon les expériences, certaines souris seront utilisées à 18 jours, correspondant à la première pousse du poil adulte chez la souris et d'autres à 6 semaines.

Deux injections dans le sinus situé derrière l'œil, dix prises de sang à la queue et une ponction cardiaque finale attendent chacune des 144 souris du projet, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et résistantes à l'insuline, elles reçoivent un virus qui modifie une enzyme du foie, pour faire monter leur cholestérol et favoriser des dépôts dans les artères. Le porteur affirme que ce changement reste "sans signes visibles ni douleur pour l'animal", tout en rangeant les injections rétro-orbitales et les prises de sang bimensuelles parmi les effets indésirables attendus. La mise à mort sert à prélever le foie et le tissu adipeux.

Objectifs

Nous allons étudier l'impact d'une modification d'une enzyme du foie sur des souris obèses et résistantes à l'insuline. Pour cela, nous utiliserons une version particulière de cette enzyme et rendrons les souris plus sensibles aux déséquilibres des graisses dans le sang en modifiant une autre protéine. Nous analyserons ensuite la quantité de graisses présentes dans le sang et vérifierons si ces changements favorisent la formation de plaques dans les artères, un facteur clé des maladies cardiovasculaires.

Bénéfices attendus

Nos recherches ont montré qu’une forme particulière de la lipase hépatique, plus active que la normale, permet de faire baisser le taux de cholestérol dans le sang, chez la souris comme chez l’homme. Or, le cholestérol LDL (souvent appelé "mauvais cholestérol") est l’un des principaux facteurs de risque des maladies cardiovasculaires. En s’accumulant dans les artères, il peut former des dépôts qui les rétrécissent et gênent la circulation du sang. Ce projet cherche à savoir si cette forme modifiée de la lipase hépatique peut protéger des souris obèses, avec un taux de sucre élevé dans le sang et une sensibilité réduite à l’insuline, contre ce type de problèmes dans les artères.

Procédures

Chaque souris recevra deux injections d’un virus (durée de 5/10 secondes), subira dix prises de sang (durée 5/15 secondes) et une ponction cardiaque avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les souris auront un taux de cholestérol élevé et seront plus susceptibles de développer des dépôts de graisses dans les artères. Cependant, ce changement reste sans signes visibles ni douleur pour l’animal. Contrairement à l’humain, les souris ne développent pas de maladies graves comme les crises cardiaques ou les accidents vasculaires cérébraux : les plaques qui se forment dans leurs artères restent stables. Les effets indésirables possibles concernent surtout les deux injections dans le sinus rétro-orbital et les prises de sang régulières réalisées au niveau de la queue toutes les deux semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, conformément aux objectifs expérimentaux. Cette mise à mort est nécessaire pour permettre le recueil des organes et tissus d’intérêt (par exemple le foie, le tissu adipeux ou d’autres prélèvements), indispensables aux analyses biologiques et histologiques prévues dans le protocole.

Remplacement

Ce projet comprend plusieurs volets : des analyses génétiques menées sur une cohorte humaine et des études en laboratoire sur des cellules hépatiques. Les données déjà obtenus ont confirmé l’intérêt de la cible étudiée. Les maladies cardio-métaboliques résultent de mécanismes complexes impliquant plusieurs organes qui communiquent entre eux. Actuellement, ces interactions ne peuvent pas être reproduites en laboratoire avec des modèles cellulaires. C’est pourquoi l’utilisation de modèles animaux reste essentielle.

Réduction

Ce projet a été conçu dans le respect de la règle des "3R" (Remplacement, Réduction, Raffinement). Seules les expériences strictement nécessaires à la réussite du projet seront réalisées.Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé avec rigueur, en s’appuyant à la fois sur notre expérience passée et sur un logiciel d’analyse statistique permettant d’optimiser la taille des échantillons. De plus, nous avons sélectionné les lignées de souris les plus adaptées afin de maximiser la pertinence des résultats tout en limitant le nombre d’animaux impliqués.

Raffinement

Nous avons pris en compte le bien-être animal en mettant en place une surveillance quotidienne assurée par des zootechniciens formés, afin de détecter tout signe de stress ou de souffrance. De plus, un examen clinique hebdomadaire sera réalisé par les responsables du protocole de recherche. Pour limiter la douleur et le stress des animaux, des mesures adaptées seront mises en place. Les injections dans le sinus rétro-orbital seront réalisées sous anesthésie gazeuse, avec l’application d’un collyre anesthésiant pour une analgésie locale. Une analgésie appropriée sera également administrée avant la mise à mort. Par ailleurs, une sédation légère sera utilisée lors des prises de sang au niveau de la queue pour réduire le stress des animaux . Des critères précis ont été établis pour définir des seuils au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal mis à mort, garantissant ainsi une prise en charge éthique et responsable. Enfin, les souris seront hébergées dans des conditions optimales : elles disposeront de cages équipées de litières et d’enrichissements (frisottis, igloo ou tube en polycarbonate). Elles seront également restreintes en nombre dans chaque cage en fonction de leur poids, afin d’assurer leur confort. Les animaux seront maintenus en groupes pour préserver leur bien-être social.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans l’étude des maladies cardiaques et métaboliques. Il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications associées à l’obésité et est largement reconnu pour sa pertinence dans la recherche biomédicale en raison de sa similitude génétique avec l'humain. Facile à manipuler et à reproduire, il offre une bonne reproductibilité des résultats, ce qui en fait un choix pour les études précliniques. Son utilisation permet ainsi d'obtenir des données fiables. Nous avons choisi des souris qui sont naturellement obèses et moins sensibles à l’insuline. Pour les rendre plus à risque de développer des plaques dans les artères (athérosclérose), nous modifions une protéine, ce qui augmente leur taux de cholestérol. Les animaux débuteront le protocole de recherche à 5 semaines d’âge (randomisation) car il est nécessaire de débuter avant la mise en place de l’insulino-résistance qui s’établit entre 6 et 12 semaines.

Quatre loups vont être capturés au piège à patte ou par fléchette anesthésique, chacun immobilisé environ 45 minutes, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Pendant ce laps de temps, l'animal est pesé, mesuré, prélevé de sang et d'ADN, perforé aux deux oreilles pour y fixer une étiquette et équipé d'un collier GPS. Le porteur énumère les risques de la capture, du stress aux blessures superficielles jusqu'aux luxations, fractures des os longs et myopathie de capture, et rappelle que l'anesthésie peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire. Les quatre loups sont relâchés immédiatement après la manipulation puis suivis douze à vingt-quatre mois, le temps de la batterie du collier.

Objectifs

Un certain nombre d’études ont été menées à travers le monde sur le loup et son rôle sur les populations proies et les écosystèmes. En effet, en tant que prédateur, le loup a un impact potentiellement important sur les populations de proies, en particulier les ongulés sauvages, en termes de densité et de comportement en modifiant la distribution, la sélection des habitats, le régime alimentaire et la démographie des grands herbivores sauvages, avec des effets sur les écosystèmes associés. Ces effets sont toutefois très peu documentés dans des environnements dominés par les activités humaines, tel qu’on peut en trouver en France et en Europe. Or, en tant que super-prédateur, l’humain et ses activités impactent l’ensemble des interactions entre les espèces et leur environnement. Alors que le loup recolonise rapidement le territoire européen et français, il devient nécessaire de mieux évaluer son comportement dans des écosystèmes dominés par les activités humaines et les effets de son expansion sur ceux-ci, en particulier sur des territoires à protection forte. Ce projet vise à combler ces lacunes en étudiant le comportement et l’utilisation de l’espace d’une meute de loups vis-à-vis des activités humaines et de ses interactions avec les autres espèces sauvages, et ainsi nous éclairer sur le rôle que joue le loup dans un écosystème anthropisé de montagne. Du fait des nombreux suivis qu’elle réalise sur la faune sauvage, la flore et les habitats naturels depuis de nombreuses années, et de son rôle majeur dans la conservation de la biodiversité, une Réserve naturelle nationale abritant depuis peu une meute de loup, représente un site d’étude idéal pour étudier ces questionnements. Les objectifs d’une telle étude sont : Étudier le comportement d’une meute de loup sur leur territoire en fonction de la saisonnalité et des activités humaines; Définir le régime alimentaire des loups dans un contexte d’abondance forte de cervidés sauvages et une dominance de l’élevage bovin ; Évaluer les impacts sur la densité, la distribution et le comportement des ongulés sauvages, notamment du Cerf élaphe, et les effets indirects à plus ou moins long terme sur les écosystèmes forestiers utilisés par ces derniers. L'intérêt global est l'acquisition de données comportementales sur le loup en tant que nouvel acteur dans un écosystème à protection forte afin de pouvoir assurer sa conservation ainsi qu'une coexistence optimale de cette espèce avec les différentes activités humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de concrétiser des études et suivis de loups dans un territoire multi-usages et multi-acteurs, typique des paysages montagnards confrontés au retour de ce grand prédateur ces dernières décennies en France et en Europe. Via l’acquisition de données par GPS sur cette espèce très discrète, sur un site d’étude protégé et très suivi (faune, flore et habitats) par ailleurs sur le long terme, ce projet permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur le comportement des loups, le fonctionnement d’une meute dans un contexte local à usages multiples et leurs rôles dans les socio-écosystèmes de montagne. Des connaissances importantes seront également acquises sur les impacts directs et indirects des loups sur la faune sauvage à l’instar des ongulés sauvages, mais aussi sur d’autres espèces à enjeu telles le Grand tétras, la Gélinotte des bois et le Lynx, ainsi que sur les écosystèmes associés (notamment forestiers). Bénéficiant de paysages contrastés, le projet permettra également d’acquérir des connaissances sur les potentiels points de contacts entre loups et humains et sur les déplacements de loup dans un paysage dynamique en termes de dérangements anthropiques en fonction des secteurs et de la saisonnalité. À plus long terme, le projet permettra de mettre en évidence les effets indirects du loup sur les écosystèmes forestiers et le rôle bénéfique qu’il pourrait jouer via la réduction des impacts des herbivores sur les forêts exploitées. Les connaissances acquises serviront à une conciliation des usages entre les activités d’exploitation forestières et de chasse tout en assurant le maintien de la biodiversité sur les milieux forestiers. Enfin, le suivi des loups et l’étude de leurs interactions avec les activités humaines et la faune sauvage, nous permettra d’avoir une meilleure compréhension de l’espèce et de son rôle dans les écosystèmes. En local, afin de maintenir l’intégrité des loups équipés et le bon fonctionnement de la meute suivie, la Réserve naturelle coordonnant ce projet a proposé en parallèle, pour les zones en dehors de son territoire (le tir létal dans la Réserve naturelle étant interdit), des alternatives aux tirs létaux de défense (ex. surveillance troupeau par agent de la réserve ou bénévole, aide berger, tir d’effarouchement, etc), ce qui assurerait la protection des individus concernés.

Procédures

Les loups seront capturés avec des pièges à patte ou par téléanesthésie (flèche anesthésique projetée par un fusil alimenté au CO2). Ils seront manipulés sous anesthésie générale. Sur une bâche de manipulation, ils seront équipés d’un collier GPS puis un ensemble de mesures corporelles (poids, mensuration), une prise de sang (analyses sanguines) et un frotti buccal (prélèvement ADN) seront effectués avant que l’animal soit relâché. Un marquage auriculaire sera également réalisé par perforation sur chaque oreille à l’aide d’une pince et d’une étiquette en plastique spécifique et adaptée. L’ensemble des manipulations est réalisé en 45 minutes environ (de l’anesthésie générale au relâcher). Après leur relâcher, les déplacements des animaux seront suivis pendant 12 à 24 mois (durée de batterie du collier). Une fois le suivi terminé le collier sera décroché automatiquement ou à distance.

Impact sur les animaux

La capture peut occasionner du stress, des troubles locomoteurs légers en réponse à un stress musculaire, des changements hiérarchiques au sein de la meute, des blessures superficielles en cas de traction sur le piège ou de morsure du câble, des blessures sévères (rares : boiterie du membre entravé, luxation des articulations, fractures des os longs), une myopathie de capture, un risque de mortalité (très faible: aucun cas de mortalité n’a été rapporté avec ce protocole par les partenaires internationaux du projet). Les effets indésirables potentiels de l'anesthésie sont : hypoventilation, hypotension, anomalies du rythme cardiaque, perturbations de la température corporelle, troubles neurologiques, nausées, vomissements, déficit de la circulation sanguine, ulcères de la cornée de l’œil, arrêt cardio-respiratoire dans de très rares cas. Des protocoles seront mis en place tout au long de l’anesthésie pour prévenir ou contrecarrer ces effets.

Devenir

Tous les animaux sont relâchés dans le milieu naturel immédiatement après leur manipulation.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternative satisfaisante aujourd’hui au suivi des grands prédateurs en milieu naturel, constat établi récemment par le conseil scientifique du Plan National d’Actions loup et activités d’élevage. En effet, les études écologiques et comportementales impliquant le suivi de ces espèces sont essentielles pour comprendre leurs interactions avec les activités humaines, la faune sauvage ainsi que les effets en cascade sur la végétation forestière notamment. Cet état des connaissances est d'autant plus important dans un contexte montagnard qui est sensible au retour du loup de par sa fragilité intrinsèque, mais aussi par la présence de multiples activités humaines, dont le pastoralisme. Cependant, les données apportées par ce type de suivi permettront d’ouvrir la voie à la modélisation informatique de l’utilisation de l’espace par les loups et de leurs interférences avec la faune sauvage et les activités humaines, ce qui pourrait autoriser à l’avenir un remplacement des suivis en nature pour répondre à certaines questions scientifiques et/ou de gestion (par exemple caractérisation des facteurs orientant la prédation sur des animaux domestiques).

Réduction

Pour obtenir des données généralisables à d’autres contextes, en prenant en compte les différences intrinsèques liés à l’individu, son rôle social au sein de la meute, les variations de cultures de meute, etc, il faut compiler des données sur un certain nombre d’animaux. Dans un premier temps, nous avons pour ambition de commencer par la capture de 4 loups, qui permettront de construire la capacité et les connaissances de terrain sur les captures, et commenceront à produire des données exploitables (dès la première capture). Capturer plusieurs individus d’une même meute est envisagé afin d’obtenir des informations sur la dispersion d’individus isolés d’une part, et pour assurer une redondance en cas de tir/collision avec un véhicule ou autre mortalité d’un individu suivi d’autre part. Ce suivi de plusieurs loups par collier GPS en milieu de moyenne montagne bénéficiera à de nombreux partenaires scientifiques en France et en Europe. En effet, les données sur l’écologie spatiale du loup seront mises à disposition dans le cadre d’un réseau scientifique européen sur les mouvements des mammifères et, plus globalement, dans une dynamique mondiale de partage de ce type de données. Les données collectées lors de notre projet, uniques en France, seront combinées à celles d'autres projets européens (dans des contextes socio-écologiques différents) impliquant des captures de loups et s'intéressant à des questions similaires. Une collaboration nationale et internationale est déjà établie dans ce sens avec les équipes partenaires travaillant sur ce sujet en France et en Europe.

Raffinement

1/ Piégeage : *Choix des sites et moments de capture priorisant la sécurité des animaux (pas de capture en été et dans conditions météo non favorables) *Ajout de ressorts et d'articulations (pivots) à la longe afin de garantir un bon niveau d'absorption pour limiter les risques de blessures *Ajout de bourrelets en tissus sur le lacet coulant pour assurer la circulation sanguine dans la patte *Alerte de déclenchement pour une intervention rapide (

Choix des espèces

Dans des territoires sauvages, il a été montré que le loup peut substantiellement modifier la densité, la distribution et le comportement des grands herbivores sauvages (ses proies privilégiées) avec des conséquences en cascade sur les écosystèmes associés. Le comportement du loup, ses interactions avec les autres espèces et son impact sur les écosystèmes sont toutefois peu documentés dans des environnements dominés par les activités humaines, qui peuvent impacter l’ensemble des interactions entre les espèces. Ainsi, les connaissances sur l'écologie du loup demeurent encore insuffisantes pour appréhender et prédire ses effets sur un territoire. Ce projet vise donc à combler ces lacunes et à nous éclairer sur le rôle que joue le loup dans un écosystème anthropisé de montagne. Pour répondre à cette problématique le recours au suivi de loups équipés de collier GPS est l’option la plus pertinente (cf. rapport du Plan National d’Actions loup et activités d’élevage). Les équipements seront déployés uniquement sur des individus subadultes et adultes d’au moins 23 kilogrammes, qui sont jugés comme suffisamment développés pour pouvoir supporter un équipement par collier GPS, d’après les retours d’expérience des projets européens portant sur le loup. Les périodes ciblées de capture permettront d’éviter de capturer des femelles dans le dernier tiers de gestation ou des jeunes.

Tuées à la fin de chaque procédure parce qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées, 1 112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la rate par chirurgie, puis viennent jusqu'à dix injections, dix prises de sang et neuf séances d'imagerie sous anesthésie par animal, pour tester un vaccin contre le cancer du foie lié au virus de l'hépatite B. Le porteur écrit que la croissance de la tumeur hépatique "est tolérée par les souris" tout en indiquant qu'elle peut affecter leur capacité à s'alimenter. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer l'immunogénicité des vecteurs et que la complexité des réponses vaccinales dans un "organisme entier" impose l'animal.

Objectifs

Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement certaines cellules immunitaires capables de tuer des cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur de nouveaux candidats vaccins pourrait être particulièrement efficace pour activer ces cellules immunitaires et contrôler la prolifération tumorale. Dans un premier temps, le but est d'établir des lignées tumorales exprimant des antigènes du virus de l'hépatite B au niveau du foie des souris. En cas de succès, l’objectif sera d'évaluer l’efficacité des candidats vaccins seuls, ou en combinaison avec des molécules anticancéreuses, à éliminer ces tumeurs. Cela permettra d’établir la preuve de concept de cette immunothérapie contre le cancer du foie et d’étudier les mécanismes du contrôle immunitaire mis en place dans l’organisme par une vaccination thérapeutique basée sur ces nouveaux candidats vaccins. Ultimement, les vaccins candidats ayant une activité antitumorale notable seront développés en vue d’un essai clinique

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme de ce projet sont la validation de la preuve du concept préclinique d'utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des candidats vaccins, avec ou sans combinaison avec d’autres molécules anticancéreuses, dans l’immunothérapie du cancer du foie lié à l'infection par le virus de l'hépatite B. L’avantage à long terme du projet actuel sera l'utilisation de ces vaccins d’immuno-oncothérapie dans le contexte d’une co-administration en clinique dans le but d’obtenir un effet additif ou synergique de la réponse immunitaire contre des tumeurs hépatiques.

Procédures

Pour un groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 7x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 7x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 6x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 1 ou 2x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 4x - Injection sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x

Impact sur les animaux

L'injection dans la rate des cellules tumorales nécessite une chirurgie et des complications post-opératoires comme des infections peuvent survenir pendant toute la période de suivi. La croissance de la tumeur au niveau hépatique est tolérée par les souris mais peut, dans certains cas, s’associer à une perte d'activité et affecter leur capacité à s'alimenter. Les animaux sont susceptibles de ressentir une légère douleur au moment des injections de vaccins, d'anticorps ou des prises de sang. Cette douleur sera de courte durée et sans impact significatif sur leur bien-être ou leur état général. Douleur au point de piqure et stress lors des prélèvements de sang sur animaux vigils.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les souris présentant des tumeurs seront euthanasiées pour des raisons éthiques (pour éviter les souffrances). Les souris sans tumeur ne peuvent être réutilisées car leur système immunitaire a été modifié par la vaccination.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité vaccinale antitumorale d’un vaccin thérapeutique, injecté seul ou en co-injection avec des molécules anticancéreuses, destiné ultimement à la thérapie de certains cancers du foie. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale, car aucun modèle in vitro ne permet d’évaluer l’immunogénicité des vecteurs d’immunisation. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité des réponses vaccinales et antitumorales au niveau d’un organisme entier. Les mécanismes en jeu sont multifactoriels et ne sont pas encore caractérisés de manière exhaustive. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est déterminé en prenant en compte que le développement d’une tumeur et son interaction avec le système immunitaire comporte une large variabilité entre les individus, comme chez l’homme. En choisissant des animaux d’âge proche, il est possible de réduire au maximum cette variabilité. Toujours pour réduire le plus possible le nombre de souris utilisées tout en s’assurant qu’un nombre suffisant sera inclus de façon à rendre les résultats concluants, le nombre d’animaux et de répétitions par expérience ont été définis en fonction de la nature de l’expérience et validés suite à l’exposé et à la discussion du projet avec un biostatisticien. Sur ses conseils, les groupes seront constitués de 10 animaux du fait de la capacité d’implantation et de la variabilité de la croissance tumorale de manière à obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes. Ce nombre pourra être réduit si la variabilité observée lors de la première procédure est moins élevée que celle actuellement estimée. Des études précédentes ont permis d’optimiser notre protocole de vaccination et de définir la cinétique de vaccination permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vaccins utilisés dans cette étude ont été préalablement validés par des études d’immunogénicité chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses spécifiques contre les tumeurs chez la souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. Si les tumeurs ne s'implantent pas ou si un candidat vaccin n'a pas d’effet significatif sur la croissance de la tumeur, les procédures suivantes ne seront pas réalisées.

Raffinement

L'injection dans la rate des cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie gazeuse avec une prise en charge de la douleur avant, pendant et après l'injection. L’implantation de tumeurs hépatiques peut induire une gêne modérée qui sera spécifiquement monitorée 2 à 3 fois par semaine au cours des expériences. Selon notre expérience antérieure, l’injection des vecteurs lentiviraux vaccinaux n’induit aucun signe clinique chez les souris. Les animaux seront observés 2 à 3 fois par semaine pour détecter tout signe d’inconfort ou de souffrance. Si un point limite est atteint, la souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés, inactivité, plusieurs mesures seront prises. Cela inclut l’ajout de gel hydrique, la réhydratation sous cutanée, le chauffage des cages ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose pour éviter l’irritation par les copeaux de bois.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe un modèle de tumeur hépatique qui peut être utilisé chez la souris pour tester notre candidat vaccin. Nos études précédentes montrent que les vecteurs vaccinaux évalués sont immunogènes chez la souris. De plus, de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.

Des lignées de souris sont élevées pour développer avec l'âge une inflammation chronique, une hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmonaire : 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nuisances annoncées sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Le porteur écrit ensuite que les conditions d'élevage seront adaptées pour que les animaux ne développent pas de symptômes, alors que le phénotype dommageable est précisément ce que cet élevage produit, les souris atteintes n'étant pas gardées au-delà de vingt semaines. Une partie des petits sert au renouvellement des accouplements, les autres partent vers des expériences menées sur un autre site, et tous sont tués à terme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’élever des animaux spécialement conçus pour nos expériences scientifiques. Grâce à ces expériences, nous cherchons à comprendre comment le métabolisme des lipides influence certaines maladies inflammatoires chroniques (ici par exemple le syndrome d'Aicardi-Goutières).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de découvrir des solutions thérapeutiques pour alléger les symptômes présents chez les patients souffrant d’inflammation chronique.

Procédures

Ces animaux developperont une inflammation chronique avec l'âge. Ces lignées murines modèles de maladies inflammatoires developpent avec le temps un hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances liées à l'inflammation chronique dans ces modèles sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Les animaux ne seront pas maintenus plus de 20 semaines, les conditions d'élevage seront donc adaptées pour qu'ils ne dévellopent pas de symptômes.

Devenir

Les animaux issus de l'élevage seront soit utilisés pour renouveler les accouplements soit utilisés pour les expérimentations dans le cadre d'une utilisation continue sur un autre site. Les animaux ne présentant pas le phénotype dommageable seront intégrés dans les groupes "contrôles". Tous les animaux seront utilisés. A la fin, ils seront tous euthanasiés.

Remplacement

L'objectif du projet scientifique associé à ces élévages nécessite l'utilisation de modèles animaux. Les méthodes substitutives notamment l'utilisation de modèle in vitro ne permet pas d'étudier la communication inter-organes.

Réduction

Afin de réduire le biais associé au sexe, des groupes équivalents d’animaux des deux sexes seront utilisés dans les protocoles expérimentaux proposés. Tous les animaux issus des accouplements seront conservés pour l'expérimentation.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues à la délétion génétique dommageable. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. De plus les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. De fait, afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux, les animaux seront placés en cage 3 individus (trio d'accouplements) avec pour enrichissement une maisonnette en carton et du coton pour la nidification. Les animaux avec un phénotype dommageable ne seront pas gardés en vie au delà de 20 semaines d'âge.

Choix des espèces

Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expérimentales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les animaux seront utilisées pour l'élevage, les animaux seront donc mis en accouplement entre 7 et 8 semaines et les animaux à phénotype dommageable seront maintenus en accouplements pour une durée maximale de 12 à 13 semaines ( âge maximum des animaux 20 semaines).